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Institut de Physique
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Une nouvelle approche pour l’imagerie multicolore
rapide de tissus uorescents
Juillet 2014
Des physiciens et biologistes viennent de mettre au point une nouvelle stratégie
d’imagerie permettant d’observer des phénomènes rapides se déroulant dans
des tissus ou organismes vivants avec une très bonne résolution spatiale.
Les chercheurs du Laboratoire d’optique et biosciences - LOB (CNRS/École
Polytechnique/Inserm), et de l’Institut de génétique et de biologie moléculaire
et cellulaire - IGBMC (CNRS/Univ. de Strasbourg/Inserm) ont combiné deux
méthodes de microscopie optique développées récemment, d’une part la
microscopie biphotonique multicolore, qui permet d’observer simultanément
plusieurs signaux dans les tissus biologiques intacts à quelques centaines de
micromètres de profondeur avec une résolution subcellulaire, et d’autre part
la microscopie illuminée par nappe très performante pour l’imagerie rapide
de tissus transparents. Grâce à cette approche, les chercheurs ont imagé les
battements du cœur d’un embryon de poisson zébré et reconstitué en trois
dimensions les mouvements cellulaires avec une résolution spatio-temporelle
sufsante pour suivre chaque cellule individuellement au cours d’un cycle
cardiaque. Ces travaux sont publiés dans la revue Nature Methods. Il est
maintenant possible d’envisager son application à l’étude de la formation du
cœur chez les vertébrés et des pathologies aboutissant à des malformations
cardiaques.
L’ingrédient de base de cette méthode de visualisation est le suivi par
excitation biphotonique de marqueurs uorescents présents dans l’organisme
étudié. Éclairées par un faisceau laser, ces uorophores émettent un photon
visible lorsqu’ils ont été excités par l’absorption simultanée de deux photons
infrarouges. Dans cette approche, seules les molécules se trouvant dans la
zone où le laser est focalisé uorescent de manière importante : ceci permet
d’assurer une très bonne résolution spatiale. Dans cette nouvelle expérience,
les chercheurs excitent simultanément trois marqueurs grâce à deux lasers
à impulsions femtoseconde synchronisés de longueurs d’onde différentes.
L’un des marqueurs émet un photon rouge après absorption de deux photons
du premier laser, un second marqueur uoresce dans le bleu en absorbant
deux photons du deuxième laser tandis que le troisième émet une lumière
verte après absorption d’un photon de chaque laser. Ces lasers, envoyés
par le côté de l’échantillon, créent une ligne d’excitation tout le long de leur
passage au travers de l’échantillon. Cette ligne est ensuite rapidement balayée
verticalement de manière à former une nappe de lumière. Enn, l’échantillon
est balayé plus lentement selon la direction horizontale pour acquérir un
volume tridimensionnel d’images. Une caméra image alors le plan éclairé à
une cadence de 50 à 100 images par seconde. L’excitation et la détection se
font ainsi simultanément sur tout un plan, ce qui permet de gagner un facteur
10 à 100 en vitesse d’imagerie par rapport à la microscopie biphotonique
usuelle dans laquelle les points sont sondés un par un en déplaçant le point de
focalisation du laser d’excitation. Par rapport à la géométrie usuelle, le schéma
en nappe de lumière a également l’avantage d’utiliser des intensités laser plus
faibles sur l’échantillon, ce qui élimine la majeure partie des perturbations
optiques présentes en imagerie multiphotonique.
En excitant plusieurs marqueurs uorescents, les chercheurs ont pu capturer
simultanément les mouvements cellulaires et le ux sanguin. Ils ont ainsi pu
suivre les trajectoires individuelles des cellules du myocarde qui se déplacent
très rapidement pendant la demi-seconde que dure un cycle cardiaque.
Ce nouveau type de microscope rassemble des propriétés essentielles pour la recherche
en sciences du vivant : (i) l’excitation multicolore permettant le suivi simultané de
plusieurs uorophores au sein du tissu ; (ii) l’imagerie tridimensionnelle de tissus intacts
avec une résolution spatiale subcellulaire grâce à l’excitation multiphotonique ; (iii) une
grande vitesse d’acquisition, de l’ordre d’une centaine d’images par seconde, permettant
de capturer des phénomènes biologiques rapides et, enn ; (iv) une très faible invasivité
autorisant l’observation prolongée d’organismes vivants.
Multicolor two-photon light-sheet microscopy, P. Mahou1, J. Vermot2, E.
Beaurepaire1 et W. Supatto1, Nature Methods 11, 600–601 (2014)
En savoir plus
Emmanuel Beaurepaire, directeur de recherche CNRS
Willy Supatto, chargé de recherche CNRS
Contact chercheur
1 Laboratoire d’optique et biosciences (LOB)
2 Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC)
Informations complémentaires
Reconstruction tridimensionnelle du cœur d’un embryon de poisson zèbre à l’aide de
l’imagerie multicolore par microscopie biphotonique à nappe de lumière. Après avoir
capturé simultanément des images des cellules sanguines (rouge), des cellules du
myocarde (vert) et des cellules du péricarde (bleu) au cours d’un cycle cardiaque durant
moins de 500 ms (à gauche), il est possible de suivre les trajectoires des cellules
individuelles (au centre) et de quantier la vitesse moyenne des cellules (à droite) dans
l’atrium (A), le ventricule (V) ou le canal atrio-ventriculaire (AV). Ici, un volume de 210
× 230 × 300 µm3 a été reconstruit avec résolution temporelle. L’échelle de couleurs
code pour des vitesses instantanées de 0 à 620 µm/seconde (au centre) et des
vitesses moyennes sur de 27 à 215 µm/seconde (à droite).
© École polytechnique, CNRS, Inserm / Nature Publishing Group