Utilisation du système CRISPR-dCas9 dans la reprogrammation

Utilisation du système CRISPR-dCas9
dans la reprogrammation cardiaque
Adélie Belin – Gabrielle Capin – Antoine Farnham
Master 2 EGPR
Université Paul Sabatier Toulouse

REMERCIEMENTS
Nous souhaitons dans un premier temps remercier particulièrement Mme Laurence Nieto pour
le temps qu’elle a su consacrer à notre projet ainsi que pour tous ses conseils avisés fournis tout
le long de ce semestre.
Nous remercions également M Rémy Poupot pour ses remarques et ses conseils apportés lors
des différentes présentations, ainsi que M Laurent Paquereau et M Vincent Ecochard pour leur
aide concernant la compréhension des vecteurs et du système CRISPR-Cas9.
Nous tenons à remercier tout particulièrement Mme Celine Galès de l’institut I2MC de
Toulouse pour le temps qu’elle nous a consacré et pour nous avoir apporté toutes les
informations nécessaires à la compréhension de la reprogrammation cardiaque.
Un grand merci à Mme Bettina Couderc pour nous avoir reçu et nous avoir éclairés sur
l’utilisation et la conception des vecteurs viraux.
Nous remercions également M Aurélien Olichon du centre CRCT de Toulouse pour nous avoir
aidé à mieux comprendre le système dCas9 couplé aux ARN guides.
Enfin, un grand merci au reste de l’équipe pédagogique du master EGPR pour leur aide et leur
soutien au cours de ce semestre particulièrement intense. Mais également à tous les étudiants
de la promotions 2016 / 2017 pour leur patience et leur bonne humeur au quotidien !

RESUME
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Elles
résultent le plus souvent d’une perte de cardiomyocytes, cellules contractiles indispensables à
la fonction cardiaque.
Des études en cours ont pour but de palier à ce problème, cependant elles souffrent d’un
manque d’efficacité. Certaines de ces études ont pour principe d’exprimer les facteurs de
transcription (MGT) exogènes, impliqués dans le développement cardiaque, permettant la
reprogrammation des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits (iCM). Cependant, des
barrières épigénétiques bloquent la reprogrammation cardiaque en empêchant l’expression des
gènes cardiogéniques endogènes. C’est pourquoi, notre projet de recherche consiste à
reprogrammer directement des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits par activation
de l’expression des facteurs de transcription MGT endogènes. Le fait d’activer les gènes
endogènes permettra de pallier la barrière épigénétique et donc d’augmenter l’efficacité de
reprogrammation.
Pour cela, le système CRISPR-dCas9-activateur sera utilisé. Le principe étant de fabriquer des
ARN guides (ARNg), capables de cibler spécifiquement les promoteurs proximaux des facteurs
MGT. Ces ARNg vont recruter une Cas9 délétée de sa fonction endonucléase (dCas9), qui sera
couplée à un activateur transcriptionnel. Ce système a fait ses preuves lors de la
reprogrammation directe sur des fibroblastes embryonnaires de souris en neurones induits. Afin
d’optimiser le système de reprogrammation, une dCas9 et des activateurs spécifiques vont être
choisis : Sa-dCas9 et l’activateur VPR. Les ARNg vont être fabriqués de manière à activer
spécifiquement les gènes cibles en évitant les effets non spécifiques.
La reprogrammation sera suivie grâce à des marqueurs spécifiques des cardiomyocytes (α-
MHC, cTnT, α-actinine sarcomérique…), des analyses de l’expression des gènes MGT mais
également d’autres gènes cardiogéniques impliqués dans la reprogrammation et différents
gènes cardiaques. Des études transcriptomiques et des analyses épigénétiques seront réalisées
en parallèle.