La Génomique

Clonage Moléculaire
Définitions

Clonage :


Sous-clonage:


Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de
ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur
Plasmide recombinant:


Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale
(Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN
Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit
Organisme recombinant

Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été
introduit
Pourquoi cloner?
 Séparer,
identifier, manipuler ou
exprimer un fragment spécifique d’ADN
3
Étape 1- Séparer
 Deux
approches:
 Fragmenter/digérer
l’ADN génomique
 Génère
un très grand nombre de fragments
 Peut-être difficile de retrouver le fragment
d’intérêt
 Amplification
 Beaucoup
par PCR
moins de fragments
 Beaucoup plus facile de retrouver la séquence
d’intérêt
Cloner
Enzyme de
restriction
Vecteur
approprié
Ligature Intermoléculaire
Recombinant
Cellules Hôte
Enzyme de
restriction
Générer des extrémités
compatibles
Fragment
d’intérêt
Ligature
d’ADN
Ligature Intramoléculaire
Non-Recombinant
Transformation
Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante
1 plasmide/1 cellule
Amplification des Plasmides Recombinants
1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert
Duplication
de plasmide
Croissance bactérienne
Criblage et Identification de Clones
Recombinants Plasmidiques
 Cartographie
 Hybridation
 PCR
de restriction
Expression
 Pourquoi?
 Produire
la protéine dans un système
hétérologue
 Produire la protéine en grande quantité
 Purifier la protéine
 Étudier l’activité de la protéine
Amplification, Mutagenèse, Clonage &
Expression de LacZ– Projet II
 Partie
I
 Amplification
LacZ
 Partie
II
 Clonage
 Partie
 Esai
& mutagenèse par PCR du gène
de LacZ dans pUC19
III
enzymatique des protéines
recombinantes
Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1
 Purification
 Permet
par QiaQuick
de retirer le tampon, sels, etc.
 Permet de retirer les amorces
 Permet de retirer l’enzyme
 Digestion
de restriction BamHI et EcoRI ont été
ajoutés à la séquence de l’amplicon
 Sites
 Absent
dans la séquence de Mel 1
 Présent dans le site de clonage multiple du
vecteur d’expression (pRS424)
 Permet le clonage dirigé