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THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Cancérologie
Présentée et soutenue par EMILIE GROSS
Le 26/10/2010
Titre : IMPACT DES COMPOSANTES CELLULAIRES DE LA LEUCEMIE LYMPHOIDE
CHRONIQUE DE TYPE B DANS LES RECHUTES POST-THERAPEUTIQUES : DE LA SIDE
POPULATION LEUCEMIQUE AUX CELLULES IMMUNITAIRES
JURY
Président : Pr. GUY LAURENT, Professeur UPS - Toulouse
Dr. ANNE QUILLET-MARY, Chargée de recherche CNRS - Toulouse
Dr. EMMANUELLE CHARAFE-JAUFFRET, MCU-PH CRCM - Marseille
Pr. CHARLES DUMONTET, Professeur ISPB - Lyon
Pr. HELENE MERLE-BERAL, Professeur Hôpital Pitié-Salpêtrière -Paris
Ecole doctorale : Ecole Doctorale de Biologie - Santé - Biotechnologie
Unité de recherche : U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan
Directeur(s) de Thèse : Dr. ANNE QUILLET-MARY
Rapporteurs :
Dr. EMMANUELLE CHARAFE-JAUFFRET, MCU-PH CRCM - Marseille
Pr. CHARLES DUMONTET, Professeur ISPB - Lyon
«La difficulté de réussir ne fait qu’ajouter à la nécessité d’entreprendre.»
Beaumarchais - Le Barbier de Séville
A mon grand-père,
Henri…
REMERCIEMENTS
Mes premiers remerciements vont au Dr. Anne Quillet-Mary, un puit d’énergie
intarissable qui m’a bien souvent fait penser à une certaine divinité indienne par la multitude
de tâches qu’elle est capable d’accomplir avec succès… Bien plus que ma directrice de thèse
durant ces quatre années, il m’est difficile aujourd’hui de transcrire avec des mots ma
gratitude tant elle est grande. Dans cet esprit et « non-exhaustivement », je te remercie pour ce
soutien sans faille que tu m’as apporté, la rigueur scientifique extrême que tu m’as enseignée
et ton implication personnelle et très précieuse dans mon parcours dans le laboratoire.
Toujours à mes cotés dans le combat, de la paillasse (ce qui est très rare !) aux reviewers en
passant par mes projets futurs et les difficultés de financement que j’ai pu rencontrer, je
trouve qu’on a formé une très belle équipe ! Ta volonté et ta curiosité scientifique nous ont
permis d’aborder des thèmes ambitieux que je te remercie de m’avoir confiés. J’espère que les
premières pierres de l’édifice LLC-B que l’on a apporté ensemble porteront leurs fruits et
serviront ton succès professionnel que je te souhaite, de tout cœur, le plus grand possible.
Je remercie le Professeur Guy Laurent, tout d’abord, d’avoir accepté de présider mon
jury de thèse. Je le remercie également pour toutes les discussions qui ont ponctuées ces
quatre années de thèse et durant lesquelles j’ai pu découvrir les dimensions poétique, sexy ou
plus fréquemment déterministe de la science. C’est d’ailleurs au cours d’une de ces fameuses
discussions qu’a jailli l’hypothèse d’une hiérarchie du clone LLC-B identifiable par le
phénotype SP. Je retiendrais également de cet enseignement l’importance de la réflexion des
manuscrits (So, what ?) et une gestion pragmatique de la science que je pense essentielle.
Je remercie les membres du jury qui ont accepté la lourde tâche de juger mes travaux
de thèse regroupés dans le présent manuscrit. J’ai été honorée de votre présence en ce jour très
spécial pour moi.
A ce titre je remercie, le docteur Emmanuelle Charaffe-Jauffret d’avoir apporté son
expertise sur les concepts de hiérarchisation tumorale et d’avoir ouvert la discussion sur ce
point qui m’était cher, bien qu’uniquement suggéré dans mes travaux. Là où d’autres avaient
reculé, je lui suis très reconnaissante d’avoir surmonté les disparités fondamentales qui
existent entre nos deux modèles d’étude (solide vs liquide), pour mettre en exergue les points
de convergence.
M’étant moi-même inspirée de ces concepts dans les cancers solides, je reste convaincue de
l’importance de l’ouverture scientifique dans la démarche intellectuelle d’identification de
nouveaux processus pathologiques et plus spécifiquement néoplasiques. Je tiens également à
remercier le Professeur Charles Dumontet pour sa disponibilité, sa gentillesse, ses critiques
justifiées et ses conseils judicieux concernant la présentation et les travaux de thèse. Son
expertise, qui regroupe de façon quasi-exhaustive tous les domaines de ma thèse, de la LLC-B
jusqu’à la thérapie par rituximab en passant par les pompes ABC et la chimiorésistance, ont
fait de lui un acteur indispensable de ce jury. Je remercie également le Professeur Hélène
Merle-Béral, référence en matière de LLC-B, d’avoir apporté sa précieuse vision du
manuscrit et des travaux qui le composent.
Je remercie le Docteur Jean-Jacques Fournié tout d’abord de m’avoir acceptée au
sein de son équipe. Je le remercie également pour la confiance qu’il m’a témoignée,
l’enthousiasme dont il a fait preuve pour mes projets et pour son apport dans la rédaction des
manuscrits dont je garde un précieux enseignement. De façon analogue à Guy Laurent, sa
propension à apporter de la poésie à la science et son ouverture scientifique m’ont également
beaucoup motivée. Je garde un excellent souvenir des heures passées ensemble à reformuler
la revue que vous m’aviez confiée, et pour laquelle j’ai pris un réel plaisir à écrire.
De façon plus personnelle, je voudrais exprimer ma gratitude à :
Samar : Ah ma Samar !!! Un vide intersidéral ponctuait tes absences au labo, ma pote, ma
compagne de galère, bien plus qu’une simple collègue, une véritable amie. Pour moi un
exemple de diplomatie, de dynamisme et de simplicité, avec elle, jamais de prises de tête…
Fun only !!!!! Que dire de plus à part que t’avoir eu sur ma route a juste été un pur plaisir et
que malgré nos destins géographiquement distincts j’espère te garder toujours à mes cotés….
Catherine : (à prononcer avec l’accent anglais, Caysssrine !!!) Ma grande cops, on en a
partagé des éclats de rires avec Samar devant des plateaux repas pas franchement fameux à la
cantine. C’était vraiment réconfortant d’avoir ton aura bienveillante à mes cotés et de
bénéficier de tes sages conseils durant ces quatre années. Pour moi, tu resteras jeune toute ta
vie !!! Je te souhaite pleins d’évènements heureux pour tes vacances illimitées !
Amandine : « My soulmate », ma grande confidente, tellement de choses en commun que ça
en devenait troublant… Les mêmes questions existentielles nous amenaient souvent à refaire
un monde hypothétique rempli de si… Ça a été énorme de te rencontrer…
Emilie L. : Sur l’échelle graduée du « taquet », je demande la première marche du podium…
Emilie est un modèle d’organisation teinté d’un amour du « gossip », qui jamais ne perd (mais
qui devrait) le contrôle. Souvent hallucinante tant la réflexion organisationnelle est poussée,
tu m’as bien souvent « coachée » sur divers points et je t’en suis très reconnaissante. Je suis
plus que ravie que tu t’épanouisses aujourd’hui dans l’énigmatique LLC-B. J’espère te
retrouver très bientôt dans notre Est natal où nous pourrons enfin parler allemand sans
complexe…
Emilie-Fleur : Sur l’échelle graduée du « taquet », je demande la dernière place… Un brin en
marge du troupeau, Emilie-Fleur est de loin la plus investie des doctorantes… Sa gentillesse
n’a d’égal que sa passion pour la chapelure. Toujours là pour me tenir compagnie tard le soir,
on a beaucoup partagé et ri ensemble. Merci pour ton oreille toujours attentive… A bientôt
j’espère sur un autre continent...
Séverine : Aussi douée à la paillasse qu’aux fourneaux, j’ai beaucoup apprécié ta rigueur
professionnelle et ton pragmatisme. Toujours à voir le côté positif des personnes et des
situations, nos réunions thés et mojitos resteront des grands moments d’harmonie
thérapeutique.
Loïc : Ou l’homme qui m’a fait découvrir les ascenseurs en or (oui je sais, tu te moques
encore de moi là-dessus !!). D’une motivation sans faille, un grand passionné de LLC-B et de
science avec un grand S, qui retransmet admirablement bien sa fougue et sa motivation aux
troupes. Je te remercie pour tous tes conseils et ton apport indispensable aux divers projets
que j’ai mené.
Fatima et Valérie : L’implication du plateau technique de cytométrie en flux, où j’ai passé
quelques centaines d’heures durant ces quatre ans, a eu un impact considérable dans la
réalisation et l’aboutissement du projet SP. Je leur suis très reconnaissante pour l’efficacité, la
disponibilité et la gentillesse dont elles ont fait preuve : les heures supplémentaires devant le
trieur pour atteindre quelques dizaines de milliers de cellules SP en témoignent.
Cécile : Très différente du commun des scientifiques académiques, j’ai adoré ton personnage
très vrai qui détonnait dans cet environnement. Surtout reste comme tu es !!
Chris B. : Toujours l’énergie au niveau maximum et le sourire, notre dernière interaction sous
la chaleur des breuvages magiques de Yovan reste inoubliable…
Chris J. : Merci pour ta gentillesse, ton support et tes conseils durant ma thèse. Egalement
victime des talents de Yovan à cette fameuse soirée, je suis sure que l’on pourra réitérer
l’expérience sous un soleil de plomb, les pieds dans le sable fin, avec pour seule musique les
vagues de l’océan Pacifique …
Mélanie : Un merci très spécial puisqu’au titre de ton M1, tu m’as énormément soulagée et
m’as accompagnée dans mes virées nocturnes au LSR2. Avec toi, j’ai également pu apprendre
sur mes qualités (et défauts) d’encadrante… Merci pour ta franchise et ton volontarisme.
Gema : Merci d’avoir œuvré à me faire aimer le confocal (sans succès : la béta-caténine s’est
révélée trop versatile…). Je garde un très bon souvenir de nos soirées ensemble dans des
temps et/ou contrées lointaines.
Loïc D. : C’était toujours un plaisir de te croiser dans les couloirs. Je garde un très bon
souvenir de Barcelone ensemble avec Gema. Merci à vous deux pour votre gentillesse, votre
motivation et votre écoute…
Yovan : Rayon de soleil permanent, ta présence solaire, ton accent et tes mojitos nous
permettent de voyager loin de la grisaille des paillasses du laboratoire… Merci !!
De façon plus globale, je souhaite remercier tous les membres de l’équipe Immunité
Innée et Hémopathies Malignes passés et présents avec qui j’ai pu interagir : Mary (Merci
pour ton enthousiasme et ta motivation exemplaire), Rémy, Frédéric Pont, Emilie Decaup
(Gardes toujours le sourire...), Aude-Hélène, Ludivine, Julie G. et Pauline (A mes yeux, la
plus prometteuse des étudiantes, j’espère que ta thèse sera à la mesure de ton talent !).
Je remercie également le laboratoire d’hématologie, et plus particulièrement le
Dr. Stéphanie Struski, pour la détection d’anomalies caryotypiques au sein de la fraction SP.
Mes remerciements vont également aux équipes de l’étage jaune : l’équipe du docteur
Bernard Payrastre et l’équipe du professeur Georges Delsol.
Point de carrefour entre ces différentes équipes, le bureau des étudiants, où règne une
émulsion scientifico-« gossipique » quasi-permanente, a représenté mon point de repliement
après les heures de manipulations à la paillasse. Ces acteurs nombreux et dont le
renouvellement est constant permet d’obtenir une atmosphère chaleureuse et hétéroclite. Au
sein du bureau des étudiants, je souhaite remercier Emilie D. (merci pour toutes les
discussions que l’on a eu, j’ai beaucoup aimé ton analyse de la science et des ragots ainsi que
ton sens de l’ironie !), Julie B. (en véritable osmose avec Emilie L., merci pour ta bonne
humeur et ton attitude sportive qui m’a convertie à bouger des muscles dont j’ignorais
l’existence jusqu’alors…), Wilfried (merci pour tes apports toujours très pertinents aux
discussions scientifiques, merci également de me donner un peu de culture moléculaire et de
m’en apprendre toujours plus sur les breuvages bizarres et autres expressions élégantes de
chez toi… merci d’avoir relu ma thèse !!), Cathy (un exemple d’efficacité, merci pour ta
gentillesse, ta disponibilité et ta positivité), Etienne (merci de m’avoir fait énormément rire au
cours de ces années, merci également pour ton volontarisme et ta motivation), Julien (merci
pour ta bonne humeur et le « fun » que tu amènes au laboratoire), Charlotte (seulement à tes
débuts, tu es pleine d’énergie et de motivation, je te souhaite une thèse fructueuse), Alan
(parti depuis 1 an, je n’oublie pas que tu as été la première personne à me parler, toujours en
confiance avec toi, j’ai beaucoup aimé nos longues discussions lors de mes premières années
de thèse).
Je tiens à remercier mes amis les plus sincères : Perrine (ma bonne étoile, tout là-bas)
et Régis (d’une amitié née du même enthousiasme pour la science en DEA, aujourd’hui très
proches au-delà de la dimension scientifique, merci pour ton soutien et ta présence !!).
Les mots manquent pour exprimer de la façon la plus juste ma gratitude envers ma
grande famille. La motivation profonde, que vous m’avez insufflée (sans le savoir, j’en suis
sure !!), et le soutien inconditionnel que vous m’avez donné, ont représenté les plus précieux
atouts de mon aboutissement personnel dans cette thèse.
Partie intégrante de cette grande famille, je ne peux passer outre la personne de
Morad, qui malgré une formation non-scientifique, connaît mieux que personne aujourd’hui,
l’ambiguïté qu’amène l’utilisation du si-RNA béta-caténine dans le modèle de la LLC-B…
A mes cotés durant la quasi-totalité de mon parcours scolaire, tu as été le catalyseur de ma
réussite et le moteur de mes ambitions… ambitions qui n’étaient qu’utopies à une certaine
époque mais qui aujourd’hui sont réalités… Il m’est difficile de traduire avec des mots ce que
tu représentes pour moi et l’infinie gratitude que je te voue…
Enfin, je ne pourrai clôturer ce chapitre sans exprimer mes plus profonds
remerciements aux patients atteints de LLC-B, à leurs médecins associés (Service
d’Hématologie de Toulouse Purpan) et aux donateurs de l’association Laurette Fugain et de
la Fondation pour la Recherche Médicale.
SOMMAIRE
ABREVIATIONS
1
PREAMBULE
5
INTRODUCTION
7
I.
LA LEUCEMIE LYMPHOÏDE CHRONIQUE DE TYPE B (LLC-B)
7
7
1. GENERALITES ET SPECIFICITES EPIDEMIOLOGIQUES ET DIAGNOSTIQUES
1.1 LA LLC-B EN CHIFFRE
7
1.2 CONTRIBUTIONS ENVIRONNEMENTALE ET GENETIQUE DANS L’APPARITION DE LA MALADIE
7
1.3 PARTICULARITES ET MYSTERES
8
1.4 HISTORIQUE
9
1.5 CLASSIFICATION DE LA MALADIE
10
1.6 LE DIAGNOSTIC
11
14
2. THERAPIES
2.1 TRANSPLANTATION/GREFFE DE MOELLE
15
2.2 AGENTS CHIMIOTHERAPEUTIQUES
15
2.3 L’IMMUNOVECTORISATION PAR ANTICORPS
18
2.4 NOUVEAUX AGENTS
21
2.5 COMPLICATIONS
21
2.6 RECHUTES
22
2.7 LA MALADIE RESIDUELLE
23
24
3. BIOLOGIE DE LA LLC-B
24
3.1 L’APOPTOSE
3.2 EMERGENCE DU ROLE DE LA PROLIFERATION DANS LA LLC-B
24
3.3 L’IMPORTANCE DU MICROENVIRONNEMENT DANS LA REGULATION DE LA BALANCE
26
APOPTOSE/PROLIFERATION DE LA LLC-B
29
3.4 L’INVASION ET LA MIGRATION
31
4. LA RESISTANCE AUX TRAITEMENTS CONVENTIONNELS DE LA LLC-B
4.1 LA CHIMIORESISTANCE INTRINSEQUE – SELECTION DE CLONES INTRINSEQUEMENT RESISTANTS
31
4.2 LA CHIMIORESISTANCE EXTRINSEQUE
32
4.3 LA RESISTANCE SPECIFIQUE AUX TRAITEMENTS CONVENTIONNELS DE LA LLC-B
33
37
5. HYPOTHESES SUR L’ORIGINE DE LA LLC-B (HISTOIRE NATURELLE DE LA MALADIE)
37
5.1 LA STIMULATION ANTIGENIQUE
5.2 LA CELLULE B A L’ORIGINE DE LA TRANSFORMATION LEUCEMIQUE
39
5.3 LA LYMPHOCYTOSE MONOCLONALE : MBL
41
5.4 L’APPORT DES MODELES ANIMAUX
42
5.5 LA THEORIE DE LA CELLULE SOUCHE HEMATOPOÏETIQUE ANORMALE
44
II. CELLULES SIDE POPULATION INITIATRICES DE TUMEURS ET
DETERMINATRICES DE LA CHIMIORESISTANCE
46
1.
1.1
1.2
1.3
2.
2.1
2.2
2.3
2.4
3.
3.1
3.2
3.3
4.
4.1
4.2
4.3
4.4
46
46
47
48
49
50
51
53
54
55
56
58
60
61
62
63
64
65
III.
CELLULES SOUCHES NORMALES
PROPRIETES FONDAMENTALES DES CELLULES SOUCHES
IDENTIFICATION DES CELLULES SOUCHES
MECANISMES MOLECULAIRES DU MAINTIEN DE LA « STEMNESS » : BMI-1
CELLULES INITIATRICES DE TUMEURS
IDENTIFICATION DES CELLULES INITIATRICES DE TUMEURS
THEORIES D’INITIATION TUMORALE
IMPLICATION DE BMI-1 DANS LES CELLULES INITIATRICES DE TUMEURS
IMPLICATIONS THERAPEUTIQUES DU CONCEPT DES CELLULES INITIATRICES DE CANCERS
LES TRANSPORTEURS ABC
ABCB1
ABCG2
AUTRES TRANSPORTEURS IMPLIQUES DANS LE CANCER
SIDE POPULATION (SP)
LA SP REPRESENTE UNE FRACTION ENRICHIE EN CELLULES SOUCHES
DETERMINANT MOLECULAIRE DU PHENOTYPE SP
POINTS CRITIQUES DE LA TECHNIQUE
CHIMIORESISTANCE DES CELLULES SP
SURVEILLANCE IMMUNITAIRE ANTI-TUMORALE
67
1. LA SURVEILLANCE IMMUNITAIRE DES TUMEURS
1.1 PREUVES EXPERIMENTALES DE L’IMMUNOSURVEILLANCE
1.2 THEORIE DE REGULATION EXTRINSEQUE DES TUMEURS
1.3 MECANISMES GENERAUX D’ « IMMUNOEDITING » ET D’IMMUNOSUBVERSION
1.4 L’IMMUNOSURVEILLANCE DANS LA LLC-B
1.5 GENERALITES SUR L’IMPLICATION THERAPEUTIQUE DU CONCEPT D’IMMUNOSURVEILLANCE
2. LE RESEAU D’IMMUNOSURVEILLANCE DES TUMEURS
2.1 L’IMMUNITE ACQUISE
2.2 IMMUNITE INNEE OU NATURELLE ANTI-TUMORALE
67
67
68
71
71
72
73
73
77
IV.
93
OBJECTIFS DE L’ETUDE
RESULTATS ET DISCUSSION
94
I. LA RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES TRAITEMENT FCR DANS LA LLCB : PERSPECTIVES D’IMMUNOMODULATION NK POST-THERAPIE.
94
1. INTRODUCTION
2. ARTICLE I.
3. DISCUSSION ARTICLE I.
3.1 LA RECONSTITUTION IMMUNITAIRE POST-FCR EST MARQUEE PAR UNE PREDOMINANCE DU
COMPARTIMENT NK.
3.2 LA CHIMIOTHERAPIE PERMET DE RESTAURER LES COMPETENCES CYTOTOXIQUES NK
3.3 IMPLICATION DES CELLULES CD4+ DANS LA RECHUTE POST-THERAPEUTIQUE
3.4 PERSPECTIVES D’IMMUNOMODULATION PAR L’ADCC DU RITUXIMAB
3.5 FACTEURS INFLUENTS LA MRD
94
95
96
96
97
98
100
101
II. LA BASE CELLULAIRE DE LA CHIMIORESISTANCE DE LA LLC-B REPOSE SUR
L’EXISTENCE DE CELLULES SP INNEES ET ACQUISES.
102
1. INTRODUCTION
2. ARTICLE II.
3. DISCUSSION ARTICLE II.
3.1 CARACTERISATION DE LA SP INNEE LEUCEMIQUE DE LA LLC-B
3.2 LA CHIMIOTHERAPIE PERMET DE SELECTIONNER LES CELLULES SP LEUCEMIQUES
3.3 LA PROLIFERATION PERMET AUX CELLULES SP DE GENERER DES CELLULES NON-SP
102
103
104
104
107
112
DISCUSSION GENERALE
113
BIBLIOGRAPHIE
121
ANNEXE : CANCER STEM CELLS OF DIFFERENTIATED B-CELL MALIGNANCIES:
MODELS AND CONSEQUENCES
135
RESUME EN ANGLAIS
146
ABREVIATIONS
5’NT: 5’ nucléotidase
A
ABC : ATP-Binding Cassette
ADCC : Antibody Dependant Cell Cytotoxicity
ALDH : Aldehyde Dehydrogenase
AN : Analogue de nucléoside
ATM : Ataxia Telangiectasia, Mutated
B
BCR : B-Cell Receptor
C
CAM-DR : Cellular Adhesion Mediated drug Resistance
CDC : Complement Dependant Cytotoxicity
CDK : Cyclin Dependant Kinase
CHOP : Cyclophosphamide, Vincristine, Prednisone, Doxorubicine
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CNT : Concentrative Nucleoside Transporter
CPA : Cellule Présentatrice d’Antigène
CSM : Cellule Souche Mésenchymateuse
CTL : Lymphocyte T Cytotoxique
CVP : Cyclophosphamide, Vincristine, Prednisone
D
dCK : deoxycytidine kinases
DLBCL : Diffuse Large B-cell Lymphoma
DLEU2 : Deleted in Lymphocytic Leukemia 2
1
DNA-PK : DNA dependant Protein Kinase
E
EMDR : Environmental Mediated Drug Resistance
ENT : Equilibrative Nucléoside Transporters
F
FC : Fludarabine Cyclophosphamide
FCR : Fludarabine Cyclophosphamide Rituximab
FMC7 : Clone d’un anticorps reconnaissant une protéine exprimée à la surface des
cellules B
I
ICAM-1 : Inter-Cellular Adhesion Molecule
IDO : Indoleamin 2,3 Dioxygenase
IFN : Interferon
Ig : Immunoglobuline
Ig-M : Immunoglubuline mutée
Ig-NM : Immunoglobuline non-mutée
ITIM : Immunoreceptor Tyrosine Inhibitory Motif
K
KIR : Killer cell Ig- like Receptor
L
LAM : Leucémie Aigue Myéloïde
LFA-1 : Lymphocyte Function-associated Antigen
LLC-B : Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
LMC : Leucémie Myéloïde Chroique
2
LPS : Lipopolysacharride
M
MBC : Malignant Monoclonal B-cell
MBL : Lymphocytose Monoclonale B
MDR : Minimal Deleted Region
MICA : MHC class I related protein A
MICB : MHC class I related protein B
MMP : Matrix Metallopeptidase
MRD : Maladie Résiduelle
N
NBD : Nucleotide binding domain
NBF : Nucleotide Binding Folds
NK : Natural Killer
P
PARP : Polymérase poly(ADP-ribose)
PBL : Peripheral Blood Lymphocyte
PcG : Polycomb Group
PCR : Polymerase Chain reaction
PGE : Prostaglandin E
PKC : Protéine Kinase C
PRC : Polycomb Repressor Complex
R
R-CHOP : Rituximab, Cyclophosphamide, Vincristine, Prednisone, Doxorubicine
RHAMM : Receptor for hyaluronan-mediated motility
S
SFM-DR : Soluble Factor Mediated Drug Resistance
3
SLL : Small Lymphocytic Lymphoma
SP : Side Population
SWI/SNF: SWItch/Sucrose Non-Fermenting
T
TCR : T-Cell receptor
TCL1 : T-cell leukemia 1
TGF-β : Transforming Growth Factor β
TLR : Toll Like Receptor
TMD : Transmembrane Domain
TN : Transporteur nucléosidique
TNF : Tumor Necrosis Factor
Treg : T régulateur
Z
Zap-70 : Zeta-chain Associated Protein kinase
4
PREAMBULE
PREAMBULE
Seconde cause de mortalité dans les pays « développés », la dénomination générique
de Cancer regroupe une centaine d’entités pour lesquelles les statistiques d’occurrence et de
mortalité actuelles sont alarmantes : près d’une personne sur trois développera au cours de sa
vie un cancer et près d’une personne sur quatre en mourra.
Les cancers proviennent d’un processus de sélection de clones capables d’outrepasser
les barrières physiologiques bloquant l’anarchie moléculaire à l’origine de la transformation
néoplasique. Cette sélection « quasi-darwinienne » permet d’élaborer la juste combinaison de
lésions génétiques et de signaux microenvironnementaux conduisant le clone émergeant à
assurer la pérennité de son expansion illimitée. La définition multifonctionnelle du cancer
repose sur les six « hallmarks » du cancer introduites par Hanahan et Weinberg en 2000 (1):
potentiel prolifératif infini, inhibition de la mort cellulaire programmée, invasion tissulaire,
capacité de formation de nouveaux vaisseaux, insensibilité aux signaux anti-prolifératifs et
auto-suffisance en signaux prolifératifs. En marge de ces caractéristiques oncogéniques pures
s’ajoute l’échappement à l’immunité anti-tumorale, qui représente un facteur extrinsèque
décisif de la progression tumorale. Près d’une décennie plus tard, il est nécessaire d’introduire
la notion d’hétérogénéité intra-clonale à cette définition du cancer. De cette notion
d’hétérogénéité cellulaire ont jaillit les « néo-concepts » d’organisation hiérarchique des
tumeurs où l’initiation et la progression du clone tumoral sont assurées par des cellules
souches transformées. En introduisant un nouveau niveau de complexité à l’éradication
thérapeutique des cancers, le concept de cellules souches cancéreuses a permis d’apporter des
éléments de réponse aux échecs des thérapies actuelles du cancer.
Les travaux de cette thèse ont été entièrement voués au cancer unique et atypique
qu’est la Leucémie Lymphoïde Chronique de type B (LLC-B), pour laquelle j’ai consacré la
première partie de l’introduction de ce manuscrit. Cette hémopathie, aux processus de
carcinogenèse encore énigmatiques, constitue une réelle passion intellectuelle à mes yeux.
L’intrigante question de la leucémogenèse de la LLC-B, qui trouve potentiellement sa réponse
dans l’hétérogénéité de cette hémopathie, a été l’inspiration de cette première partie.
5
PREAMBULE
Au-delà des généralités caractéristiques et thérapeutiques de la maladie, j’ai tenté de
développer les différents aspects de la biologie et de la résistance thérapeutique en mettant en
exergue la documentation concernant l’hétérogénéité du clone leucémique. Cette première
partie s’est achevée sur les théories actuelles concernant l’origine de la LLC-B et s’ouvre à la
problématique de hiérarchisation des tumeurs.
Dans une seconde partie, j’ai développé, de façon volontairement peu spécifique, le
concept des cellules souches cancéreuses pour clôturer en détail, avec l’identification
d’hétérogénéités cellulaires hiérarchiques par la technique des Side Population (SP).
Enfin, dans une troisième partie, les concepts clés de la surveillance immunitaire antitumorale, de l’immunosélection à l’immuno-échappement en passant par les implications
thérapeutiques, ont été abordés. Les acteurs principaux de la surveillance immunitaire antitumorale ont été ensuite disséqués et la documentation sur les interactions étroites de ces
derniers avec les cellules de LLC-B a été délivrée le plus exhaustivement possible.
Cette thèse s’inscrit dans une démarche intellectuelle vouée à la perspective
d’éradication thérapeutique de la LLC-B. Cette visée thérapeutique transparaît, dans
l’ensemble des travaux expérimentaux et bibliographiques regroupé de ce manuscrit, au
travers de l’hétérogénéité cellulaire du potentiel chimiorésistant du clone leucémique et des
perspectives d’immunomodulation post-thérapie. Bien que d’apparence éloignées, l’étude
fondamentale, définissant une nouvelle hétérogénéité du clone leucémique LLC-B, et l’étude
plus « appliquée », de la surveillance immunitaire après traitement, trouvent leur point de
convergence dans la thérapeutique de la rechute. L’incurabilité de la LLC-B résidant dans sa
propension à réémerger après thérapies, cette thèse ne se contente pas uniquement d’apporter
des éléments de réponse sur l’origine cellulaire potentielle des rechutes. Elle tente également,
au travers de l’immunothérapie post-chimiothérapie, d’esquisser des solutions thérapeutiques
permettant une éradication complète du clone leucémique.
6
« La volonté aboutit à un ajournement, l'utopie ;
la science aboutit à un doute, l'hypothèse. »
Victor Hugo - Post-scriptum de ma vie
INTRODUCTION
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
INTRODUCTION
I.
La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B (LLC-B)
Définition de la LLC-B :
La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B (LLC-B) est caractérisée par l’accumulation et
l’infiltration de lymphocytes B matures au niveau des compartiments sanguins, médullaires et
ganglionnaires.
1. Généralités et spécificités épidémiologiques et diagnostiques
1.1
La LLC-B en chiffre
La fréquence et l’incurabilité de la LLC-B font de cette pathologie un enjeu majeur de
santé publique. En effet, la LLC-B représente la forme la plus fréquente des leucémies
affectant l’adulte dans les pays développés. L’incidence est de 3,9 pour 100 000 individus aux
Etats-Unis avec une forte variabilité selon le sexe, l’occurrence de la LLC-B doublant dans la
population masculine en comparaison avec la population féminine. Les populations âgées sont
les plus touchées, l’âge moyen au moment du diagnostic étant de 72 ans (2).
1.2
Contributions environnementale et génétique dans l’apparition de la maladie
Malgré cette forte fréquence, l’étiologie de la maladie reste obscure. En effet, il existe peu
de données épidémiologiques substantielles établissant un lien causal entre l’occurrence de la
maladie et l’exposition à des agents chimiques ou des radiations. Seul l’Agent Orange, un
herbicide utilisé au Vietnam, a été explicitement associé à un risque accru d’apparition de
LLC-B. Le rôle des radiations ionisantes, dont l’exposition est traditionnellement liée aux
développements de Leucémies Aigues Myéloïdes (LAM) et Leucémies Myéloïdes
Chroniques (LMC), reste, pour la LLC-B, controversé au sein de la littérature
épidémiologique (3, 4).
7
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
S’ajoute à ces risques environnementaux peu définis et très spécifiques, un rôle bien
mieux établi du patrimoine génétique dans l’apparition de LLC-B dites « familiales » pour
approximativement 5 à 10 % des cas. Cette part solide de la génétique repose sur
l’observation d’une augmentation de 7,5 fois du risque de développement de LLC-B pour les
personnes apparentées au premier degré à un patient LLC-B. De plus, ces parents au premier
degré présentent une Lymphocytose Monoclonale B (MBL), précurseur putatif et forme
précoce asymptomatique avérée de la LLC-B, dans 13,5 à 18 % des cas. Récemment, ces
constats épidémiologiques se sont renforcés scientifiquement avec la preuve formelle de
l’existence de loci communs impliqués dans la susceptibilité à la LLC-B (2).
1.3
Particularités et mystères
Récapitulant de façon partielle les « hallmarks » du cancer (1), la LLC-B est un cancer
unique caractérisé par l’accumulation de cellules B majoritairement quiescentes alimentée par
une sous-population « élite » proliférante (5). En plus de ce profil prolifératif atypique, les
cellules de LLC-B présentent une forte dépendance aux composantes cellulaires et
cytokiniques de leur microenvironnement, rendant leur manipulation ex-vivo complexe et
biaisée (6). En effet, la LLC-B présente un spectre de « homing » tissulaire diversifié avec
une infiltration des cellules malignes au niveau des compartiments sanguin, médullaire et
ganglionnaire. Les cellules de LLC-B isolées à partir de ces différents tissus présentent une
hétérogénéité de leur profil transcriptionnel, phénotypique, apoptotique et prolifératif dictée
par le microenvironnement inhérent à chacun de ces tissus (7-11). Ces études tissu-spécifiques
associées à l’extrapolation des connaissances de la biologie B normale (12) tendent à
démontrer que le ganglion est le siège de la pathogenèse LLC-B. Cependant, pour des raisons
d’accessibilité et d’éthique, la quasi-totalité des études scientifiques sont menées sur la phase
leucémique issue du sang périphérique, reflet potentiellement uniquement partiel de la LLCB. Les recherches sur cette partie cachée de l’iceberg s’avèrent être d’autant plus complexes
qu’il n’existe pas de modèle cellulaire relevant de la LLC-B.
8
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
1.4
Historique
La description des symptômes cliniques de la LLC-B ainsi que la définition cellulaire
morphologique de la maladie, distincte d’une pathologie myéloïde, été reportée pour la
première fois en 1847 par Virchow. Ce n’est qu’en 1909 que la LLC-B a été reconnue comme
une entité clinique propre. La distinction entre formes chronique et aigue de leucémie ne s’est
fait que plus tard en 1967. Les grandes avancées thérapeutiques et diagnostiques de la maladie
se sont effectuées avec les propositions de classification, maintenant standard, de la LLC-B
par Rai et Binet dans les années 70. Enfin, à la fin des années 80, l’implémentation des
caractéristiques morphologiques et immunophénotypiques aux critères de classification de la
maladie ont permis d’établir la base de la prise en charge actuelle du patient LLC-B (3, 13).
Sang
Ganglion
Moelle osseuse
Agent Orange
Prédispositions
génétiques
CD19
Clonalité des
chaînes légères κ
ou λ
CD5
CD23
Zap70
CD38
CD20
Délétions 13q, 17p et
11q
Trisomies 12
Schéma 1 : Vue d’ensemble de la pathologie LLC-B
9
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
1.5
Classification de la maladie
La classification de la maladie selon Rai ou Binet permet de stratifier le stade d’évolution
des patients afin d’apporter une évaluation pronostique basée sur des symptômes cliniques et
de guider le choix de la stratégie thérapeutique la plus spécifique au degré d’avancement de la
maladie.
Classification Rai
d’après les références Abbott, Oncologist, 11(1), 31-30 (2006) et Leblond V., Hématologie
collection FMC SFH (2009) (14, 15).
Stade
0
1
2
3
4
Lymphocytose absolue
(> 5 000/mm3)
Lymphadénopathie
*
*
*
Hepathomégalie
*
Splénomégalie
*
Anémie
*
(Hémoglobine < 10 g/dl)
Thrombopénie
(Plaquette < 100 000/µL)
Tableau 1 : Classification de Rai de la LLC-B
Légende :
*
: Avec ou sans
: Ou
Classification Binet
d’après les références Abbott, Oncologist, 11(1), 31-30 (2006) et Leblond V., Hématologie
collection FMC SFH (2009) (14, 15).
10
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Stade
A
B
C
Lymphocytose absolue
(> 5 000/mm3)
< 3 aires lymphoïdes atteintes
> 3 aires lymphoïdes atteintes
Anémie
°
(Hémoglobine < 10 g/dl)
Thrombopénie
°
(Plaquette < 100 000/µL)
Correspondance avec Classification de Rai
0, 1 et 2
1 et 2
3 et 4
Tableau 2 : Classification de Binet de la LLC-B
Légende :
° : et/ou
1.6
Le diagnostic
1.6.1
Le diagnostic clinique
Conformément aux classifications de Rai et de Binet, le diagnostic clinique primitif de la
LLC-B repose sur la recherche d’aires ganglionnaires atteintes et sur la détection d’une
lymphocytose absolue (>5 000 cellules/mm3 de sang) chronique (persistance de plus de 3
mois). Cet examen clinique est complété par une évaluation de la morphologie et du
phénotype de ces cellules (14, 16).
1.6.2
Caractéristiques phénotypiques et morphologiques
L’examen microscopique de cellules de LLC-B révèle des cellules de petite taille d’aspect
mature.
11
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Cependant, c’est l’étude de l’immunophénotype unique des cellules de LLC-B qui
constitue l’outil essentiel au diagnostic formel de la maladie. Ces lymphocytes B matures
présentent une expression des marqueurs canoniques de la lignée B, CD19 et CD20.
L’expression du CD20 à la surface des cellules de LLC-B reste cependant faible comparée
aux cellules B physiologiques et lymphomateuses. L’expression du « B-Cell Receptor »
(BCR) à la surface de ces cellules est relativement faible et le caractère monoclonal de
l’expansion leucémique est révélé par l’expression d’une seule chaîne légère des
immunoglobulines (Igs) (Kappa ou Lambda). Une co-expression du marqueur du linéage T,
CD5, est un des aspects les plus typiques du phénotype LLC-B lorsqu’il est associé à une
positivité du marqueur d’activation CD23 et une négativité des marqueurs FMC7 et CD79b.
L’ensemble de ces critères phénotypiques (CD23+, CD5+, sIg Faible, FMC7-, CD79b-)
permette au moment du diagnostic d’établir un score de Matutes gradué de 1 à 5, les scores
de 4 et 5 identifiant formellement une LLC-B (17).
La définition de marqueurs pronostiques complétant ces systèmes de classification a été
un champ de recherche particulièrement exploré dans la LLC-B.
1.6.3
Facteurs pronostiques
La LLC-B compte une littérature abondante en matière de facteurs pronostiques. De façon
logique, la classification de Binet ou Rai, se basant sur des critères exclusivement cliniques,
constitue la première étape à la définition pronostique de la maladie.
1.6.3.1
Facteurs cytogénétiques
Quantités de données dans la littérature démontrent une implication de translocations
chromosomiques oncogéniques dans l’apparition et le développement de lymphomes B (18).
Dans ce contexte, la LLC-B est un cas particulier puisque les translocations chromosomiques
récurrentes sont rares et qu’aucune mutation oncogénique spécifique de cette hémopathie n’a
été identifiée. Les aberrations caryotypiques couramment diagnostiquées dans la LLC-B sont
principalement : la délétion 13q14 (plus de 50 % des cas), la délétion 11q22-q23 (environ 18
% des cas), la trisomie 12 (environ 16 % des cas) , la délétion 17p13 (environ 7 % des cas)
(19).
12
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
La région 13q14 code pour deux microARNs, miR15a et miR16-1. L’étude
fonctionnelle de la « minimal deleted region » (MDR) de cette région chromosomique en
modèle murin démontre l’implication de cette délétion dans les mécanismes de pathogenèse
de la LLC-B (20). Cette délétion est néanmoins associée à un bon pronostic (2).
Concernant la trisomie 12, le support oncogénique apporté par l’aberration
chromosomique reste évasif puisque aucun gène impliqué dans la pathogenèse LLC-B n’a été
identifié dans cette région. Son statut pronostique reste également obscur et controversé dans
la littérature (2).
La région 11q22-q23 contient le gène ATM (Ataxia Telangiectasia, Mutated),
composant essentiel de la réponse aux dommages de l’ADN. Cette délétion est associée à une
maladie caractérisée par une progression rapide, une lymphadénopathie extensive et une
survie plus courte (2).
Les délétions de la région 17p13 ont un impact sur la suppression tumorale intrinsèque.
En effet, la région 17p13 est porteuse du gène codant pour p53, la protéine suppresseur de
tumeurs par excellence. Cette anomalie est de mauvais pronostic et est associée à une
résistance à la Fludarabine. Les délétions 17p et 11q sont deux éléments prédictifs d’une
survie plus courte de façon indépendante du stade de la maladie (2).
1.6.3.2
Facteurs moléculaires et phénotypiques
Dans la biologie B normale, la rencontre des cellules B avec l’antigène au niveau des
centres germinatifs en présence de cellules T se traduit par l’apparition de mutations
ponctuelles au niveau des Igs. Ce processus conduit à la sélection de mutants présentant la
meilleure affinité pour l’antigène. L’étude du statut mutationnel des Igs a permis de définir
deux groupes de LLC-B de types : (i) Igs mutées (Ig-M) de bon pronostic et (ii) Igs nonmutées (Ig-NM) de pronostic péjoratif avec une médiane de survie, pour ces patients,
considérablement raccourcie. Ce facteur pronostique est le plus stable au cours de la
progression tumorale (21) mais également le plus fastidieux à déterminer. La recherche de
marqueur de substitution du statut mutationnel du BCR a démontré que l’expression de la
« zeta-chain associated protein kinase » (Zap-70), protéine clé de la signalisation du « T-Cell
Receptor » (TCR), pouvait être utilisée comme indicatrice de l’absence de mutation au niveau
du BCR (22).
13
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Reflet à la fois du statut prolifératif et de l’interaction avec le microenvironnement,
l’expression de l’ectoenzyme CD38 à la surface des cellules est associée à un mauvais
pronostic lorsqu’elle est présente sur plus de 30% des cellules leucémiques.
Enfin, la valeur pronostique des marqueurs de prolifération indicateurs de l’évolution de la
masse tumorale ; que sont les marqueurs sériques LDH, β2-microglobuline, CD23 soluble, et
thymidine kinase ainsi que le temps de doublement des lymphocytes ; est la démonstration de
l’importance de la composante proliférative de la LLC-B (14).
L’ensemble de ces données cliniques diagnostiques et pronostiques permette de guider la
thérapeutique vers la greffe de cellules souches, la chimiothérapie ou l’immunochimiothérapie.
2. Thérapies
En dépit de l’apport constant de nouvelles thérapies, la LLC-B reste une maladie
incurable. Les différentes modalités thérapeutiques cherchent à générer une réponse clinique
et moléculaire/phénotypique maximale sans pour autant permettre un réel traitement curatif.
Historiquement, l’objectif de la prise en charge thérapeutique des patients LLC-B est passé de
palliations des symptômes, à retardement de la progression et réduction de la masse tumorale
pour arriver à la visée actuelle d’une réponse clinique et moléculaire maximale. L’évolution
de ces objectifs s’est faite de pair avec l’introduction de thérapies basées sur la Fludarabine et
l’élaboration de nouvelles combinaisons thérapeutiques incluant les anticorps monoclonaux.
Pour les patients de stade A, l’abstention thérapeutique est couramment adoptée. Pour les
stades plus avancés montrant des signes d’évolutivité et d’agressivité, l’association
Fludarabine, Cyclophosphamide et Rituximab (FCR) est incontestablement actuellement le
« gold standard » de la thérapie LLC-B. Seule la mise en évidence d’une délétion 17p,
signature moléculaire de patients réfractaires à la chimiothérapie, déroge à cette règle et dicte
une approche thérapeutique alternative et plus spécifique (Alemtuzumab et greffe de moelle
allogénique). Quelque soit l’option thérapeutique, l’efficacité première de celle-ci sur
l’éradication des cellules leucémiques fait place de façon quasi-invariable, au cours du temps,
à la réémergence du clone leucémique.
14
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
2.1
Transplantation/Greffe de moelle
La transplantation de cellules souches est une modalité thérapeutique lourde dont
bénéficient uniquement les sujets jeunes et à hauts risques. Deux modalités sont possibles
l’autogreffe et l’allogreffe de cellules souches.
L’autogreffe est l’option qui génère le moins de mortalité associée au traitement en
parallèle d’un taux de rémission complète plus faible que pour l’allogreffe. En effet, bien que
l’on observe une rémission prolongée (rémissions moléculaires obtenues chez plus de 2/3 des
patients), l’autogreffe ne permet pas d’éradiquer durablement le clone leucémique (23).
La seconde option, la transplantation de cellules souches allogéniques, apparaît comme
l’unique traitement curatif de la LLC-B. Cependant, la mortalité associée à la procédure
limite son usage aux patients jeunes réfractaires ou en rechute. L’efficacité du traitement
repose sur l’établissement d’une réponse immunitaire du greffon contre la leucémie. Ce prérequis d’efficacité est basé sur l’observation d’un fort taux de rechute en présence de greffons
dépourvus de cellules T. L’équilibre de cette réponse immunitaire est crucial étant donné les
risques majeurs de mortalité résidant dans l’établissement d’une réponse immunitaire du
greffon contre l’hôte. Contrairement aux autres traitements, cette approche thérapeutique
permet une éradication durable du clone leucémique de façon indépendante du statut
pronostique initial de ces patients (23, 24).
2.2
Agents Chimiothérapeutiques
2.2.1
Analogues de purines
Les analogues de purines les plus couramment utilisés sont la Fludarabine, la Pentostatin
et la Cladribine. Dans l’évolution du traitement de la LLC-B, l’introduction de la Fludarabine
dans les protocoles thérapeutiques a démontré la supériorité de celle-ci en monothérapie en
termes de taux de réponse clinique et de temps de rémission par rapport au Chlorambucil et à
aux combinaisons CHOP et CVP (CHOP : Cyclophosphamide, Vincristine, Prednisone,
Doxorubicine et CVP: Cyclophosphamide, Vincristine, Prednisone) (14, 25).
15
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
L’amélioration de la réponse clinique grâce à l’introduction de la Fludarabine en combinaison
avec le Cyclophosphamide (FC) puis récemment l’addition du Rituximab au FC a permis
d’atteindre des taux de rémission complète significatifs, qui ont fait de cette dernière
combinaison le « gold standard » actuel de la thérapie de la LLC-B.
Les analogues de purines sont des agents chimiothérapeutiques qui ciblent à la fois les
cellules proliférantes et quiescentes. L’action de cette classe de drogues sur les cellules
proliférantes requiert l’incorporation des analogues de purines dans l’ADN et l’inhibition de
la synthèse de l’ADN. Pour les cellules quiescentes, le mécanisme cytotoxique est largement
attribué à : (i) l’accumulation de cassures spontanées dans ADN, (ii) l’inhibition de la
réparation de ces dommages à l’ADN, (iii) la diminution de la synthèse d’ARN (effet global
sur la transcription de gènes potentiellement importants pour la survie) et (iv) la déplétion de
NAD+/ATP due à l’activation continuelle de la polymérase poly(ADP-ribose) (PARP). Ce
dernier aspect de la mort induite par les analogues de purines reste encore discuté dans la
littérature. Les analogues de purines induisent également de façon directe une transition de la
polarité de la membrane mitochondriale qui engendre une mort cellulaire via l’apoptose
(lorsque celle-ci est fonctionnelle grâce à la présence de caspases) ou via la nécrose (26).
Schéma 2 : Modèle de signalisation cytotoxique induite par les analogues de purines
D’après Pettitt et al., British Journal of Haematology 121, 692-702 (2003)
16
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
L’action des analogues de purines repose sur la voie de signalisation suivante. La
première étape du métabolisme de ces drogues est l’entrée de la molécule dans la cellule via
les transporteurs nucléosidiques de la famille CNT et ENT (concentrative et equilibrative
nucleoside transporters). Une fois contenus dans l’espace intracellulaire, les analogues de
purines sont convertis sous forme d’un dérivé 5’-triphosphorylé par l’action de diverses
deoxycytidine kinases (dCK) (La réaction inverse est catalysée par les 5’ nucléotidases
(5’NT)). Cette étape est un pré-requis absolu à la cytotoxicité du composé, les réponses
thérapeutiques à la Fludarabine étant corrélées au ratio dCK/5’NT. Les composés
phosphorylés deviennent alors substrats de nombreuses enzymes impliquées dans la synthèse
et la réparation de l’ADN (27).
Schéma 3 : Modèle général du métabolisme des analogues de nucléoside
D’après Jordheim et al., Bulletin du Cancer 92 (3), 239-48 (2005)
Légende :
AN : analogue de nucléoside
TN : Transporteur nucléosidique
1 : nucléoside et nucléotide kinases
2 : 5’ nucléotidases
17
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
2.2.2
Agents alkylants
Les agents alkylants utilisés dans la LLC-B sont le Chlorambucil et le Cyclophosphamide.
Le Chlorambucil a été pendant longtemps le traitement de référence de la LLC-B. Le
Cyclophosphamide est utilisé en combinaison avec la Fludarabine et le Rituximab.
Le mode d’action des agents alkylants repose sur les liaisons fortes qu’ils établissent avec
les protéines, l’ARN et l’ADN. C’est en grande partie sur cette dernière interaction que
s’exerce majoritairement leur action cytotoxique, grâce à la formation de ponts à l’intérieur
d’un même brin d’ADN ou entre deux brins (schéma 4,
). Le second mécanisme d’action de
ces molécules passe par l’attachement d’un groupe alkyl au niveau des bases de l’ADN.
L’ADN est ensuite fragmenté par les enzymes de réparation qui tentent de réparer ces défauts
mineurs de l’ADN (schéma 4,
). De plus, ces bases alkylées inhibent la synthèse d’ADN et
d’ARN. Le troisième mécanisme réside dans l’introduction d’erreurs d’appariement par les
bases alkylées conduisant à l’apparition de mutations (schéma 4,
1
Formation de liaisons
intra/inter brins
2
).
Ajout de group alkyl
aux bases
3
Introduction d’erreurs
d’appariement
Schéma 4 : Mode d’action des agents alkylants
(d’après www.cancerquest.org/index.cfm?page=486)
2.3
L’immunovectorisation par anticorps
18
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Troisième entité du traitement de référence de la LLC-B, les anticorps monoclonaux
offrent par leur mode d’action distinct une nouvelle option thérapeutique complémentaire,
pour le Rituximab, et/ou alternative, pour l’Alemtuzumab, à l’action chimiothérapeutique de
la Fludarabine et du Cyclophosphamide.
2.3.1
Le Rituximab
En clinique, le Rituximab peut être utilisé en monothérapie ou en combinaison avec la
chimiothérapie (FCR, R-CHOP) en première ligne. Il est également utilisé dans des thérapies
de consolidation ou d’entretien.
Le Rituximab est un anticorps chimérique dirigé contre le CD20. Cette Ig glycosylée de
type IgG1 est composée de régions constantes d’origine humaine et de régions variables des
chaînes lourdes et légères d’origine murine. Le spectre d’expression du CD20 est restreint aux
cellules B normales (du stade pré-B au B mature) et malignes. Cet antigène est absent à la
surface des cellules souches hématopoïétiques, des progéniteurs B (cellules pro-B), des
plasmocytes normaux et des tissus normaux non-hématopoïétiques. En plus de son profil
d’expression cellulaire, un des intérêts majeurs du ciblage du CD20 est qu’il ne s’internalise
pas lors de son engagement avec le Rituximab. Le Rituximab présente trois mécanismes
d’action majeurs (28):
la génération d’une cytotoxicité dépendante du complément (CDC) en faisant intervenir la
liaison du fragment C1q du complément à l’extrémité Fc de l’anticorps (schéma 5, A).
la cytotoxicité cellulaire dépendante de l’anticorps (ADCC), qui implique l’action de
populations immunitaires effectrices présentant à leur surface un récepteur au fragment Fc
des Igs (cellules Natural Killer (NK), macrophages, granulocytes, lymphocytes Tγδ). Ce
dernier mécanisme apparaît comme le mécanisme prépondérant de l’action cytotoxique du
Rituximab. En effet, il a été démontré que le polymorphisme du gène FcγRIIIa (CD16),
codant pour un récepteur avec des affinités variables pour les IgGs, corrèle avec la
réponse thérapeutique à la combinaison R-CHOP (29). Le débat reste cependant maintenu
puisque un an plus tard, ces données ont fait l’objet d’une controverse (30) (schéma 5, B).
l’induction directe de l’apoptose dont la relevance in vitro et in vivo fait l’objet de débat et
par lequel, il semble exercer un effet chimiosensibilisant (31) (schéma 5, C).
19
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Schéma 5 : Modes d’action du Rituximab
Modifié d’après Taylor and Lindorfer, Nat Clin Pract Rheumatol 3: 86–95 (2007).
2.3.2
L’Alemtuzumab ou Campath
L’Alemtuzumab est un anticorps monoclonal IgG1 kappa humanisé dirigé contre le CD52,
une protéine représentée de façon quasi-ubiquitaire par les cellules différenciées de
l’hématopoïèse (Lymphocytes B et T, cellules NK, monocytes, thymocytes, macrophages et
certains granulocytes). Ce spectre d’expression cellulaire explique sa limitation d’utilisation
majeure : l’immunosuppression intense qu’il induit. Ce médicament est administré en
monothérapie ou en association avec la chimiothérapie pour les patients réfractaires (32).
Comme pour le Rituximab, son mode d’action majoritaire est dépendant de sa fraction Fc
au travers de l’induction de CDC et d’ADCC, en présence d’effecteurs fonctionnels (33). Il
est également capable dans des systèmes d’étude in vitro d’induire une mort par apoptose
(34).
20
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
2.4
Nouveaux agents
Malgré l’efficacité de toutes ces thérapies dites standard qui améliorent le temps de
rémission, l’immense majorité des patients rechute de façon inexorable. Ce constat démontre
le besoin d’adopter de nouvelles thérapies qui permettront d’envisager dans l’avenir une
éradication durable et complète du clone leucémique. Toute une pléiade de nouveaux agents
fait actuellement l’objet d’études pré-cliniques et cliniques pour la LLC-B.
La Bendamustine, un agent alkylant, apparaît comme un nouveau médicament pour la
LLC-B bien que celle-ci ait une histoire clinique longue en Allemagne où elle est utilisée
depuis plus de 30 ans. Cette drogue apparaît très efficace pour la LLC-B puisqu’elle est active
sur des patients réfractaires aux agents alkylants. De façon unique par rapport à la classe
d’agent alkylant, elle induit une activation de la réponse aux dommages à l’ADN, une
apoptose massive des cellules et une inhibition du point de contrôle mitotique qui engendre
une catastrophe mitotique (35).
Tout un panel de thérapies ciblées est actuellement en cours développement. De façon
non-exhaustive, elles incluent l’anticorps monoclonal dirigé contre le CD23 (Lumiliximab),
des anti-CD20 « nouvelle génération » avec une affinité augmentée pour le CD16, des
modulateurs de l’immunité (le Lénalidomide), des inhibiteurs de CDK (Cyclin dependant
Kinase) (Flavopiridol, SNS-032), des molécules antisenses et inhibiteurs pharmacologiques
de Bcl-2, et des inhibiteurs de PKC (Protéine Kinase C) (Enzastaurin) (35, 36).
2.5
Complications
Dans la LLC-B, l’envahissement et la modification du microenvironnement des
compartiments sanguin, médullaire et ganglionnaire par les cellules leucémiques engendrent
de lourdes répercussions sur les fonctions inhérentes au système hématopoïétique et, en
particulier, sur la protection aux agents infectieux exercée par l’immunité. Les complications
associées à la pathologie LLC-B sont fréquentes et majoritairement d’ordre immunitaire. Elles
peuvent représenter un risque supplémentaire qui peut s’avérer fatal dans certains cas. La
gravité et la fréquence des complications qui vont être abordées ; déficit immunitaire,
désordres auto-immunitaires et syndrome de Richter ; sont fortement amplifiées par une
thérapie immunodépressive.
21
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
La LLC-B s’accompagne de façon inhérente, d’une modification des fonctions
immunitaires effectrices des différents acteurs T, NK, monocytes et complément, en termes de
quantité et d’efficacité.
La majorité des patients, tous stades confondus, développe une hypogammaglobulinemie.
L’hypogammaglobulinemie est caractérisée par une réduction forte du niveau des Igs de
classe A, G et M dont l’intensité corrèle avec la survenue d’infections bactériennes (S.
pneumonia et H. influenza). L’ensemble de ces dysfonctionnements du système immunitaire
inhérents et accentués par les thérapies entraîne l’émergence d’infections bactériennes (S.
pneumonia, S. aureus, H. influenza) et virales (EBV, HHV8). Ces troubles infectieux
représentent la première cause de mort pour les LLC-B de stade avancé.
Les complications auto-immunes sont fréquentes et touchent 10 à 25% des patients. La
production d’auto-anticorps par la composante B non-leucémique est à l’origine d’anémies
auto-immunes hémolytiques et potentiellement de la thrombocytopenie immune. Ce sont les
deux affections auto-immunes les plus couramment rencontrées dans un contexte de LLC-B
(37).
Enfin, l’apparition de syndromes de Richter résultant de la transformation d’une LLC-B
en lymphome de haut grade, majoritairement DLBCL (Diffuse Large B-cell Lymphoma),
intervient dans 5% des cas. Cette transformation représente également une issue fatale pour
les patients LLC-B. Lorsque le clone DLBCL émergeant est de la même origine clonale que
celui de la leucémie, une acquisition de nouvelles lésions génétiques est généralement
observée et inclut majoritairement des délétions chromosomiques et des mutations affectant le
gène codant pour la protéine p53. L’expression du CD38, l’absence d’une délétion 13q14 et la
taille des ganglions sont des facteurs prédictifs d’un risque de développement d’un syndrome
de Richter. Le syndrome de Richter engendre l’apparition d’une maladie agressive et
résistante aux thérapies dont la médiane de survie avoisine les 6 mois (38).
2.6
Rechutes
A l’exception des allogreffes, l’apparition de rechutes après traitement est un évènement
quasi-inévitable qui survient dans des laps de temps qui diffèrent d’un patient à l’autre, de
façon dépendante des facteurs pronostiques initiaux.
22
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
2.7
La maladie résiduelle
De l’augmentation de l’efficacité des protocoles thérapeutiques, s’accompagnant d’un
taux croissant de rémission complète (définie par les critères cliniques et morphologiques) a
émergé un intérêt pour la recherche de cellules pathologiques résiduelles ou maladie
résiduelle (MRD) après traitements. Biologiquement, l’origine de la persistance de ces
cellules fait appel aux notions de chimiorésistance intrinsèque et extrinsèque qui vont être
abordées au paragraphe §4 et dont la LLC-B est un parfait modèle récapitulatif.
Différentes techniques permettent d’évaluer la présence de cellules leucémiques
résiduelles. Les plus sensibles d’entres elles sont la cytométrie quatre couleurs
CD19/CD5/CD22/CD81 et la « Polymerase Chain Reaction » (PCR) quantitative allèlespécifique qui détecte la séquence du réarrangement des gènes des chaînes lourdes des Igs.
Ces deux techniques permettent d’atteindre des seuils de sensibilité de 10-4 (1 cellule
leucémique pour 10 000 cellules normales) (15, 39).
La détection de la MRD s’est avérée prédicative de la survie sans progression et de la
survie globale, mais la valeur pronostique de la présence d’une maladie résiduelle reste
variable suivant le traitement. De plus, la recherche de maladie résiduelle ne s’effectue que
sur les compartiments sanguins et médullaires, et occulte complètement l’impact des thérapies
sur la présence de maladie résiduelle au niveau des ganglions. Certaines thérapies de
consolidation (Alemtuzumab) montrent une efficacité sur l’éradication de la MRD (40).
L’apparition constante de rechutes post-thérapeutiques dicte le besoin d’établir une
meilleure connaissance fondamentale de la LLC-B. C’est d’ailleurs au travers de l’échec des
thérapies actuelles mais également de l’interprétation des facteurs pronostiques, reflet de la
progression leucémique, que deux aspects majeurs mais mutuellement liés de la biologie de la
LLC-B émergent : la prolifération et l’interaction avec le microenvironnement. Ces deux
aspects tendent à s’opposer à la vision « ancienne école » de la LLC-B, définissant une
pathologie accumulative résultant d’un défaut d’apoptose.
23
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
3. Biologie de la LLC-B
3.1
L’apoptose
La résistance intrinsèque à l’apoptose des cellules de LLC-B généralement admise et à
l’origine de la thèse accumulative de la maladie reste un phénomène complexe à étudier du
fait de l’engagement spontané des cellules vers l’apoptose ex-vivo. Néanmoins, les cellules de
LLC-B présentent un profil moléculaire de cellules résistantes à l’apoptose comme l’atteste la
surexpression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1 et la sous-expression des
protéines pro-apoptotiques Bax et Bcl-xs (4). Comme pour d’autres aspects de la biologie
LLC-B, la part du microenvironnement dans la survie des cellules leucémiques est
incontestable (cf. § 3.3).
3.2
Emergence du rôle de la prolifération dans la LLC-B
3.2.1
La nouvelle vision
Quantité d’évidences scientifiques démontre que les cellules sanguines leucémiques sont
quiescentes. De fait, l’examen microscopique de ces cellules révèle une chromatine nucléaire
condensée, traduisant une activité métabolique minimale. De plus, ces cellules présentent de
façon unanime un blocage de leur cycle cellulaire en phase G0/G1. Ces deux arguments
majeurs ont alimenté pendant près de quatre décennies la vision simpliste d’une maladie
inerte résultant de l’accumulation de cellules présentant un défaut d’apoptose. Des travaux
récents tendent à proposer un nouveau modèle où la prolifération apparaît comme un
mécanisme essentiel de la leucémogenèse. Le premier argument provient de l’analyse de la
taille des télomères de cellules de LLC-B. Cette étude révèle que les cellules de LLC-B
présentent des télomères plus courts en comparaison avec des cellules B normales, traduisant
une histoire proliférative plus intense (41). Ce sont les travaux de Messmer en 2005 qui vont
incontestablement clôturer l’ère de l’ancienne vision accumulative pour introduire la nouvelle
vision de la LLC-B décrivant une maladie dynamique dotée d’un potentiel prolifératif. Cette
étude basée sur l’incorporation d’eau lourde (2H2O) dans l’ADN des cellules tumorales in vivo
a permis de mettre en évidence la dynamique quotidienne de génération et de mort des
cellules leucémiques.
24
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
La quantité de cellules leucémiques produites représente 0,1% à 1,76% de la population
tumorale totale et surpasse les taux rencontrés dans la génération de cellules B normales. La
fraction proliférante leucémique est dans cette étude préférentiellement CD38+, qui apparaît
ici comme un indicateur d’une division récente (42). La relevance physiopathologique de ces
données est démontrée par la corrélation entre un taux de génération de cellules leucémiques
supérieur à 0,35% et la présence d’une maladie progressive (5).
Enfin très récemment, les modèles murins délétés au niveau de la région 13q14 présentent
un développement de LLC-B en marge de phénotypes et de complications hématologiques
associés à la LLC-B. Cette région chromosomique code non-exclusivement pour les
microARNs miR15a et miR16-1. L’étude fonctionnelle de ces deux déterminants de la
pathogenèse LLC-B indique que leur action réside dans la promotion de la prolifération en
agissant au niveau de la transition G1/S du cycle cellulaire (20). Cette étude établit, de ce fait,
le rôle moteur de la prolifération dans les mécanismes de leucémogenèse.
L’ensemble de ces données indique que la prolifération concerne préférentiellement une
population privilégiée (5) qui établit une niche intégrant des signaux microenvironnementaux
multiples au niveau de structures particulières appelées centres de prolifération.
3.2.2
Les centres de prolifération
La présence de centres prolifératifs au niveau des ganglions et plus rarement au niveau de
la moelle osseuse est une caractéristique unique de la LLC-B. Ces foyers de proliférations
forment des structures nodulaires et contiennent des agrégats de cellules tumorales de grande
taille, de phénotype pseudo-blastique, proliférantes (Ki67+), CD38+ et surexprimant de
nombreuses protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, survivine, Mcl-1) (2, 6). Le lien entre ces
centres prolifératifs et la génération de cellules leucémiques est suggéré de façon corrélative
par la corrélation entre taille et nombre des centres prolifératifs et le temps de doublement des
lymphocytes (43). Ces centres prolifératifs offrent une niche idéale pour les cellules
leucémiques qui vont être soumises à des signaux prolifératifs et anti-apoptotiques fournis par
les composantes cellulaires et cytokiniques de ce microenvironnement support de
l’oncogenèse. Ce réservoir va permettre ensuite l’alimentation du compartiment majoritaire en
cellules circulantes quiescentes.
25
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
3.3
L’importance
du
microenvironnement
dans
la
régulation
de
la
balance
apoptose/prolifération de la LLC-B
La démonstration la plus explicite de l’influence du microenvironnement sur la biologie
LLC-B est la mort spontanée des cellules de LLC-B cultivées ex vivo. Le second argument
étayant cette thèse se résume par la prévention de cette mort spontanée via l’ajout de cellules
accessoires et de cytokines (6).
3.3.1
Les cellules T accessoires
Au niveau des centres de prolifération, le compartiment prolifératif de cellules
leucémiques semble avoir la capacité de façonner son microenvironnement en recrutant des
cellules T CD3+ dont la grande majorité présente un phénotype CD4+CD40L+.
Ce recrutement des lymphocytes T, dépendant des « chemokines ligands » CCL22 et CCL27,
permet aux cellules leucémiques nichées dans les centre prolifératifs de se pourvoir en
contacts cellulaires et signaux CD40L et IL-4 (2, 6). Ce support de l’oncogenèse LLC-B par
les lymphocytes T est supporté par un ensemble de données accumulées in vitro qui
démontrent la survie et/ou la prolifération de cellules LLC-B, en présence de cellules T
autologues activées, ou de cytokines dérivées de ces dernières (IL-4 et CD40L) (44-46). De
plus, les cellules de LLC-B issues des ganglions présentent un profil apoptotique qui diffère
de leur homologue du compartiment sanguin, de façon dépendante de la stimulation du CD40
dérivée de la composante T. La forte expression de Mcl-1 est associée à une faible expression
de Noxa pour les cellules du ganglion. Cette tendance est totalement inversée pour les cellules
sanguines mais rétablie sous une stimulation chronique du CD40 (10).
De même, ce rôle support des lymphocytes T dans la pathogenèse LLC-B est suggéré par
une étude (Communication, ASH 2008) qui indique que l’expansion de cellules LLC-B
xénogreffées en modèle murin est dépendante de la prolifération de la composante T
autologue (47).
Plusieurs études proposent un modèle de coopération cellulaire successive où la
stimulation T représente un support prolifératif de courte durée au niveau des centres de
prolifération. Le relais est assuré par les cellules « stromales » qui fournissent un support antiapoptotique de longue durée en interagissant préférentiellement avec la composante cellulaire
leucémique circulante (44).
26
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
3.3.2
3.3.2.1
Les cellules stromales
Les cellules nurses
Les cellules nurses apparaissent comme une entité quasi-unique et spécifique de la LLCB. Ces cellules sont de grande taille, adhérentes, d’aspect fibroblastique et apparaissent
phénotypiquement stromales (Vimentin et STRO-1) (48). Cependant, les cellules nurses
proviennent de la fraction CD14+ présente dans le sang périphérique qui semble se
différencier au contact des cellules leucémiques in vitro (49). Ces cellules nurses interagissent
physiquement, de façon forte, avec les cellules leucémiques et les protègent d’une apoptose
spontanée in vitro par un mécanisme dépendant de SDF-1 ou de BAFF/APRIL (48, 50).
3.3.2.2
Les cellules stromales de la moelle osseuse
L’ajout de cellules stromales de la moelle osseuse permet d’inhiber l’apoptose spontanée
des cellules de LLC-B in vitro. Il semblerait que cette suppression de l’apoptose soit
indépendante de facteurs solubles mais fondée sur un contact cellulaire direct dépendant des
intégrines β1 et β2. Cette propriété unique semble être propre au statut leucémique des
cellules de LLC-B puisque leurs homologues B normaux sont incapables d’interagir avec
cette composante stromale et d’éviter ainsi la mort cellulaire (51, 52).
3.3.3
La stimulation BCR
La stimulation antigénique est l’évènement moléculaire le plus fondamental qui conduit à
l’expansion des lymphocytes B. Par extrapolation avec la physiologie B normale, il est
rationnel de spéculer que la stimulation antigénique de cellules LLC-B puisse constituer un
événement oncogénique menant à la prolifération et à la survie du clone leucémique.
Bien que les cellules LLC-B présentent une faible expression de l’Ig de surface, l’analyse
du phénotype des cellules de LLC-B montre que celles-ci expriment, de façon inhérente, un
certains nombre de marqueurs d’activation tels que le CD23, CD25, et fréquemment le CD69,
le CD71, et le CD27.
27
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Ce phénotype de cellules B compétentes immunologiquement indique que l’expérience
antigénique constitue très probablement une étape dans la leucémogenèse LLC-B (53).
Les arguments, qui tendent à placer la stimulation du BCR comme centrale dans la
pathogenèse LLC-B, reposent majoritairement sur la comparaison des LLC-B de types Ig-M
(de bon pronostic) et Ig-NM (de mauvais pronostic). En effet, la plupart des LLC-B de type
Ig-NM présentent un BCR compétent capable d’induire une signalisation alors que les
cellules non-répondantes à la stimulation BCR font majoritairement partie de la catégorie IgM (54). De plus, l’analyse de la taille des télomères de cellules de LLC-B révèle que les
cellules LLC-B de type Ig-NM ont des télomères plus courts, témoins de phases prolifératives
passées plus intenses (55). Enfin, la présence de foyers de prolifération est, dans le contexte
des hémopathies, une particularité unique de la LLC-B. De façon intéressante, la présence de
ces structures cellulaires particulières dans les maladies auto-immunes (l’arthrite rhumatoïde
et la sclérose multiple) renforce le concept de l’importance de la stimulation antigénique dans
la prolifération leucémique et souligne un lien potentiel entre mécanismes d’auto-immunité et
oncogenèse LLC-B (56).
3.3.4
Facteurs solubles et cytokines
Partie intégrante de leur phénotype de cellules activées, les cellules de LLC-B expriment
de nombreux récepteurs à différentes cytokines et ligands des « Toll like receptors » TLR
(impliqués dans les signaux de danger), indiquant la présence d’un environnement
cytokinique indépendant du BCR, complexe et varié. Exceptées les cytokines dérivées des
cellules du microenvironnement préalablement citées (CD40L, SDF-1, IL-4, BAFF, APRIL),
de nombreux facteurs solubles, potentiellement présents aux sites d’invasion leucémique,
permettent dans des systèmes de culture in vitro d’induire l’entrée en cycle des cellules de
LLC-B et de promouvoir leur survie. Non-exhaustivement, ces facteurs solubles comprennent
l’IL-2, IL-15 et également les ligands du TLR9 (ADN aux motifs CpG) (57-59). D’une façon
très originale et inattendue, des travaux récents démontrent l’induction d’une signalisation
anti-apoptotique puissante dans les cellules de LLC-B via l’interaction du domaine non
catalytique de MMP-9 (Matrix Metallopeptidase) et de l’intégrine α4β1/CD44v (60).
28
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
3.4
L’invasion et la migration
Trait d’union entre ces différents aspects biologiques de la LLC-B, l’invasion tissulaire est
un processus clé de la pathogenèse LLC-B puisqu’elle définit la base des systèmes de
classification de la maladie. Deux axes majeurs de cytokines chimioattractives (CCL et
CXCL : « chemokine ligand ») et leur récepteur spécifique (CCR : « chemokine receptor »),
sont documentés, de façon prédominante, dans la littérature et guident la migration des
cellules leucémiques au travers des différentes localisations anatomiques : CXCL12/CXCR4
et CCL21, CCL19/CCR7 (61).
L’axe CXCL12/CXCR4 permet l’entrée dans la moelle osseuse et la sortie du ganglion.
Au niveau clinique, la corrélation entre le niveau d’expression de CXCR4 et le stade
d’évolution de la maladie reste encore controversée (61, 62). Cependant, l’engagement du
BCR, évènement oncogénique pour les LLC-B de type Ig-NM, induit une réduction de
l’expression de CXCR4 permettant l’accumulation des cellules stimulées dans les niches
prolifératives contenues dans les ganglions (63).
Le second axe, CCL21, CCL19/CCR7, est impliqué dans la migration préférentielle des
cellules vers les ganglions. La relevance clinique de cet axe est indiquée par la corrélation
entre le degré de lymphadénopathie et le couple expression/fonctionnalité du récepteur CCR7
des cellules LLC-B (64). De même, le niveau d’expression de α4β1, intégrine essentielle dans
le processus de migration dépendant des chimiokines, est indicateur de la présence de
lymphadénopathies (65).
L’engagement de ces trois acteurs clés de l’invasion LLC-B (récepteurs CXCR4, CCR7 et
l’intégrine α4β1) induit l’expression de MMP-9, la protéine de référence dans l’invasion
tumorale. En effet, cette enzyme est impliquée dans la dégradation protéolytique de la
membrane basale vasculaire et de la matrice extracellulaire des tissus lymphoïdes (66, 67).
Enfin, plusieurs études, basées sur des systèmes d’analyse in vivo et in vitro, démontrent
un défaut du potentiel de migration des cellules circulantes de la LLC-B au niveau des
ganglions et de la moelle osseuse (68, 69). Ces derniers rapports suggèrent une nouvelle
hétérogénéité de la LLC-B, basée sur une différence de capacité à infiltrer des tissus
importants pour la pathogenèse, ce potentiel étant potentiellement réservé à une population
leucémique privilégiée.
29
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Schéma 6 : Principal microenvironnement de la LLC-B
En conclusion, des données scientifiques émergeantes démontrent que la prolifération est
fondamentale dans la pathogenèse. Ce processus, qui semble se dérouler au niveau des centres
prolifératifs, est hautement dépendant de la localisation anatomique des cellules leucémiques
et traduit un rôle essentiel du microenvironnement. De plus, les cellules du
microenvironnement protègent les cellules leucémiques de l’apoptose. En conséquence, les
processus de migration des cellules leucémiques sont déterminants dans la pathogenèse. On
notera cependant une hétérogénéité au niveau de la prolifération et de la migration qui semble
être restreinte à une sous-population « élite » de cellules leucémiques.
L’ensemble de ces données montre que la LLC-B présente une biologie caractérisée par
une balance apoptose/prolifération dépendante du microenvironnement. De plus, les
différentes stratégies thérapeutiques actuelles échouent à éradiquer de façon durable le clone
leucémique, qui ré-émerge de façon quasiment invariable après traitement. Ces données
cliniques traduisent un potentiel chimiorésistant, au sein des cellules leucémiques, dont les
mécanismes moléculaires d’action sous-jacents sont multiples.
30
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
4. La résistance aux traitements conventionnels de la LLC-B
La chimiorésistance peut être intrinsèque, résultant de l’accumulation de mutations et de
l’acquisition d’éléments favorisant la résistance. Elle peut être également extrinsèque dans un
phénomène communément appelé « Environmental mediated drug resistance » (EM-DR) qui
peut s’accomplir au travers de facteurs solubles (SFM-DR, soluble factor mediated drug
resistance) ou de l’adhésion protectrice à des éléments cellulaires du micrœnvironnement
(CAM-DR, cellular adhesion mediated drug resistance) (70).
4.1
La chimiorésistance intrinsèque – sélection de clones intrinsèquement résistants
4.1.1
La cytogénétique
Quantité de données dans la littérature démontre de façon irrévocable le rôle central des
délétions et mutations affectant p53 dans l’établissement d’une chimiorésistance innée ou
naturelle (71). De façon acquise, l’étude menée par Sturm I et al. démontre que la
chimiothérapie par agents alkylants induit une sélection de clones chimiorésistants présentant
des mutations de p53 (72). De façon moins catégorique, les délétions 11q affectant la protéine
ATM semblent être associées à l’émergence d’une instabilité génomique et à l’occurrence de
chimiorésistances secondaires. Ces deux données prédictives dictent le besoin d’adopter une
approche thérapeutique alternative indépendante de la fonction p53 et des dommages à l’ADN
(2).
4.1.2
Le statut anti-apoptotique
La chimiorésistance de la LLC-B a été longtemps attribuée à un défaut d’activation de
l’apoptose conféré par une surexpression de protéines anti-apoptotiques. De fait, les protéines
Mcl-1 et Bfl-1 apparaissent comme des marqueurs du phénotype chimiorésistant et reflètent
l’incapacité d’obtenir une réponse complète à diverses monothérapies in vivo (73, 74). La
sélection de clones chimiorésistants en termes de profil apoptotique est suggérée par l’étude
de Olsson en 2007 qui indique qu’un fort niveau d’expression de Bfl-1 est corrélé à l’absence
de réponse clinique à la dernière thérapie subie (75).
31
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
De plus, le ratio Bcl-2/Bax, référence prédictive du potentiel à engager l’apoptose, détermine
la sensibilité des cellules de LLC-B in vitro mais ne corrèle pas avec la réponse clinique dans
la LLC-B (73, 76, 77). Néanmoins, un ratio Bcl-2/Bax important semble accompagner la
caractéristique chimio-réfractaire (78).
4.1.3
Les transporteurs ATP-Binding Cassette (ABC)
Les transporteurs ABC, qui permettent l’exclusion des drogues hors de la cellule, sont
des acteurs clés de la résistance aux thérapies anti-tumorales. Les cellules de LLC-B
expriment l’ARN messager codant pour les protéines ABCB1 (MDR1), ABCB4 (MDR3),
ABCA1 (MRP1) et BCRP2 (79-81). De plus, un pourcentage substantiel de cellules présente
une protéine ABCB1 (PgP, MDR1) active comme l’atteste l’efflux de la rhodamine 123, ce
pourcentage s’accentuant après un épisode thérapeutique. L’activité et l’expression d’ABCB1
et de MRP est inhérente à une sous-population de cellules LLC-B et cette population est
sélectionnée par des chimiothérapies contenant des substrats de ABCB1 (79, 82). Cette étude
est récemment confirmée par Svirnovski et al, qui démontre l’augmentation concertée de
l’activité et de l’expression d’ABCB1 dans les cellules de patients ayant été traitées avec des
combinaisons chimiothérapeutiques agressives (80). La corrélation entre niveau d’expression
des ABC transporteurs et expérience thérapeutique et/ou stade d’évolution de la maladie fait
cependant encore l’objet de débats (83, 84). Néanmoins, la LLC-B exprime de façon
importante ABCA1 (MRP1) et le niveau de cette expression semble corréler avec la
progression de la maladie (83, 85).
4.2
La chimiorésistance extrinsèque
La sensibilité des cellules de LLC-B cultivées ex vivo et exposées à différents agents
chimiothérapeutiques ne reflète pas la réponse clinique obtenue après thérapie. Deux
hypothèses peuvent être émises : (i) l’impact du microenvironnement dans l’acquisition d’un
potentiel chimiorésistant est crucial et (ii) la chimiothérapie in vitro ne s’adresse pas à la
population réservoir de la LLC-B qui permet de rétablir la population leucémique après
traitement in vivo. Quelque soit l’hypothèse considérée, ces deux explications potentielles
peuvent s’associer sous la notion de niches de chimiorésistance.
32
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Le rôle du microenvironnement dans la suppression de l’apoptose spontanée et
l’expression de protéines anti-apoptotiques a été abordé au paragraphe §3.3. De la même
façon, ces différents éléments du microenvironnement exercent un rôle protecteur de
l’apoptose pharmacologiquement induite via l’EM-DR confortant ainsi la thèse de niche de
chimiorésistance où des populations privilégiées au contact du microenvironnement sont
préservées de l’effet cytotoxique des drogues. Afin de reconstituer partiellement le
microenvironnement ganglionnaire spécifique de la LLC-B, il est possible de mimer le profil
apoptotique des cellules « élites » du ganglion en stimulant de façon chronique les cellules
sanguines de la LLC-B avec du CD40L. Ces cellules « lymph node-like » présentent un fort
potentiel chimiorésistant in vitro (86, 87) et un profil d’expression protéique similaire aux
cellules de LMC exprimant l’oncogène Bcr-Abl (88). Ces données expérimentales sont
confirmées par l’inhibition de la chimiorésistance induite par le CD40 en présence
d’inhibiteur de c-Abl (88).
4.3
La résistance spécifique aux traitements conventionnels de la LLC-B
La résistance aux traitements standards de la LLC-B, Fludarabine, Cyclophosphamide et
Rituximab, va être abordée dans ces paragraphes.
4.3.1
La chimiorésistance vis-à-vis de la Fludarabine
P53 apparaît comme un acteur clé du potentiel cytotoxique des analogues de purines
puisque les patients présentant une délétion p53 sont fortement réfractaires au traitement à la
Fludarabine. Cependant, des données expérimentales accumulées in vitro démontrent que des
voies p53 dépendantes et indépendantes sont impliquées dans l’action cytotoxique de cette
drogue. De plus, la surexpression de protéine anti-apoptotiques tels que Mcl-1 (73) et Bcl2
(89) corrèle avec une chimiorésistance vis-à-vis de la Fludarabine. Il existe également une
discordance importante entre la susceptibilité modeste des cellules in vitro et leur résistance
absolue in vivo, due probablement à la mise en jeu de facteurs microenvironnementaux ou au
ciblage préférentiel de populations leucémiques peu actives dans la pathogenèse (26). De fait,
l’action des analogues de purines sur les cellules en division est également un point important
à considérer étant donné l’importance du « pool » prolifératif, contenu au niveau des foyers de
prolifération, dans l’expansion du clone leucémique.
33
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Plusieurs facteurs environnementaux interviennent dans la résistance à la Fludarabine.
Le couplage CD40/CD40L, tels qu’il intervient au niveau des centres prolifératifs, permet de
résister à la mort induite par la Fludarabine dans un mécanisme dépendant de NFKB (90) et
potentiellement des surexpressions des protéines anti-apoptiques Bcl-xl et Mcl-1 (88). De
façon similaire, la surexpression de Bcl-xl, dépendante de l’engagement de α4β1 par adhésion
sur fibronectine, protège de l’action cytotoxique de la Fludarabine (91).
De façon plus spécifique au métabolisme du composé, la LLC-B exprime les protéines
hCNT2, hCNT3, hENT1 et hENT2 impliquées dans le transport des analogues de nucléosides.
Bien que le niveau d’expression de ces transporteurs est corrélé avec la sensibilité des cellules
de LLC-B à la Fludarabine in vitro (92), une surexpression de l’ARN messager de hCNT3
caractérise, de façon inattendue, les cellules de LLC-B résistantes à la Fludarabine (93). La
capacité de phosphorylation des analogues de purines, révélée par le ratio dCK : 5’NT,
détermine également le niveau de sensibilité des cellules de LLC-B à l’action des analogues
de purines (73, 94).
Low
expression of
transporters
Protection from
apoptosis by
microenvironment
components
Schéma 7 : Points de résistance des cellules de LLC-B à l’action des analogues de
nucléosides
34
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Modifié d’après Pettitt et al., British Journal of Haematology 121, 692-702 (2003)
4.3.2
La chimiorésistance vis-à-vis des agents alkylants
De façon générale, la résistance des cancers aux agents alkylants s’exerce à plusieurs
niveaux : (i) l’altération du transport de la drogue, (ii) les défauts de la cinétique de formation
des ponts de l’ADN, (iii) la présence d’enzymes inactivant les drogues (métallothionein,
aldehyde dehydrogenase (ALDH)), (iv) l’inhibition du processus d’apoptose et (v)
l’amplification des capacités de réparation de l’ADN.
Dans la LLC-B, l’implication des mécanismes d’entrée, de détoxification et d’inhibition
d’apoptose restent controversés dans la résistance aux agents alkylants ou reposent
uniquement sur des données corrélatives. Comme pour la Fludarabine, les délétions et
mutations de p53 confèrent une résistance primaire aux agents alkylants. Une efficacité accrue
de la réparation de l’ADN par le système NHEJ (Non-Homologous End Joinning), révélée par
une augmentation de l’activité de la DNA-PK (DNA dependant protein kinase), semble
contribuer au phénotype résistant des cellules de LLC-B (95).
Alkylating agents
ALDH
Schéma 8 : Résistance à l’action des agents alkylants
35
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Modifié d’après Panasci L et al., Clin Cancer Res 7, 454-461 (2001)
4.3.3
La résistance vis-à-vis du Rituximab
Outre les mécanismes de résistance au Rituximab qui vont impliquer le contrôle du
système immunitaire environnant (cf. chapitres §III 2.1.3, §III 2.2.1.3 et §III 2.2.2.5), la LLCB présente de façon innée et acquise des mécanismes de résistance au Rituximab faisant
intervenir principalement la modulation antigénique.
En premier lieu, les cellules de LLC-B expriment très peu de CD20 à leur surface et
limitent donc le nombre de sites de fixation du Rituximab. Cependant, l’impact du nombre de
molécules de CD20 sur l’action cytotoxique du Rituximab reste encore discuté (96).
L’existence et l’émergence post-thérapie d’un variant d’épissage alternatif du CD20,
présentant un défaut d’adressage à la membrane ont été récemment reportées. Bien que les
données montrent que ce variant soit très peu représenté dans les cellules de LLC-B, on note
une augmentation de son transcrit pour les cellules leucémiques issues du ganglion (97). La
LLC-B est une exception en termes de résistance au Rituximab puisqu’elle est la seule
hémopathie maligne capable sécréter du CD20 soluble dans le plasma (98). Cette sécrétion
implique la séquestration plasmatique du Rituximab, entraînant potentiellement une
diminution de son effet anti-leucémique. Ce dernier point reste discutable étant donné que les
doses administrées sont largement saturantes. Enfin, le « shaving » du CD20, observé pour les
cellules LLC-B et faisant intervenir la composante phagocytaire, conduit à la perte de CD20 à
la surface des cellules leucémiques. En effet, les monocytes, en interagissant avec la fraction
Fc du Rituximab, arrachent de la surface des cellules leucémiques le complexe
CD20/anticorps, laissant des cellules leucémiques invisibles au Rituximab (99).
En conclusion, l’étude des mécanismes de résistance de la LLC-B aux thérapies reste
indispensable à l’élaboration de traitements permettant l’éradication complète du clone
leucémique. En parallèle, l’élucidation de l’origine de la LLC-B, encore hypothétique,
cruciale dans la compréhension de la pathogenèse LLC-B, constitue invariablement la clé des
futurs succès thérapeutiques.
36
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
5. Hypothèses sur l’origine de la LLC-B (histoire naturelle de la maladie)
L’origine et la série d’évènements moléculaires et cellulaires qui conduisent au
développement de la LLC-B restent aujourd’hui énigmatiques. L’exploration de la biologie de
la LLC-B et de ces précurseurs putatifs, les connaissances à propos de son homologue B
normal ainsi que l’émergence de nouveaux modèles murins, permettent de proposer plusieurs
hypothèses sur les mécanismes de la pathogenèse LLC-B.
5.1
La stimulation antigénique
L’identification de similarités au niveau des structures du BCR (plus particulièrement
prononcées pour les cas Ig-NM), de différents patients LLC-B, supporte l’hypothèse d’un
antigène commun potentiellement impliqué dans la pathogenèse de la maladie. Ces
caractéristiques communes du récepteur impliquent la région CDR3, une chaîne légère
stéréotypique et un profil de mutation somatique similaire. Cette similarité structurelle ou
BCR stéréotypique, dont l’incidence concerne 20% des patients, est particulièrement
intrigante puisqu’elle engendre dans 1% des cas l’expression de BCR quasi-identiques, un fait
inter-individus extrêmement rare dont la probabilité de rencontre est quasi-improbable dans le
contexte d’une physiologie B normale (2, 100).
Cette thèse antigénique, associée à la différence de fonctionnalité du BCR entre formes
Ig-M et Ig-NM pourrait expliquer la valeur pronostique du statut mutationnel des Igs. En
effet, dans les formes Ig-NM, la persistance d’une stimulation antigénique de faible affinité
pourrait engendrer l’expansion du clone. Inversement, pour les formes Ig-M la stimulation
chronique de haute affinité aurait le potentiel de sélectionner un clone initialement répondeur,
mais qui au cours du temps à force de stimulations antigéniques deviendrait anergique (56).
Les LLC-B Ig-NM présentent, de façon fréquente, des BCR polyréactifs qui se lient à de
multiples antigènes incluant les auto-antigènes et des antigènes du non-soi. Il est possible que
les rencontres répétées d’un clone polyréactif avec son antigène microbien (infections
répétées) ou auto-antigène de prédilection entraînent une expansion anormale qui en présence
de mutations additionnelles conduisent à la conversion d’un lymphocyte B en cellule maligne
de LLC-B (2, 100).
37
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
De plus, l’importance de la stimulation antigénique et de la nature des antigènes en cause
dans la pathogenèse LLC-B est traduit par l’impact de certains sous-groupes de BCR
stéréotypiques, identifiés par la séquence CDR3, sur le pronostic (2). Plusieurs cas de BCR
stéréotypiques présentent des homologies de séquence HCDR3 avec des clones auto-réactifs
anti-DNA, anti-facteurs rhumatoïdes, et anti-cardiolipin. De même, des études plus
fonctionnelles ont démontré la liaison entre une Ig stéréotypique particulièrement représentée
dans la LLC-B et une large diversité d’auto-antigènes incluant l’IgG humaine, la myoglobine
et l’ADN double brins. Le rôle essentiel de l’absence de mutations somatiques dans ces
phénomène de poly/auto réactivité a récemment été démontré par mutagenèse dirigée sur des
cellules de LLC-B de type Ig-M (15, 56). Certains anticorps en revanche présentent une réelle
spécificité pour des agents infectieux tels que les polysaccharides de S. pneumoniae.
L’épisode d’une infection respiratoire, fréquemment sous forme de pneumonie, semble
précéder de façon statistiquement significative l’émergence d’une LLC-B. L’ensemble de ces
observations bien que spéculatives favorise la thèse d’une origine infectieuse (15).
Schéma 9 : Modèle de leucomogenèse LLC-B dépendante de la stimulation du BCR
D’après Chiorazzi et al., New England Journal of Medecine 352 (8), 804-815 (February
2005)
38
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
5.2
La cellule B à l’origine de la transformation leucémique
La LLC-B n’est pas un pur produit de cancérisations aberrantes et désordonnées
puisque l’on retrouve son homologue non-leucémique dans la différenciation normale B
(CD19+CD5+CD23+). La LLC-B correspond donc, sur des considérations purement
phénotypiques, au stade B mature activé qui représente dans l’hématopoïèse normale une
fraction très minoritaire des lymphocytes B.
Pour les LLC-B de type Ig-M, plusieurs hypothèses toujours en cours de débat sont
proposées. Les mutations somatiques ne se produisant qu’au niveau des centres germinatifs, il
était initialement proposé que les cellules de LLC-B de type Ig-M correspondaient à des
cellules ayant été soumises à une expérience antigénique au niveau des centres germinatifs.
En conséquence, les cellules de LLC-B de type Ig-M serait issues des cellules B mémoires
post-GC n’ayant pas effectué la commutation isotypique des Igs (2). Cependant, bien que
l’implication du centre germinatif dans le phénomène de mutations somatiques soit
actuellement controversée, les profils phénotypiques et transcriptomiques, la présence de
mutations au niveau de Bcl-6 (trait génétique du passage aux centres germinatifs) confortent
l’hypothèse que les LLC-B de type Ig-M pourraient provenir de la transformation leucémique
de cellules B mémoires IgM+IgD+CD27+ (2, 101).
De la même façon, le profil d’expression génique des LLC-B de type Ig-NM comporte
plus de similarité avec les cellules B mémoires post-GC que les cellules naïves CD5+. Cette
thèse est confortée par la récente démonstration que le passage au niveau des centres
germinatifs a la capacité de produire des cellules B mémoires ne présentant pas de mutations
somatiques. De même, leur phénotype de cellules activées (plus accentué que pour les Ig-M)
supporte l’hypothèse d’une expérience antigénique (2).
Toujours concernant l’origine des cellules LLC-B de type Ig-NM, une deuxième thèse,
décrivant une histoire biologique indépendante des centres germinatifs, reste cependant
plausible. Cette hypothèse est confortée par l’auto-réactivité des cellules de LLC-B de type
Ig-NM qui associe ces cellules à des lymphocytes B résidants dans la zone marginale. En
effet, la poly/auto réactivité des anticorps produits par les cellules de LLC-B de type Ig-NM
l’apparente orthologiquement à la lignée murine B1. Ces cellules B murines présentent le
marqueur CD5 à leur surface, une Ig non-mutée et un fort potentiel de transformation.
39
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
L’expansion permanente de cette lignée chez la souris est assurée par une stimulation autoantigénique chronique. Aucun équivalent de ces cellules B1 n’est retrouvé chez l’homme.
Cependant, les cellules humaines de la zone marginale tendent à récapituler certaines de leurs
propriétés sous stimulation. Ces cellules, résultant d’une activation T indépendante, cette piste
murine conforte l’hypothèse d’une rencontre antigénique indépendante du passage au sein des
centres germinatifs (2, 15).
Schéma 10 : Schéma récapitulatif des différentes hypothèses concernant l’origine cellulaire de
la LLC-B
D’après Zenz et al., Nature Review of Cancer 10 (1), 37-50, (February 2010)
40
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Schéma 11 : Voies de signalisation cellulaire de la maturation B
D’après Chiorazzi et al., New England Journal of Medecine 352 (8), 804-815 (February
2005)
5.3
La lymphocytose monoclonale : MBL
La MBL ou lymphocytose B monoclonale est une population B clonale présentant un
profil immunophénotypique similaire à la LLC-B. Elle est détectée dans 3,5% de la
population saine. Son occurrence augmente avec l’âge (suggérant l’existence de stimulations
chroniques persistantes durant la vie d’un individu), le sexe masculin et chez les sujets sains
apparentés à des cas de LLC-B dites « familiale ». Cette dernière observation soulève
l’origine d’une prédisposition génétique dans l’expansion clonale de cette population
précurseur de la LLC-B (56).
Récemment, dans des études de grande envergure, il a été démontré que cette population
précède tous les cas de LLC-B (102, 103). Cette donnée corrélative est étayée par la détection
de la del13q14 dans cette population MBL, indiquant l’initiation d’acquisition de lésion
génétique par le clone au stade non-leucémique (102). De façon similaire, les modèles murins
délétés pour cette région chromosomique présentent une incidence non-négligeable de MBL
en parallèle de développements majeurs de LLC-B (20).
41
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
En association avec la thèse du BCR, l’expansion « antigène-dépendante » d’une
population B normale, visible dans les individus sains, pourrait correspondre à la MBL.
L’analyse du répertoire des Igs de cette population indique cependant qu’uniquement 4% de
individus sains présentant une MBL ont une séquence HCDR3 stéréotypée spécifique de la
LLC-B (104). La stéréotypie du BCR est une caractéristique majeure du statut Ig-NM. Or, les
cellules de la population MBL présentent une Ig majoritairement mutée. En conséquence,
cette population pourrait représenter le précurseur pré-leucémique des formes Ig-M de la
LLC-B (104).
L’incidence de la MBL est 100 fois supérieure à celle de la LLC-B (2). Il résulte de cette
constatation simple que seule une fraction des individus présentant une MBL développe une
LLC-B. De ce fait, la MBL pourrait représenter potentiellement une première étape d’un
processus composé d’évènements multiples de leucémogenèse.
5.4
L’apport des modèles animaux
5.4.1
La difficulté à obtenir un modèle de xénogreffe
Longtemps imputée à l’absence de cellules initiatrices de LLC-B, la difficulté à obtenir un
modèle relevant de xénogreffe de LLC-B, en modèles murins immunodéficients, souligne la
complexité de la leucémogenèse LLC-B et l’importance du microenvironnement immunitaire
dans cette pathologie (105, 106). Le premier (et seul) modèle convainquant publié de
xénogreffe de cellules de patients LLC-B date de 2007. Dans ce rapport, l’efficacité de la
greffe effectuée dans des souris NOD/SCID s’avère être dépendante du stade d’évolution de
la maladie. Cependant, ces cellules présentent une invasion préférentielle de la rate et de la
cavité du péritoine avec une infiltration des sites physiologiques de la LLC-B (moelle
osseuse, sang périphérique et ganglions) relativement rare (107).
Plus récemment, la reconstitution d’un microenvironnement hématopoïétique, par
injection intra-os chez la souris NOD/SCID/γcnull de cellules CD34+ de cordon, de cellules
souches mésenchymateuses (CSM) et de PBMC de patients LLC-B, a permit d’établir un
modèle de xénogreffe proche de la physiopathologie humaine. Cependant, ces travaux n’ont
pas été validés par publication (47).
42
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
5.4.2
Le modèle Eμ-TCL1
Le modèle transgénique Eμ-TCL1 (T-cell Leukemia 1) a longtemps été le modèle murin
de référence de la LLC-B. Ce modèle repose sur la surexpression de TCL1 dans la lignée B
sous la dépendance de la région régulatrice « enhancer » des Igs. TCL1 est un régulateur de la
voie oncogénique PI3K/AKT et sa surexpression par les cellules de LLC-B reflète un
pronostic péjoratif. Ces souris transgéniques Eμ-TCL1 présentent, avec un degré âgedépendant, une expansion et une infiltration progressive de lymphocyte B CD5+IgM+ au
niveau du péritoine, puis de la rate, suivie de la moelle osseuse pour finir avec une maladie
symptomatique
et
agressive
caractérisée
par
la
présence
d’adénopathies
et
de
spléno/hépathomégalies à l’âge de 20 mois. La pertinence du modèle réside dans l’analogie
qu’il présente au niveau de la nature de l’Ig de surface avec les LLC-B de mauvais pronostic.
De fait, les Igs de ces cellules leucémiques murines sont majoritairement non-mutées et
stéréotypées (108).
5.4.3
Les souris NZB
Les souris New Zealand Black, exemptes de toutes modifications transgéniques et
initialement modèles d’étude de l’auto-immunité, présentent un développement spontané et
tardif de LLC-B. Favorisant la thèse de l’auto-immunité initiatrice de LLC-B, ce modèle
présente dans un premier temps une hyperprolifération de lymphocytes B (B1) produisant des
auto-anticorps dirigés contre l’ADN et des protéines érythrocytaire. Vers l’âge de 9 à 12 mois,
cette hyperprolifération progresse ensuite inexorablement vers l’apparition d’une LLC-B
(109).
5.4.4
Les modèles MDR-/- et miR-15a/16-1-/-
La délétion 13q14 est l’aberration chromosomique la plus représentée dans la LLC-B.
L’étude cette région chromosomique a permis de définir la région minimale délétée (MDR) et
d’identifier plusieurs gènes codés par cette région : les deux microARNs miR-15a et miR16-1
et DLEU2 (Deleted in Lymphocytic Leukemia 2), un transcrit stérile.
43
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
Très récemment, des nouveaux modèles murins délétés au niveau de cette MDR ou plus
spécifiquement au niveau des deux microARNs ont été établis. Ces deux modèles, avec une
incidence plus prononcée pour les MDR-/-, récapitulent tous les spectres phénotypiques et
pathologiques (MBL, SLL (Small Lymphocytic Lymphoma), syndrome de Richter, BCR
stéréotypé) associés à la LLC-B, avec un développement prédominant et tardif de LLC-B.
L’analyse fonctionnelle des deux miRs indique leur implication majeure dans l’accélération
de la transition G1/S du cycle cellulaire. En parfaite adéquation avec la nouvelle vision de la
LLC-B, cette étude met en exergue la prolifération dans les mécanismes de pathogenèse LLCB (20).
5.5
La théorie de la cellule souche hématopoïétique anormale
L’implication de la cellule souche hématopoïétique ou de progéniteurs immatures dans la
pathogenèse LLC-B, de façon analogique au modèle de leucémogenèse de la LAM, reste
obscure à l’heure actuelle. L’engouement premier pour cette théorie date de 1997 avec la
détection de trisomie 12 et de délétion 13q14 dans la fraction CD34+ de patient LLC-B
présentant ces aberrations chromosomiques (110). Néanmoins, ces données furent rapidement
controversée en 1999 par la même équipe (111). Depuis, cette théorie de hiérarchisation du
clone leucémique est très rarement étayée dans la littérature et les études qui en font l’objet
restent peu pertinentes ou trop préliminaires (112, 113).
En conclusion, l’origine cellulaire de la LLC-B reste hypothétique aujourd’hui malgré les
différentes thèses qui supportent la carcinogenèse de la cellule B-mémoire et la stimulation
antigénique comme centraux dans ses processus de pathogenèse.
44
INTRODUCTION : La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
CONCLUSION
La complexité de la biologie de la LLC-B, due à sa dépendance au microenvironnement,
n’a pas permis de mettre en évidence une hétérogénéité du pouvoir initiateur au sein des
cellules leucémiques. Cependant, l’évolution clinique des patients, qui se traduit par la rechute
inévitable après thérapie, suggère l’existence d’une hiérarchie au sein du clone leucémique,
avec potentiellement à sa tête un compartiment initiateur de LLC-B comprenant les cellules
souches leucémiques multi-résistantes. Cette hiérarchie potentielle est également suggérée par
l’hétérogénéité cellulaire des capacités de prolifération et de migration qui apparaissent
confinées à une population leucémique « privilégiée ».
45
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
II.
Cellules Side Population initiatrices de tumeurs et
déterminatrices de la chimiorésistance
1. Cellules souches normales
Le renouvellement cellulaire permanent des tissus (l’homéostasie tissulaire), qui perdure
tout au long de l’existence d’un individu, est assuré par différentes populations de cellules
souches pluripotentes et unipotentes capables de régénérer un tissu spécialisé. Ce dogme
appliqué à l’ensemble de l’organisme, par extrapolation des connaissances acquises sur
l’embryogenèse, reste cependant uniquement confirmé pour un certain nombre de tissus pour
lesquels une population de cellules souches a été formellement identifiée (tissus
hématopoïétique, mammaire, cerveau, intestin, peau, gonades…).
1.1
Propriétés fondamentales des cellules souches
Les cellules souches sont définies de manière fonctionnelle par la division asymétrique.
Cette compétence unique leur confère deux caractéristiques majeures : l’auto-renouvellement
(division à l’identique assurant la pérennité du « pool » souche) et la capacité de
différenciation (génération de cellules matures d’un tissu donné).
La valeur physiologique de ces cellules pour l’organisme entier, conférée par leur
potentiel unique, implique une rareté de ces cellules, un état de quiescence, une régulation
complexe des décisions d’auto-renouvellement et de différenciation, et une protection
puissante contre les agents mutagènes et cytotoxiques (114). Ces propriétés fondamentales
sont assurées en grande partie par l’activation de voies de signalisation morphogènes telles
que les voies Wnt/β-caténine, Sonic Hedgehog et Notch.
46
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 12 : Différentes voies de destinée des cellules souches
D’après Blank et al., Blood 111 (2), 492-503 (January 2008)
1.2
Identification des cellules souches
L’identification univoque des cellules souches repose majoritairement sur la présence de
marqueurs immunophénotypiques d’immaturité tels que le CD34, c-kit et FLT3 et l’absence
d’antigène de maturité, normalement présent sur les cellules différenciées et spécialisées. De
même, l’émergence de marqueurs dit fonctionnels (Hoechst négatif, ALDH positif) permet,
sur la base d’activités enzymatiques impliquées dans la « souchitude » ou « stemness »,
d’affiner la définition phénotypique des populations de cellules souches, en conjonction avec
la détection d’un immunophénotype immature. Ce n’est cependant que par validation in vivo
par transplantation sérielle chez des animaux modèles, conformément à la propriété unique de
division asymétrique des cellules souches, que l’identification formelle de ces cellules peut
être validée (115-117).
47
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
1.3
Mécanismes moléculaires du maintien de la « stemness » : BMI-1
La faculté de division asymétrique garantit à la fois un profil d’expression génique
maintenant l’état de pluripotence et une flexibilité génomique permettant l’engagement dans
diverses voies de différenciation, en conjonction avec la disparition de la capacité d’autorenouvellement. La régulation intrinsèque de cette double contrainte est majoritairement
exercée par des mécanismes épigénétiques. Parmi les différents acteurs de la régulation
épigénétique, les protéines de la famille polycomb (PcG) sont fortement impliquées dans la
régulation de cette « mémoire cellulaire ». Les protéines de la famille PcG s’assemblent pour
former les complexes « polycomb repressor complex » (ou PRC), PRC1 et PRC2. Ces
complexes se lient à leurs cibles chromatiniennes, au niveau de l’histone H3 marquée
spécifiquement par des triméthylations des résidus lysine 27 et 9, et répriment la transcription
de gènes cibles en inhibant le processus de remodelage de la chromatine dépendant de
SWI/SNF (SWItch/Sucrose Non-Fermenting) et la machinerie de transcription. La protéine
BMI-1, composante du complexe PCR1, initialement identifiée comme un oncogène
coopérant avec c-myc dans le développement de lymphomes B et T, est certainement la plus
étudiée dans le contexte de maintenance de la pluripotence. Ses gènes cibles comprennent
p16INK4a et p19/p14ARF, deux gènes répresseurs de la phase S et suppresseurs de tumeur (118).
BMI-1 apparaît être un déterminant essentiel du potentiel prolifératif des cellules souches et
progénitrices hématopoïétiques (119). L’invalidation de BMI-1 en modèle murin indique une
implication de celle-ci dans l’auto-renouvellement des cellules souches neurales (120).
Récemment l’invalidation des gènes cibles de BMI-1 (p16INK4a, p19ARF et Trp53) a démontré
l’acquisition, par les progéniteurs multipotents, d’une capacité de reconstitution à long terme
de l’hématopoïèse (121).
Schéma 13 : Voie de signalisation induite par BMI-1
D’après Pardal et al., Nature Reviews Cancer 3 (12), 895-902 (December 2003)
48
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
2. Cellules initiatrices de tumeurs
Les connaissances acquises sur l’immense potentiel régénératif des cellules souches et
l’inhérente hétérogénéité des cellules tumorales ont fait émerger une nouvelle ère de la vision
des tumeurs avec la théorie des cellules initiatrices de tumeurs ou cellules souches tumorales.
L’initiation de cette nouvelle réflexion de la tumorigenèse s’est faite avec les travaux
pionniers de John Dick et Dominique Bonnet en 1997 démontrant l’existence d’une
organisation hiérarchique de la LAM. Dans ces travaux, l’expansion leucémique a pour
origine cellulaire une cellule souche hématopoïétique et leucémique contenant les lésions
génétiques originelles du clone leucémique (122). Depuis, de nombreuses données
expérimentales publiées indiquent que ce modèle de hiérarchisation du clone tumoral existe
dans de nombreuses tumeurs hématologiques et solides (cancer du sein, gliome, LMC….). Ce
modèle stipule que l’initiation et la propagation tumorale sont alimentées par une population
« réservoir » de cellules cancéreuses pourvues des propriétés fondamentales des cellules
souches (différenciation et auto-renouvellement) (123, 124).
Schéma 14 : Modèle de leucémogenèse proposé par Bonnet D et Dick J en 1997
D’après Bonnet D et Dick J, Nature Medecine 3 (7), 730-737 (July 1997)
49
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
2.1
Identification des cellules initiatrices de tumeurs
Par analogie à leur homologue normal, l’identification de cellules souches tumorales
repose sur la sélection de populations définies par leur statut primitif (immunophénotype
immature, exclusion du Hoechst, présence de l’ALDH, chimiorésistance…) combinée à la
régénération de l’hétérogénéité de la tumeur primaire (différenciation) en modèle murin
xénogreffé de façon sérielle (auto-renouvellement). Cette dernière méthode de criblage unique
du potentiel initiateur de tumeur comporte un certain nombre de limitations et engendre un
débat dans la communauté scientifique.
2.1.1
Limitations du modèle murin dans la recherche de cellules initiatrices de tumeurs
Les limitations associées à l’utilisation des modèles murins incluent la différence de
microenvironnement humain/murin (compatibilités cytokiniques et interactions cellulaires), le
statut du microenvironnement (tumoral humain vs vierge et sain murin), l’absence de cellules
immunitaires dans les modèles immunodéficients et la pertinence du site d’injection. Bien
qu’ils ne récapitulent qu’en partie les mécanismes de tumorigenèse humaine et que des
différences fondamentales entre niches tumorales murines et humaines persistent, les modèles
murins syngéniques et transgéniques mimant l’apparition et la progression de certains cancers
offrent une option alternative au modèle de xénogreffe.
2.1.2
Controverses d’initiation tumorale apportées par les modèles animaux
En plus de ces barrières inhérentes aux modèles murins d’oncogenèse humaine, la
controverse récente de cette méthode d’identification des cellules initiatrices de tumeurs
indique que le potentiel initiateur de tumeur pourrait être contenu dans un pourcentage
substantiel de cellules tumorales (mélanome : 1 cellule/4 et modèle de lymphomes et
leucémies : 1 cellule/10) (125, 126). De ce fait, l’initiation tumorale ne serait pas comme le
stipule le dogme initial, dictée uniquement par la biologie des cellules souches et restreinte à
une population élite. Les modèles d’études disponibles actuellement semblent entraîner une
sous-estimation de la fréquence de ces cellules initiatrices de tumeurs, pour le cas de certains
types de cancers ou de cancers homogènes (125, 126).
50
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Contrairement aux cellules souches normales, il est cependant globalement établi dans la
littérature que la rareté des cellules souches tumorales est très variable selon le grade tumoral,
le pronostic initial, l’expérience passée d’une chimiothérapie et la présence de métastases
(127).
2.2
Théories d’initiation tumorale
Outre la théorie n’impliquant pas de hiérarchisation dans le schéma d’oncogenèse (pour
les tumeurs homogènes ou équipotentes), plusieurs modèles d’initiation tumorale
hiérarchiques peuvent être proposés. Le premier, de façon analogique aux travaux conduit sur
la LAM, la LMC et la « stemness » physiologique, stipule que la cellule souche normale du
tissu considéré est le siège de la transformation oncogénique et génère par différenciation une
progénie cancéreuse (124).
Le second modèle implique l’acquisition (pré- ou post-tumorale) de propriétés
fonctionnelles d’auto-renouvellement et de différenciation par des compartiments cellulaires
progéniteurs ou matures. L’hypothèse de dédifférenciation fonctionnelle des cellules
progénitrices est corroborée par les travaux de l’équipe de Clarke qui, certes dans un contexte
physiologique normal, indiquent que les délétions des gènes cibles de BMI-1 entraînent
l’acquisition d’une capacité de régénération de l’hématopoïèse à long terme. Dans un contexte
cancéreux, les produits de fusion MOZ-TIF2, MLL-AF9 et MLL-ENL confèrent des
propriétés de cellules souches aux cellules progénitrices, les convertissant ainsi en cellules
initiatrices de tumeur (123).
A partir de modèles cellulaires matures, des études récentes indiquent l’induction d’une
reprogrammation cellulaire vers la pluripotence au travers de l’expression de c-myc, Nanog,
Oct4 et Sox2 par des cellules fibroblastes matures. Ces travaux laissent entrevoir l’existence
de phénomènes de reprogrammation similaires au niveau des cellules matures dans le cancer
(128). De plus, certains mécanismes moléculaires propres à la carcinogenèse apparaissent
promoteurs et/ou supports du statut souche. Des études démontrent qu’à une induction de la
transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est couplée une acquisition de propriétés de
« stemness » (129), liant l’apparition de métastases aux cellules souches cancéreuses (130).
De façon similaire, l’hypoxie semble promouvoir et maintenir un phénotype de cellules
souches cancéreuses (131).
51
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 15 : Modèles d’initiation tumorale et parallèle avec la biologie des cellules
souches normales
D’après Pardal et al., Nature Reviews Cancer 3 (12), 895-902 (December 2003)
Quelque soit le modèle considéré, la part fondamentale que jouent ces populations
immatures dans l’initiation du cancer (« cell of origin ») et/ou dans la maintenance de la
progression tumorale reste encore obscure.
52
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
2.3
Implication de BMI-1 dans les cellules initiatrices de tumeurs
Tout comme une majorité des cellules cancéreuses et des cellules souches normales, les
cellules souches cancéreuses utilisent les voies de signalisation morphogènes (Sonic
Hedgehog, Wnt β-caténine, Notch….). De même, BMI-1, garant de la pluripotence et
médiateur de la signalisation Sonic Hedgehog dans les cellules cancéreuses, joue un rôle
essentiel dans la biologie des cellules souches cancéreuses. Son implication est majeure dans
la prolifération et l’auto-renouvellement des cellules souches cancéreuses du sein (132) et de
certaines leucémies (LAM et LMC) (119, 133). De plus, la signalisation dépendante de BMI1 apparaît comme la signature moléculaire de l’agressivité, de la présence de métastases et
prédit un pronostic péjoratif pour divers types de cancers (134).
Schéma 16 : L’expression des protéines de la famille Polycomb group (PcG) est
déterminante dans l’identité souche et l’émergence de tumeurs
D’après Sauvageau M et Sauvageau G, Plos Biology 6 (4), e113 (April 2008)
53
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 17 : Voie de signalisation de BMI-1 dans des contextes souches normaux et
tumoraux
D’après Liu et al, Cancer research 66 (12), 6063-71 (June 2006)
2.4
Implications thérapeutiques du concept des cellules initiatrices de cancers
La vision hiérarchisée du cancer a introduit également un nouveau niveau de réflexion
dans la thérapeutique du cancer, où la réémergence de la maladie peut-être imputée à l’activité
régénératrice de cellules initiatrices de cancer. Il apparaît clairement que la plupart des
traitements ciblent efficacement les populations matures du cancer et n’affectent pas ou peu le
compartiment initiateur. En effet, la résistance aux traitements de ces cellules initiatrices de
tumeurs, conférée par leur relative quiescence, la surexpression des transporteurs ATP et de
molécules anti-apoptotiques, leur résistance au stress oxidatif et aux dommages à l’ADN, et
leur efficacité de réparation de l’ADN, dicte le besoin d’élaborer de nouvelles stratégies
thérapeutiques permettant d’éradiquer ces cellules.
54
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 18 : Implications thérapeutiques des cellules souches cancéreuses
D’après Pardal et al., Nature Reviews Cancer 3 (12), 895-902 (December 2003)
Point de convergence entre chimiorésistance et « stemness », les transporteurs ABC jouent
un rôle essentiel dans la biologie des cellules tumorales et des cellules souches.
3. Les transporteurs ABC
La famille des transporteurs ATP Binding Cassette (ABC) compte 49 membres divisés en
sept sous-classes identifiées par les lettres A à G. Ces protéines sont structurellement
composées de deux segments hydrophobiques transmembranaires, qui confèrent la spécificité
de l’efflux, et de domaine de liaison à l’ATP ou nucléotide « binding folds » (NBF), dont la
séquence en acides aminés détermine l’appartenance aux sous-classes préalablement citées.
Ces protéines effluent, hors de l’espace intracellulaire, un large spectre de molécules
endogènes et exogènes dans un processus « énergie-dépendant » impliquant la liaison et
l’hydrolyse de l’ATP. De façon non-exhaustive, ces substrats incluent des agents
chimiothérapeutiques, des ions métalliques, des peptides, des acides aminés, des hydrates de
carbone, des métabolites et des composés hydrophobiques. Les transporteurs ABC présentent
un spectre d’expression tissulaire varié qui prédomine dans les organes excréteurs tels que le
foie, les intestins, la barrière sang/cerveau, la barrière sang/testicule, le placenta et les reins.
55
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Le rôle majeur de ces protéines réside dans la protection tissulaire en excrétant des
composés toxiques, métabolites endogènes et xénobiotiques. L’exploration des fonctions des
transporteurs ABC dans des contextes normaux ou cancéreux démontrent l’implication de
certains membres de cette famille dans la maintenance de l’immaturité des cellules souches et,
de façon potentiellement liée, dans la chimiorésistance de certains cancers. Les exemples les
plus documentés dans la littérature sont les protéines ABCG2 et ABCB1 (42, 135).
Schéma 19 : Illustration de l’activité d’efflux des transporteurs ABC
D’après Fletcher et al., Nature Reviews Cancer 10 (2), 147-156 (February 2010)
3.1
ABCB1
ABCB1, également connue sous la dénomination de P-glycoprotéine (P-gp) ou Multi-drug
résistance 1 (MDR1), a été identifiée sur la base de sa capacité à conférer aux cellules
cancéreuses qui l’expriment un phénotype résistant aux drogues.
ABCB1 est exprimée dans les cellules du foie, de l’intestin, de l’endothélium, du
pancréas, du placenta, et les cellules hématopoïétiques (cellules immatures CD34+ckit+,
cellules NK et CD8+).
56
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Les fonctions physiologiques qui lui sont associées dans ces différents tissus relèvent de la
protection tissulaire et de fonctions indépendantes de l’activité d’efflux, qui restent encore peu
explorées dans la littérature. Les souris « knock-out » pour les gènes mdr1 a et b présentent
des dysfonctionnements des systèmes gastrointestinal et rénal et des susceptibilités
augmentées à l’action cytotoxique de certaines drogues. Les substrats de ABCB1 sont de
nature cationique ou amphiphatique et souvent hydrophobique, et comprennent des agents
chimiothérapeutiques (anthracyclines, vinca alkaloides, taxanes et étoposides), des drogues
immunosuppressives, des inhibiteurs des protéases (spécifiques du HIV) et certains
antibiotiques (42).
Le rôle essentiel d’ABCB1 dans la chimiorésistance innée ou acquise des cancers est de
loin la fonction d’ABCB1 la plus étudiée, en particulier dans la LAM et les tumeurs solides
(42, 135). Cependant, en relation avec les « hallmarks » du cancer, il semblerait que cette
protéine soit impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires destinées à supporter la
progression tumorale (136). ABCB1 est impliquée dans la résistance à l’apoptose induite par
les agents chimiothérapeutiques, les irradiations UV, l’engagement de Fas ou de TNFα. Cette
résistance à l’apoptose est dépendante de l’inhibition de l’activation de la caspase 3 et/ou de
l’altération du métabolisme du céramide (42, 137). De plus, l’inhibition pharmacologique, la
répression de l’expression de l’ARN messager et des expériences de surexpression de ABCB1
s’accordent à confirmer le rôle de ce transporteur dans la résistance à l’apoptose et la
prolifération. De façon similaire, les lignées cancéreuses délétées pour ABCB1 présentent une
altération de leur phénotype migratoire et invasif (136). En conséquence, il apparaît que
l’expression d’ABCB1 apporte une valeur pronostique indicatrice du niveau d’invasion, de la
présence de métastases ganglionnaires, et de l’agressivité de nombreux cancers solides (136).
L’implication d’ABCB1 dans la biologie des cellules souches hématopoïétiques est
suggérée par sa surexpression dans ces cellules. Probablement majoritairement en charge de la
protection de ce « pool » de cellules contre les xénobiotiques naturels, la surexpression
ectopique d’ABCB1 par les cellules de la moelle osseuse engendre une accélération de la
différenciation en parallèle d’apparitions de désordres myéloprolifératifs (138).
57
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 20 : Structure topologique putative d’ABCB1
D’après Zhang, Cell Research 17 (4), 311-323 (April 2007)
Légende :
TMD1 : Transmembrane domaine
NBD : Nucleotide binding domain
3.2
ABCG2
ABCG2, également appelée Breast Cancer Resistance Protein 1 (BCRP1) a été découverte
sur la lignée de cancer du sein MCF7 sélectionnée par la doxorubicine en présence de
vérapamil. Elle représente ainsi le déterminant moléculaire d’une chimiorésistance
indépendante de la fonction d’ABCB1. La protéine ABCG2 est un demi-transporteur pourvu
d’un unique NBF dont l’homodimérisation semble essentielle pour assurer sa fonction de
transporteur (139). Le spectre d’expression tissulaire d’ABCG2 comprend le placenta, le
cerveau, les reins, l’intestin, le foie, les testicules, les ovaires, les cellules souches
hématopoïétiques, les cellules NK et les précurseurs érythroïdes (116, 140). Le rôle
physiologique d’ABCG2 dans ces organes relève surtout de la protection des tissus contre les
composés toxiques exogènes ou endogènes (135).
58
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
ABCG2 compte une pléiade de substrats qui incluent non-exhaustivement des agents
chimiothérapeutiques (Mitoxanthrone, Topetocan, Imatinib, Flavopiridol, Anthracycline,
Fludarabine….), des molécules antivirales, des inhibiteurs de la HMG-CoA reductase, des
molécules carcinogènes ainsi que des antibiotiques (135, 141). L’expression d’ABCG2 est
finement régulée au niveau transcriptionnel notamment par certaines hormones sexuelles
(progestérone et oestrogène) et par l’hypoxie. Une régulation épigénétique négative de
l’expression d’ABCG2 intervient également par méthylation des îlots CpG des régions
promotrices du gène abcg2 (135).
Il est clairement démontré qu’ABCG2 exerce un rôle protecteur des cellules souches
hématopoïétiques contre l’action cytotoxique/mutagène d’agents chimiothérapeutiques (142).
Les cellules souches hématopoiëtiques surexpriment ABCG2 et l’engagement dans la
différenciation est caractérisé par une répression de l’expression d’ABCG2, à l’exception du
cas des progéniteurs érythrocytaires. Cette expression préférentielle d’ABCG2 dans le
compartiment primitif de l’hématopoïèse indique un rôle potentiel d’ABCG2 dans le maintien
de l’état indifférencié des cellules souches hématopoïétiques (139). En effet, un blocage de la
maturation est observé lorsque des cellules médullaires surexprimant ABCG2 sont
transplantées chez la souris irradiée léthalement, indiquant potentiellement l’efflux de
molécules différenciantes par ABCG2 (140). Cette hypothèse est en partie corroborée par
l’étude démontrant le rôle essentiel d’ABCG2 dans la survie de cellules progénitrices en
milieu hypoxique (143). En effet, les cellules souches hématopoïétiques sont contenues dans
des niches spécialisées et le microenvironnement hypoxique qui caractérise ces sites semble
être essentiel au maintien de la pluripotence de ces cellules (144). Il est possible qu’in vivo
l’expression d’ABCG2 confère une aptitude à survivre en milieu hypoxique et, de fait, soit le
garant du statut de « stemness ». Cependant, l’expérience des souris délétées pour le gène
abcg2 montrent une absence de répercussion sur le nombre de cellules souches et sur la
physiologie de l’hématopoïèse, remettant ainsi en question le rôle d’ABCG2 dans le maintien
de l’état indifférencié des cellules souches (136).
Dans les cancers, le rôle d’ABCG2 dans la chimiorésistance des LAM est clairement
établi. De plus, certaines études démontrent que l’expression d’ABCG2 pourrait servir de
facteur pronostique. L’étude de l’expression d’ABCG2 au sein d’un panel contenant 150
tumeurs non-traitées démontre une positivité pour les carcinomes du tube digestif (colon,
œsophage et estomac) (135).
59
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
De la même façon, pour le cancer du poumon non à petites cellules, l’expression d’ABCG2
est prédictive de la réponse à la thérapie et indique un pronostic péjoratif (136).
Schéma 21 : Structure topologique putative d’ABCG2
D’après Zhang, Cell Research 17 (4), 311-323 (April 2007)
Légende :
TMD1 : Transmembrane domaine
NBD : Nucleotide binding domain
3.3
Autres transporteurs impliqués dans le cancer
D’autres transporteurs sont impliqués dans la maintenance et la progression tumorale.
ABCC1 (MRP1) est impliquée dans la chimiorésistance des tumeurs en effluant des agents
cytotoxiques tels que les Anthracyclines, les Vinca alkaloïds, la Mitoxantrone et l’Etoposide.
ABCC1 est associée à un pronostic péjoratif dans certains cancers, tels que les carcinomes
hépatocellulaires, le cancer du sein et les neuroblastomes, où son expression corrèle au degré
de différenciation, à la masse tumorale et au niveau d’invasion (uniquement pour les
carcinomes hépatocellulaires) (136). De façon similaire à ABCB1, ABCC1 est impliquée dans
la survie, la prolifération et la migration des neuroblastomes. Il apparaît également que son
expression est particulièrement élevée dans les métastases issues de carcinomes mammaires et
de mélanomes (136).
60
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Dans la biologie normale, si ABCC1 est impliquée dans la maintenance de l’état indifférencié
de certaines cellules hématopoïétiques matures, néanmoins son rôle dans le maintien des
cellules souches reste peu étudié (138).
Plus ponctuellement dans la littérature, l’expression d’autres membres de la large famille
des transporteurs ABC, tels que ABCA3 et ABCB5, est associée à la tumorigenèse.
L’expression d’ABCA3 corrèle avec le stade d’évolution du cancer pancréatique (136) et
ABCB5 marque spécifiquement les cellules initiatrices de mélanomes récemment décrites
(145).
En fonction du tissu ou de la pathologie considérée, la définition immunophénotypique du
compartiment de cellules souches est très variable et fait fréquemment l’objet de débats.
Option alternative ou complémentaire à cette technique traditionnelle d’isolation des
compartiments souches, la technique des Side Population (SP), basée sur l’activité des
transporteurs ABC, offre une universalité d’usage ainsi que la possibilité d’étudier une
population immature en l’absence de marqueurs de surface validés.
4. Side Population (SP)
Le Hoechst 33342 est un colorant vital qui se lie aux régions riches en liaisons AT au
niveau des petits sillons de l’ADN. L’intensité de la fluorescence émise reflète la quantité
d’ADN, la structure de la chromatine, et permet de déterminer les phases du cycle cellulaire
(137). C’est cependant son statut de substrat des transporteurs de la famille des ATP-binding
cassettes (ABC) qui fait du Hoechst 33342 un marqueur de « stemness » et la base de la
technique d’isolation des SP décrite par Margaret Goodell en 1996. Dans cet article princeps
(146), c’est à l’occasion d’une analyse du cycle cellulaire de cellules médullaires murines que
les auteurs ont découvert que l’émission simultanée du Hoechst 33342 à deux longueurs
d’onde (rouge 675 nm et bleu 450 nm) permettait d’isoler distinctement une sous-population
très minoritaire Hoechst négative, localisée sur le côté de la population majoritaire Hoechst
positive (d’où le terme side). Cette population, très mineure, présentait un phénotype
immature (Sca1+, Lin-) et un potentiel de régénération de l’hématopoïèse à long terme chez la
souris irradiée.
61
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 22 : Side Population (SP) médullaire murine Lin-Sca-1+ identifiée pour la
première fois en 1996
D’après l’article princeps Goodell et al., Journal of Experimental Medecine 183 (4),
1797-1806 (1996)
4.1
La SP représente une fraction enrichie en cellules souches
Quatorze ans plus tard, l’abondante littérature disponible sous le mot clé SP atteste de la
validité de cette méthode d’isolation ou du moins de l’intérêt qu’elle a suscité. Des cellules SP
ont été identifiées dans de nombreux tissus sains (peau, poumon, cerveau, cœur, foie, reins, et
sein). Le haut niveau d’expression de gènes impliqués dans la « stemness » et le potentiel de
différenciation multipotent font qu’il est généralement admis, au travers de ces différents
articles, que le compartiment SP est enrichi en cellules souches, à quelques exceptions près
qui seront évoquées dans le paragraphe §4.3 (147). De plus, le degré de l’activité d’efflux
semble être corrélé, au sein de la SP, au niveau d’engagement des cellules dans la
différenciation : les cellules présentant un efflux élevé étant les moins différenciées (148).
Conformément à la thèse des cellules souches cancéreuses, les adeptes de la vision
hiérarchique de la carcinogenèse se sont vus offrir, par la technique des SP, un outil
performant permettant de détecter de potentielles cellules initiatrices de tumeurs là où les
marqueurs membranaires avaient échoué. Ainsi, des cellules SP ont été détectées au sein de
lignées cellulaires tumorales (Myélome Multiple, sein, prostate, thyroïde, poumon, gliome,
neuroblastome…) et d’échantillons néoplasiques primaires (LAM, ascite de cancer des
ovaires, neuroblastomes, néoplasmes mésenchymateux) (147, 149, 150).
62
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Le potentiel initiateur supérieur de ces différentes SP est en général prouvé in vivo par
xénogreffe chez la souris immunodéficiente en comparaison avec les cellules non-SP.
Certaines études se contentent de conclure sur la capacité de division asymétrique des cellules
SP par l’observation de la reconstitution de l’hétérogénéité initiale de la tumeur (cellules
Hoeschst positives et cellules Hoechst négatives) (147). De façon unique, l’étude menée par
Wu et collègues démontre que le couplage auto-renouvellement/différenciation est restreint à
la population SP de néoplasme mésenchymateux lors de transplantations sérielles chez la
souris NOD/SCID, alors que les cellules non-SP ont la capacité d’initier la tumeur
uniquement lors de la première transplantation. L’article démontre également une corrélation
entre grade tumoral et pourcentage de cellules SP, conférant de ce fait au phénotype Hoechst
négatif une valeur pronostique pour les néoplasmes mésenchymateux (151).
4.2
Déterminant moléculaire du phénotype SP
La dynamique du phénotype SP est assurée par les transporteurs ABC comme l’atteste la
disparition de la population en présence d’un inhibiteur non-spécifique de ABCB1
(vérapamil) (146). Plus précisément, les déterminants moléculaires du phénotype SP, les plus
documentés dans la littérature, sont ABCB1 et ABCG2 (137, 140). Cependant, de nombreuses
preuves scientifiques démontrent la prédominance de la contribution d’ABCG2 dans
l’expression du phénotype SP. De fait, les souris délétées pour le gène codant pour ABCB1
(mdr1a-/-b-/-) présentent un pourcentage de cellules SP médullaires identique aux souris
sauvages (140). Les souris délétées pour le gène codant ABCG2 présentent une sévère
réduction du pourcentage de la SP au sein des cellules de la moelle osseuse. Cependant, la
persistance d’une fraction mineure de SP suggère que l’activité d’ABCG2 n’est pas l’unique
déterminant moléculaire du phénotype SP de la moelle osseuse murine (142). Enfin,
l’existence probable d’un troisième transporteur conférant l’efflux du Hoechst aux cellules SP
médullaires murines est suggérée par la présence d’une SP dans les souris triple « knock-out »
pour les gènes codant pour ABCB1 (mdr1a/b) et ABCG2 (152). Enfin, il est important de
dissocier activité et expression des ABC transporteurs. Le potentiel tumorigène contenu dans
la fraction SP ne semble pas être fonction du niveau d’expression d’ABCG2. En effet, les
cellules triées sur la base de l’expression de membrane de cette pompe n’expriment pas de
capacité initiatrice de tumeur supérieure au compartiment ABCG2 négatif (153).
63
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
Schéma 23 : Dynamique du phénotype SP et persistance d’une SP dans les souris délétées
pour les gènes mdr1a et b
D’après Zhou et al., Nature Medecine 7 (9), 1028-1034 (September 2001)
Légende :
Reserpine : inhibiteur non spécifique des ABC transporteurs
2-Deoxyglucose + sodium azide : agent supprimant l’ATP cellulaire
4.3
Points critiques de la technique
Le concept de la SP enrichie en cellules souches ou initiatrices a été démontré, de façon
ponctuelle dans la littérature, comme n’étant pas applicable à tous les tissus. En effet,
l’existence de cellules souches hématopoïétiques au sein de la population non-SP (154),
l’absence de marqueur d’immaturité de la SP isolée à partir de l’épiderme (155), et
l’indépendance du phénotype SP dans la capacité régénérative du capiton graisseux
mammaire (156) sont trois exemples précis réfutant l’implication du phénotype SP dans la
« stemness » dans des contextes cellulaires spécifiques.
La grande critique de la technique des SP est la toxicité du colorant Hoechst qui contenu
dans les cellules de la fraction non-SP a le potentiel de désavantager cette fraction cellulaire
dans les tests fonctionnels.
64
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
En plus d’une induction de l’apoptose ou de l’arrêt du cycle cellulaire induit par ce composé,
la procédure de coloration Hoechst et de tri sur la base du phénotype SP (laser UV) des
cellules SP et non-SP du sang périphérique mobilisé entraînent la perte de la capacité
régénérative à court terme de la lignée myéloïde, dans le cadre d’un lymphome (157). De
plus, une étude ancienne conduite sur des lignées multipotentes indique que le colorant
Hoechst 33342 peut induire la différenciation cellulaire. L’extrapolation des données de cette
étude unique à l’actuel protocole d’isolation des SP laisse envisager la possibilité d’une sousestimation du potentiel souche contenu dans la fraction non-SP (158). Cependant, les tests
incluant, comme contrôle supplémentaire, les cellules non chargées en colorant Hoechst
démontrent que pour la lignée cellulaire du cancer du sein MCF7, le colorant Hoechst
n’affecte pas les propriétés fonctionnelles des cellules non-SP (159). Enfin, tous les
paramètres physiques (agitation, température, durée) et chimiques (concentration du
Hoechst/concentration cellulaire) du test, ainsi que les stratégies de fenêtrage, et le type
d’appareillage (laser…) représentent une multitude de variables qui nécessite une constance
rigoureuse.
4.4
Chimiorésistance des cellules SP
Les cellules SP issues de tumeur présentent un haut degré de chimiorésistance, qui peut
apparaître intuitif étant donné que le principe de leur isolation repose sur la capacité d’efflux
au moyen des ABC transporteurs. De fait, les SP sont résistantes à un large de spectre de
drogues comprenant de façon non-exhaustive des substrats avérés des transporteurs ABC tels
que la Mitoxanthrone, la Doxorubicine, la Daunorubicine, la Fludarabine, l’Etoposide et le
Cisplatine (149, 160-162). Il est possible que, de façon analogue aux cellules souches, les
cellules SP expriment un arsenal moléculaire, indépendant de l’efflux, leur conférant une
évasion à l’action cytotoxique des thérapies anticancéreuses. La résistance des cellules SP aux
radiations ionisantes tend à supporter cette théorie (163). En parallèle de ces données
accumulées in vitro, l’implication des cellules SP chimiorésistantes dans les rechutes postthérapeutiques est suggérée par le pourcentage important de cellules SP qui caractérise les
patients LAM en rechute et/ou réfractaires aux thérapies (160).
65
INTRODUCTION : Cellules SP initiatrices de tumeurs et déterminatrices de la chimiorésistance
CONCLUSION
Bien que le concept des cellules initiatrices de cancer fasse l’objet de controverses et ne
soit pas applicable à l’ensemble des cancers, l’identification et la caractérisation de ces
cellules restent fondamentales pour élaborer des options thérapeutiques performantes et
ciblées. La technique des Side Population (SP) basée sur l’activité d’ABCG2 permet de
mettre en évidence des compartiments chimiorésistants, potentiellement immatures. En effet,
l’immaturité des cellules initiatrices de cancer est souvent accompagnée d’une forte
chimiorésistance. L’éradication de ces cellules, inefficace par la chimiothérapie, requiert
d’autres alternatives thérapeutiques telles que l’immunothérapie via les cellules immunitaires.
66
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
III.
Surveillance immunitaire anti-tumorale
1. La surveillance immunitaire des tumeurs
Proposé pour la première fois par Ehrlich en 1909, le concept de surveillance immunitaire
repose sur l’hypothèse d’une éradication spontanée et continuelle par le système immunitaire
de tumeurs naissantes avant que celles-ci ne deviennent cliniquement détectables. Ce concept
fut revisité plus d’un demi-siècle plus tard par Thomas et Burnet qui établirent les bases de
l’immunosurveillance. Selon Burnet, les cellules néoplasiques expriment des antigènes
propres à leur statut tumoral et sont capables d’induire une réponse immunitaire spécifique,
engendrant l’éradication des tumeurs émergeantes. Thomas, quant à lui, émit l’hypothèse de
l’existence, au sein d’organismes complexes pourvus d’une durée de vie longue, de
mécanismes immunologiques contrôlant l’apparition de cancers de façon analogue aux
défenses anti-infectieuses.
1.1
Preuves expérimentales de l’immunosurveillance
Il fallut encore quelques décennies pour que ce concept jusqu’alors hypothétique ne soit
formellement validé par des preuves scientifiques solides apportées par les modèles animaux
et les données cliniques de patients atteints de cancers (164). De fait, les souris délétées pour
des composants essentiels au fonctionnement du système immunitaire inné et adaptatif
(RAG2, TCRγ, IFNγ…) présentent une susceptibilité accrue au développement de tumeurs
spontanées ou induites par des agents chimiques (165). Ces modèles « preuve de concept »
du contrôle immunitaire des tumeurs seront détaillées plus spécifiquement pour chaque acteur
du réseau de l’immunosurveillance.
Les preuves « cliniques » de la surveillance immunitaire des tumeurs à l’échelle humaine
restent plus limitées et reposent sur des données majoritairement corrélatives. Le premier
élément alimentant l’existence de ce concept chez l’homme est l’association d’un pronostic
favorable à un taux élevé de lymphocytes infiltrant les tumeurs. De plus, une prédisposition
aux leucémies, lymphomes et cancers viraux est liée à la présence d’immunodéficiences
congénitales ou acquises.
67
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Par contraste, la transplantation allogénique de cellules T et NK, utilisée à des fins
thérapeutiques, permet un contrôle immunologique de la tumeur par le biais d’un effet greffon
versus leucémie ou greffon versus tumeur. Enfin et conformément à la théorie originelle de
Burnet, il est maintenant avéré que les cellules tumorales expriment de façon qualitative ou
quantitative des antigènes tumoraux permettant l’élaboration d’une réponse immunitaire
spécifique et durable (grâce à la composante cellulaire mémoire) (166).
1.2
Théorie de régulation extrinsèque des tumeurs
Très récemment, l’étude plus approfondie des dialogues cellules tumorales/cellules
immunitaires et le constat de l’inhérente tolérance immunologique au sein des tumeurs ont
introduit de nouvelles notions de l’immunité oncologique : l’immunosélection des tumeurs
qui
peut
être
décomposée
en
deux
phénomènes :
l’
« immunoediting »
et
l’immunosubversion. Ce modèle de progression tumorale dépendant de facteurs extrinsèques,
contrastant avec la thèse traditionnelle de facteurs exclusivement intrinsèques d’oncogenèse,
propose un processus multi-étapes :
La phase d’élimination (immunosurveillance), où les fonctions immunitaires
agissent comme suppresseur de tumeur extrinsèque.
La phase d’équilibre, où l’expansion du clone tumoral est contrôlée par
l’immunité.
La phase d’échappement, qui permet à la tumeur d’esquiver les réponses
immunitaires et de s’amplifier de façon incontrôlée.
La dernière étape d’échappement ou « immune escape » requiert la sélection d’un variant
non-immunogénique (« immunoediting ») et/ou la suppression active de toutes réponses
immunitaires (immunosubversion). Ces mécanismes de sélection se font au moment de
l’échappement après une étape d’équilibre où le système immunitaire exerce une pression de
sélection sur le clone tumoral et façonne l’immunogénicité de celui-ci (165). Quantité de
données expérimentales existe en ce qui concerne les étapes d’élimination ou d’échappement.
68
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Concernant cette dernière étape, l’argument scientifique appuyant cette thèse repose sur
l’observation du haut degré d’immunogénicité des tumeurs issues de souris immunodéprimées
qui s’oppose à la faible immunogénicité de tumeurs issues de souris immunocompétentes. Les
données expérimentales concernant la phase d’équilibre, où phase invisible, sont de façon
justifiée plus limitées. Récemment, une étude élégante a apporté la preuve expérimentale de
l’existence de cette phase d’équilibre. Dans un modèle murin de tumeur induite par agent
chimique, la dormance du clone tumoral est majoritairement assurée par les cellules T, et
l’inhibition ciblée de ces fonctions immunitaires permet le développement de tumeur
cliniquement apparente (167).
Bien que l’ensemble de ces théories soit encore l’objet de débats et se situe en marge des
théories classiques de progression tumorale, il a été récemment proposé que
« l’immunoescape » constitue la septième « hallmark » du cancer (165).
Schéma 24 : Schéma récapitulatif de la théorie de régulation extrinsèque des tumeurs
D’après Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6, 715-727 (October 2006)
69
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Schéma 25 : Illustration des étapes d’immunosurveillance, d’équilibre et d’échappement
D’après Dunn et al. Nature Reviews Immunology 6, 836–848 (November 2006)
70
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
1.3
Mécanismes généraux d’ « immunoediting » et d’immunosubversion
Les stratégies d’ « immunoediting » spécifiques d’un acteur de la surveillance
immunitaire interviennent pendant les étapes de reconnaissance immunitaire des cellules
tumorales. De façon générale, les mécanismes, mis en place par les cellules tumorales et
agissant de façon « universelle » dans l’échappement immunitaire, touchent les phases de
cytotoxicité post-reconnaissance ou font appel à des phénomènes d’immunosubversion
généraux.
Les cellules tumorales sont capables d’inhiber les voies de mort mises en œuvre par les
cellules T cytotoxiques (CTL) et NK. En effet, la surexpression de PI9 (un inhibiteur de
granzyme B-perforine) et de FLIP (un inhibiteur de la caspase 8), la mutation ou la sousexpression des récepteurs de mort et de la caspase 8 sont des mécanismes qui permettent
d’échapper à la lyse induite par les cellules immunitaires.
En parallèle, l’immunosubversion intervient généralement par la sécrétion de facteurs
solubles (Indoleamin 2,3 Dioxygenase (IDO), CD95L, Tumor growth Factor- β (TGF-β),
Prostaglandin E-2 (PGE2)) inhibant les fonctions anti-tumorales de nombreux acteurs de la
surveillance immunitaire (165, 168). De plus, dans un microenvironnement « coopérant », les
tumeurs favorisent le recrutement des composants de l’immunité supportant la progression de
l’oncogenèse (macrophages alternatifs, cellules T régulatrices) au détriment des effecteurs
anti-tumoraux (168). Ce microenvironnement pro-tumoral, recruté via un spectre d’expression
préférentiel de chimiokines chimioattractives, est pourvu de cellules (T regulateur (Treg),
CSM) ayant le potentiel d’inhiber les acteurs majeurs de l’immunité anti-tumorale en faveur
de la protection du clone tumoral (168).
1.4
L’immunosurveillance dans la LLC-B
Le défaut de fonctionnement du système immunitaire est une caractéristique de la LLC-B
qui se manifeste au niveau clinique par la survenue d’infections (37). De manière générale, les
cellules de LLC-B sécrètent de forts niveaux de molécules immunosuppressives telles que le
TGF-β, l’IL-10 et l’IL-6 (169-171). De plus, l’interaction des cellules leucémiques avec les
composants de l’immunité est sévèrement affectée par le défaut d’expression de molécules
d’adhésions et de signaux co-stimulatifs (172).
71
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Les modalités d’interactions des cellules LLC-B avec chacun des composants cytotoxiques de
l’immunité importants dans la surveillance anti-tumorale seront abordées de façon détaillée
dans les paragraphes §2.1.3, §2.2.1.2 et §2.2.2.5.
1.5
Généralités sur l’implication thérapeutique du concept d’immunosurveillance
L’ensemble de ces considérations sur le rôle déterminant de la fonction immunitaire dans
la progression tumorale implique un nouveau niveau de réflexion sur les stratégies
thérapeutiques à adopter. En effet, la majorité des thérapies anticancéreuses contenant des
agents chimiothérapeutiques sont fortement délétères pour l’ensemble du système
immunitaire et entraînent une profonde immunosuppression (responsable dans certains cas de
l’apparition de cancers secondaires). Il apparaît possible que l’immunosuppression induite par
les traitements chimiothérapeutiques soit délétère en compromettant la surveillance
immunitaire et favorisant l’échappement immunitaire des cellules tumorales persistantes postchimiothérapie (173).
Malgré leur effet majoritairement immunosuppresseur, certaines thérapies conventionelles
permettent (165) :
de reverser les phénomènes d’immunosubversion (faible dose de cyclosporine :
suppression des Treg en faveur de l’expansion tumorale), et de ce fait, rétablit les
fonctions NK et CTL suppressives de tumeurs,
d’inhiber
les
mécanismes
d’
« immunoediting »
(irradiation,
anthracycline :
restauration de l’immunogénicité des tumeurs),
d’activer les fonctions effectrices du système immunitaire (imatinib mesatylate,
activation des cellules NK).
Enfin, l’immunothérapie anti-cancéreuse apparaît comme une alternative thérapeutique
prometteuse car spécifique et durable par la mémoire immunologique et la génération
constante de cellules effectrices.
72
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Schéma 26 : Implications thérapeutiques du concept d’immunosurveillance
D’après Zitvogel et al., Journal of Clinical Investigation 118 (6), 2008
2. Le réseau d’immunosurveillance des tumeurs
2.1
L’immunité acquise
L’immunité acquise est une composante essentielle du système immunitaire qui se
façonne au gré des rencontres antigéniques de la vie d’un individu. Cette branche de
l’immunité présente les caractéristiques suivantes : spécificité antigénique, diversité, mémoire
immunitaire et reconnaissance du Soi et du non-Soi. On distingue deux types de réponse
immunitaire : à médiation humorale (via les lymphocytes B) et à médiation cellulaire (via les
lymphocytes T pourvu d’un récepteur comprenant les chaînes α et β). Il existe une
coopération indispensable à de multiples niveaux entre immunité naturelle et acquise.
Brièvement, après une phase d’éducation antigénique, l’action cytotoxique des cellules B
réside dans leur différenciation en cellules plasmocytaires capables de sécréter des anticorps
solubles qui, lors de leur fixation à leur cible antigénique, entraîne la lyse de celle-ci via
différents processus tels que la phagocytose, l’ADCC, et la CDC.
73
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Schéma 27 : Réponse anti-tumorale à médiation humorale
D’après Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6, 715-727 (October 2006)
Les lymphocytes Tαβ sont divisés en deux sous-types majoritaires : les cellules T
auxiliaires (CD4+) et les cellules T cytotoxiques (CD8+). L’activation des cellules T se fait par
la reconnaissance de leur antigène spécifique en conjonction avec le complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH) de classe I (pour les cellules CD8+) et II (pour les cellules CD4+)
au niveau de leur TCR. Cette étape de reconnaissance s’effectue grâce aux cellules
présentatrices d’antigènes (CPA). L’activation des cellules T auxiliaires conduit à la sécrétion
de cytokines coordonnant les réponses immunitaires innées, humorales et cytotoxiques T.
Après reconnaissance de l’antigène, les cellules T CD8+ se différencient en CTL et détruisent
les cellules présentant leur antigène spécifique par des mécanismes lytiques dépendant des
systèmes perforine/granzyme B (174).
Cytokine
production
Schéma 28 : Réponse anti-tumorale à médiation cellulaire
Modifié d’après Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6, 715-727 (October 2006)
74
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
2.1.1
Preuves scientifiques de l’immunosurveillance acquise
La preuve la plus solide de l’implication des lymphocytes dans la surveillance
immunitaire des tumeurs provient des modèles murins délétés pour le gène codant pour rag2
(recombination activating gene 2). Les mutants homozygotes pour rag2 sont viables mais sont
incapables d’effectuer la recombinaison VDJ, à l’origine de la diversité et de la spécificité du
répertoire de l’immunité acquise. En conséquence, ces modèles murins ne peuvent produire
des cellules B et T matures. Ces souris développent, à une fréquence plus élevée et de façon
plus précoce que leurs homologues non-délétés, des tumeurs induites chimiquement (175). De
la même façon, les souris délétées pour le gène codant la chaîne β du TCR, présentent un haut
degré de susceptibilité aux développements de tumeurs xénogreffées ou induites par agents
chimiques (175). Très récemment, la dormance tumorale induite pendant la phase d’équilibre
apparaît clairement dépendante des cellules T puisque l’inhibition des cellules CD4+ et CD8+
entraîne le développement de tumeurs cliniquement apparentes (167). A l’échelle du patient,
de nombreuses données cliniques démontrent la valeur pronostique bénéfique des cellules T
CD8+ infiltrants les tumeurs. De fait, la présence de cellules CD8+ à des sites intra-tumoraux
est un marqueur pronostique indépendant, pour le cancer du colon, le cancer de l’œsophage, le
cancer du sein, le cancer des ovaires, et les mélanomes malins (175). Enfin, la découverte
d’antigènes tumoraux, initiée par Thierry Boon en 1991, est la démonstration de la nature
antigénique des tumeurs et de leur capacité à engendrer des réponses immunitaires spécifiques
(176). De nos jours, une pléiade d’antigènes tumoraux a été identifiée et constitue des cibles
prometteuses pour des stratégies de vaccination anti-cancéreuses. Bien qu’une des méthodes
d’identification des antigènes tumoraux repose sur un criblage des spécificités antigéniques
des anticorps présents dans le sérum de patients atteints de cancers, il existe peu de preuves
scientifiques démontrant l’existence d’une surveillance immunitaire à médiation humorale
(177).
2.1.2
« Immunoediting » spécifique des cellules T
Durant les phases d’échappement aux réactions immunitaires acquises, les tumeurs
mettent en place un processus de sélection de variants non-immunogéniques.
75
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
En ce qui concerne la phase de reconnaissance, on compte entre autres, parmi les différentes
stratégies d’ « immunoediting » qui affectent la fonction CTL, l’extinction de l’expression du
HLA de classe 1, la sous-régulation de l’expression des antigènes tumoraux et de leur
machinerie de « processing » et d’adressage à la membrane, l’altération de l’expression des
molécules d’adhésion et le masquage des antigènes tumoraux par la mucine (165, 178).
Schéma 29 : Illustration des stratégies d’ « immunoediting » spécifique de la réponse antitumorale T
D’après Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6, 715-727 (October 2006)
2.1.3
Interactions entre cellules T et cellules de LLC-B
Dans la LLC-B, il existe une expansion anormale du compartiment lymphocytaire T
CD8+, suggérant l’existence d’une réponse immunitaire spécifique envers les cellules
leucémiques (179). En faveur de cet argument, l’existence de populations T oligoclonales
spécifiques de la population leucémique autologue a été mise en évidence (180). Cette
population T reste cependant fonctionnellement déficiente comparée à des populations T
normales : elle prolifère peu sous stimulus mitogène et présente une altération d’expression de
molécules de surface (Lymphocyte Function-associated Antigen 1 (LFA-1), Inter-Cellular
Adhesion Molecule 1 (ICAM-1), CD28, CD25…), du profil cytokinique (IL-2) et une
augmentation de molécules inhibitrices de la signalisation cytotoxique (Killer cell Ig- like
Receptor (KIRs) et CD94) (179, 181). Plus précisément, l’analyse de la signature
transcriptomique de ces cellules révèle un défaut de formation du cytosquelette, du transport
des vésicules et de la cytotoxicité (182).
76
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
De plus, les cellules de LLC-B surexpriment le CD200, molécule immunosuppressive qui
induit, dans des modèles animaux, l’incapacité des cellules T à contrôler le développement
tumoral (183).
2.2
Immunité innée ou naturelle anti-tumorale
L’immunité innée constitue la première barrière aux agents pathogènes. L’immunité innée
anti-tumorale compte trois acteurs principaux : les cellules dendritiques, les cellules NK et les
cellules Tγδ. Les cellules NK et Tγδ sont à la frontière entre immunité innée et adaptative et
représentent les armes cytotoxiques de la branche naturelle de l’immunité. Les cellules
dendritiques ont une action principalement de CPA et par cette fonction initient, dans des
contextes de cancer, les réponses immunitaires spécifiques à médiation cellulaire. Ce sont
également des cellules sécrétrices de cytokines et présentatrices de signaux co-stimulateurs
qui permettent d’amplifier et de coordonner les réponses CTL et NK anti-tumorales. Compte
tenu de leur potentiel cytotoxique, seules les cellules Tγδ et NK seront abordées dans les
prochains paragraphes.
2.2.1
Les cellules Tγδ
Récemment identifiées et en marge des cellules Tαβ, les cellules Tγδ correspondent à une
fraction mineure de la population T, présentant un TCR hétérodimérique composé de deux
chaînes γ et δ, générées par recombinaisons somatiques au niveau des segments VDJ. La
diversité combinatoire limitée du répertoire Tγδ confère à ces lymphocytes T une
reconnaissance antigénique restreinte, qui les place à la frontière entre immunité innée et
acquise (184). Dans le sang périphérique des individus sains, la population Tγδ représente 1 à
10% des cellules T circulantes. Dans d’autres sites anatomiques tels que l’épithélium du petit
intestin, la peau, l’œsophage, les poumons ou encore la trachée, les cellules Tγδ sont
représentées de façon plus abondante. Deux sous-groupes majoritaires de lymphocytes Tγδ
ont été décrits :
l’un exprimant les régions variables du TCR Vγ9 et Vδ2, composant la majorité de la
fraction Tγδ circulante (50-95%) et étant impliqué dans la surveillance immunitaire
des cancers hématologiques.
77
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
l’autre, Vδ1, marquant une population résidente des tissus épithéliaux et fournissant
une défense anti-tumorale et anti-pathogène au niveau de ces sites (185, 186).
En faveur de la thèse d’une constante activation in vivo, les cellules Tγδ circulantes
expriment des marqueurs de cellules T mémoires et peuvent être divisées en différentes souspopulations basées sur l’expression du CD16 (FcγRIII), du CD27 et du CD45RA. De façon
fonctionnelle, les cellules Tγδ utilisent des mécanismes de lyse semblables aux cellules Tαβ
tels que les systèmes perforine/granzyme et les récepteurs/ligands de mort (Fas/FasL). Les
cellules Tγδ sécrètent une variété de chimiokines pro-inflammatoires (MIP, RANTES) et de
cytokines (interferon γ, TNFα) et prolifèrent sous l’action de l’IL-2. Très récemment, une
fonction de CPA a été attribuée aux cellules Tγδ, démontrant un nouveau rôle de ces cellules
dans l’initiation de l’immunité Tαβ (185, 186).
Schéma 30 : Distribution et rôle des différents sous-groupes de cellules Tγδ
D’après Ferrarini et al., Trends in Immunology 23 (1), 14-18 January 2002
78
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
La reconnaissance antigénique des cellules Tγδ est unique. Indépendamment du CMH et
des CPA, les cellules Tγδ reconnaissent des antigènes non-conventionnels de faible poids
moléculaire, de nature lipidique ou correspondant à des métabolites microbiens nonpeptidiques phosphorylées, regroupés sous la dénomination commune de phosphoantigènes.
Plus précisément, il est clairement établi que les TVγ2δ9 reconnaissent de façon dépendante
du TCR des intermédiaires phosphorylés de la voie de biosynthèse de l’isoprenoïde. Cette
voie de synthèse semble être amplifiée dans des cas de cancers et peut être modulée par
administration d’aminobiphosphates (185, 186).
Schéma 31 : Surveillance immunitaire menée par les cellules Tγδ
Modifié d’après Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6, 715-727 (October 2006)
En plus de cette liaison atypique du TCR, l’activation des cellules Tγδ est subtilement
modulée par un panel de récepteurs activateurs (NKG2D) ou inhibiteurs (KIR) communs aux
cellules NK. En ce qui concerne les signaux activateurs, les ligands du NKG2D, MICA/B
(MHC class I related proteins A et B), ULBP1 à 4 et RAET1G (UL16-binding protein
family), sont induits dans des contextes de stress génotoxiques et dépendant des protéines
« heat shock ». Ces ligands marquent la surface de cellules épithéliales ainsi que d’une large
diversité de tumeurs (187). De plus et toujours par analogie avec les cellules NK, l’expression
du CD16 par les cellules Tγδ confère à ces cellules une fonction effectrice de l’ADCC en
présence d’anticorps.
79
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
Schéma 32 : Récepteurs des cellules Tγδ
D’après Rey et al., Trends in Molecular Medecine 15 (6), 275-284
2.2.1.1
Preuve de l’immunosurveillance des Tγδ
La démonstration la plus évidente du rôle des cellules Tγδ dans la surveillance anti-
tumorale réside dans les modèles délétés de la chaîne γ du TCR. Ces animaux TCR-γ
-/-
,
injectés avec des cellules d’une lignée de carcinome ou des carcinogènes chimiques (MCA,
TPA, DMBA), ont une sensibilité accrue au développement de tumeurs en comparaison avec
les souris sauvages. Il apparaît clairement que les cellules Tγδ ont un rôle unique dans le
contrôle immunologique des tumeurs puisque dans ces modèles murins dépourvus de cellules
Tγδ, les cellules Tαβ et NK ne compensent pas, en termes de formation de tumeur, l’absence
de cellules Tγδ (175). Les données cliniques, qui tendent à consolider les expériences
murines, démontrent que la stimulation in vivo des cellules Tγδ induit un effet anti-lymphome
(188).
80
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
De façon corrélative, il apparaît que les patients atteints de LAM ne montrant pas de maladie
résiduelle après transplantation allogénique de moelle osseuse présentent un taux de cellules
Tγδ particulièrement élevé (189).
2.2.1.2
« Immunoediting » et interactions avec les cellules de LLC-B
Etant donné la quantité de similitude entre cellules Tγδ et cellules NK dans la
reconnaissance des cellules tumorales, les stratégies d’immuno-échappement mises en place
par les tumeurs spécifiques de ces couples ligands/récepteurs seront abordées dans le
paragraphe NK, qui compte une littérature plus abondante en la matière.
Néanmoins, de façon très intéressante, un des seuls exemples spécifiques d’immunoéchappement Tγδ est fourni par la LLC-B. En effet, il apparaît que la stimulation par
aminobisphophate ne soit efficace en termes d’expansion Tγδ que sur une fraction de patients.
Les patients non-répondeurs présentent d’une part un pronostic péjoratif (Ig-NM) et d’autre
part un profil phénotypique spécifique de leur compartiment Tγδ. Ces résultats suggèrent
l’existence d’un mécanisme atypique d’immunosubversion induisant la différenciation et
l’inhibition des cellules Tγδ (190). De plus, une proportion non-négligeable de patients LLCB présente un taux élevé de lymphocytes Vδ1 circulants qui représentent majoritairement,
chez les sujets sains, une population résidente des tissus. Ces lymphocytes Vδ1 sont capables
dans des systèmes de lyse autologue d’induire la mort des cellules leucémiques de façon
dépendante de NKG2D. Le suivi clinique de ces patients démontre l’absence de progression
tumorale pour les patients présentant initialement une proportion élevée de lymphocyte Vδ1
(191). Enfin, la stimulation des cellules TVγ9δ2 de patients LLC-B par phosphoantigène
démontre, dans des système autologues, une augmentation de la lyse des cellules leucémiques
de LLC-B en présence de Rituximab (192).
2.2.2
Les cellules NK
La première description des cellules NK s’est faite, en 1975, sur la base fonctionnelle de
la capacité de ces cellules à lyser de manière spontanée certaines cellules tumorales in vitro.
Les cellules NK représentent une classe unique de lymphocytes, distincts des cellules T et B,
qui participent à la protection anti-pathogènes et à la surveillance anti-tumorale (193).
81
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
La définition phénotypique des cellules NK humaines repose sur la négativité du CD3
conjointe à la positivité du marqueur CD56. On distingue cependant deux sous-groupes de
cellules NK :
CD56bright CD16dim, pourvues de propriétés immunorégulatrices conférées par
une activité productrice de cytokines (Interferon-γ (IFN-γ), Tumor Necrosis
Factor (TNF) et Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GMCSF)). Cette population représente 10% des cellules NK circulantes et
pratiquement 100% des cellules NK résidentes au niveau des tissus lymphoïdes
secondaires à proximité des composants de l’immunité, tels que les cellules T
et les CPA sur lesquelles elles exercent leurs fonctions immunorégulatrices.
CD56dim CD16bright, pourvues d’une forte activité cytotoxique, qui représentent
la quasi-totalité des cellules NK circulantes (194).
Certaines études suggèrent que ces deux sous-classes de cellules NK correspondraient à
deux niveaux de différenciation distincts du développement NK, avec une progression du
phénotype CD56bright vers le phénotype « mature » CD56dim (194).
L’activité cytotoxique des cellules NK s’effectue de façon semblable aux cellules T par
l’exocytose de granules lytiques contenant un cocktail de perforine, de granulysin et de
membres de la famille granzymes. Alternativement, les cellules NK expriment et sécrètent des
molécules, telles que TRAIL et FasL, engageant les récepteurs de mort à la surface des
cellules cibles et induisant l’apoptose de celles-ci (193).
Il existe tout un panel de cytokines (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23 et IFNαβ)
pouvant activer, de façon indépendante de la reconnaissance immunologique, la prolifération
et les fonctions cytotoxiques et immunorégulatrices des cellules NK. Enfin, des rapports
relativement récents pointent de façon élégante l’ambiguïté de la fonction NK qui apparaît
spécifique et pourvue d’une forme de mémoire, dans des modèles murins exempts de cellules
T et soumis à une exposition d’haptens (195).
82
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
2.2.2.1
Cytotoxicité
La caractérisation récente des récepteurs activateurs et inhibiteurs des cellules NK,
codés de façon germinale, a mené à la découverte de la complexité des mécanismes
moléculaires gouvernant la reconnaissance NK des cellules tumorales.
L’émergence de ces connaissances se sont initiés avec l’établissement du concept unique de
reconnaissance des cellules NK : « missing-self recognition ». En effet, dans ces articles
pionniers, la perte d’expression des molécules du CMH de classe I par des cellules tumorales
entraîne une cytotoxicité NK à l’encontre de celles-ci (196-198). Ce profil de reconnaissance
jusqu’alors unique a mené à l’identification des récepteurs inhibiteurs que sont les KIRs et
NKG2A/CD94. Les KIRs sont extrêmement polymorphes et leur spectre d’expression au
niveau clonal est très varié. Cette diversité permet de créer pour chaque individu une
population hétérogène de cellules NK. Les KIRs reconnaissent HLA-A, HLA-B et HLA-C et
CD94-NKG2A est spécifique de HLA-E. La caractéristique commune de ces récepteurs
inhibiteurs est qu’ils sont pourvus d’une séquence ITIM (immunoreceptor tyrosine inhibitory
motif) au niveau de leur extrémité cytoplasmique. La phophorylation de ces motifs induit le
recrutement et l’activation des phosphatases SHP-1 et SHP-2 qui empêche l’activation NK.
Parmi la variété de récepteurs inhibiteurs présents à la surface des cellules NK et listés sur le
schéma 35, le récepteur inhibiteur KLGR1 se fixe spécifiquement à la E-cadhérine, dont
l’absence marque l’initiation de la migration des cellules tumorales vers des sites
métastatiques. Il est possible que la spécificité de ce récepteur confère aux cellules NK la
capacité de contrôler l’émergence de métastases (199)
Schéma 33 : Le principe de reconnaissance « Missing-self »
D’après Ljunggren et al., Nature Reviews Immunology 7, 329-339 May 2007
83
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
En ce qui concerne la composante moléculaire activatrice, le récepteur le plus étudié
reste NKG2D (CD314) qui appartient à la famille des lectines de type C. Ce récepteur
homodimérique est également présent sur les cellules Tαβ et Tγδ. Au niveau moléculaire,
NKG2D s’associe avec la protéine adaptatrice DAP10 et permet la transduction d’une cascade
de signalisation spécifique. L’impact de l’engagement unique (récepteur primaire) de ce
récepteur sur l’induction d’une réponse cytotoxique reste encore controversé (199, 200).
Cependant, l’intégration des signaux positifs du NKG2D induit une cytotoxicité dans des
contextes d’expression normale du HLA-ABC, suggérant une potentielle prévalence de cette
signalisation activatrice (199). Les ligands de NKG2D sont multiples et comprennent les
molécules du CMH non-classiques (MICA et MICB) et les protéines de la famille des « UL16
binding proteins » (ULBP1 à 4 et RAET1G). Les ligands de NKG2D marquent la surface de
cellules ayant subit un stress génotoxique, oxidatif ou encore dépendant des protéines « heat
shock ». De fait, dans des contextes tumoraux, la présence constante d’atteintes génotoxiques
et l’activation perpétuelle des réponses de dommage à l’ADN dans la progression du cancer
(due à la prolifération anarchique) est potentiellement une des raisons pour laquelle certaines
tumeurs expriment ces ligands (200).
Schéma 34 : Le principe de reconnaissance « Induced-self »
D’après Gasser and Raulet, Cancer Research 66 (8), 3959-62 April 2006
84
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
D’autres récepteurs activateurs sont connus aujourd’hui tels que NKp44, NKp30,
NKp46, CD16, CD244 (199). En plus de ces récepteurs spécifiques au signal cytotoxique
NK, les molécules intervenant dans la synapse immunologique telles que les molécules
d’adhésion joue un rôle primordial dans le contact cellulaire effecteurs/cibles. La liste
exhaustive de ces récepteurs est donnée sur le schéma 35.
Schéma 35 : Récepteurs des cellules NK
D’après Rey et al., Trends in Molecular Medecine 15 (6), 275-284
Même si le degré de coopération et de hiérarchie qui s’opère entre ces récepteurs n’est
pas complètement élucidé, il est clairement établi que c’est la balance entre signaux
activateurs (induced-self) et inhibiteurs (missing-self) qui détermine l’engagement d’une
réponse biologique.
85
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
2.2.2.2
ADCC
L’expression du CD16 (également connu sous le nom de FcγRIIIa), qui se lie au
fragment Fc des IgG, confère aux cellules NK la capacité d’être des effecteurs privilégiés de
l’ADCC. L’expression du CD16 n’est pas restreinte aux seules cellules NK, puisque certains
macrophages, cellules Tαβ et Tγδ expriment ce récepteur. La complexité de la biologie
d’activation des cellules NK, manifestée par la variété de signaux inhibiteurs et activateurs de
la cytotoxicité, semble être secondaire dans les phénomènes d’ADCC. En effet, la cytotoxicité
induite par l’engagement du CD16 est activement dépendante de la liaison de LFA-1 à
ICAM1. Cette dépendance aux signaux induit par LFA-1 est fondée sur les données obtenues
à partir d’individus LFA-1 déficients et d’expériences utilisant des anticorps anti-LFA-1
bloquants (199). Cependant, il apparaît dans des expériences utilisant des anticorps
activateurs, que le CD16 est le seul récepteur NK dont l’engagement unique permet d’induire
une réponse biologique cytotoxique (199). En ce qui concerne l’implication des ligands de
NKG2D et des molécules de MHC classe I, les données majoritairement corrélatives et
rarement fonctionnelles ne permettent pas d’établir la fonction de ces signalisations de la
cytotoxicité naturelle dans la régulation du signal ADCC (201). En comparaison avec la
cytotoxicité naturelle, la signalisation induite par le CD16 génère un effet cytotoxique
puissant qui augmente significativement le pourcentage et la fréquence de cellules lysées
(202).
Schéma 36 : Le phénomène d’ADCC
D’après Wayne et al., Nature Reviews Immunology 3, 304-316 (April 2003)
86
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
2.2.2.3
Preuve de l’immunosurveillance anti-tumorale NK
La déplétion in vivo de cellules NK, (par anticorps NK1.1 ciblant les cellules NK et
NKT murines) dans des modèles murins sauvages et mutés (dépourvus de cellule NKT)
inoculés avec des cellules tumorales, démontre le rôle clé des cellules NK dans le contrôle de
l’initiation tumorale et de l’apparition de métastases (203). De plus, les cellules NK présentent
un potentiel thérapeutique en clinique notamment dans l’effet greffon versus leucémie ou
greffon versus tumeurs recherché par les transplantations allogéniques dans des contextes de
« HLA mismatch ». Enfin, le rôle positif des cellules NK dans la surveillance immunitaire est
également démontré dans la LAM, par la corrélation qui existe entre l’activité NK et la survie
sans rechutes (190).
2.2.2.4
« Immunoediting » spécifique NK
En relation directe avec les modalités d’activation des cellules NK, les exemples
d’échappement immunitaire NK les plus documentés dans la littérature concernent l’axe
NKG2D. L’expression des ligands de NKG2D est fortement dérégulée dans de nombreux
types de cancers et notamment dans les stades agressifs de LAM (190). Par contraste,
l’expression du récepteur NKG2D est sous-régulée à la surface des cellules NK de la LMC,
résultant potentiellement du fort niveau d’expression et de sécrétion de MICA et MICB qui
caractérise ces cellules leucémiques (190). En effet, l’exposition chronique du récepteur
NKG2D à ses ligands provoque une diminution de la cytotoxicité NK (165). De même, la
présence de ligands de NKG2D solubles dans de nombreux cancers (LAM, LMC, LLC-B,….)
induite par une dégradation protéolytique assurée par les MMPs, entraîne une internalisation
et une dégradation du récepteur NKG2D par les voies lysosomales. Toujours en faveur de la
progression tumorale, la présence de ligands solubles du NKG2D induit également
l’expansion de cellules NKG2D+CD4+ immunosuppressives (204). Liant immunosubversion
et « immunoediting », la sécrétion de la protéine immunosuppressive TGF-β par les cellules
tumorales entraîne la diminution conjointe du récepteur NKG2D et de ses ligands à la surface
des cellules (200).
En ce qui concerne l’axe du HLA/KIR, il est démontré, dans le Myélome Multiple, que
l’expression du HLA augmente en parallèle de la progression tumorale (190).
87
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
De même, l’altération de l’expression du HLA est un phénomène peu observé dans les
hémopathies malignes, témoignant potentiellement de la faible menace que représente
l’immunité T (181). L’expression de HLA-G par les cellules tumorales, engendrant une
signalisation négative sur la cytotoxicité NK, est une stratégie d’immuno-échappement
additionnelle qui existe dans certains types de cancer (205). En marge des mécanismes
dépendant du NKG2D, certaines hémopathies malignes (LAM) démontrent un défaut de
l’activation NK, attestée par la sous-expression des récepteurs NKp30 et NKp46, et suggérant
la présence de mécanismes d’ « immunoediting » et d’immunosubversion sous-jacents (190).
Dans la LMC, l’expression de Bcr-Abl par les cellules NK augmente l’expression des KIRs et
influe ainsi sur le seuil d’activation de ces cellules NK (181).
HLA-G
Schéma 37 : « Immunoediting » permettant d’échapper à la surveillance anti-tumorale NK
Modifié d’après Zwirner et al., Cytokine & Growth factor Review, 2007
88
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
2.2.2.5
NK « immunoediting » et interactions avec les cellules de LLC-B
La LLC-B est un parfait modèle récapitulatif de l’ensemble des mécanismes qui rendent
les cellules cancéreuses invisibles aux cellules NK. L’importance de la surveillance NK dans
la progression leucémique est démontrée par la valeur prédictive du ratio NK : MBC
(malignant monoclonal B-cell) sur l’évolution de la maladie (206).
La LLC-B est très résistante à la lyse spontanée des effecteurs de l’immunité innée dans
des tests de cytotoxicité menés in vitro (207, 208), dans un effet qui semble être dépendant de
l’expression du HLA de classe I (208). Les cellules NK de patients LLC-B présentent une
diminution de leur activité cytotoxique, en termes de production et de sécrétion de granules
cytotoxiques, comparés à des cellules NK de donneurs sains (209, 210). De fait, il a été
démontré que le surnageant de cultures primaires de LLC-B altérait fortement l’activité
cytotoxique des cellules NK issues de donneurs sains. De plus, les cellules de LLC-B
expriment des niveaux très faibles des ligands du NKG2D, mais cette faible expression
semble être modulable par traitement à l’acide rétinoïque (191). Récemment, il a été démontré
que les cellules de LLC-B sécrètent des formes solubles de MICA, MICB et ULBP2, et que le
niveau de ces sécrétions corrèle avec la survie sans traitement. Dans cette étude, il apparaît
que les niveaux d’ULBP2 soluble en parallèle d’autres facteurs pronostiques conventionnels
apporte une valeur prédictive de la survie sans traitement (211). De même, l’expression de
HLA-G, signal inhibiteur, permet la protection des cellules leucémiques à la lyse NK (211).
2.2.2.6
Impact de la chimiothérapie sur les cellules NK
Etant donné l’implication fondamentale des cellules NK dans l’effet du Rituximab,
troisième bras du « gold standard » du traitement de la LLC-B, il est important de considérer
dans ce chapitre l’effet de la chimiothérapie sur la cytotoxicité NK.
L’oncologie clinique conventionnelle prend rarement en compte l’impact délétère des
traitements chimiothérapeutiques sur le système immunitaire. De plus, le degré
d’immunosuppression induit par la chimiothérapie affecte significativement le risque de
rechute (166). L’étude de l’évolution des populations immunitaires post-chimiothérapie
démontre que les cellules NK sont les premières cellules à se reconstituer après
chimiothérapie dans la LAM (166).
89
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
De la même façon, les cellules NK sont les premières cellules à émerger après
transplantations autologues ou allogéniques de cellules souches dans la LAM. La
lymphocytose NK post-transplantation apparaît même comme un élément prédictif de
l’efficacité de l’effet greffon versus leucémie (166).
Cependant, l’effet délétère des chimiothérapies peut s’avérer bénéfique, lorsque cellesci modulent le rapport effecteurs/cibles en faveur des cellules effectrices. De plus, certaines
chimiothérapies permettent une immunomodulation de la fonction NK. A cette fin, une étude
récente a permis de répertorier les composants chimiothérapeutiques ayant une action sur la
cytotoxicité NK. Ces composés peuvent être inhibiteurs : Chlorambucil, MG-132, Docetaxel,
Cladribine, Paclitaxel, Bortezomib, Gemcitabine et Vinblastine. D’autres composés
n’affectent pas la cytotoxicité et apparaissent même pour certains activateurs : Bevacizumab,
Bleomycin, Doxorubicin, Epirubicin, Vinorelbine, Carboplatin, Methotrexate, Ifosphamide,
Etoposide, Hydroxyurée, Asparaginase, 5-Fluorouracil, 6-Mercaptopurine, Streptozocin et
Cyclophosphamide (212). Concernant les modalités thérapeutiques de la LLC-B, seul le
cyclophosphamide est présent dans cette étude et démontre un effet bénéfique sur la
cytotoxicité NK. En revanche, les analogues de purines présents, qui représentent la classe
d’agent chimiothérapeutique de la Fludarabine, sont délétères pour l’activité cytotoxique NK
(Cladribine, Gemcitabine) (212). Cependant, il est démontré que la Fludarabine affecte peu la
viabilité NK et active la cytotoxicité de ces cellules dans un contexte de LLC-B (213). Il est
également démontré que de petites doses de Cyclophosphamide inhibent de façon sélective
les Treg pro-tumoraux et restaurent les fonctions cytotoxiques des cellules NK et T (165). De
même, l’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, active l’activité cytotoxique NK
et cet impact sur la fonction NK, en termes de production d’IFN-γ, corrèle avec la survie de
patients atteints de tumeurs gastro-intestinales (165, 214). L’action des taxanes dans le cancer
du sein démontre une augmentation de la cytotoxicité NK comparée aux patients non-traités
(215).
En plus d’un effet direct sur la fonction immunitaire NK, certaines chimiothérapies
contrecarrent les stratégies d’ « immunoediting » mises en place par les tumeurs en les
rendant immunogéniques. En ce qui concerne la surveillance NK, cet effet s’est
majoritairement illustré dans la littérature par une expression des ligands de NKG2D. Les
agents genotoxiques (Radiations ionisantes, 5-Fluorouracil, Cisplatin et UVC) ainsi que
l’action d’inhibiteurs de histone déacetylase et de topoisomérase engendrent la surexpression
des molécules MICA et MICB et permettent la lyse NK (165, 166).
90
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
En effet, l’expression des ligands NKG2D est liée au niveau moléculaire à l’activation des
voies de signalisation de dommage à l’ADN, dépendantes de ATM et Chk1 (216). En
parallèle de la lyse par exocytose de granules, la mort engendrée par l’expression des ligands
de mort par les cellules NK est également augmentée par certaines chimiothérapies, telles que
la Mitomycine, 5-Fluorouracil, la Doxorubicine et le Cisplatine, qui induisent l’expression des
récepteurs de mort (166). L’ensemble de ces données tende à démontrer le potentiel clé des
cellules NK dans les réponses anti-tumorales post–chimiothérapie.
91
INTRODUCTION : Surveillance immunitaire anti-tumorale
CONCLUSION
La surveillance anti-tumorale joue un rôle clé dans le contrôle de l’apparition de cancers.
Cependant, l’expansion tumorale est caractérisée par un échappement aux réponses
immunitaires anti-tumorales qui témoigne d’un processus d’immunosélection des cellules
cancéreuses. Cette immunosélection de variants tumoraux non-immunogéniques exerçant une
immunosubversion de la surveillance immunitaire des cancers permet d’atteindre l’étape
d’immuno-échappement essentielle au développement anarchique et exponentiel des tumeurs.
L’ensemble de ces stratégies mises en place par les tumeurs peut être rompue par la
chimiothérapie. Cependant, le point d’équilibre qui existe entre immunosuppression et
restauration de l’immunocompétence reste un élément fondamental du bénéfice apporté par la
chimiothérapie.
92
Objectifs de l’étude
IV. Objectifs de l’étude
La nouvelle vision de la LLC-B, basée sur l’activité proliférative d’une sous-population
nichée au niveau des centres prolifératifs, permet aujourd’hui d’ébaucher de nouvelles
théories sur l’hétérogénéité intra-clonale des cellules de LLC-B. Cependant, l’ensemble des
processus qui conduise cette population à devenir réservoir de la maladie reste à définir. Plus
spécifiquement se pose la question d’une spécificité intrinsèque de migration et de
prolifération
de
ces
cellules
leucémiques
ou
d’une
spécificité
dictée
par
le
microenvironnement spécifique de la LLC-B à ces sites anatomiques ? Au-delà de ces
considérations fondamentales sur la maladie, l’évolution clinique des patients après
traitements où la résurgence de la maladie apparaît inexorable révèle le besoin de cibler
thérapeutiquement les cellules leucémiques chimiorésistantes et persistantes post-thérapies.
A cette fin, les cellules immunitaires ont le potentiel de contrôler la maladie résiduelle
après thérapie et ce, en dépit de l’inhérente immunodéficience qui caractérise la surveillance
anti-tumorale de la LLC-B. En effet, des données scientifiques émergeantes démontrent que la
chimiothérapie peut rétablir une surveillance immunitaire efficace en annihilant les
mécanismes d’immunosélection mis en place par les tumeurs.
Se pose alors la question de la première étude : La compétence du système immunitaire
de la LLC-B est-elle restaurée par le traitement FCR et permet-elle un contrôle de la
maladie résiduelle ?
La réémergence quasi-constante des cellules leucémiques post-thérapie suggère
d’autre part une nouvelle hétérogénéité, potentiellement hiérarchique, du clone leucémique en
termes de chimiorésistance. L’immunophénotypage étant trop variable et restreint, la
recherche de techniques alternatives d’identification des cellules souches et des cellules
initiatrices de cancer a permis de développer des méthodes d’identification fonctionnelles de
ces compartiments « immatures ». La chimiorésistance est une caractéristique intrinsèque des
cellules souches qui peut être mise en évidence par l’efflux du Hoechst 33342 dépendant de
l’activité d’ABCG2.
De ce fait, se pose la question à l’origine de notre deuxième étude : Est-il possible de
révéler une hétérogénéité cellulaire du potentiel chimiorésistant éventuellement
hiérarchique dans la LLC-B en identifiant et caractérisant une population SP dans la
LLC-B ?
93
RESULTATS &
DISCUSSION
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
RESULTATS ET DISCUSSION
I.
La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la
LLC-B : Perspectives d’immunomodulation NK postthérapie.
1. Introduction
Les protocoles thérapeutiques sont connus pour la profonde immunosuppression qu’ils
entraînent.
Cette
dernière
peut
s’avérer
fatale
en
cas
d’infection
opportuniste.
Cette
immunosuppression compromet également le bénéfice de l’impact de la chimiothérapie sur la masse
tumorale, puisqu’elle annihile le contrôle immunitaire de la maladie résiduelle. Il est cependant
clairement établi dans la LLC-B, qu’en l’absence de tous traitements, le système immunitaire est
déficient (217) et présente un défaut des fonctions Tαβ et NK (37). Conformément à la théorie de
régulation extrinsèque des tumeurs (165), ce constat supporte la thèse que la LLC-B pourrait être la
résultante
de
l’expansion
et
de
la
sélection
d’un
clone
non-immunogénique
capable
d’immunosubversion de l’immunité environnante (218). De plus, des données bibliographiques
récentes tendent à nuancer l’impact des chimiothérapies sur la surveillance anti-tumorale et
démontrent un effet bénéfique de celles-ci via l’inhibition de phénomène d’immunosubversion et d’
« immunoediting » (165). Dans ce contexte, se posa la question suivante : Quel est l’impact du gold
standard thérapeutique de la LLC-B (FCR) sur l’immunité de patients atteints de LLC-B ?
Cette étude tend à répondre à cette question au travers de quatre objectifs majeurs :
Quantifier en parallèle de la maladie résiduelle leucémique, les populations immunitaires
effectrices de la surveillance anti-tumorale NK, T CD8, T CD4, Tγδ, et monocytaire.
Evaluer la cytotoxicité naturelle de PBL (Peripheral Blood Lymphocyte) post-thérapie.
Evaluer les capacités ADCC de PBL post-thérapie.
Déterminer de façon corrélative l’impact, en termes de proportion ou d’activité cytotoxique,
des différentes populations immunitaires sur le contrôle de l’évolution de la maladie
résiduelle.
94
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
2. Article I.
Gross E, Ysebaert L, Kühlein E, Blanc A, Corre J, Fournié JJ, Laurent G,
And Quillet-Mary A.
Immune recovery after fludarabine-cyclophosphamide-rituximab treatment in Bchronic lymphocytic leukemia: implication for maintenance immunotherapy.
Leukemia. 2010 24(7):1310-6.
95
Leukemia (2010) 24, 1310–1316
& 2010 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 0887-6924/10
www.nature.com/leu
ORIGINAL ARTICLE
Immune recovery after fludarabine–cyclophosphamide–rituximab treatment in
B-chronic lymphocytic leukemia: implication for maintenance immunotherapy
L Ysebaert1,2,3,6, E Gross1,2,6, E Kühlein4, A Blanc1,2, J Corre5, JJ Fournié1,2, G Laurent1,2,3 and A Quillet-Mary1,2
1
Inserm U563, Toulouse F-31300, France; 2Université Toulouse III Paul-Sabatier, Centre de Physiopathologie de Toulouse
Purpan, Toulouse F-31300, France; 3CHU Toulouse, Hopital Purpan, Service d’Hématologie, Toulouse F-31300, France; 4CHU
Toulouse, Hopital Rangueil, Laboratoire d’Immunologie, Toulouse F-31300, France and 5CHU Toulouse, Hopital Purpan,
Laboratoire d’Hématologie, Toulouse F-31300, France
Thirty B-cell chronic lymphocytic leukemia patients were
treated with fludarabine–cyclophosphamide–rituximab (FCR)
and immune cell counts (natural killer (NK) cells, CD4, CD8, Tcd
and monocytes) were monitored from the end of treatment
(EOT) up to 36 months (M36). Moreover, nonleukemic peripheral blood lymphocyte cytotoxicity (PBL/CTC) as well as
rituximab (RTX)-dependent PBL/CTC was also measured at the
initiation of therapy, EOT and M12. These parameters were
correlated with post-FCR monitoring of the minimal residual
disease (MRD) level in blood using a four-color flow cytometry
technique. FCR induced a profound and sustained depletion of
all T-cell populations, Tcd being the most affected, whereas NK
cells were relatively preserved. Both basal and interleukin-2stimulated nonleukemic PBL/CTC against MEC-2, a CLL cell
line, increased during the post-FCR period. There was no
correlation between immune recovery parameters and MRD
progression profile, except that patients with high post-FCR
CD4 þ counts experienced rapid MRD progression. MRD at M12
predicts clinical relapse. The limited data show RTX-mediated
LBL/CTC activity against autologous B-cell cells in individuals
with o1% residual disease at M12, opening avenues for
immunomodulation post-FCR with anti-CD20 antibodies. To
conclude, our study suggests that MRD increase at M12
precedes disease evolution post-FCR, and should be assessed
as a surrogate marker for proactive management of CLL relapse.
Leukemia (2010) 24, 1310–1316; doi:10.1038/leu.2010.89;
published online 13 May 2010
Keywords: FCR; MRD; immune recovery; NK; antibody-dependent
cellular cytotoxicity; RTX
Introduction
Recent therapeutic successes in B-cell chronic lymphocytic
leukemia (B-CLL) management were achieved by combinations
of purine analogs, alkylating agents and monoclonal antibodies.1 In this regard, the fludarabine, cyclophosphamide,
rituximab (FCR) schedule is now generally considered as one of
the best first-line regimens, yielding a 95% overall response rate
and 52% complete response (CR). Moreover, FCR induces a
molecular response rate as high as 66%.2 However, FCR therapy
results in a profound immunosuppression, mainly due to
neutropenia during the treatment, but also related to severe
and sustained B- and T-cell depletion over the 2-year posttreatment period. FCR-mediated immunosuppression is reflected
by a significant rate of opportunistic infections, which occur
Correspondence: Dr L Ysebaert, CHU Toulouse, Service d’Hématologie, Hopital Purpan, Toulouse F-31300, France.
E-mail: [email protected]
6
These authors contributed equally to this work.
Received 16 September 2009; revised 11 March 2010; accepted 30
March 2010; published online 13 May 2010
during the post-treatment period.1 It has also been proposed that
immunosuppression could also contribute to the emergence of
second malignancies, including leukemia and Richter’s syndrome, which has been observed in the setting of both B-CLL
and Waldenström’s disease.3–5
Whether FCR therapy could affect some specific immune cell
population and natural effector cell function is unknown. This
question is still of interest based on two considerations. First, it
is conceivable that host immune function may contribute to
the control of the disease; for example, B-CLL relapse reflects
escape to innate immunity through proper deficit in natural
killer (NK) or Tgd cell function, which can be further worsened
by treatment.6–8 Second, in the perspective of maintenance
therapy with monoclonal antibodies,9 including rituximab
(RTX), it is important to know whether antibody-dependent
cellular cytotoxicity (ADCC) capacity of natural effector cells
is preserved during the post-FCR period. For this reason, we
have measured at different times immune cell counts (NK,
CD4, CD8, Tgd), in vitro nonleukemic peripheral blood
lymphocyte (PBL) cytotoxicity with or without interleukin
(IL)-2, reflecting NK and lymphokine activated killer (LAK)
function, respectively, as well as RTX-dependent PBL ADCC
against autologous leukemic cells. Finally, these values were
correlated with post-FCR monitoring of the minimal residual
disease (MRD) level in blood used in this study as a parameter of
disease control.
Patients and methods
Patients and treatment
From December 2005 to December 2008, 30 patients with
B-CLL referred to our University Hospital who received FCR as
their frontline treatment were prospectively evaluated on
informed consent (according to the local ethics board recommendations). Treatment initiation was based on the National
Cancer Institute-International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (NCI-IWCLL) criteria, and associated fludarabine
(40 mg/m2 at days 1–3, per os), cyclophosphamide (250 mg/m2
at days 1–3, per os) and RTX (375 mg/m2 at day 1 for course 1,
and then 500 mg/m2 at day 1 for courses 2–6, intravenously).
Response was assessed 3 months after the last FCR course, and
patients were classified according to the NCI-IWCLL criteria,
except for bone marrow biopsy (patients with clinical and
biological evidence of CR are therefore considered as CR or
nodular PR patients). Bone marrow cytological and phenotypical studies were only provided to PR patients, to stratify them as
CRi (incomplete bone marrow recovery) or PRd (disease
related), as described elsewhere.1,10
Immune cell recovery and MRD follow-up post-FCR
L Ysebaert et al
Immunological studies
At different times following treatment completion (end of
treatment, EOT), fresh whole blood was used for immune cell
counts and immunophenotype profile. PBLs were stained with
two combinations of monoclonal antibodies: CD3-FITC/CD8PE/CD45-PerCP/CD4-APC in trucount tubes and TCRVg9d2FITC/CD56-PE/CD3-PerCP-Cy5.5/CD16PE-Cy7/CD45-APC-H7,
purchased from BD Biosciences (Becton-Dickinson France
SAS, Le Pont de Claix, France), gated on CD45/SS, and acquired
on a FACSCANTO II BD. The lymphocyte absolute counts
were obtained directly with the CANTO software on the
trucount tube.
MRD flow cytometry
MRD monitoring after FCR was made according to published
international recommendations.11 MRD levels are given
according to this consensus, as the percentage of positive cells
among total leukocytes with the two four-color combinations
proposed: CD43-FITCint/CD79b-PElo/CD5-PerCP-Cy5.5/CD19APC and CD81-FITClo/CD22-PElo/CD5-PerCP-Cy5.5/CD19-APC.
Monoclonal antibodies were purchased from BD Biosciences.11,12
All MRD data were obtained from fresh blood samples using a
FACSCalibur BD. Acquisition was stopped when all leukocytes
in samples had been processed (a median of 115 000 events
were analyzed). The sensitivity of this assay is one CLL cell among
104 leukocytes. These combinations allowed a distinct determination of B-CLL and normal B cells.
Cell- and antibody-mediated cellular cytotoxicity
The natural cytotoxicity and ADCC function of effector cells
from CLL patients were tested using the classical chromium
release assay. Briefly, PBL from CLL patients were stimulated or
not with recombinant glycosylated IL-2 (10 ng/ml, a kind gift
from Sanofi-Aventis, Toulouse, France) during 3 days in RPMI
10% fetal calf serum at 37 1C, 5% CO2 and used as effector
cells. Target cells (MEC-2 or B cells from autologous patients,
and frozen before treatment) were incubated in RPMI 1% fetal
calf serum for 1 h at 37 1C with 51Cr (Sodium Chromate, Perkin
Elmer, Courtaboeuf, France) (100 mCi for 106 cells). Cells were
then washed and incubated or not with RTX (10 mg/ml) for
15 min at room temperature. Cells were washed again and
plated at 104 cells per well in round-bottom 96-well plates.
Increasing amounts of effector cells were added to triplicate
wells as an NK/target ratio ranging from 0.1:1 to 2:1 depending
on the patients. This ratio was calculated from the NK
percentage obtained by flow cytometric analysis. Control wells
contained only target cells (pre-coated or not with RTX) to
measure spontaneous release or target cells with 0.1% Triton
X-100 to measure maximal release. After centrifugation, plates
were incubated for 4 h at 37 1C with 5% CO2. Then 50 ml were
collected from each well and counted in a gamma counter. The
percentage of specific lysis was calculated as follows: ((sample
release–spontaneous release)/(maximal release–spontaneous
release)) 100.
Statistical methods
Student’s t-test was used for comparison of independent
samples, and Mann–Whitney U-test for comparison of nonparametric variables. All statistical tests were two-sided and used
a P-value of 0.05 for statistical significance. Survival data were
carried out using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK, USA)
according to the Kaplan–Meier method, data being measured 12
1311
months after the completion of FCR treatment (to classify
patients into MRD group A or B). Events relevant for the end
point event-free survival were clinical progression, disease
recurrence or death from any cause, transformation of any kind
(one Richter’s syndrome, one secondary acute myeloid leukemia due to treatment). Data were analyzed as of September
2009.
Results
Patients and clinical follow-up
Patient demographics are described in Table 1. FCR yielded
CR þ nodPR rate as high as 80%, with 10% CRi and 10% PRd
rate (no stable disease or progressive patient). Response rate was
correlated with stage C but not with other clinical or biological
parameters. At 3 months after the last FCR course (EOT), fourcolor flow cytometry peripheral blood MRD level o104 was
obtained in 16 of 30 (53.3%) patients. During follow-up (ranging
from 12 to 46 months with a median of 30 months), 8 disease
progressions occurred (disease-free survival (DFS) for the entire
cohort was 67% at 26 months). In all cases, increase in MRD
4102 was detected at 3–6 months before clinical relapse. On
molecular progression, three patients died (one from Richter’s
syndrome, two from severe sepsis), one needed re-treatment and
four remained treatment-free (owing to Binet stage A disease,
with discrete hyperlymphocytosis and palpable lymph nodes).
Collectively, these results suggest that in the first year post-FCR,
an MRD increase 41% of total leukocytes predicts clinical
relapse.
Table 1
Characteristics of 30 patients treated with FCR as a
frontline regimen
Characeristics
n
Percentage of patients
Binet stage
A
B
C
Median age (years)
Gender (M/F)
Median leukocytosis per ml
2
19
9
30
30
30
6.7
63.3
30
57 (36–69)
70/30
84500
FISH
Del13q alone/normal
Del11q
Tri12
17
8
2
63
30
7
IgVH
MUT/UNMUT
20
40/60
CD38
420%
26
50/50
Response
ORR
CR+nod PR
CRi
PRd
MRD o104 after FCR
30
24
3
3
30
100
80
10
10
53.3
Abbreviations: CR, complete response; CRi, incomplete bone marrow
recovery; Del13q/11q, deletion 13q/11q; F, female; FCR, fludarabine–
cyclophosphamide–rituximab; FISH, fluorescent in situ hybridization;
IgVH, immunoglobulin variable heavy chain gene status (MUT,
mutated; or UNMUT, unmutated); M, male; MRD, minimal residual
disease; nod, nodular; ORR, overall response rate; PR, partial
response; PRd, disease related; Tri12, trisomy 12.
Leukemia
Immune cell recovery and MRD follow-up post-FCR
L Ysebaert et al
1312
MRD level
(% of leucocytes)
MRD group A (n=81)
MRD group B (n=12)
100%
100%
10%
10%
1%
1%
0.1%
0.1%
0.01%
0.01%
<0.01%
<0.01%
EOT
M6
M12
M18
M24
EOT
M6
M12
M18
MRD FU
MRD
Group B
50%
42%
55.5%
40%
50%
p=
A
B
C
no del11q
del11q
MRD
group A
50%
58%
44.5%
60%
50%
MUT
UNMUT
54.5%
50%
45.5%
50%
ns
46%
58%
54%
42%
ns
75%
25%
0.014
MRD group A
Percent surviving
Binet stage
Log-rank p<0.01
FISH :
IgVH
MRD group B
CD38
months
M24
>20%
<20%
MRD <10-4 EOT
ns
ns
Figure 1 Minimal residual disease (MRD) kinetics after completion of FCR therapy. (a) Groups A and B are defined at 1 year of follow-up as
having MRD levels below (a) or above (b) 1% of total leukocytes (set up as a clinically relevant relapse value, represented by a black thick line),
each curve depicting the MRD monitoring from one patient. The value o0.01% symbolizes the threshold of MRD detectability with our flow
technique, and MRD-negative patients are therefore plotted at this value for graphic representation purposes. (b) Disease-free survival (DFS) postFCR according to MRD group. After 1 year of follow-up, MRD groups A and B have statistically different DFS by Kaplan–Meier analysis (log-rank
Po0.01). (c) Correlation between MRD control and disease characteristics. MRD kinetics between EOT and M12 is only correlated with the
quality of molecular response after FCR (MRD EOT o0.01%), not with baseline CLL risk factors. EOT: end of treatment; FCR: fludarabine,
cyclophosphamide, rituximab; M6–24: months 6–24 post-FCR; MRD FU: minimal residual disease follow-up; P ¼ NS: not significant.
Flow cytometry follow-up
MRD was assessed every 6 months for at least 1 year after FCR
completion. At 1 year, 30 of 30 patients were informative. From
EOT, different MRD profiles were observed, but we chose
to classify patients according to the MRD outcome after 1 year
into two groups (Figure 1a). Group A patients had MRD levels
below 1% of total leukocytes (n ¼ 18 of 30), and group B
patients had progressive MRD levels 41% of total leukocytes
(n ¼ 12 of 30) at 12-month (M12) evaluation. Interestingly,
two patients in group A showed progressive decrease in MRD
levels (without receiving any treatment). From M12, group B
had significantly shorter DFS (18 months vs not reached in
group A, log-rank Po0.01) (Figure 1b). Group A and group B
showed no significant differences for Binet stage, del11q, IgVH
mutational status and CD38 expression (data not shown).
However, undetectable MRD at EOT evaluation was predictive
of a favorable molecular outcome over the first year after treatment (P ¼ 0.014) (Figure 1c). These data indicate that patients
with MRD levels remaining o1% of leukocytes did not
experience clinical relapse, suggesting the occurrence of some
immunomodulating events.
Immune subset recovery after FCR
NK, monocytes, T CD4/CD8 and Tgd lymphocyte counts
reconstitution are presented in Figure 2a. FCR induced a sharp
and prolonged decrease in values for all lymphoid subpopulations, compared with the pre-FCR period. The median time
to reach CD4 þ 4200 cells per ml was 6 months (but up to
24 months to reach 400 cells per ml), and the median CD8 þ
levels reached the normal range after 12 months. T Vg9d2
lymphocytes showed profound and sustained depletion.
Leukemia
NK cells were relatively preserved, although they remained
below the normal range (Figure 2). From EOT to M12, NK cells
accounted for up to 32% of PBL, endowed with potential ADCC,
because they express CD16 (Figure 2b). Normal B cells
(Figure 2c, calculated from MRD dot plot analyses) rapidly
increased, to reach almost normal ranges (2–3% of leukocytes,
instead of 3–6%) in the first year post-immunochemotherapy.
The only patient with decreased B cell numbers is the patient
who required second-line treatment at 15 months after FCR.
Altogether, these findings showed that Tgd and CD4 þ T cells
were much more sensitive to FCR than NK cells.
NK function recovery
As NK cells are believed to be important immune effectors
for both disease control and defenses against pathogens, we
investigated whether FCR could have influenced intrinsic NK
function. For this reason, we measured at different times the
natural PBL lysis capacity against MEC-2, a CLL-derived cell
line, at the low effector/target ratio of 0.4:1. As shown in
Figure 3a, we found that resting PBL from healthy donors
showed a modest activity against MEC-2 (4.7±3.5%), the latter
being dramatically boosted when PBLs were stimulated by IL-2
(LAK activity) (24.8±14%). As shown in Figure 3a, when tested
at the overt phase of the disease, resting B-CLL PBL showed
similar cytotoxicity against MEC-2, compared with healthy
donors (1.4±1.1%). However, when IL-2 was used, LAK activity
was much lower, compared with normal healthy donors
(6.5±4.3%, P ¼ 0.004), suggesting that LAK function was
indeed depressed in B-CLL samples (Figure 3a). Moreover, as
depicted in Figure 3b, LAK activity progressively increased
and was totally restored at M12 compared with EOT in eight
Immune cell recovery and MRD follow-up post-FCR
L Ysebaert et al
1313
Absolute count/mm3
Absolute count/mm3
CD4
NK
n=
22
25
EOT
17
M6
8
M12
8
M18
M24
8
n=
M36
27
26
19
13
9
7
EOT
M6
M12
M18
M24
M36
23
M12
10
10
8
M18
M24
M36
n=
24
25
21
9
9
8
EOT
M6
M12
M18
M24
M36
T
NK/CD16 EOT
R2= 0,9564
350
Absolute cell number
24
M6
CD8
Mono
n=
24
EOT
300
250
200
150
100
50
n= 21
EOT
0
0
50
100
150
200
250
300
24
19
11
10
7
M6
M12
M18
M24
M36
M6
M12
M18
350
Absolute cell number
NK/CD16 M12
R2= 0,9158
10
700
Normal B cells
(% of leucocytes)
Absolute cell number
800
600
500
400
300
200
1
0,1
0,01
100
EOT
M24
0
0
100
200
300
400
500
600
Absolute cell number
Figure 2 Time kinetics of absolute numbers of different cellular subsets in the blood of CLL patients following FCR treatment. (a) Each box shows
the median value () and the 25–75% percentiles, and bars represent the range of values. The gray zone within each category represents our
laboratory’s normal values for each cellular subset. (b) Correlation between CD16-expressing cells and CD3CD56 þ NK cells (results shown are
EOT and M12, but are also true at M18 and M24). (c) Normal B-cell recovery (four-color flow cytometry) is rapid and almost reaches the normal
range within 6–12 months). Same representation is used as for MRD kinetics data, and the results shown are percentage of B lymphocytes among
total leukocytes. n: the number of patients analyzed at each time point during follow-up; EOT: end of treatment; M ¼ months.
paired samples (19.9±15.2% vs 4.6±2.4% at EOT, P ¼ 0.02),
as the results were comparable to what was seen with healthy
donors. This result suggests that, whereas the NK function was
altered in B-CLL at the overt phase of the disease, FCR restored
LAK activity (using IL-2) within 1 year after therapy completion.
Correlation between MRD and immune recovery
On the basis of the above results, we investigated whether
immune recovery could influence disease control attested by
the MRD level remaining below 1%. For this reason, we have
compared group A and group B patients for CD4, CD8, NK, Tgd,
Leukemia
Immune cell recovery and MRD follow-up post-FCR
L Ysebaert et al
1314
p=0.004
p=0.02
50
p=0.002
-IL-2
+ IL-2
40
30
p=0.02
20
10
0
Normal donors
CLL before FCR
CD4+ ber absolute numb
% specific cytotoxicity
p=0.03
p
p=0.02
% specific cytotoxicity
50
p=0.01
-IL-2
+ IL-2
MRD
n=
40
group B
12
Figure 4 Low median CD4 þ T-cell count at EOT is predictive of
good disease control during the first year post-FCR (MRD remaining
below 1% of total leukocytes), according to the Mann–Whitney
analysis in 26 available patients (P ¼ 0.02). EOT: end of treatment.
30
20
p=0.002
10
EOT
M12
Figure 3 Natural cytotoxic capacities of CLL patients’ PBL recovered
after FCR. (a) Comparison of natural cytotoxicity (IL2) or LAK ( þ IL2)
activity of PBL taken from 8 CLL patients (just before receiving FCR) or
10 healthy donors against the MEC-2 cell line. Effector/target ratio
shown is always 0.4:1, and lysis experiments were carried out as stated
in the Patients and methods section. (b) LAK activity against MEC-2 is
restored in the first year post-FCR treatment. PBL from eight CLL
patients were collected at EOT and M12, and lysis experiments were
carried out. Paired t-test analyses indicate a significant recovery of LAK
activity at M12 post-FCR. EOT: end of treatment; FCR: fludarabine,
cyclophosphamide, rituximab; IL-2: interleukin-2; M12: 12 months
after FCR.
PMN counts, as well as for NK and LAK activities against
MEC-2, measured at EOT, M6 and M12. As illustrated in
Figure 4, group A showed significantly lower CD4 þ counts at
EOT (median ¼ 133 vs 225 per ml, n ¼ 26, P ¼ 0.02), and a slow
CD4 þ T-cell recovery during the first year post-FCR (median
at M12: 233 vs 419 per ml, n ¼ 25, P ¼ 0.02). We found no
correlation with the other parameters at any other time point,
including NK or LAK function (data not shown). Best CD4 count
cutoffs to predict DFS were o150 per ml at EOT (DFS 30 vs
16 months, P ¼ 0.008), and o300 per ml at M12 (DFS from
M12 post-FCR: 19 vs 7 months, Po0.01).
PBL cellular cytotoxicity against autologous B-CLL cells
after FCR
On the basis of the above findings, which indicated that the
NK/LAK function was improved during the first year post-FCR,
we speculated that PBL from CLL patients treated with FCR
could exert potent RTX-mediated ADCC against autologous
leukemic cells. From unpaired analyses, we first compared
RTX-ADCC ±IL-2 from CLL patients before and 12 months after
FCR, but detected no statistical difference (mean RTX-ADCC
þ IL-2 was 8.1±4% at baseline vs 18±12% at M12, n ¼ 6). We
then focused on these six patients at M12 (three from each MRD
% specific cytotoxicity
0
Leukemia
group A
14
40
MRD group A (M12)
p=0.03
MRD group B (M12)
30
20
10
0
CLL
CLL RTX
CLL RTX
IL-2
Figure 5 Rituximab-mediated ADCC against autologous CLL cells.
PBL from six patients (three in group A, and three in group B) were
collected 1 year after completion of FCR, and assessed for natural
cytotoxicity (control) and ADCC with RTX with or without IL-2, against
autologous CLL cells (frozen before FCR treatment) as targets. Results
shown are mean cytotoxicity (±s.d.) at a calculated effector/target
ratio of 0.4:1.
group, A and B). Against autologous B-CLL cells, group A
patients show statistically different RTX-ADCC (28.8±7% vs
8.1±2.8% in group B, P ¼ 0.03, Figure 5). These results suggest
that although the LAK function was dramatically improved by
FCR therapy, NK remained ineffective against the leukemic
clone, unless being used in association with RTX, which may
redirect intrinsically efficient NK cells toward their targets, or
trigger secondary signals resulting in boosting their cytolytic
function.
Discussion
Although FCR has become one of the major standards for B-CLL,
scarce information is available on long-term immune reconstitution after therapy. Recently, concerns about FCR-induced
immunosuppression were raised about the relatively high rate of
opportunistic infection during the post-FCR period.1 We also
Immune cell recovery and MRD follow-up post-FCR
L Ysebaert et al
1315
addressed the kinetics of MRD levels after FCR, and its
relevance for the prediction of clinical relapse. Correlative
studies between both recovery data (immune cells and MRD)
point toward a putative role of the immune system in the control
of CLL post-FCR.
Unsurprisingly, we have found that FCR induced a severe and
prolonged depletion of all T-cell subsets. Previous studies have
largely documented the sensitivity of CD4 and CD8 T cells to
fludarabine.13,14 However, the impact of the drug on Tgd subset
has not so far been reported. These cells were found to be even
more sensitive than Tab cells. The extent to which severe Tgd
depletion contributes to FCR-associated opportunistic infection
remains to be determined. This question is of interest because of
the introduction of phosphoantigen-based preparations able to
expand in vivo Tgd cell population.9 Interestingly, NK cells were
relatively preserved. This observation is in sharp contrast with
alemtuzumab therapy, which was found to be harmful toward
NK cells.15 PBLs derived from B-CLL patients have much lower
cellular cytotoxic capacity, compared with those from healthy
donors. As NK cells support most, if not all, PBMC natural
cytotoxicity,16 this observation suggests that, before treatment,
NK basal function is profoundly altered in B-CLL. Decrease in
NK-mediated B-CLL lysis has been largely described. However,
it remains unclear whether CLL cell natural resistance or
decreased function of B-CLL patient NK cells has the more
important role. Our study shows that NK activity in autologous
RTX-ADCC improved during the post-FCR period in some
patients (who could benefit from RTX maintenance treatment),
but remained very low in others, suggesting that these latter
patients are endowed with highly NK-resistant CLL cells.
MRD eradication during and post-FCR is predictive of better
outcome in the CLL8 trial. Extensive data on MRD monitoring
post-FCR are lacking. Such data collected after bone marrow
grafting procedures indicated MRD increase as a good
predictive marker for clinical relapse.17–19 In our cohort of 30
patients, 8 out of 12 patients from group B (MRD 41% at M12)
suffered a relapse, with increasing levels of MRD 41% being
always detected 3–6 months before clinical relapse. MRD
monitoring at 12 months after FCR identified patients with a
high relapse risk, who could benefit from investigational
treatments aiming to prevent overt relapse. The choice of
MRD threshold is nonetheless questionable. Using a 0.05%
threshold (as proposed recently in the post-allograft setting19),
four patients from group A would fall into group B, none with
overt clinical relapse (despite 424 months of follow-up). Thus,
the size of our cohort may limit the significance of a 1%
threshold: the main message is clearly that MRD monitoring
should be implemented in the follow-up of FCR patients
because of its relevance in predicting clinical evolution of the
disease. Another interesting result suggests a negative impact of
CD4 þ cell recovery on molecular disease control. This
observation is in agreement with another study presented very
recently.20 The significance of these observations remains
unclear. They may simply reflect a surrogate biomarker of FCR
efficacy against lymphocytes. Characterization of these CD4 þ
cells was beyond the scope of this study. It seems unlikely that
these cells are CD4 þ Treg, which could have thus facilitated
tumor cell escape. Indeed, Treg cells are exquisitely sensitive to
fludarabine and indeed efficiently depleted by this drug.14
Alternatively, it is possible that these CD4 þ cells correspond to
an expansion of cytokine-producing cells, which may exert a
direct helper function toward tumor cells, as for example
CD4 þ CD154 þ cells, a subset that was found to facilitate
proliferation, survival and immuno-escape of CLL cells.21 CD4
monitoring cannot be considered as a surrogate marker for MRD
evolution of course, but future strategies aiming at modulating
CD4 þ subsets (Tregs, Th17) may prove of interest in CLL.
In a view of immunomodulation strategies early post-FCR, we
present data indicating that natural effectors, presumably NK
cells, exert in the presence of RTX cellular cytotoxicity against
autologous leukemic cells. Interestingly, such RTX-mediated
ADCC of patient PBL improved during the post-FCR period and
reached levels comparable to that of normal healthy donors
(data not shown). We believe that ADCC increase is due to
enhanced NK function during the same period of time. This
finding is important to consider because ADCC is the major
mechanism by which RTX exerts its anti-leukemic effect. This
consideration, combined with the observation that MRD control
during the 1-year post-FCR period seems to be critical for future
clinical outcome, argues for the use of RTX as maintenance or
consolidation therapy during the first year following FCR
completion. RTX-based maintenance therapy is currently being
tested in the setting of FCR-treated B-CLL (French collaborative
CLL2007-SA phase III trial). Whether these studies will confirm
our hypothesis is still unknown. Our study also suggests that this
strategy should benefit from co-administration of NK-stimulating
cytokines such as IL-2,22 IL-1523 or IL-2124 or drugs susceptible
to enhance NK function, such as Lenalidomide.25
To conclude, our study shows that FCR therapy induces a
severe and prolonged T-cell depletion; however, NK cells
are less affected and NK function even increases 1 year after
treatment, with potential autologous RTX-ADCC restoration.
We also provide evidence that MRD monitoring the first year
post-FCR is of clinical importance to predict relapses and
manage preemptive therapeutic strategies. Altogether, these
results support the use of anti-CD20-based maintenance
therapy in B-CLL to maintain low levels of MRD, prolong PFS
and perhaps improve survival.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgements
We are grateful to the patients who participated in the study and
their referring physicians. We also thank Pr C Récher for a critical
reading of the paper. This work was supported by grants from
INSERM and Association Laurette Fugain (ALF/No 07-05).
We thank F Hoffmann-La Roche Ltd for providing rituximab used
in our experiments. EG is the recipient of a grant from Ministère
délégué à l’Enseignement supérieur et à la Recherche.
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RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
3. Discussion Article I.
L’inhérente
immunodéficience
de
la
LLC-B,
témoignant
du
processus
d’immunosélection du clone leucémique au cours de sa progression, est un frein à toutes
tentatives d’immunothérapie de cette hémopathie (217). La chimiothérapie, bien qu’étant
majoritairement documentée comme étant immunosuppressive, a le pouvoir de reverser la
tolérance immunitaire aux cellules de LLC-B en inhibant les processus d’immunosubversion
et d’ « immunoediting » (165). Au cours de cette étude, nous démontrons le bénéfice de la
chimiothérapie sur la fonction immunitaire NK au travers de la persistance des cellules NK
post-thérapie, de la restauration de leur potentiel cytotoxique et de l’amplification de ce
phénomène par l’ADCC du Rituximab. Néanmoins, en faveur d’un rétablissement précoce
des
phénomènes
d’immunosubsersion
par
les
cellules
leucémiques
réémergentes,
l’augmentation de l’ADCC en présence d’IL-2 apparaît partiellement inhibée. Nous révélons
également que la présence accrue de cellules CD4+, potentiellement à l’origine de ces
événements immunosubversifs, accompagne la réémergence des cellules leucémiques
progressantes.
3.1
La reconstitution immunitaire post-FCR est marquée par une prédominance du
compartiment NK.
De façon attendue, toutes les populations lymphocytaires T sont fortement touchées par
le traitement FCR. En effet, l’immunosuppression des cellules Tαβ induite par le
Cyclophosphamide et la Fludarabine est largement documentée dans la littérature (219-221).
La reconstitution immunitaire post-FCR des cellules TVγ9δ2 circulantes reste cependant sans
précédent bibliographique. Etant donné la prévalence et l’importance biologique du sousgroupe TVδ1 (191), il aurait été intéressant de déterminer également l’influence du traitement
FCR sur cette population impliquée de façon atypique dans la surveillance immunitaire de la
LLC-B.
De façon très intéressante, les cellules NK et monocytaires sont relativement bien
préservées. Cette reconstitution précoce des cellules NK est également documentée dans des
cas de lymphoablation par chimiothérapie et lors de transplantation de cellules souches
hématopoïétiques (166).
96
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
Dans ce dernier cas, les cellules NK reconstituées de façon précoce émergent de progéniteurs
CD34+, présentent un phénotype immature et sont essentiellement sécrétrices de cytokines
(166). Dans des cas de chimiothérapies immunosuppressives, il est possible que cette
population de cellules NK immatures soit sélectionnée et que leur statut primitif leur
permettent de résister à l’action des agents chimiothérapeutiques. Supportant la thèse d’une
résistance innée aux traitements chimiothérapeutiques contenue dans le compartiment NK, il
est décrit que les cellules NK murines issues de la rate surexpriment le transcrit d’ABCG2, un
transporteur impliqué dans l’efflux de drogues chimiothérapeutiques (140). L’expression
protéique de ce transporteur pour les NK humains circulants, conférant une chimiorésistance
multiple reste à être démontrée cependant.
Quelque soit le mécanisme de résistance du compartiment NK, effecteur majoritaire de la
cytotoxicité naturelle PBL, l’expérience de la chimiothérapie associée à la résistance de la
population NK permettent d’établir, in vivo, de nouveaux rapports effecteurs/cibles en faveur
de la population effectrice.
3.2
La chimiothérapie permet de restaurer les compétences cytotoxiques NK
La cytotoxicité naturelle des PBL issus de patients LLC-B est, à l’état basal (avant
chimiothérapie), significativement inférieure à la cytotoxicité naturelle des PBL issus de
donneurs sains, et cela même en présence d’une stimulation préalable à l’IL-2. Le défaut
d’activité cytotoxique qui caractérise ces cellules NK issues de patients LLC-B est corroboré
par de nombreuses études (209, 210, 222, 223). En s’inspirant de la thèse d’immunosélection,
ce défaut est probablement la résultante de l’immunosubversion exercée par les cellules
leucémiques via la sécrétion de facteurs solubles qui engendrent l’inhibition de la cytotoxité
NK (209). Dans notre étude, on observe cependant la réversion de ce phénomène 12 mois
post-FCR. Trois hypothèses interconnectables et cumulables sont envisageables pour
expliquer cette restauration de l’activité cytotoxique NK : (i) la mort des cellules leucémiques
a rompu les dialogues immunosubversifs entre cellules leucémiques et cellules NK et/ou
cellules NK et cellules immunosuppressives du microenvironnement (ii) l’expérience de la
chimiothérapie traduite par la mort ou la modification de l’immunogenecité des cellules
leucémiques engendre un effet immunostimulant (iii) les agents chimiothérapeutiques
induisent de façon directe une augmentation de l’activité cytotoxique NK.
97
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
En ce qui concerne les stratégies d’immunosubversion, la sécrétion de facteurs
immunosuppressifs tels que le TGF-β, les ligands du NKG2D, l’IL-10 et l’IL-6 par les
cellules leucémiques est clairement établie dans la LLC-B (169-171, 211). L’étude de
l’expression de surface des récepteurs activateurs et inhibiteurs NK pourrait être indicatifs de
la présence de tels phénomènes. Dans ce contexte, des études préliminaires au sein du
laboratoire démontrent que le TGF-β présent dans le sérum des patients LLC-B induit une
diminution du NKG2D à la surface des cellules NK. De plus, la perte de composants
cellulaires non-tumoraux immunosuppressifs de l’activité NK (Treg) est également une thèse
possible, notamment en présence de Cyclophosphamide (165).
Bien que cette étude se concentre en particulier sur les fonctions effectrices, la
chimiothérapie a le potentiel de moduler l’immunogénicité des cellules leucémiques
résiduelles. En effet, les études élégantes ménées par Raulet et al., démontre que les
dommages à l’ADN induits par les agents génotoxiques conduisent à la surexpression de
ligands du NKG2D (216). Afin de valider cette hypothèse, l’étude de l’expression des ligands
majeurs de la cytotoxicité NK (MICA, MICB, ULBP1-4, LFA-1, HLA-ABC, HLA-E) à la
surface des cellules leucémiques appartenant à la maladie résiduelle validerait cette
hypothèse. Cependant, le nombre limité de cellules et la définition du temps après traitement
relevant pour cette étude rend cette hypothèse complexe à valider expérimentalement.
Enfin, la thèse d’une action directe bénéfique des agents chimiothérapeutiques sur
l’activité NK repose en partie sur la démonstration qu’in vitro des doses thérapeutiques de
certains agents chimiothérapeutiques n’affectent pas la viabilité des cellules NK et améliorent
leur activité cytotoxique (Methotrexate, 6-Mercaptopurine, Etoposide, Fludarabine) (212,
213). Bien que ces études démontrent que le Cyclophosphamide n’affecte pas la fonction NK,
l’effet conjoint des trois composants du FCR in vivo n’apparaît pas délétère sur la cytotoxicité
naturelle dans notre étude.
3.3
Implication des cellules CD4+ dans la rechute post-thérapeutique
Le groupe de patients testé dans l’étude a été divisé en deux sur la base de la MRD <
1% à la fin du traitement. Ce seuil prédit l’absence de rechute dans les deux années
consécutives au traitement.
98
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
De façon intéressante, les patients présentant ce pronostic favorable sont caractérisés par un
faible nombre absolu de cellules CD4+ et une reconstitution lente de cette population. A
l’inverse, la progression leucémique, qui caractérise le groupe de patients au pronostic
défavorable (MDR>1%), est accompagnée d’une reconstitution rapide et d’une présence
accrue des cellules CD4+.
Afin de déterminer le rôle exact de ces cellules CD4+ dans le pronostic péjoratif de la
progression leucémique post-traitement, il est nécessaire de mener une étude approfondie de
leur phénotype. Quantité de données contenue dans la littérature décrive le rôle ambigu des
différentes populations CD4+ et permette de définir quelques hypothèses sur l’identité
potentielle de ces cellules CD4+ favorisant la rechute dans notre étude.
Les plus documentées sont les cellules CD4+CD25+ T régulatrices (Treg) qui exercent une
immunosuppression des effecteurs de l’immunité anti-tumorale dans divers cancers.
Cependant, leur extrême sensibilité à l’action du Cyclophosphamide (165) tend à infirmer
cette hypothèse, bien qu’il ait été démontré récemment que les Treg issus de patients LLC-B
sont plus résistants à l’apoptose induite in vitro que les Treg issus de donneurs sains (224).
De façon analogue aux T régulateurs, les cellules CD4+ NKG2D+, qui apparaissent dans
des microenvironnements riches en ligands solubles du NKG2D, tel celui de la LLC-B,
entretiennent également une immunosuppression (223).
L’action pro-tumorale des cellules CD4+ ne s’exerce pas uniquement au niveau de
l’immunosuppression. Ces cellules mènent également une action favorisant la survie, la
prolifération et la migration des cellules cancéreuses.
Les cellules Th17, récemment décrites, font partie de cette dernière catégorie en exerçant
un rôle double dans l’immunité anti-tumorale (activation des effecteurs de la surveillance des
cancers) et pro-tumorale (sécrétion de facteurs permettant la progression tumorale) (225).
Potentiellement promotrices de la leucomogenèse post-FCR, leur interaction avec les cellules
de LLC-B n’a jamais été décrite.
En revanche, il existe un sous-groupe de cellules T accessoires CD4+CD154+ qui au
niveau des centres prolifératifs, est un composant essentiel du microenvironement de la LLCB. Par extrapolation de ces connaissances sur le microenvironnement de la LLC-B, il est
envisageable que les cellules CD4+ accessoires, telles celles que l’on retrouve au niveau des
ganglions, assurent la survie du clone leucémique survivant post-FCR dans la fraction
circulante en fournissant des signaux IL-4 et CD40L (44-46).
99
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
L’impact connu de ces signaux sur la progression, la survie et l’acquisition d’un profil antiapoptotique chimiorésistant par les cellules leucémiques laisse suggérer l’importance de ces
cellules CD4+ dans la réémergence du clone leucémique post-chimiothérapie (86-88, 90).
Cette présence augmentée de cellules CD4+ qui accompagne la progression leucémique
post-thérapeutique fait sens avec l’étude de N. Chiorazzi qui démontre que l’expansion d’une
population T autologue (dont le phénotype n’est pas mentionné dans l’étude) est nécessaire à
la xénogreffe de cellules de LLC-B (47).
3.4
Perspectives d’immunomodulation par l’ADCC du Rituximab
Dans notre étude, l’ajout de Rituximab dans des systèmes autologues de lyse augmente
considérablement la lyse des cellules leucémiques avec des PBL obtenus post-FCR. Ces
données ADCC combinées à l’amélioration de la lyse spontanée post-chimiothérapie justifie
l’intérêt thérapeutique de moduler la fonction NK post-chimiothérapie. Les anticorps
monoclonaux, les inhibiteurs du protéasome, les agents deméthylants, les inhibiteurs d’histone
déacetylase et les IMIDS sont des agents immunomodulateurs utilisés en thérapie ou en essais
de phase clinique. Les inhibiteurs du protéasome, agents déméthylants et inhibiteurs d’histone
déacétylase permettent d’amplifier l’immunogénicité des cellules tumorales en augmentant
notamment l’expression des ligands du NKG2D. Cependant, leur activité négative directe sur
la fonction NK reportée dans certaines études dicte une approche plus globale de réflexion, en
définissant des doses suffisamment faibles pour être sans effet sur la fonction effectrice tout
en conservant la modulation de l’immunogénicité des cellules cibles (190). Les IMIDs
stimulent les fonctions effectrices anti-tumorales, notamment NK (190). Leur utilisation en
conjonction avec le Rituximab est cependant contre-indiquée par l’étude de Lapalombella et
al. (2008) qui démontre un effet négatif du Lenalinomide sur l’expression du CD20 et
l’ADCC des cellules de LLC-B (226). Enfin, les anticorps monoclonaux, tels que le
Rituximab ou encore les anti-CD20 « nouvelle génération », dotés d’une propension plus forte
à générer de l’ADCC, sont des agents immunomodulateurs très efficaces puisqu’ils ont la
possibilité de cibler le compartiment leucémique uniquement et qu’ils engagent la
signalisation cytotoxique NK la plus puissante (CD16 dépendante) (36). Enfin, la possibilité
d’accroître la population effectrice TVγ9δ2 par administration de phosphoantigène représente
une option d’immunomodulation et d’amplification de l’ADCC dans la LLC-B (192).
100
RESULTATS ET DISCUSSION : La reconstitution immunitaire après traitement FCR dans la LLC-B :
Perspectives d’immunomodulation NK post-thérapie
Dans notre étude, une disparité de réponse persiste, cependant, entre groupe A (MRD
<1%) et groupe B (MRD>1%) au niveau de l’activité ADCC en présence d’IL-2. Celle-ci est
amplifiée fortement pour le groupe A et quasiment sans effet pour le groupe B. La thèse de
phénomène d’immunosubversion est encore valable pour expliquer ce phénomène. Cette perte
de réponse à l’IL-2 peut-être expliquée, à partir des éléments obtenus dans cette étude, par une
activité immunosuppressive conjointe ou non des cellules CD4+ survivantes et/ou du clone
leucémique progressant.
3.5
Facteurs influents la MRD
Dans cette étude, le facteur MRD<1% à la fin du traitement est l’unique paramètre qui
détermine l’absence d’évolution clinique (survie sans progression) dans les deux années qui
suivent le traitement. Dans la LAM, il est clairement établi que ce sont les cellules NK, en
termes de proportion et d’activité, qui sont garantes de la rémission post-chimiothérapie et de
l’absence de rechute (166). Exceptée une corrélation avec une présence élevée de cellules
CD4+ discutée préalablement, la présence de MRD >1% n’est pas corrélée à un défaut
quantitatif de reconstitution immunitaire. Cependant, au niveau fonctionnel, la perte de
réponse à l’IL-2 des cellules NK du groupe progressant suggère l’importance de la
surveillance immunitaire de la MRD.
Dans ces travaux, la preuve de concept du bénéfice que peut apporter la chimiothérapie
FCR à la surveillance immunitaire de la LLC-B est introduite. En plus d’un établissement
nouveau de rapport effecteurs/cibles en faveur de la fraction effectrice, la restauration de la
cytotoxicité NK et la reconstitution rapide du compartiment NK après traitement permettent
d’envisager l’immunomodulation NK post-thérapie. Cependant, la progression leucémique
réémergeante post-thérapie semble déjà dotée d’un potentiel immunosubversif comme
l’atteste la perte de réponse des cellules NK en présence d’IL-2. L’identification des dialogues
cellulaires immunosuppressifs dans la LLC-B liés ou non à la présence augmentée de cellules
CD4+ est essentielle pour permettre l’élaboration de stratégies d’immunothérapie efficaces sur
les patients en rechute.
101
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
II.
La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose
sur l’existence de cellules SP innées et acquises.
1. Introduction
En dépit de progrès thérapeutiques constants, la LLC-B reste une maladie incurable
caractérisée par l’invariable résurgence du clone leucémique post-thérapie. Ce constat
purement clinique suggère l’existence d’un compartiment leucémique chimiorésistant dont
l’éradication a le potentiel de conditionner les succès thérapeutiques futurs. L’état actuel de la
littérature concernant la chimiorésistance des cellules de LLC-B repose sur la signature
cytogénétique, les défauts d’apoptose intrinsèques, l’activation de voies de survie modulées
par les composants du microenvironnement, et l’activité enzymatique naturelle et acquise de
MDR1/ABCB1. L’ensemble de ces études tende à déterminer de façon globale des
mécanismes cellulaires représentés de façon homogène au sein du clone leucémique. Dans
cette étude, nous avons émis l’hypothèse que la résurgence post-thérapeutique du clone
leucémique résulte de la dynamique de régénération d’une sous-population chimiorésistante.
Dans cette théorie, la chimiorésistance de la LLC-B est basée sur l’identification d’une
hétérogénéité, potentiellement hiérarchique, du clone leucémique, où une sous-population
multi-résistante « réservoir » maintient la pérennité de la progression leucémique en assurant
la reformation du compartiment majoritaire chimiosensible après traitements.
Combinant chimiorésistance, hiérarchie et hétérogénéité cellulaire, les cellules SP
représentent un compartiment cellulaire naturellement chimiorésistant dont le déterminisme
moléculaire dépend de l’activité d’ABCG2 (140). Ce compartiment mineur, représenté dans
divers tissus sains et tumoraux, enrichi la fraction cellulaire immature des tissus bien que
certains exemples de types cellulaires différenciés dérogent à cette règle (227).
Dans ce contexte, trois questions fondamentales s’imposent : Existe-t-il une
hétérogénéité du clone leucémique révélable par le phénotype SP ? La SP LLC-B est-elle
chimiorésistante ? Quelle est la dynamique des cellules SP à générer des cellules non-SP ?
Cette étude tend à apporter des éléments de réponses à ces trois questions aux travers
de six objectifs de recherche :
Evaluer l’existence et quantifier la proportion de cellules SP sanguines chez
des patients n’ayant jamais été traités.
102
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Définir, par le phénotype et la recherche d’anomalies cytogénétiques, le statut
leucémique et clonal de la population SP.
Définir un marqueur de surface et/ou une signature moléculaire spécifique(s)
de la population SP.
Evaluer la résistance du compartiment SP aux traitements conventionnels de la
LLC-B in vitro.
Evaluer la relevance du modèle de chimiorésistance par l’étude d’échantillon
de patients après traitement.
Etablir la capacité des cellules SP à générer des cellules non-SP (compartiment
majoritaire de la maladie).
2. Article II.
Gross E, L’Faqihi-Olive FE, Ysebaert L, Brassac M, Struski S,
Kheirallah S, Fournié JJ, Laurent G,
And Quillet-Mary A.
B-Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) chemoresistance involves innate and
acquired leukemic Side Population (SP) cells.
Leukemia 2010, 24(11):1885-92.
103
Leukemia (2010) 24, 1885–1892
& 2010 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 0887-6924/10
www.nature.com/leu
ORIGINAL ARTICLE
B-chronic lymphocytic leukemia chemoresistance involves innate and acquired
leukemic side population cells
E Gross1, F-E L0 Faqihi-Olive2, L Ysebaert1,3, M Brassac1, S Struski4, S Kheirallah1, J-J Fournié1, G Laurent1,3
and A Quillet-Mary1
1
INSERM, U563, Toulouse, F-31300 France and Université Toulouse III Paul-Sabatier, Centre de Physiopathologie de Toulouse
Purpan, F-31300 France; 2IFR150-BMT, Toulouse, F-31300, France; 3CHU Toulouse, Hôpital Purpan, Service d’Hématologie,
Toulouse, F-31300 France and 4CHU Toulouse, Hôpital Purpan, Laboratoire d’Hématologie, Toulouse, F-31300 France
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) therapy remains
unsatisfactory due to repeated resurgences of the chemoresistant disease. In this study, we investigated the basis of
this chemoresistance by applying the ‘side population’ (SP)
analysis to blood samples from B-CLL patients. We report the
existence of few natural SP cells, which harbors phenotypic
and cytogenetic hallmarks of B-CLL in most patients with this
disease (n ¼ 22). SP cells appeared resistant to conventional
B-CLL treatments, such as Fludarabine, Bendamustin or
Rituximab. Indeed, treatment with Fludarabine (16/18 cases)
or Bendamustin (5/7 cases) resulted in complete elimination of
non-SP, whereas cells displaying the SP phenotype were the
only surviving. Although some B-CLL SP cells were innately
chemoresistant, chemotherapy by Fludarabine selected not
only innate SP cells but also induced some acquired SP cells,
which arose from non-SP by drug-driven evolution. This SP
selection by chemotherapeutic treatments is further supported
by the overall increase of the SP percentage in patients who
experienced chemotherapy in the preceding year. Functionally,
proliferative stimulation of SP cells was able to partially
replenish in vitro the non-SP cell compartment of the B-CLL
disease. The chemoresistance of B-CLL relies, in our model, on
the cellular heterogeneity of B-CLL SP cells and on their
regenerating dynamics.
Leukemia (2010) 24, 1885–1892; doi:10.1038/leu.2010.176;
published online 9 September 2010
Keywords: ABC transporters; B-CLL; chemoresistance;
side population
Introduction
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is a quite unique
cancer characterized by a progressive accumulation of
quiescent CD19 þ CD5 þ CD23 þ B-cell clones in the blood,
bone marrow and lymphoid tissues. This disease is still considered as incurable, despite the introduction of Fludarabinebased combinations. Indeed, Fludarabine yields high response
rates when combined with monoclonal antibodies or other
drugs as first-line therapy,1–3 but does not avoid the mostly
invariable relapses4 due to progressive outgrowth of B-CLL
cells increasingly resistant to the successive lines of therapy.
A complete eradication of the leukemic clone is therefore
mandatory to definitively stop the striking evolution of the
B-CLL disease. To this aim, a better knowledge of the innate and
acquired cellular pathways leading to B-CLL chemoresistance
is warranted.
Correspondence: Dr A Quillet-Mary, CPTP, INSERM U563, CHU
Purpan, BP3028, Toulouse 31024, France.
E-mail: [email protected]
Received 18 May 2010; revised 24 June 2010; accepted 6 July 2010;
published online 9 September 2010
In the past, B-CLL chemoresistance has been attributed to
intrinsic apoptotic defects5,6 and to both genuine and adaptive
(drug-induced) activity of the MDR1/ABCB1 protein.7 In this
study, we hypothesized that the progressive development of
B-CLL chemoresistance might result from dynamics of heterogeneous chemoresistant cell subsets in addition to the mere
acquisition of an enzymatic activity. More precisely, posttherapeutic B-CLL relapse could uncover a hierarchical
organization of the whole B-CLL cell population, in which a
discrete and multiresistant leukemic cell compartment repeatedly replenishes the main chemosensitive B-CLL cell population
after treatment(s).
A very minor cell compartment from various tumors8–13
and normal tissues14–17 comprises naturally chemoresistant
(ABCG2 þ ) cells, with high dye-efflux capacity, that are referred
to as ‘side population’ (SP) cells.14,18 Although sorting the
SP cells usually enriches for a subset displaying stemness
features,8,9–13,14,18 this phenotype is not only exclusively restricted to stem cells19 but also shared by some differentiated
cells.20,21 In this study, we tracked chemoresistant subsets
of B-CLL cells by the SP technique to clarify the dynamics
of chemoresistance in this disease. Our study confirms the
existence of Fludarabine-resistant leukemic SP cells in B-CLL, as
established recently by Foster et al.22 In addition to uncovering
both innate and acquired cell compartments with SP phenotype,
this report addresses the question of polyresistance displayed
by the B-CLL SP cells and demonstrates the prevalence of this
population in post-therapeutic B-CLL samples. Finally, this study
attempted to characterize SP cell dynamics underlying successive B-CLL relapses with progressive chemoresistance. Thus,
both innate and acquired SP cells represent as major actors of
the B-CLL pathogenesis and important therapeutic targets.
Methods
B-CLL samples and culture
Peripheral blood samples were collected from 22 untreated and
5 previously treated B-CLL patients after obtaining informed
consents and approval from the Toulouse University Medical
Center Ethic Committee. B-CLL diagnosis was carried out by
morphology and immunophenotype (Matutes score of 4/5).
Briefly, mononuclear cells were separated by Ficoll centrifugation and analyzed or purified for SP by flow cytometry.
For western blotting experiments, B-leukemic cells were purified
by magnetic separation according to the manufacturer’s
instructions (Stem cell Technologies, Grenoble, France). For
in vitro treatments, cells were cultured in RPMI containing 10%
fetal calf serum at 1 106 cells/ml in the presence or absence of
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1886
Fludarabine (2 mg/ml) (Schering SA, Loos, France) during 7 days,
Bendamustin (50 mg/ml) (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)
during 3 days or Rituximab (Hoffmann La Roche Ltd, Basel,
Switzerland) 10 mg/ml during 7 days. For proliferation assay,
cells were labeled with 1 mM of carboxyfluorescein succinimidyl
ester (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) at 37 1C during 10 min
and were subsequently treated or not with 250 nM of DSP30 (CpGODN) (Sequence: 50 -TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC-30 )
(TIB MOLBIOL, Berlin, Germany) in combination with 50 ng/ml of
recombinant glycosylated interleukin (IL)-2 (kind gift from SanofiAventis, Toulouse, France) in RPMI containing 10% fetal calf
serum during 7 days.23,24
were obtained by treatment with Fludarabine during 7 days
and subsequent sorting of 7-amino-actinomycin D/CD56/CD3/
Hoechst 33342-negative phenotype. Cells were then washed
with cold phosphate-buffered saline and resuspended into
Laemli buffer 1. The protein extracts were processed according to western blot standard procedure. The different antibodies used in this study were as follows: anti-BMI-1 (Ozyme,
Saint-Quentin en Yvelines, France), anti-ABCG2 (Abcam, Paris,
France) and a-tubulin (Sigma). Horseradish peroxidaseconjugated secondary antibodies against rabbit, rat or mouse
immunoglobulins were from Jackson Immunoresearch Laboratories (Jackson Immunoresearch Laboratories, Suffolk, UK).
Flow cytometry
On the basis of the protocol designed by Goodell et al.,14
primary B-CLL cells were stained with 5 mg/ml of Hoechst
33342 dye (Invitrogen) with or without pre-incubation with
ABC transporter inhibitors (Verapamil, Fumitremorgin C and
Reserpine) (Sigma) during 90 min at 37 1C under agitation.
Subsequently, cells were incubated on ice with anti-CD19-FITC
(Beckman Coulter, Roissy, France) and anti-CD5-PC7
(Clinisciences, Montrouge, France) antibodies in combination
with one of the following phycoerythrin-labeled antibodies: anti-k
light chain, anti-l light chain (from DakoCytomation, Trappes,
France), anti-CD38, anti-CD34, anti-CD3, anti-CD56 (all
from Beckman Coulter) and anti-CD23 (Clinisciences). Before
fluorescent-activated cell sorting analysis, cells were stained
with 2 mg/ml of 7-amino-actinomycin D (BD Pharmingen,
Le Pont de Claix, France). Data acquisitions were performed on
a BD LSR II cytometer (BD Bioscience, Le Pont de Claix, France).
Flow cytometry acquisitions were analyzed using BD FACSDiva
(BD Bioscience) and FlowJo softwares (Treestar, Ashland,
OR, USA).
Cell sorting
Cell sorting was performed with Hoechst 33342-stained B-CLL
peripheral blood cells treated or not with Fludarabine and
subsequently labeled with anti-CD56, anti-CD3 and 7-aminoactinomycin D. After high discrimination on FSC-H/FSC-W
(Forward scatter) and SSC-H/SSC-W (Side scatter) parameters,
gating on CD56, CD3, 7-amino-actinomycin D and Hoechst
33342 negative cells was used to enable B-CLL-derived SP cells
sorting. Sorted SP cells were subsequently analyzed by
fluorescence in situ hybridization or cultivated in the presence
of DSP30/IL-2 or Fludarabine. When sorting non-SP cells, B-CLL
cells were stained with 1 mg/ml of Hoechst 33342 to avoid the
high toxicity engendered on primary non-SP cells by the original
5 mg/ml concentration. Cell-sorting experiments were performed
on a FACS ARIA Sorp (BD Bioscience).
Interphasic fluorescence in situ hybridization
Fluorescence in situ hybridization experiments were performed
with P53/SE17, DLEU(13q14)/13qter and SE12(D12Z1) probes
(Kreatech, Amsterdam, The Netherlands) on cytospin of SP and
non-SP/Bulk cells, according to the manufacturer’s recommendations.
Western blot
Primary B-leukemic cells (Bulk B-CLL) for western blotting
were obtained by negative purification with magnetic beads
(Human B-cell enrichment kit without CD43 depletion, Stem
cell technologies, Grenoble, France). SP cells (SP Fludarabine)
Leukemia
Statistical analysis
Student’s paired t-test was used to determine differences
between paired samples, with cutoff a ¼ 5%. Values were
expressed as means±s.d.
Results
Characterizing B-CLL-derived innate SP cells
We assessed the percentage of cells with SP phenotype in blood
samples obtained from several (n ¼ 22) newly diagnosed
(previously untreated) B-CLL patients by measuring Hoechst
33342 efflux through ultraviolet laser-based flow cytometry.
This analysis evidenced a minor proportion of SP cells in every
sample (median rate of SP cells among total cells ¼ 0.035%,
range: 0.01–0.39%) (Figure 1a, Table 1). The SP phenotype
was abrogated on cell treatment with the ABC transporter
inhibitors verapamil (80 mM) (Figure 1a), fumitremorgin C (5 mM)
and reserpin (50 mM) (not shown). Total SP cells in every sample
contained a CD19 þ CD5 þ , CD19 þ CD23 þ and CD19 þ clonal
immunoglobulin light chain þ cells, which phenotypes
are characteristic of B-CLL leukemic cells (Figure 1b). In most
of the patients, total SP cells also comprised non-leukemic
CD19CD5 cells (not shown). Of note, there was no correlation between clinical characteristics and the rate of SP among
whole blood cells.
In the aim of identifying a specific marker of B-CLL SP cells,
we compared the leukemic fraction (CD19 þ CD5 þ -gated cells)
of SP and non-SP cells in each sample for expression of
markers typically characterizing poor prognosis in B-CLL
(CD38) and immature phenotypes (CD34). Expression of CD38
was analyzed separately on CD38 þ (more than 30% of positive
cells) and CD38 patients. For CD38 þ patients only, SP cells
displayed an overall increase of CD38 expression compared
with their non-SP counterpart. This trend was reproducible for
the three patients tested, although no significance was found
(Figure 1c). No differences were observed for CD34 expression
(Figure 1c) and CD127 (not shown).
The phenotype of SP cells strongly suggested their leukemic
nature. Nevertheless, to check for clonality of B-CLL SP cells,
the SP cells sorted from (del 13q14, del p17 and þ 12) B-CLL
patients were analyzed by fluorescence in situ hybridization.
We found identical cytogenetic alterations in both bulk and SP
leukemic cells in all patients tested (Figure 1d), confirming that
SP cells belongs to the leukemic clone.
Together, these data indicated that in the absence of any
treatment, all B-CLL samples comprise a minorFyet sizeableF
proportion of natural SP cells, which display the same phenotypic and cytogenetic profiles as the whole B-CLL population,
suggesting that they are innate B-CLL SP cells.
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1887
B-CLL treatments select SP cells
We next asked whether the B-CLL chemotherapy selects for SP
cells, by treating B-CLL blood samples with either Fludarabine
(2 mg/ml, 7 days, n ¼ 18), Bendamustin (50 mg/ml, 3 days, n ¼ 7),
or Rituximab (10 mg/ml, 7 days, n ¼ 3) before measuring their
CD19 þ CD5 þ SP fraction. All treatments caused a clearcut
enrichment in CD19 þ CD5 þ 7AAD SP cells (Figure 2a), on
average of B2.5-fold with Rituximab and 1000-fold with
Fludarabine or Bendamustin (Figure 2b). We noticed a global
chemoresistance of the whole B-CLL cells (both SP and
non-SP) in 2/18 and 2/7 patients for Fludarabine and
Bendamustin respectively (not shown). Nevertheless as expected, Fludarabine and Bendamustin induced a massive destruction of the vast majority of B-CLL cells, although SP phenotype
analysis of the few drug-surviving cells evidenced a highly
Hoechst Blue
+ verapamil
100K
100K
50K
50K
0.01%
0.13%
50K
100K
50K
100K
CD19
Hoechst Red
105
105
105
10
4
4
104
10
3
3
10
103
102
102
102
101
101
10
1
2
3
4
10 10 10 10 10
CD5
4
5
p=0.16
101
1
2
3
4
10 10 10 10 10
Kappa Light Chain
5
p=0.08
101 102 103 104 105
CD23
p=0.30
3.5
Relative MFI
3
Values
Median
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Non-SP
SP
Non-SP
SP
Non-SP
CD34
CD38
CD38+ patients
CD38- patients
n=5
n=3
NSP or Bulk
selective destruction of the non-SP compartment by all
treatments (Figure 2a).
Molecular validation of this exclusive SP phenotype was
given by the overexpression of ABCG2 by Fludarabine-resistant
SP cells, in complete accordance with the described SP phenotype.20 In addition, Fludarabine-resistant SP cells had strongly
upregulated BMI-1 expression (Figure 2c).
To check whether non-SP cells evolved by an adaptive
switch toward SP cells under the selective pressure of these
treatments, sorted non-SP cells (purity 499%) were treated as
above (2 mg/ml Fludarabine for 7 days) before the analysis of the
SP phenotype.
A minority of cells (initially exhibiting a non-SP phenotype)
survived in these experiments, and virtually all the drugsurviving cells exclusively displayed the SP phenotype
(Figure 2d).
To validate further, our in vitro-based concept of chemoresistant B-CLL SP cells, we analyzed the CD19 þ /CD5 þ SP
percentage of five patients before and within 1 year after
Fludarabine-based therapy (Table 2). These patients were either
relapsing or showing incomplete response after treatment.
Except for one patient showing decreased SP percentages after
therapy, a global increase of the SP percentage was observed for
the four remaining patients, who experienced therapy within the
year preceding analysis (Table 2 and Figure 2e). The median
leukemic SP percentage in post-therapeutic patients reached a
level considerably higher than what was observed for untreated
patients (0.43 versus 0.04%, before therapy).
Together, these results highlight the high level of resistance
of SP cells toward multiple chemotherapeutic agents. These
in vitro data are further supported by the significant amount of
SP cells present after chemotherapy in patients undergoing
relapse or displaying persistent leukemic cells. In addition,
n=5
SP
del13q14
76%
52%*
84.5%
87%
90%
71%*
delp17
+12
SP
Figure 1 Characterizing B-cell chronic lymphocytic leukemia
(B-CLL)-derived innate side population (SP) cells. (a) Peripheral
blood cells from B-CLL patients were stained with Hoechst 33342
and analyzed by ultraviolet laser-based flow cytometry. The left panel
shows the SP phenotype from a representative B-CLL patient
peripheral blood sample (case 3). The SP cells are outlined and
shown as a percentage of the total cell population. The right panel
shows inhibition of the SP phenotype in the presence of 80 mM
verapamil. A total of 22 patients were tested as described above.
(b) Leukemic phenotypic characteristics of the SP cells for one
representative patient (case 3). B-CLL cells were loaded with Hoechst
33342 dye subsequently immunolabeled with anti-CD5 anti-CD19
anti-CD23 and anti-k light chain and finally stained with 7-aminoactinomycin D. Nineteen patients were tested for the leukemic
phenotype on the SP fraction. (c) B-CLL SP-specific cell surface
markers. B-CLL cells were loaded with Hoechst 33342 dye and
subsequently immunolabeled with anti-CD38 and anti-CD34 in
combination with anti-CD19 and anti-CD5 antibodies. The relative
MFI (mean fluorescent intensity) (MFI of the marker of interest/MFI of
the isotype control) for each cell surface marker is represented for the
CD19 þ CD5 þ non-SP fraction and SP fraction. Respectively five
CD38 patients and three CD38 þ patients were tested for CD38
expression in both populations. Five different patients were tested
for CD34 expression. Horizontal bars indicated the median values.
(d) Cytogenetic features of B-CLL SP cells from B-CLL patients with
identified chromosomal abnormalities. Pictures show positive hybridization patterns (fluorescence in situ hybridization, FISH) for the
known chromosomal aberration (del 13q14 del p17 and þ 12) for
purified SP and non-SP/Bulk compartments. The results of FISH are
given as percentages of 200 sorted peripheral blood cells for either SP
or non-SP fractions. *Two patients had fewer than 200 analyzable
nuclei: SP cells from patient with del13q14 (50 cells) and SP cells from
patient with trisomy 12 (38 cells). Del stands for deletion and þ 12
means trisomy 12.
Leukemia
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1888
Table 1
Side population (SP) fraction and clinical characteristics
of untreated B-CLL patients
Patient no.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Sex/age a
Stage b
WBC c
Percentage of total SP
F/73
F/68
F/69
M/78
F/75
M/59
M/78
M/74
F/61
M/44
M/71
M/75
M/75
M/64
F/54
M/78
F/69
M/65
F/72
M/88
M/76
F/66
A
A
B
A
A
B
C
A
A
B
B
C
A
B
A
A
B
A
A
A
B
A
83 600
74 600
131 000
21 700
52 300
83 000
42 000
32 300
120 600
95 000
83 700
63 500
58 000
187 000
102 000
56 000
58 000
47 800
59 600
32 200
64 200
79 300
0.16
0.13
0.03
0.19
0.05
0.01
0.01
0.03
0.06
0.03
0.39
0.02
0.03
0.04
0.05
0.04
0.02
0.015
0.05
0.015
0.065
0.01
Abbreviations: B-CLL, B-cell chronic lymphocytic leukemia;
WBC, white blood cell count.
a
Sex was defined: M, male; F, female, and age was expressed in years.
b
Staging was according to Binet staging system.
c
WBC was expressed as cells/ml of blood.
these results demonstrated that the selective pressure exerted by
B-CLL chemotherapy induced both survival of innate SP cells
and an adaptive switch of non-SP cells, leading to a stringent
selection of both innate and adaptive (acquired) SP cells.
B-CLL SP and non-SP cell dynamics
We finally aimed at characterizing the dynamics of SP and nonSP populations in B-CLL. More precisely, we asked whether
proliferating SP cells could refuel the main compartment of nonSP cells. B-CLL cells are inherently quiescent and their proliferation in vivo is a finely tuned process.25 In order to investigate
the refuelling capacity of SP cells, we used the powerful
proliferative trigger DSP30 (CpG-ODN) and IL-223,24 as a
molecular tool to induce B-CLL proliferation in vitro. First, we
tested the ability of this combination to induce proliferation of
B-CLL SP cells. B-CLL cells loaded with carboxyfluorescein
succinimidyl ester were induced to proliferate by DSP30 and
IL-2. The cells were cultured in vitro for 7 days before measuring
the division by flow cytometry in conjunction with detection of
SP and non-SP fractions. This method enabled us to assess
division through carboxyfluorescein succinimidyl ester dilution
in both CD19 þ CD5 þ SP and non-SP cells from six B-CLL
patients. As expected, the bulk of B-CLL cells, which is
essentially composed of non-SP, proliferated vigorously on
stimulation with DSP30 þ IL-2, whereas untreated cells did not
divide at all. Most importantly, the stimulus had also triggered
division of the SP cells (Figure 3a). Sorted SP cells (from n ¼ 3
B-CLL patients) were then induced to divide as above and
then analyzed for SP phenotype after in vitro culture. After
7 days of stimulation, the phenotype of all samples of SP-sorted
cells revealed both SP and non-SP cells (Figure 3b). Varying
proportions of these compartments were observed with the
different samples (non-SP median ¼ 15.9%, range: 4.25–29%),
Leukemia
suggesting that proliferating SP cells refuelled the non-SP
compartment on division. Finally, once stimulated as above,
the Fludarabine-induced SP cells were also able to regenerate
non-SP cells (non-SP median ¼ 71%, range: 56,4–99%)
(Figure 3c).
Together these observations indicated that in B-CLL, both
mitotic division and chemotherapeutic adaptive evolution can
drive a bidirectional dynamics refuelling both SP and non-SP
cell compartments.
Discussion
This study aimed at elucidating the cellular basis of B-CLL
chemoresistance. Confirming a recent publication,22 here we
reported the existence of few natural SP cells in virtually all
B-CLL patients, which harbors phenotypic and cytogenetic
hallmarks of the disease. Although they are chemoresistant,
B-CLL SP cells are present in patients before any treatments.
In our in vitro model, the SP phenotype appeared as an essential
feature to survive drug treatment, making chemotherapy a
potent screening for such cells. Indeed, B-CLL highly depleting
therapies, inducing a massive cell death of the overall B-CLL
population, selected exclusively for acquired and innate SP
cells. Supporting this in vitro cellular pathway of B-CLL
chemoresistance, most post-therapeutic samples, from patients
either relapsing or showing an incomplete response, exhibit a
high percentage of leukemic SP cells. Finally, both mitotic
division of innate SP cells and chemotherapy-induced emergence of acquired SP cells are able to refuel both SP and non-SP
cell compartments of the B-CLL disease. Three issues are raised
by these findings.
First, the stemness of cancer SP cells has long been debated,26
although this question had not been addressed in B-CLL so far.
Here, the specific phenotype of B-CLL SP cells, which was
formally validated by ABCG2 and BMI-1 expressions,20,27 was
nevertheless quite incomplete as lacking typical cell surface
markers of immaturity (for example, CD34, CD127).28 However, B-CLL is a malignant disease of phenotypically mature
B cells, in which clonal progeny naturally lacks expression
of immaturity antigens.25 Likewise, SP cells from other mature
B-cell malignant hemopathies, such as multiple myeloma, also
present phenotypes inherent to the differentiation status of their
non-malignant counterpart.21 The increased level of CD38
expression, which here typified B-CLL SP cells from CD38 þ
patients, is usually observed for highly proliferating B-CLL
cells29 and correlates with a poor clinical outcome,30 supporting
the view that B-CLL SP cells are important for progression of
the disease. The fact that whether in vitro SP cells exposed
to pertinent stimuli and microenvironmental cells31 actually
undergo more mitosis than the bulk of quiescent B-CLL cells
remains elusive, although likely. There is now a large amount
of scientific evidence suggesting that the proliferating pool
of B-CLL cells is localized into specialized structures in the
lymph nodes called the proliferation centers. In this specific
surrounding microenvironment, the B-CLL cells contained in the
proliferation centers display high proliferative capacity (Ki67 þ )
and increased expression of antiapoptotic proteins.32 We are
planning to investigate the SP phenotype of the leukemic cells
present in the proliferation centers ‘feeding’ the B-CLL population in the peripheral blood.
Demonstrating the leukemic-initiating activity of human
B-CLL SP cells in vivo; however, for example, by regenerating
the whole human disease in mice models xenografted with
human SP cells still remains out of reach. Related experiments,
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1889
Hoechst Blue
a
Day 7 +
Fludarabine
Day 7
Day 3 +
Bendamustin
Day 3
125
125
125
125
100
100
100
100
75
75
75
75
50
50
50
50
25
25
25
25
0.09%
98.73%
0.07%
25 50 75 100 125
25 50 75 100 125
25 50 75 100 125
Day 7 +
Rituximab
Day 7
250
250
200
200
150
150
100
100
50
95.05%
50
0.37%
0.17%
50 100 150 200 250
50 100 150 200 250
25 50 75 100 125
Hoechst Red
b
SP cells (%)
0.001
0.1
0.01
1
10
0.07
Day 7
***
Day 7 +
2μg/ml of Fludarabine
92.78
Day 3
0.07
**
Day 3 +
50μg/ml of Bendamustin
78.06
Day 7
0.13
Day 7 +
10μg/ml of Rituximab
0.33
e
BMI-1
α-Tubulin
Sorted non-SP cells
+ Fludarabine Day 7
250K
250K
200K
200K
150K
150K
100K
100K
50K
50K
0.0%
50
10 K
0K
15
0K
20
0
25 K
0K
ABCG2
Hoechst Blue
ud
Fl
SP
Bu
lk
B-
C
ar
LL
ab
in
e
Sorted Non-SP cells
Day 7
99.90%
Hoechst Red
Percentage of SP cells
d
50
10 K
0
15 K
0K
20
0K
25
0K
c
100
100.00
Median
Patients
10.00
1.00
0.10
0.01
Before therapy
Post-therapy
Figure 2 B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) treatments select for acquired side population (SP) cells. B-CLL cells were either treated
with 2 mg/ml of Fludarabine during 7 days or with 50 mg/ml of Bendamustin during 3 days or Rituximab 10 mg/ml during 7 days. (a) The dot plots show the
representative SP phenotype of untreated versus drug treated of CD19 þ CD5 þ -gated B-CLL cells. (b) Histograms represent the mean percentage (±s.d.)
of SP cells among the CD19 þ CD5 þ population in treated and untreated conditions. (Fludarabine n ¼ 18; Bendamustin n ¼ 7; Rituximab n ¼ 3)
(**Po0.01 and ***Po0.005). (c) Western blot analysis of the chemoresistant B-CLL SP cells. After 7 days of treatment with Fludarabine (2 mg/ml), SP cells
were sorted in order to exclude the 7-amino-actinomycin D-positive cells and the CD3 þ /CD56 þ cells, whereas bulk leukemic B cells were purified by
magnetic sorting. Western blot analysis of ABCG2 and BMI-1 proteins represented on the cropped blots is representative of seven different experiments
performed with seven distinct patients. a-Tubulin was used as a loading control. (d) The dot plot shows the representative SP phenotype of sorted non-SP
cells cultivated 7 days in the presence or the absence of Fludarabine. This dot plot represents gated CD19 þ CD5 þ cells and is representative of the four
different patients analyzed. (e) The results are reported as percentage of CD19/CD5-positive SP cells among CD19/CD5-positive total cells. Five patients
were tested before and within 1 year after therapy. Horizontal bars indicated the median values.
Table 2
therapy
Patient
no.
Leukemic SP fraction of B-CLL patients before and after
CD19+/CD5+
SP percentage
before therapy
23
0.04
24
25
26
27
0.049
0.19
0.07
0.02
Therapy
Fludarabine/
cyclophosphamide/
Rituximab
Fludarabine/Campath
Fludarabine
Fludarabine/Rituximab
Fludarabine/
cyclophosphamide/
Campath
CD19+/CD5+
SP percentage
after therapy
4.48
0.02
5.14
0.34
0.52
using drug-surviving cells, have successfully been performed
for human lung cancer xenografts,33 but the human B-CLL
dependence to local immune microenvironments for survival
and growth cannot be met or adequately reconstituted
in immunodeficient mice. New murine models deleted for
miR-15a/16-1, which develop a B-CLL-like pathology,34 might
represent a new option to fully validate the leukemic-initiating
potential of B-CLL SP cells in vivo.
Second, this study uncovered the heterogeneity of the SP
compartment, by evidencing two distinct subsets of chemoresistant SP cells; the innate pool, which exists in patients before
treatment, and its acquired counterpart, which differentiates on
chemotherapeutic pressure. These compiled findings and the
increased proportion of SP cells observed in post-therapeutic
patients suggest that current therapeutic options are ineffective
Leukemia
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1890
DSP30 + IL-2
Non-treated
0.1%
750
Non-SP
200
Hoechst Blue
6
5
4
3
2
1
0
1000
250
500
250
150
0
2
10
100
SP
50
50
100
150
103 104 105
15
12.5
10
7.5
5
2.5
0
200
102 103 104
Sorted SP cells + DSP30/IL-2 Day 7
Sorted SP cells Day 0
Hoechst Blue
105
CFSE
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
100
29.6%
3
102 10 104
105
Hoechst Red
50
3
102 10 104 105
30
25
20
15
10
5
0
0%
250
84.3%
150
200
Non-SP: 29%
250
50
150
100
200
250
Hoechst Red
Hoechst Blue
DSP30 + IL-2
Fludarabine 7 days + 7 days of culture
-
+
250
250
200
200
150
150
0.1%
100
100
50
50
50 100 150 200 250
71%
50
100 150 200 250
Hoechst Red
Figure 3 B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) side population (SP) and non-SP cell population dynamics. (a) Proliferation of SP and
non-SP compartments. DSP30 and interleukin (IL)-2-induced proliferation was assessed by carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dilution
for SP and non-SP cells. The B-CLL cells were CFSE labeled and then treated or not with 250 nM of DSP30 and 50 ng/ml of IL-2 during 7 days.
The cells were then subjected to Hoechst 33342 and antibody stainings. CFSE dilution of both CD19 þ CD5 þ -gated non-SP (upper panel) and
SP (lower panel) cells was determined for unstimulated (left panel) and stimulated cells (right panel) in terms of percentage of dividing cells.
The fluorescent-activated cell sorting data shown are representative of six patients tested. (b) Non-SP cells generation from sorted SP cells. The left
panel shows the SP phenotype of freshly sorted SP cells. The right panel shows the SP and non-SP cells after 7 days of culture in the presence of
250 nM of DSP30 and 50 ng/ml of IL-2. The data shown are representative of three SP-sorting experiments performed with three different patients.
(c) Non-SP cells generation from Fludarabine-induced SP cells. The graphs show SP phenotype of CD19 þ CD5 þ -gated unstimulated and DSP30/
IL-2-stimulated Fludarabine-resistant cells. B-CLL cells were treated with Fludarabine 2 mg/ml during 7 days. Subsequently, B-CLL cells were
washed and cultured for 7 days in the absence (left panel) or in the presence of DSP30 (250 nM) and IL-2 (50 mg/ml) (right panel), and subjected
to Hoechst 33342 and anti-CD19/anti-CD5 stainings. The dot plot is representative of three experiments performed with three different patients.
The Hoechst 33342-positive cells are outlined and expressed as a percentage of the total CD19 þ CD5 þ population.
toward a significant fraction of leukemic cells. Large amount of
literature have evidenced, as their first identification, the
multiresistant potential of SP cells toward a wide spectrum of
genotoxic insults such as ionizing radiation,35 anthracyclines
derivatives8 and platinium.33 In complete accordance with our
findings, ABCG2 ectopic expression has been shown to mediate
Fludarabine resistance,36 and B-CLL SP cells have been shown
to resist Fludarabine treatment.22 Our study is the first report
which, to our knowledge, extends SP resistance to Bendamustin,
Leukemia
an alkylating agent, and Rituximab, a monoclonal antibody.
Although we assume that the molecular basis of chemoresistance to Fludarabine and Bendamustin is relying on activity of
ABC transporters, which efflux drugs and Hoechst 33342 dye,36
resistance to Rituximab rather involves additional drug-resistance mechanisms, such as the inhibition of the apoptotic
process. This study also demonstrated that some non-SP
may switch to SP under chemotherapy, generating what we
referred here to as adaptive SP cells. Indeed, this presumably
Innate and acquired chemoresistant B-CLL SP cells
E Gross et al
1891
corresponds to the well-established, classical mode of chemotherapeutic resistance based on the upregulation of ABC
transporters by cells escaping to apoptosis. Under such
circumstances, the expression of ABCB1 mRNA was known to
globally enhance among surviving cells7,37,38 by adaptation to
the drug. From our above data, we now conclude that B-CLL
chemoresistance not only relies on the mere upregulation of
efflux pump by some evolving cells, but also involves the
cellular heterogeneity reflected by both natural and acquired
subsets of SP cells.
Third, we uncover here a dynamics of B-CLL sub-populations
regeneration susceptible to account for repetitive B-CLL posttherapeutic relapses. Untreated B-CLL patients comprise at
diagnostic a bulk of circulating CLL cells composed of non-SP
plus rare innate SP cells. Mitotic divisions of this bulk, either
induced by DSP30/IL-2 in vitro or by physiological stimuli
extrapolated in vivo,31 do self-perpetrate this heterogeneity
observed in all patients. By contrast, chemotherapy massively
destroys most non-SP cells and selects SP cells only, which are
either innately resistant SP or newly adapted SP cells.
Furthermore, the downstream proliferation of chemoresistant
SP cells regenerates partially the non-SP compartment of the
B-CLL disease.
To conclude, this report pinpointed two SP cell subsets as
critical determinants of B-CLL chemoresistance. Hence, future
studies identifying means to eradicate these populations will
bring significant progress to improve the efficiency of B-CLL
therapy.
Conflict of interest
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgements
We are grateful to the patients who participated in the study and
their referring physicians. We thank Amandine Blanc, Emilie-Fleur
Gautier, Catherine Trichard, Emilie Laprévotte, Cyril Broccardo,
Julien Familiades and the cytometry platform of IFR150-BMT
(Toulouse, France) for helpful discussion and technical assistance.
Acknowledgements are also made to Cécile Demur and HIMIP
(Hémopathies Inserm Midi-Pyrénées) for cellular banking. EG and
AQM designed, performed research, analyzed, interpreted data
and wrote the article. F-E L0 F-O designed research and collected
data. MB and SS performed research, analyzed and interpreted
data. LY provided patient’s samples. SK analyzed and interpreted
data. JJF analyzed and interpreted data and wrote the article. GL
designed research and wrote the article. This study was supported
by grants from INSERM and Association Laurette Fugain (ALF/ N1
07–05). Emilie Gross is a recipient of a grant from le Ministère
délégué à l’Enseignement Supérieur et à la Recherche and la
Fondation pour la Recherche Médicale. Samar Kheirallah is a
recipient of a grant from le Ministère délégué à l’Enseignement
Supérieur et à la Recherche and l’Association pour la Recherche
sur le Cancer.
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RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
3. Discussion Article II.
La rechute post-thérapeutique invariable de la LLC-B suggère l’existence d’une souspopulation intrinsèquement multi-résistante capable de reformer le clone leucémique. Afin de
définir les bases cellulaires et moléculaires de la chimiorésistance dans la LLC-B, nous avons
traqué les cellules leucémiques pourvues d’un phénotype SP qui marque des populations
immatures naturellement chimiorésistantes. Dans cette étude, nous identifions un
compartiment minoritaire SP existant chez tous les patients avant traitement et amplifié dans
des échantillons de patients post-thérapeutiques. Nous démontrons que la chimiothérapie in
vitro sélectionne exclusivement les cellules SP et que la pression exercée par le stress
génotoxique induit une fraction des cellules non-SP à acquérir le phénotype SP, qui apparaît
déterminant pour la survie. Sous stimulus prolifératif, les cellules SP innées et
chimiorésistantes sont capables de reformer partiellement le compartiment majoritaire
Hoechst positif non-SP. L’ensemble de ces données, chimiorésistance et potentiel prolifératif,
tende à apporter des éléments de réponse sur la base cellulaire des rechutes de la LLC-B : les
SP innées et acquises.
3.1 Caractérisation de la SP innée leucémique de la LLC-B
3.1.1
Universalité du phénotype SP, SP « physiologique » et SP leucémique
Confirmant l’étude récente de Foster et al. (2010), notre étude démontre l’existence
d’une SP chez tous les patients atteints de LLC-B jamais traités auparavant (162).
L’universalité de la présence d’une SP (100%, n=22) sur l’ensemble des patients dans notre
étude contrastant avec l’étude américaine (85%, n=21) ainsi que la variabilité de la fourchette
des pourcentages de SP entre les deux études (0,01% à 0,39% vs 0,02% à 2,17%) peuvent être
aisément attribuées aux stratégies de fenêtrage (notamment CD19+/CD5+ pour Foster et al. vs
totaux dans notre étude), à l’appareillage, aux échantillons de patients et aux variantes de nos
deux protocoles Hoechst (par exemple dans l’utilisation de l’iodium propidium (IP) à la place
du 7-amino-actinomycin D (7AAD)).
104
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Un point majeur de divergence entre nos deux études réside également dans la présence de
cellules non-leucémiques capables d’effluer le Hoechst 33342 que nous retrouvons dans des
échantillons de sang périphérique de patients. Bien que la SP des patients de l’étude
américaine ne soit pas exclusivement leucémique en termes de phénotype (66%), Foster et
collègues infirment l’hypothèse de l’existence d’une SP totale dans des échantillons de
donneurs sains. Cependant, l’étude du phénotype SP dans des échantillons de moelle osseuse
normales et issues de patients atteints de LAM démontre qu’il existe des SP des populations
lymphocytaires matures T, B et NK (228). De même, Zhou et al. (2001), démontrent que
l’expression du gène ABCG2, déterminant moléculaire du phénotype SP, n’est pas
uniquement restreinte aux compartiments immatures et apparaît pour les cellules NK
normales et les progéniteurs érythrocytaires (140). De façon similaire (résultats non montrés),
nous observons une SP « normale » du sang périphérique de patients LLC-B qui contient de
façon variable des cellules Hoechst négatives CD19-CD5+ (probablement d’origine T) et
CD19-CD5-.
Bien que le sang périphérique contienne une SP non-leucémique probablement
physiologique, nous montrons par la détection d’anomalies chromosomiques spécifiques de la
LLC-B et par phénotypage CD19+CD5+, CD19+Ig light chain+, CD19+CD23+ le statut
leucémique d’une proportion non-négligeable des cellules de la SP. De fait, l’ensemble des
études suivantes s’effectue sur la fraction CD19+CD5+ de la SP.
Certaines études montrent une prévalence du compartiment SP dans les stades ou
grades les plus avancés de cancers (151, 161). Cependant, aucune corrélation entre stade de la
maladie, facteur pronostique, lymphocytose et proportion de SP n’a été formellement
identifiée dans notre étude.
3.1.2
La surexpression du CD38 : relevance physiopathologique
Afin de définir phénotypiquement la SP leucémique et d’identifier un marqueur
membranaire exclusif et alternatif à l’exclusion du Hoechst, une pléiade de marqueurs de
surface a été testé de façon comparative entre les compartiments CD19+CD5+ SP et non-SP.
Dans cette recherche, nous observons qu’une augmentation de l’expression du CD38 marque
le compartiment SP des patients CD38+. Dans la littérature clinique, il est clairement établi
que l’expression de ce marqueur sur plus de 30% des cellules leucémiques est associée à un
pronostic péjoratif et prédit une maladie progressive (229).
105
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Le ligand du CD38 est la protéine CD31 qui marque la surface des cellules nurses,
endothéliales et également des cellules de LLC-B (9, 230, 231). Probable reflet de sa valeur
clinique défavorable, cette protéine marque au niveau du sang périphérique une population de
cellules de LLC-B enrichie en cellules proliférantes (Ki-67+) (232) ou ayant récemment
proliféré (cellules marquées aux 2H) (233).
En plus d’un lien avec la prolifération des cellules de LLC-B, les cellules leucémiques
CD38+ présentent un profil transcriptomique spécifique caractérisé par une surexpression de
voies de signalisation impliquées dans la survie (VEGFR2, IL-1β, VEGF et Mcl-1) (234).
L’expression du CD38 est plus élevée à la surface des cellules leucémiques nichées au niveau
des microenvironnements spécifiques de la LLC-B (9, 235). De façon plus précise, le CD38
marque les cellules leucémiques contenues dans les centres de prolifération à proximité des
cellules CD4+CD154+ (9, 236). De fait, l’axe CD38/CD31 permet un « nichage » (homing)
des cellules LLC-B au niveau de microenvironnements riches en signaux prolifératifs et antiapoptotiques et son activation in vitro induit la prolifération et la différenciation des cellules
leucémiques (237). Bien que l’impact biologique de cet axe pour la LLC-B est actuellement
controversé (230), une étude récente démontre que la signature génétique de l’interaction
CD38/CD31 touche des voies de signalisation impliquées dans la prolifération, la migration et
le « homing » (238). L’ensemble de ces travaux conduit aujourd’hui à proposer la théorie
globale selon laquelle l’expression du CD38 forte pendant les processus de prolifération au
niveau des centres prolifératifs permet aux cellules un « nichage » au niveau de ces structures.
La sorties des cellules ayant proliféré, vers le sang périphérique par un processus dépendent
de CXCR4 (63) s’accompagnerait d’une perte progressive de l’expression du CD38. La valeur
pronostique du CD38 réside, au sein de cette théorie, dans la prédiction que plus la proportion
de cellules CD38+ dans le sang est élevée, plus le taux de renouvellement cellulaire et de
prolifération au niveau des ganglions est intense. Dans ce contexte encore théorique,
l’expression élevée du marqueur CD38 dans la SP leucémique amène à proposer deux
hypothèses : (i) ces cellules ont subi des évènements prolifératifs plus intenses ou plus récents
que leur homologue non-SP (ii) une activité de nichage au niveau des centres prolifératifs est
plus forte pour les cellules SP. Néanmoins, il est important de considérer que l’ensemble de
ces hypothèses ne reste valide que pour les patients CD38+ et que la significativité de
l’augmentation de l’expression de ce marqueur reste à être confirmée.
106
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
3.1.3
Statut mutationnel du BCR des cellules SP leucémiques
En parallèle du CD38, le statut mutationnel du BCR est un facteur pronostique qui
traduit deux histoires cellulaires et deux origines potentielles différentes. Bien que
l’expérience du centre germinatif fasse débat dans l’explication de ces deux sous-types de
LLC-B, l’étude du statut mutationnel et de la spécificité antigénique du BCR des cellules SP
leucémiques issues de patients informerait sur la monoclonalité de cette population (même
séquence IgVH) en comparaison avec la fraction non-SP. Sur la base de cette information, il
serait alors possible d’émettre des hypothèses sur une histoire cellulaire et immunologique
commune ou non aux deux populations, SP et non-SP.
3.2
La chimiothérapie permet de sélectionner les cellules SP leucémiques
3.2.1
Un enrichissement spectaculaire
La chimiorésistance de la population SP est traduite par l’enrichissement exclusif de
cette
population
après
monochimiothérapie
conduite
in
vitro.
Deux
agents
chimiothérapeutiques distincts ont été testés : la Fludarabine (analogue de purines) et la
Bendamustine (agent alkylant), les deux drogues résultant en un enrichissement exclusif du
compartiment SP leucémique. Une telle concentration du potentiel chimiorésistant dans les
seules cellules pourvues d’un phénotype SP n’a jamais été observée. En effet, l’étude de la
chimiorésistance dans la littérature SP démontre généralement un enrichissement notable du
compartiment SP avec cependant une nette persistance du compartiment non-SP (149, 161,
163). De même, l’étude américaine des cellules SP de la LLC-B démontre un enrichissement
compris entre 2 et 22 fois avec des taux de SP ne dépassant pas les 0,22% après traitement à
la Fludarabine (162). Cette divergence expérimentale s’explique par les différences
fondamentales existant entre nos deux protocoles de traitement (dose et temps d’incubation).
L’enrichissement que nous présentons dans ce manuscrit est sans précédent et offre une
méthode alternative pour obtenir le compartiment chimiorésistant de la LLC-B pour une
grande majorité des patients. En effet, quelques patients (n=2) se sont montrés réfractaires à
cette tendance. Le seul patient démontrant une résistance croisée aux deux agents
chimiothérapeutiques démontre un profil très atypique de son compartiment non-SP. En effet,
pour ce patient, la disparition de la fraction non-SP est quasiment inexistante.
107
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Le phénotype de la population leucémique non-SP est CD19+CD5+CD34+ et, mise en
présence de cellules OP-9 (cellules médullaires murines) et d’IL-7, ces cellules leucémiques
prolifèrent de façon significative (dilution du CFSE) (résultats non montrés). Bien que cet
unique résultat reste en marge de la globalité des patients LLC-B, il apparaît que, dans certain
cas exceptionnels, la chimiorésistance ne soit pas confinée au seul compartiment SP.
Cependant, on notera que, ce soit via le phénotype Hoechst négatif ou la positivité du CD34,
l’expression de la chimiorésistance dans la LLC-B est accompagnée de caractéristiques
fonctionnelles ou phénotypiques d’immaturité.
3.2.2
Mécanismes moléculaires de la multi-résistance du compartiment SP
Le mécanisme moléculaire à l’origine de cette chimiorésistance multiple apparaît
instinctivement dépendant de l’activité d’efflux d’ABCG2. En effet, la Fludarabine est un
substrat de la pompe ABCG2 (141). Cependant, la Bendamustin ne fait pas partie de la liste
des substrats d’ABCG2 et la résistance des cellules SP n’a jamais été décrite pour ce composé
chimiothérapeutique. Cependant, on ne peut pas exclure, qu’additionnellement aux
mécanismes généraux d’efflux via ABCG2, les cellules SP de la LLC-B concentrent un
arsenal de défenses impliqué dans la chimiorésistance tel que la présence d’enzymes
détoxifiantes, la surexpression de protéines anti-apoptotiques ou une réponse amplifiée aux
dommages à l’ADN. Dans cet esprit, nous avons étudié le potentiel recouvrement entre
populations Hoechst- et ALDH+. L’ALDH est une enzyme impliquée dans la détoxification du
Cyclophosphamide (239) qui est exprimée préférentiellement à des stades immatures de
l’hématopoïèse (240). Cependant, il apparaît qu’au sein des cellules de LLC-B, l’ALDH
présente une activité homogène sans permettre la définition d’un compartiment distinct
caractérisé par de fort niveau d’activité d’ALDH (résultats non montrés). Outre l’efflux des
drogues via ABCG2, la présence de mécanismes additionnels de résistance est supportée par
la résistance des cellules SP aux radiations ionisantes (163) ainsi que nos données concernant
la résistance au Rituximab.
108
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
3.2.3
Mécanismes de résistance au Rituximab
En présence de Rituximab, on obtient un enrichissement bien plus modeste
directement lié à la mort cellulaire marginale que celui-ci entraîne sur l’ensemble des cellules
leucémiques.
L’explication moléculaire et cellulaire de la résistance au Rituximab dans ce test est plus
discutable que pour la chimiorésistance induite par la Fludarabine ou la Bendamustine.
En effet, le Rituximab dans nos tests in vitro, réalisés en l’absence de complément et en
présence de cellules CD16+, est capable d’induire la mort des cellules leucémiques via
l’ADCC et l’apoptose. L’induction directe d’apoptose par le Rituximab est faible dans la
LLC-B, en partie à cause de la faible expression du CD20, déterminante dans l’effet direct du
Rituximab, qui caractérise cette hémopathie maligne (226). L’ADCC, en revanche, est le
mécanisme majeur d’action du Rituximab. Nos données d’enrichissement de la fraction SP
par le Rituximab suggèrent que la SP est résistante à l’ensemble de ces deux mécanismes
(ADCC et apoptose directe). On peut imaginer cependant, qu’en dehors des mécanismes
d’inhibition de la mort qui peuvent être mis en jeu pour échapper à l’ADCC et à l’apoptose
directe, la probabilité de rencontre entre cellules SP et cellules NK est nettement inférieure à
celle d’une rencontre entre cellules non-SP et cellules NK. Ce mécanisme de résistance basé
sur la rareté de la population SP est extrapolable in vivo et permet aux cellules SP d’être
invisibles aux cellules immunitaires.
3.2.4
Relevance physiopathologique de la chimiorésistance des cellules SP
L’ensemble de nos résultats fait état d’une résistance vis-à-vis d’agents thérapeutiques
conventionnels de la LLC-B. En lien avec le gold standard thérapeutique de la LLC-B (FCR),
l’action simultanée de ces trois drogues sur le phénotype Hoechst des cellules survivantes
reste à être défini. Cependant, les résultats obtenus in vivo pour des patients traités l’année
précédant l’analyse du phénotype SP, valident d’une part la résistance aux trois drogues et
d’autre part l’ensemble du concept de l’importance de la SP dans les mécanismes cellulaires
de chimiorésistance et de rechute post-thérapeutique. De façon similaire, l’étude de la LAM
démontre une augmentation spectaculaire de la proportion de cellules SP dans les échantillons
de patients en rechute ou résistants aux protocoles thérapeutiques (160).
109
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
3.2.5
Mécanismes cellulaires de survie sous stress chimiothérapeutique
Quelques soient les mécanismes moléculaires déterminants ces diverses résistances,
les phénomènes cellulaires à l’origine de l’enrichissement post-chimiothérapie peuvent être
expliqués de façon non-exhaustive par quatre hypothèses : (i) une éradication complète de la
fraction non-SP, (ii) une éradication complète de la fraction non-SP combinée à une
prolifération du compartiment SP, (iii) la survie des cellules SP et la conversion de cellules
non-SP en cellules SP et (iv) l’unique conversion de cellules non-SP en cellules SP.
La mort massive des cellules en culture démontre que l’enrichissement induit par les
drogues provient en partie de la destruction sélective du compartiment non-SP. De plus, la
survie préférentielle des cellules SP innées est en partie confirmée par les résultats de Foster
et al. qui démontrent une induction inférieure de l’apoptose pour le compartiment SP, en
présence de Fludarabine, en comparaison avec les cellules non-SP (162). Cependant, la
démonstration formelle de la chimiorésistance de la SP innée ne peut être établie qu’en
traitant les cellules SP innées triées avec la Fludarabine. Le nombre limité de cellules SP
innées obtenues après tri rende ces expériences particulièrement difficiles. Dans le but
d’infirmer ou de confirmer une conversion potentielle des cellules non-SP en cellules SP sous
pression chimiothérapeutique conformément aux hypothèses (iii) et (iv), les cellules non-SP
marquées au Hoechst 33342, de façon non-toxique, ont été purifiées et cultivées en présence
de Fludarabine. On observe pour tous les patients testés, une conversion d’une proportion
mineure de cellules non-SP en cellules SP sous pression chimiothérapeutique. Ce processus
cellulaire d’acquisition de chimiorésistance n’a encore jamais été documenté au travers du
phénotype SP. En conclusion, deux compartiments chimiorésistants co-existent dans la LLCB : les SP innées ou naturelles et les SP acquises ou adaptatives.
3.2.6
Bases moléculaires de l’acquisition du phénotype SP
L’explication moléculaire de ce phénomène repose sur l’induction de l’expression
et/ou de l’activité d’ABCG2 dans une sous-population privilégiée du compartiment non-SP.
En effet, la chimiothérapie a le potentiel de réactiver épigénétiquement l’expression
d’ABCG2 par déméthylation des séquences promotrices (241).
110
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Une autre explication moléculaire réside dans l’étude récente de Liang et al. (2010) qui
suggère que l’instabilité génomique inhérente des cancers et son amplification par stress
génotoxiques permet d’accroître la proportion de cellules SP (242).
Dans notre modèle, les deux composantes innées et acquises forment la SP
chimiorésistante obtenue par traitement Fludarabine. La SP chimiorésistante surexprime les
protéines ABCG2 et BMI-1. La surexpression d’ABCG2 au niveau protéique valide le
phénotype Hoechst 33342 négatif. La surexpression de BMI-1, une protéine impliquée dans la
maintenance de l’état d’immaturité des compartiments primitifs de l’hématopoïèse tend à
suggérer le statut immature des cellules SP de la LLC-B. Dans la littérature SP, la
surexpression de BMI-1 est une caractéristique des cellules SP issues de cancers épidermoïdes
oraux (243), du cancer de la vessie (244) et du cancer de l’œsophage (245). Peu d’articles
reporte une implication de cette protéine dans des mécanismes de chimiorésistance.
Cependant dans le mésotheliome, les protéines BMI-1 et ABCG2 confèrent une
chimioresistance vis-à-vis du Cisplatine et du Premetrexed dans des contextes cancéreux
uniquement (246).
Afin de déterminer si les surexpressions protéiques d’ABCG2 et de BMI-1 sont des
caractéristiques intrinsèques de la SP leucémique et non l’effet du choc chimiothérapeutique,
l’expression des gènes BMI-1 et ABCG2 au sein des SP innées a été quantifiée par QPCR.
Aucune augmentation de l’ARN messager de ces deux protéines d’intérêt n’a été révélée dans
ces expériences (résultats non montrés). Il est concevable que la SP innée ne surexprime pas
la protéine ABCG2, dont il est fondamental de dissocier expression et activité (153). Dans ce
sens, l’étude de Foster nous informe sur une hétérogénéité de l’expression d’ABCG2 par les
cellules SP issues de différents patients LLC-B, certains présentant une expression faible de la
pompe (162). Au-delà d’une régulation post-transcriptionnelle et post-traductionnelle
d’ABCG2, la possibilité d’une régulation dépendante de l’action des drogues reste
envisageable conformément aux travaux précédemment cités (241).
Pour BMI-1, la thèse d’un effet dépendant de la chimiothérapie est également
recevable. Néanmoins, l’exemple de la LMC montre qu’en présence de niveau de transcrits
équivalent aux différents stades de la maladie, une régulation post-transcriptionnelle s’opère
et entraîne une surexpression de la protéine à certains stades (247).
Enfin, bien que l’acquisition de la protéine ABCG2 soit le mécanisme potentiel
prédominant de la conversion non-SP en cellules SP, il est concevable que l’acquisition de
BMI-1 par la pression thérapeutique participe à la conversion des cellules non-SP.
111
RESULTATS ET DISCUSSION : La base cellulaire de la chimiorésistance de la LLC-B repose sur
l’existence de cellules SP innées et acquises
Cependant, l’action de BMI-1, majoritairement activatrice de la prolifération dans les
contextes cancéreux (119, 132, 133), suggère que l’activation de son expression permet un
maintien et une régénération de la progénie leucémique après chimiothérapie (121).
3.3
La prolifération permet aux cellules SP de générer des cellules non-SP
Afin de tester la capacité de la population SP innée et induite par la Fludarabine à
régénérer le « bulk » leucémique, différents stimuli ont été testés tels que TPA/IL-2, antiCD38/IL-2, CD40L/IL-2, DSP30/IL-2 et IgM/LPS (lipopolysacharride). Le plus puissant et
efficace, en termes de nombre de patients répondeurs mais également le plus éloigné de la
physiopathologie de la maladie est le DSP30 (CpG-ODN) combiné à l’IL-2. Cette
combinaison permet aux cellules de LLC-B de proliférer par induction de voies de
signalisation de danger dépendantes de l’engagement du TLR9 (Toll-like-réceptor) (248,
249). Dans la pathogenèse LLC-B, la prolifération des cellules leucémiques est finement
régulée par un microenvironnement spécifique et intervient au niveau des centres de
prolifération qui concentrent les signaux moléculaires et les acteurs cellulaires nécessaires à la
division. Par ce stimulus DSP30/IL-2, totalement artificiel, nous observons la capacité des
cellules SP innées et chimiorésistantes à générer des cellules Hoechst 33342 positives. Afin
de ne pas écarter la possibilité qu’une fraction de cellules d’intérêt puisse être contenue dans
le compartiment non-SP, la fraction non-SP purifiée a été soumise au stimulus prolifératif
DSP30/IL-2. Cependant, bien que la concentration de Hoechst 33342 contenue dans les
cellules ne soit pas toxique, il n’a pas été possible de conclure sur la capacité des cellules nonSP à régénérer le compartiment SP par division mitotique en raison d’un blocage du cycle
induit par la présence de Hoechst 33342 dans les cellules.
L’ensemble de ces résultats démontre une nouvelle hétérogénéité cellulaire de la LLCB. Cette hétérogénéité combinant phénotype SP et chimiorésistance apparaît être impliquée
dans les évènements cellulaires à l’origine des rechutes post-thérapeutiques de la LLC-B.
Bien que le potentiel initiateur de leucémie de ce compartiment reste à être prouvé
scientifiquement au moyen de modèles murins, cette étude souligne l’intérêt du ciblage
thérapeutique de ce compartiment leucémique chimiorésistant.
112
« Ce n'est pas dans la science qu'est le bonheur,
mais dans l'acquisition de la science »
Edgar Allan Poe - Le Pouvoir des mots
DISCUSSION
GENERALE
DISCUSSION GENERALE
DISCUSSION GENERALE
La LLC-B est une maladie incurable. La base cellulaire de cette incurabilité réside
dans l’apparition constante de rechutes après traitement. Ce constat clinique traduit
l’inefficience des thérapies à éradiquer de façon exhaustive une fraction non-négligeable et
chimiorésistante du clone leucémique. Une meilleure compréhension des mécanismes
cellulaires et moléculaires qui permettent la résurgence du clone leucémique post-thérapie est
essentielle à l’élaboration de thérapies indépendantes de l’action cytotoxique des
chimiothérapies.
Les données accumulées sur la chimiorésistance (acquise et innée) exclusive des
cellules SP de la LLC-B in vitro et leur forte persistance in vivo post-thérapie suggèrent
l’implication des cellules SP dans les phénomènes de régénération du clone leucémique après
traitements. Une ébauche des capacités de repeuplement de cette population uniquement
sanguine a été effectuée en présence d’un stimulus prolifératif artificiel éloigné de la
physiopathologie de la LLC-B. En effet, la prolifération des cellules de LLC-B se déroule
dans un microenvironnement ganglionnaire spécifique au sein de structures particulières que
sont les centres de prolifération. Afin de replacer ces données de régénération dans des
modèles les plus proches possibles de la physiopathologie, l’enjeu serait de reconstituer in
vitro l’environnement ganglionnaire des cellules de LLC-B, tel qu’il l’est décrit dans les
publications de Plander et al. (2009) et de Kater et al. (2004) (45, 87). Dans ces systèmes de
prolifération plus « physiopathologiques », la prolifération des cellules SP ainsi que leur
capacité à générer des cellules non-SP pourraient être définies. De plus, l’impact de ce
microenvironnement sur la conversion des cellules non-SP en cellules SP pourrait être
également étudié et permettrait de répondre à la question du rôle de la pression
microenvironnementale dans la modification du phénotype des cellules de passage au niveau
des ganglions. Enfin, l’étude d’échantillons ganglionnaires de patients LLC-B, qui fait l’objet
d’un projet collaboratif au sein du laboratoire, combinée à l’étude du sang périphérique de ces
mêmes patients permettra de définir la proportion de cellules leucémiques pourvues d’un
phénotype SP au niveau de ces structures réservoirs de la maladie. Ces expériences
permettront de replacer l’importance du phénotype SP non seulement dans la prolifération
post-thérapeutique mais également dans l’ensemble de la physiopathologie de la maladie qui
permet l’expansion du clone leucémique. De fait, se pose la question : les cellules SP de la
LLC-B peuvent-elles représenter le compartiment initiateur de leucémie de la LLC-B ?
113
DISCUSSION GENERALE
Trois données majeures de nos travaux tendent à indiquer que la SP de la LLC-B
correspond à un compartiment immature de la maladie : le phénotype Hoechst négatif, la
chimiorésistance exclusive et multiple, et la surexpression de BMI-1. Afin de valider cette
hypothèse de hiérarchisation du clone leucémique, il est nécessaire d’établir le potentiel
initiateur de leucémie de la population SP par transplantations sérielles dans des modèles
murins. Cependant, la quiescence des cellules de LLC-B et leur dépendance aux composants
du microenvironnement font que les modèles de xénogreffe de cellules de LLC-B restent peu
accessibles techniquement. Le modèle développé par l’équipe de N. Chiorazzi qui requiert
l’injection combinée de cellules du microenvironnement et d’une grande quantité de cellules
leucémiques apparaît comme le plus pertinent pour la recherche de cellules initiatrices de
LLC-B (47). Une option alternative aux modèles de xénogreffe réside dans les modèles
transgéniques tels que les souris Eµ-TCL1, NZB ou encore les MDR-/- et miR-15a/16-1
-/-
récemment développées. Cette stratégie requiert d’effectuer une étude complète du phénotype
SP dans ces modèles de pathogenèse qui ne reflètent que partiellement l’oncogenèse LLC-B
humaine. Une fois l’existence de cellules SP avérée dans ces modèles murins, le potentiel
initiateur de leucémies des cellules SP sera déterminé par transplantations sérielles dans des
souris syngéniques de même fond génétique. Ce protocole expérimental est valide avec les
cellules leucémiques issues de souris Eµ-TCL1 qui lorsque qu’injectées à des souris
syngéniques engendrent le développement d’une leucémie létale (250). Il est néanmoins
possible qu’il n’existe pas de compartiment initiateur dans les modèles murins de pathogenèse
LLC-B, de façon similaire à l’étude controversant l’hypothèse des cellules souches dans des
modèles murins de lymphomes B (Eµ -myc) et T (Eµ-N-RAS) ainsi que de LAM (PU.1-/-)
(125). Même si pour l’exemple de la transplantation de cellules leucémiques issues des souris
Eµ-TCL1, les cellules proviennent uniquement de compartiments prolifératifs tels que la rate
et les ganglions, on ne peut pas exclure la possibilité d’une équipotence, contrastant avec
l’hétérogénéité, en termes d’initiation de LLC-B qui ne reflète pas la leucémogenèse humaine.
Bien que l’étude du potentiel initiateur de la maladie soit essentielle dans la démonstration de
l’importance de la fraction SP de la LLC-B, une question fondamentale persiste : la SP estelle une cause ou une conséquence de la carcinogenèse ? Plus précisément, la population SP
est-elle à l’origine de la maladie ou est ce que son occurrence reflète une petite proportion du
clone formée post-transformation leucémique pour assurer la pérennité de l’expansion
cancéreuse dans des conditions de stress comme l’expérience de la chimiothérapie.
114
DISCUSSION GENERALE
Une expérience potentielle pour répondre à cette question pourrait l’étude du phénotype
Hoechst de la MBL, le stade pré-leucémique de la LLC-B. Cependant, il reste possible que
l’acquisition du potentiel de chimiorésistance traduit par le phénotype SP soit dépendante du
processus de transformation leucémique.
Notre étude révèle une hétérogénéité de la LLC-B basée sur le phénotype SP, une
population connue dans la littérature pour être enrichie en cellules initiatrices de cancer. De
plus, la chimiothérapie permet de sélectionner cette population, initialement représentée de
façon infime, dans un processus qui comprend l’induction du phénotype SP sous stress
génotoxique. Dans des concepts plus globaux de hiérarchisation du cancer, la
chimiorésistance est une caractéristique fondamentale des cellules initiatrices de cancer.
Certains exemples dans la littérature utilisent cette propriété de chimiorésistance pour
démasquer la fraction souche de lignées cancéreuses hétérogènes. De fait, un variant
tumorigénique de la lignée de cancer du sein SK-BR3 a été généré par passages sériels de la
lignée parentale dans des souris NOD-SCID traitées à l’Epirubicin (251). De même, Levina et
collègues (2008) dans une étude très élégante démontre, dans un modèle de cancer du
poumon, que les cellules survivantes à une thérapie – drug surviving cells (DSC) - (trithérapie
composée de Doxorubicin, Etoposide et de Cisplatine) récapitulent toutes les caractéristiques
inhérentes aux cellules souches cancéreuses (149). De façon analogue à la pression
chimiothérapeutique, les conditions extrêmes de survie telles que l’absence de sérum et
l’hypoxie permettent de sélectionner cette composante souche des cancers (127). Cependant, à
l’instar de nos résultats sur l’acquisition du phénotype SP sous chimiothérapie, se soulèvent
les questions suivantes : Dans quelle mesure favorisons-nous la « dédifférenciation » des
cellules ? Ce potentiel de « dédifférenciation » est t-il contenu dans l’ensemble des cellules ou
uniquement confiné à une élite présentant une plasticité génomique aux stress ? Ce potentiel
de « dédifférenciation » ou d’immaturité dans la carcinogenèse peut-il exister de façon
inhérente, en l’absence de stress, dans des populations cancéreuses matures ?
La LLC-B est une maladie du compartiment mature de la lymphopoïèse B, aussi est-il
plutôt atypique de concevoir un compartiment immature au sein d’une population déjà
avancée dans la différenciation. Supportant ce fait, les marqueurs canoniques d’immaturité
tels que le CD34 et le CD127 n’ont pas été retrouvés à la surface des cellules SP leucémiques
(résultats non montrés).
115
DISCUSSION GENERALE
Similairement, l’étude menée par Matsui et al. démontre que pour le Myélome Multiple,
correspondant à la transformation néoplasique du stade final de la lymphopoïèse B, les
cellules initiatrices de cette hémopathie présentent le phénotype « immature » CD138- (150).
En effet, l’expression du CD138 est acquise lors du stade terminal de différenciation et
caractérise les cellules du Myélome multiple. Ces cellules initiatrices de Myelome Multiple
présentent également un phénotype CD20+ CD27+, associé à des stades plus précoces mais
mature de la lymphopoïèse B. Ce phénotype récurrent dans la recherche de cellules initiatrices
d’hémopathies B matures caractérise les cellules B mémoires (252, 253). De fait, l’autorenouvellement des cellules mémoires B et T est une caractéristique unique du système
immunitaire adaptatif qui permet la maintient de l’immunité tout au long de la vie d’un
individu (254). En effet, contrastant avec les systèmes neuronaux et myéloïde de
hiérarchisation cellulaire où l’auto-renouvellement est restreint au seul compartiment primitif,
l’auto-renouvellement est maintenu à des stades multiples dans la lymphopoïèse B afin de
permettre la génération de clones produisant des anticorps pourvus de la plus haute affinité.
Supportant cette thèse, les cellules T mémoires sont capables de division asymétrique (255) et
les cellules B et T mémoires partagent avec les cellules souches hématopoïétiques une
signature moléculaire commune impliquée dans l’auto-renouvellement (256). Concernant le
modèle LLC-B qui est caractérisé par une positivité du marqueur CD27 (53), de plus en plus
d’éléments scientifiques démontrent que les cellules de LLC-B Ig-NM et Ig-M pourraient être
issues de la transformation leucémique de cellules B mémoires, dotées d’une capacité d’autorenouvellement (2, 257). De plus, en faveur de la cellule SP initiatrice, BMI-1 apparaît
comme étant un trait de la signature moléculaire commune entre les cellules B mémoires et
les cellules souches hématopoïétiques (256). Il est donc possible d’émettre la thèse, qu’une
population initiatrice B mémoire, initialement dotée d’une capacité d’auto-renouvellement
inhérente à sa fonction immunologique et soumise à une stimulation antigénique chronique,
soit le précurseur de la LLC-B.
La théorie de compartiments initiateurs, pourvus de fonctions primitives, au sein de
compartiments B matures peut être également expliquée par les concepts récents de
reprogrammation cellulaire. En effet, les lymphocytes B présentent une grande plasticité,
traduite par une capacité de reprogrammation.
116
DISCUSSION GENERALE
Cette capacité de reprogrammation, induite ex vivo, soit par l’expression ectopique de
protéines impliquées dans la pluripotence (Oct4, Sox2, Klf4 et c-myc) soit par l’inhibition du
garant du lignage B (Pax5), engendre une « dédifférenciation » de ces lymphocytes B vers
respectivement la pluripotence ou un stade progéniteur capable de générer des cellules T (258,
259). Si l’occurrence de ces concepts de reprogrammation cellulaire à partir de stades matures
n’est toujours pas avérée dans des cas de physiologie normale ou de carcinogenèse, il l’est
cependant au niveau des compartiments progéniteurs de l’hématopoïèse (121, 260).
Néanmoins, l’étude de l’inactivation de pax5 démontre l’apparition de lymphomes agressifs
présentant un phénotype immature. Bien que dans notre étude l’implication du gène pax5 soit
écartée puisque l’on conserve l’identité B dans la population SP, il est possible que
l’inactivation ou l’activation de certains gènes durant le processus de transformation
leucémique conduise à une reprogrammation partielle des lymphocytes qui acquièrent un
phénotype plus immature et plus résistant. Dans cette logique, l’expression de BMI-1 pourrait
être garante de l’état d’immaturité associé à la chimiorésistance des cellules SP de la LLC-B.
L’inactivation des trois gènes cibles de BMI-1 (p16ink4a, p19Arf, Trp53) conduit des
progéniteurs multipotents à acquérir une capacité de régénération de l’hématopoïèse à long
terme (121). De façon très spéculative, l’hétérogénéité de l’expression de BMI-1, reflétée par
une surexpression de celle-ci dans la population SP, est potentiellement indicative de son
potentiel à générer le clone leucémique ou encore d’une activité de reprogrammation
cellulaire.
En résumé, bien que la capacité initiatrice de la population SP LLC-B soit loin d’être
démontrée, sa chimiorésistance ainsi que son potentiel à régénérer le compartiment non-SP
soulignent l’intérêt de son ciblage thérapeutique de façon indépendante de l’usage de la
chimiothérapie.
Le potentiel de certaines immunothérapies à participer à l’éradication de la fraction SP
a été en partie étudié dans la LLC-B (162, 261). Par stratégie de vaccination de cellules
leucémiques LLC-B modifiées pour exprimer le CD40L et l’IL-2, les auteurs démontrent une
diminution de la SP dans la circulation sanguine, dont la réémergence rapide est dépendante
du déclin de l’immunité T. De plus, des stratégies de vaccination plus spécifiques semblent
être envisageables car les cellules SP stimulées par le CD40L expriment de façon
différentielle certains antigènes tumoraux dont RHAMM (Receptor for hyaluronan-mediated
motility).
117
DISCUSSION GENERALE
Enfin, cette stratégie thérapeutique démontre à l’occasion d’un « short report » (261),
l’éradication du compartiment SP suivie d’une disparition progressive du compartiment nonSP d’un patient LLC-B présentant un stade leucémique avancé. Cependant, le double rôle du
CD40L dans les phases de prolifération/survie des cellules leucémiques n’est pas dénué d’un
risque d’expansions leucémiques aggravantes (46).
La spécificité de l’immunothérapie T (dépendante d’une expression cellulaire
potentiellement hétérogène), l’ensemble des mécanismes d’ « immunoediting » qui couvre
l’expression antigénique ( cf. introduction paragraphe § III 2.1.2 ), la rareté des cellules SP
(qui compromettent les probabilités de synapse immunologique) et l’immunodéficience T
CD8 dans la LLC-B (179) dictent le besoin d’alternatives immunothérapeutiques plus
globales (indépendante des CPA et des signaux co-stimulateurs).
Dans ce contexte, plusieurs stratégies d’immunociblage de cette population SP
indépendamment de la fonction T cytotoxique peuvent être envisagées.
Dans un premier temps, il apparaît essentiel d’identifier des cibles moléculaires
spécifiques au travers de la définition du transcriptome complet des populations SP innée et
chimiorésistante, en comparaison avec le transcriptome de la population non-SP. Une telle
approche avec une attention particulière, au moment de l’interprétation, sur les marqueurs de
surface permettra potentiellement de définir des anticorps spécifiques de cette population. La
génération d’anticorps thérapeutiques, dont l’épitope serait restreint exclusivement aux SP
leucémiques, pourrait permettre une éradication de cette population chimiorésistante, de façon
alternative à la chimiothérapie. Cette stratégie d’identification s’est avérée efficace pour
définir des cibles thérapeutiques des cellules initiatrices de mélanomes malins (anti-ABCB5)
(145) et de Myélome Multiple (anti-CD20, Rituximab) (150). Le cas du mélanome malin
montre que le ciblage par anticorps anti-ABCB5 réduit considérablement la formation de
tumeurs et le volume tumoral dans des modèles murins de xénogreffe.
Outre l’identification de nouvelles cibles, il est possible à l’instar de nos travaux sur la
reconstitution immunitaire post-FCR de définir des stratégies efficaces, indépendantes de
l’apport de nouveaux outils thérapeutiques spécifiques du compartiment SP. En effet, l’impact
du Rituximab sur la population SP n’a été testé que dans un contexte où l’ensemble du clone
leucémique était présent. En plus de l’inhérente déficience des fonctions NK dans la LLC-B,
la rareté des cellules SP a pu constituer un mécanisme efficace d’échappement à l’action de
l’anticorps monoclonal.
118
DISCUSSION GENERALE
Cependant, si on extrapole in vivo nos données d’enrichissement, le fait que la chimiothérapie
démasque et sélectionne exclusivement les cellules SP constitue potentiellement l’étape
requise à l’efficacité d’une stratégie d’immunothérapie par Rituximab.
De plus, la modification de l’immunogénicité des cellules survivantes au choc
chimiothérapeutique dans des lignées cellulaires de leucémie (262) combinée à la résistance
des cellules NK post-traitement que nous reportons, suggère la possibilité d’une réponse
immunitaire NK anti-SP. Cependant, l’existence et l’efficacité d’un tel contrôle
immunologique des cellules LLC-B survivantes post-chimiothérapie par les cellules NK sont
infirmées par la constance du phénomène de rechute qui caractérise la LLC-B. Supportant
cette hypothèse, la reconstitution d’un environnement immunosélectif post-thérapie,
potentiellement par la reconstitution des cellules CD4+, semble être un pré-requis à la
réémergence du clone leucémique. L’enjeu des stratégies d’immunociblage réside ici dans
l’identification et l’inhibition des mécanismes d’immunosubversion et d’ « immunoediting »
spécifiques de la population leucémique résurgente et de son microenvironnement protumoral (cellules CD4+). De même, il est possible que, lors de la chimiothérapie, certaines
cellules échappent aux stress en migrant au sein de niches, fournissant des signaux antiapoptotiques et immunosubversifs, et inhibant le recrutement des cellules effectrices de
l’activité anti-tumorale. L’identification des dialogues cellulaires et des processus de
recrutement des cellules leucémiques et des cellules de la surveillance anti-tumorale au sein
de ces niches chimiorésistantes, est donc essentielle pour cibler cette stratégie de résistance
extrinsèque. A cette fin, l’utilisation d’anticorps bloquant les interactions entre cellules
initiatrices et microenvironnement a démontré une efficacité dans la LAM (anti-CD44) (127).
Enfin, les ratios effecteurs/cibles en faveur des populations effectrices NK obtenus
post-FCR, la restauration des compétences cytotoxiques NK et la présence accrue de cellules
SP chimiorésistantes après thérapie préludent le potentiel thérapeutique de stratégies
d’immunomodulation de la fonction NK post-thérapie.
Indépendamment des approches immunothérapeutiques, les signaux, engageant la
différenciation des cellules initiatrices avec perte des fonctions inhérentes à leur statut
(chimiorésistance, quiescence, auto-renouvellement), offrent une alternative thérapeutique
récemment explorée. En effet, les cytokines différenciantes, telles que l’IFN-α dans la LMC,
ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques (227) dans l’inhibition du potentiel
immature et le ciblage des populations différenciées par les thérapies conventionnelles.
119
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSION
En conclusion, une nouvelle hétérogénéité potentiellement hiérarchique de la LLC-B a
été découverte au cours de ces travaux via l’identification de la SP leucémique
chimiorésistante. Cette nouvelle compréhension de l’hétérogénéité du clone leucémique tend
à apporter des éléments de réponse sur la base cellulaire des rechutes post-thérapeutiques.
Une nouvelle vision thérapeutique de la LLC-B, où cette hétérogénéité du clone leucémique
est intégrée et utilisée, est suggérée dans l’ensemble des travaux de cette thèse.
L’immunociblage par les cellules NK post-chimiothérapie, de cette population impliquée dans
la rechute, apparaît être une option thérapeutique prometteuse au travers de la reconstitution et
de la restauration des capacités cytotoxiques NK après thérapie.
120
« Le paradoxe de la science est qu'il n'y a qu'une réponse à ses méfaits et à ses périls :
encore plus de science… »
Romain Gary – Charge d’âme
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134
ANNEXE
ANNEXE
ANNEXE : CANCER STEM CELLS OF
DIFFERENTIATED B-CELL MALIGNANCIES:
MODELS AND CONSEQUENCES
Submitted to the journal Cancers
Emilie Gross1,2, Anne Quillet-Mary1,2 Loic Ysebaert1,2,3 Guy Laurent1,2,3 and Jean-Jacques Fournié1,2,4
1
INSERM, U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, 31300 Toulouse, France;
2
Université Toulouse III Paul-Sabatier, 31300 Toulouse, France;
3
Service d’Hématologie, CHU Purpan, 31300 Toulouse, France
4
Corresponding author: [email protected]
Abstract
The concept of cancer stem cells has revolutionized our current vision of cancer development and was
validated in solid tumors and cancers of the primitive hematopoietic compartment. Proof of its
principle are still lacking however, in malignancies of differenciated B-cells. We review here the
current literature which nevertheless suggests hierarchical organizations of the tumor clone for mostly
incurable B-cell cancers such as multiple myeloma, lymphomas and B-chronic lymphocytic leukemia.
We propose two models accounting for cancer stem cells in these contexts: a “top-to-bottom” clonal
hierarchy from memory B-cells and a “bottom-to-top” model of clonal reprogramming.
Selection
pressure on the growing tumor can drive such reprogrammings and increase its genetic diversity.
135
ANNEXE
Introduction
Pioneer work by John Dick and Dominique Bonnet has initiated a new vision of carcinogenesis
by demonstrating the hierarchy of the AML malignant clone [1]. By showing that AML comprised a
minor immature compartment, whose properties recapitulate those of the normal hematopoietic stem
cell (HSC), they demonstrated a new model of leukemogenesis and defined the first cancer stem cell.
By analogy with hierarchical organization of hematopoiesis, this concept implies that a discrete
fraction of cells with stem cell features (asymmetric division) is able to indefinitely sustain the
malignant progeny through self-renewing and differenciation processes. Since this initial report in the
mid 90’s, there has been a great enthusiam for this concept as evidenced by the number of identified
“cancer stem cells” (CSC) in varied hematological and solid tumors (chronic myelogenous leukemia
(CML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), breast cancer, brain cancer, prostate cancer….).
Methods to identify putative cancer stem cells were initially based on defining the immature
phenotype of cancer-initiating cells. The variability of cell surface phenotypes in various conditions, as
well as the lack of applicability in every malignant settings, led investigators to devise novel methods
of identification based on stem cell properties [2]. The side population (SP) phenotype mediated by
the activity of ABCG2, an ABC transporter involved in hematopoietic stem cell biology, and detected by
efflux of the Hoechst 33342 dye defines “stem cell-like cells” with drug resistant potential [3-5].
Similarly, activity of ALDH, an enzyme involved in detoxification of a variety of compounds including
active metabolites of cyclophophamide [6] and preferably expressed in primitive cell compartment [7],
permits the identification of putative stem cell compartment [8, 9]. Although these methods allow
definition of specific primitive cell compartments, definitive proof of cancer-initiating potential is
provided by serially transplanting (self-renewal) these cells and recapitulating the initial cancer
heterogeneity (differentiation) in xenografted or transgenic mice models.
With the cancer stem cell concept, a new era of cancer therapy has emerged. The
conventional therapies destroy differentiated cancer cells but leave intact the highly chemoresistant
cancer stem cells. After eradication of the tumor progeny by therapy, the “cancer stem cells” able to
switch on their mitotic division/differentiation program can drive the reemergence of the initial tumor
heterogeneity [10]. Thus, full eradication of the malignant clone requires the integration of tumor
heterogeneity for the design of efficient therapeutics.
The cancer stem cell concept has been fully validated in AML, ALL and some solid cancers,
since the cell that received the initial oncogenic hit was a stem cell itself in such pathologies. By
definition indeed, no such stem cell exist in mature lymphopathies, even if long lasting, self renewing
memory cells exist. So what should be the definition of a CSC?
From a clinician viewpoint it is a cell that resists to all therapies and drives subsequent
relapses, while a more formal definition implies a cell that is able to self-renew, migrate, differentiate
and reconstitute the heterogeneity of the initial tumor. Since relapses are always part of the natural
136
ANNEXE
history of low grade lymphomas and myeloma, these diseases involve stem cells according to the first
definition, although scientific data that validating this conclusion based on the second definition are
completely lacking.
We chose to blunt the strict CSC definition to its more clinical version such as to take in
account the evidences for cancer-initiating cells in hematopoietic B mature malignancies which are
now emerging from the literature. Here we review and discuss the studies which support the CSC
theory in multiple myeloma (MM), lymphomas and B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) (Figure 1).
Figure 1: B-cell malignancies and their progenitor cells
Multiple Myeloma (MM)
Along with elevated serum immunoglobulin and osteolytic bone disease, multiple myeloma
(MM) is characterized by the clonal expansion and accumulation of mature and quiescent CD45CD138+ antibody secreting neoplasic plasma cells in the bone marrow. Despite initial clinical responses
induced by a wide range of cytotoxic agents, MM remains incurable with almost constant
reconstitution of the malignant clone after each therapeutic round. Such a clinical scenario is usually
attributed to the underlying activity of CSCs.
The hierarchy of an MM-stem cell whose progeny replenishes the MM clone was proposed
long time ago [11, 12]. In these early works, malignant plasma cells derived from Balb/c mice with
chronic peritoneal inflammation were engrafted in syngeneic animals with a tumorigenic cell frequency
as low as ~1/1,000 cells. The self-renewal capacity of these MM-initiating cells was then formally
demonstrated by their subsequent engraftment in secondary recipients. Thus the MM population was
heterogeneous, as it encompassed both self-renewing, highly proliferative stem cells and their more
137
ANNEXE
quiescent progeny [11-13]. A related clonogenic potential was uncovered in few MM cells from
primary human MM samples [14].
When anti-MM-idiotype antibodies were used to detect a phenotypically distinct -more
immature- compartment of proliferating MM B cells, they revealed its presence in both blood and bone
marrow from patients with MM and monoclonal gammopathy of unknown significance (MGUS, a premyeloma state) [15]. The Ig gene rearrangements and chromosomal abnormalities of such clonotypic
MM B-cells were characterized, together with the demonstration of their ability to differentiate into
plasma cells in vitro [16-19]. In addition, MM cells are malignant counterparts of the terminal stage
(CD138+) of B cell lymphopoiesis. Accumulating -yet controversed- evidences from studies with
xenografted mice suggest that the MM-initiating cells are confined within a small CD19+CD138- subset
differing from the CD20-CD138+ malignant bulk [20-22]. Further phenotypic definition of these
clonotypic MM B cells delineated the myelomagenic potential to CD19+/CD138-/CD27+/CD20+ cells, a
phenotype characteristic of memory B cells. Such CD138- cells displayed not only chemoresistance but
also stem cell characteristics such as ALDH+ and SP phenotype, constitutive Hedgehog signaling and
self-renewal in serially transplanted mice [23, 24].
Obviously, a highly specific targeting of this MM clonotypic B cell population is therefore likely
to validate the CSC concept in MM, in addition to unveil new therapeutic options for this disease.
B-Lymphomas
The generic denomination of B-cell lymphoma encompasses a variety of entities (>70 in WHO
classification) which pathogenesis relies on B-cell neoplasic transformation and accumulation within
the lymphatic tissues. B-cell lymphomas are divided into Hodgkin lymphomas (HL) and Non-Hodgkin
lymphomas (NHL), which consist in 30 different malignant entities. The most prevalent malignancies
of this second group are Diffuse Large B cell lymphoma (DLBCL, 35%), Follicular Lymphoma (25%)
and Mantle Cell Lymphoma (5-10%). The first formal evidence for lymphoma-initiating cells came
from the detection of few transplantable lymphoma cells in mice [25]. Since then, the lymphoma stem
cell hypothesis has remained largely unexplored in these diseases, although the following lines of
evidence now suggest their existence in Hodgkin’s, Follicular and Mantle Cell lymphomas (see below).
Hodgkin Lymphoma
Hodgkin Lymphoma (HL) is a very unique cancer in which neoplasic cells (Hodgkin Reed-Sternberg /
HRS cells) account for 0.1%-1% of the total cells in a biopsy. These morphologically atypical tumor
cells from the hematopoietic B lineage express CD30 and CD15 and lack typical sIg markers of B-cell
identity. However, their B-cell origin is evidenced by the occurrence of clonal Ig heavy chain gene
rearrangement and somatic mutations [26]. As for MM, HL cell lines (L428 and KM-H2) comprise a
138
ANNEXE
small fraction of B-cells harboring the CD20+ CD27+ memory phenotype as well as the ALDH activity
involved in stemness [7]. When sorted, such CD20+ CD27+ memory B cells were able to durably
generate HRS cells in vitro and they displayed high clonogenic and self-renewal potentials. Related
clonotypic B-cells in peripheral blood samples from most HL patients were detected by light chain
restriction among the CD27+ ALDHhigh cells [27]. Although these evidences suggest that clonotypic B
cells could represent HL precursors, the lymphoma-initiating capacities of this B cell population
remains to be formally proven.
Follicular Lymphoma
The hallmark of Follicular Lymphoma (FL) is the t(14;18) translocation which causes overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 gene. Although this chromosomal rearrangement constitutes a
founding step for FL oncogenesis, additional molecular and cellular events are required for full blown
malignant transformation. FL remains an incurable disease, with frequent relapses replenishing the
initial tumor bulk after chemotherapies. As for HL, very few studies investigated a potential hierarchy
in the FL clone.
The first element concerning the cellular origin of FL is the presence of a pre-malignant cell
subset in peripheral blood from healthy adults. This subset is composed of oligoclonal and long-lived
normal B-cells which harbour the t(14;18) translocation and a CD27+IgD+ phenotype. Together with
some unusual features of memory B cells (such as allelic paradox), these characteristics are typical of
the FL genome and phenotype [28]. Little is known on the genesis of such premalignant clones,
except that they progressively expand in farmers exposed to pesticides epidemiologically linked to
NHL [29]. Investigations of this atypical “memory-like” and pre-malignant FL seed in murine models
are nevertheless required to validate its FL stemness.
The second element suggesting a FL hierarchy is the persistence of a t(14;18)+ cell subset in
lymph nodes from most FL patients in remission [30]. In line with the clinical course of FL, these
remission-relapses episodes might thus reflect post-therapeutic replenishment of the malignant clone.
Whether the t(14;18)+ cell persistence is mediated by intrinsic chemoresistance (due to stemness
features such as ALDH+ and SP+) or by environment-mediated drug resistance remains controversial.
In favor of the intrinsic chemoresistance however, preliminary data revealed that some FL cell lines
and biopsies displayed an ABCG2+ SP+ subset that was highly chemoresistant to gemcitabine [31].
In conclusion, the hierarchy concept is still in its infancy for FL, and many scientific evidences
are still lacking to formally validate this hypothesis. They comprise, inter alia, the characterization of
the stemness signature of the pre-FL cell population and the identification of second hits leading to FL
pathogenesis.
139
ANNEXE
Mantle Cell Lymphoma
Mantle Cell Lymphoma (MCL) is characterized by the expansion of neoplastic CD5+, cyclin D1+ (due to
a t(11;14) translocation) cells which accumulate in the lymph nodes, bone marrow, spleen,
gastrointestinal tract and to a lesser extent in blood. The sole report suggesting a hierarchical
organization of the MCL clone described SP cells in (IL14α x c-Myc) double transgenic mice which
developed MCL. The surprisingly large MCL SP compartment in this model exhibited both cytogenetic
hallmarks and stemness features of MCL . These stem cell characteristics included longer telomeres,
clonogenic potential and MCL-initiating capacities in xenografted mice [32]. To fully extrapolate this
concept to the pathogenesis of human MCL however, it remains to be validated in MCL biopsies.
Chronic Lymphocytic Leukemia
B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is characterized by the clonal expansion and
accumulation of CD19+ CD5+ malignant -though quiescent- lymphocytes in the blood, the bone
marrow and the lymphoid tissues. Accumulating evidences suggest that the proliferative compartment
of this malignancy resides in specialized structures from lymphoid tissues called proliferation centres
[33, 34]. This unique feature of B-CLL reflects its strong dependence to microenvironmental signals
and precludes most classic mice models. Among the various factors involved in B-CLL prognosis, the
mutational status of BCR defines two types of disease: B-CLL with mutated (associated with a good
prognosis) or with unmutated Ig (associated with a poor prognosis) [35]. Although previous attempts
to evidence the involvement of HSC in B-CLL have been refuted [36, 37], a hierarchical organization of
the B-CLL leukemic clone remains to be validated [38].
In line with the CSC concept in B-CLL, this cancer remains incurable due to post-therapeutic
re-emergence of the leukemic cell clone. As for MM and FL, this clinical evolution could result from a
“B-CLL stem cell” clone with high drug-resistant and post-therapeutic replenishing potentials. This
intraclonal heterogeneity of the B-CLL clone was tracked by monitoring its SP phenotype. We and
others demonstrated the existence of few drug-resistant CD19+CD5+ SP cells in virtually all patients
[39, 40]. Their identical cytogenetic abnormalities indicated that such SP were clonally related to the
rest of the B-CLL cells. Furthermore, the post-therapeutic amplification of these SP suggested their
implication in the relapse. Of note however, the chemotherapeutic pressure selected an evolutive
conversion of some non-SP cells into SP cells over-expressing both ABCG2 and the stem cell marker
BMI-1 [41].
These recent studies of the B-CLL disease uncovered an hitherto unattended heterogeneity of
the leukemic clone regarding stem cell-like features such as the SP phenotype, multi drug resistance
140
ANNEXE
and BMI-1 over-expression. Whether this heterogeneity is hierarchical remains to be determined, for
example through investigation of the B-CLL-initiating potential of its SP fraction.
Memory B cells : the usual suspects
In search for cancer-initiating cells, memory B-cells are usual suspects for the pathogenesis
of differenciated B-cell malignancies (MM, HL, FL, mutated B-CLL) [28, 34, 42] (Figure 1). Likewise,
unmutated B CLL cells as well as MCL are orthopically related to long-lived and self-replenishing CD5+
murine cells [42]. Although self-renewal is confined to the primitive stem cell compartment in most
tissues, adaptive immunity maintains life-long protection through self-renewal of memory B and T
lymphocytes [43]. Supporting this parallel, memory T cells can undergo asymmetric division [44] and
self-renewal programs represent a gene signature shared by memory B and T lymphocytes as well as
by HSC [45]. Of note, BMI-1 over-expression is also shared by both memory B cells and HSC [45].
Here, we propose that memory B cells represent a cancer stem cell compartment in most
mature B malignancies. These cells represent an expanded and self-renewing reservoir refueling
tumor growth through a hierarchical paradigm matching the HSC concept in AML and CML.
Transformation of the B-cell memory compartment by chromosomal translocation (for FL) and
additional events (e.g. microenvironmental or chronic antigenic stimuli) [29, 34] might drive the
generation of malignant progenies. In such a paradigm, the type of transforming molecular event
targeting the same memory B cell might contribute to determine the various malignant entities
produced (FL, CLL, HL, MM). Whether this “transformed” memory B cells possesses a drug-resistant
phenotype remains to be demonstrated. We speculate that the stemness of memory cells involves
their drug-resistance transcriptional programs.
Molecular reprogramming
Although consistent evidences tend to make memory B-cells good candidates for mature B
CSC, accumulating data demonstrate the impressive plasticity of B-cell lineage differentiation.
Illustrations of such reprogramming events in cancer are provided by AML and CML pathogenesis,
where committed progenitors can acquire stem cell properties [46, 47]. Although the natural
occurrence of such B-cell differentiation reprogramming has never been documented, the bioactivity
of reprogramming transgenes has formally demonstrated the extraordinary plasticity of lymphocytes.
Differentiated B cells were reprogrammed into macrophages upon introduction of CEBPα/β combined to
extinguished expression of Pax5, a B-cell identity gene [48]. Furthermore, conditional mutant Pax5 gene
triggered the retro-differentiation of mature B-cell into uncommitted lymphoid progenitors in mice. In
addition to the development of immature and aggressive lymphoma, it also triggered an efficient Bto-T cell conversion when transplanted in mice lacking lymphoid cells [49]. Along studies of induced
pluripotent stem cells (iPS), terminally differentiated B cells were reprogrammed to pluripotency
141
ANNEXE
through ectopic expression of Oct4, Sox2, Klf4 and c-MYC in conjunction with interruption of B-specific
transcriptional program by specific knockdown of Pax5 or exogenous expression of CEBPα/β [50].
Although the occurrence of reprogramming phenomenon in mature B cell lymphoma remains
unknown, specific gene expression may confer stemness properties. This might occur during
malignant progression or initiation, enabling the fraction of cancer-initiating cell to gain, independently
of their inherent differentiation, self-renewal and replenishing activities. For instance, Bmi-1
overexpression could represent such a reprogramming event in B-CLL. Supporting this hypothesis,
mimicking BMI-1 activity by deleting its target genes in multipotent progenitors allowed these cells to
acquire a long-term hematopoietic repopulating ability that was otherwise the HSC compartment’s
privilege [51]. In addition, the c-Myc oncogene, which is frequently deregulated in B-lymphoma, is
also involved in controlling the balance between self-renewal and differenciation in HSC [52]. As a
plausible proof of concept for the function of c-Myc in lymphoma stem cells, Eµ-MYC lymphoma cells
were almost homogenously able to initiate lymphomas in transplantation experiments [53]. It is thus
possible that c-Myc was a reprogramming factor which conferred stemness to the malignant cells in
these mice.
Conclusion
The CSC concept established in AML has yielded a new understanding of carcinogenesis and
relapses. The underlying mechanism was based on a hierarchical structure of the malignant clone
from this highly primitive compartment of hematopoiesis. With malignancies of the differentiated B
lymphocytes however, this concept still remains to be validated, although the lines of evidence
reviewed here do support its validity. These studies recurrently point to the putative involvement of
memory B cells as CSC in differentiated B-cell malignancies as diverse as NHL, MM, HL and CLL.
Although in these diseases, the hierarchical model implies that CSC generates tumor heterogeneity
through the developmental plasticity of memory B-cells, other models of tumor clone organization can
also be proposed.
We infer that cellular reprogramming can disrupt the initial clone pyramid and initiate the
tumor in a reverse, “bottom-to-top” fashion. This does not necessarily refute the hierarchical paradigm
of CSC, but rather requires a secondary, inducible “bottom-to-top” reprogramming of new clonal
hierarchies. Although such “bottom-to-top” reprogramming has already been demonstrated for AML
[54], the fludarabine-induced switch of some non-SP cells into SP cells in B-CLL [39] extends such a
reprogramming plasticity to malignant mature B cells. This induced reprogramming might not be
restricted to responses to chemotherapeutic exposure however, since different selective pressures
usually edit oncogenesis and cancer progression. Immunity as well as hypoxia, competition for
142
ANNEXE
metabolites, stromal support or cell migration (e.g. epithelial-mesenchymal transition) might also
induce “bottom-to-top” reprogramming. Since most diagnosed cancers have already been exposed to
these pressures for growth, reprogramming within the malignant clone is most likely to have occurred
and yielded a heterogeneous and diversified cell progeny. However, classic (top-to-bottom)
hierarchical reprogramming from the same upstream CSC is less prone to diversify this organization
than reverse (bottom-to-top) reprogramming from daughter cells (Figure 2).
Although recent reports yet support this concept [53], future studies from our and others
laboratories will explore the pressure-induced reprogramming of highly differentiated cells into cancerinitiating cells within the context of mature B-cell lymphomas.
Figure 2: models of clonal progenies in normal and malignant contexts. Note the difference between bottom to
top models 1 and 2 is the target of the oncogenic hit.
143
ANNEXE
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RESUME EN ANGLAIS
TITLE: Impact of B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia cell components in posttherapeutic relapses : from leukemic chemoresistant Side Population to immune cells.
B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is defined by the clonal expansion
and accumulation of malignant B lymphocytes in blood, bone marrow and lymph node
compartments. This atypical cancer, characterized by peripheral blood accumulation of
quiescent lymphocytes, displays a proliferative potential concentrated within the proliferative
centers, in the lymph nodes. This unique feature of B-CLL renders elusive its leucemogenesis
mechanisms and justifies the current lack of scientific evidences regarding hierarchy of the
leukemic clone. In the clinic, the constant and invariable resurgence of the leukemic clone
post-therapy makes B-CLL an incurable disease. Elucidation of the cellular heterogeneity
mediating chemoresistance as well as the elaboration of novel therapeutic options are
essential to eradicate durably the leukemic clone.
As a result of the inherent inefficiency of current therapeutic regimens,
immunotherapy constitutes a promising and alternative therapeutic approach. However,
efficacy of immunotherapeutic strategies are highly dependant on preliminary disruption of
immunosubversive dialogues between leukemic cells and actors of anti-tumor immunity. In
this context, chemotherapy has the potential to reverse the immunoselection phenomenon
engendered by tumor cells. In B-CLL, we show that, in addition to a selective survival of NK
cells, the FCR protocol (Fludarabine Cyclophosphamide Rituximab) restores natural cytotoxic
capacities of peripheral blood lymphocytes (PBL), which can be further enhanced by
Rituximab implementation. Nevertheless, in the case of evolving minimal residual disease
(MRD) characterized, here, by high CD4+ cells levels, NK function appeared inhibited,
suggesting the occurrence of early immunoselective events post-therapy. Although
immunological control of disease relapse remains an important parameter, unraveling the
cellular heterogeneity that allows a specific leukemic population to escape cytotoxic effects of
therapies, remains crucial.
With the aim of uncovering this cellular basis of chemoresistance, we used the Side
Population (SP) phenotype in order to define a new intra-clonal heterogeneity of B-CLL cells
from peripheral blood. Present before therapy and amplified in post-therapeutic samples, the
minor SP compartment recapitulates phenotypic and cytogenetic characteristics of the B-CLL
clone. Furthermore, in vitro Fludarabine and Bendamustin treatments select exclusively
leukemic cells harboring the SP phenotype. At the cell level, this enrichment involves
partially the acquisition of the SP phenotype by a minor proportion of non-SP cells under
chemotherapeutic pressure. Proliferation of sorted or chemotherapy-induced SP cells allow
partial reconstitution of main non-SP compartment. These data suggest, with a non
physiological proliferative trigger, the potential of SP cells to promote expansion of the
leukemic clone post-therapy.
In perspective, the favorable effector/target ratio post-therapy and the increased
cytotoxic function of PBL combined to the chemoresistance strongly suggest the therapeutic
potential of NK immunomodulation.
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AUTEUR : GROSS Emilie
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Amphithéâtre de Télémédecine de Purpan, le 26 Octobre 2010 à 13h30
TITRE : Impact des composantes cellulaires de la Leucémie Lymphoïde Chronique de type B dans les rechutes
post-thérapeutiques : de la Side Population leucémique chimiorésistante aux cellules immunitaires.
SPECIALITE : CANCEROLOGIE
DIRECTEUR DE THESE : Dr. QUILLET-MARY Anne
MOTS-CLES : Leucémie Lymphoïde Chronique de type B, Side Population, Chimiorésistance, Reconstitution
immunitaire.
LABORATOIRE : U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Equipe Immunité innée et
hémopathies malignes.
La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B (LLC-B) est définie par l’expansion clonale de
lymphocytes B malins de phénotype mature au niveau des compartiments sanguin, médullaire et ganglionnaire.
Ce cancer atypique, caractérisé par l’accumulation sanguine de lymphocytes quiescents, présente un potentiel
prolifératif concentré au niveau des ganglions dans la fraction leucémique des centres prolifératifs. Ces
particularités uniques de la LLC-B rendent énigmatique son processus de leucémogenèse et justifient l’absence
de preuves expérimentales concernant la hiérarchisation du clone LLC-B. Au niveau clinique, la résurgence
constante et invariable du clone leucémique post-thérapie fait de la LLC-B une maladie incurable. La
compréhension de l’hétérogénéité cellulaire à la base de la chimiorésistance et l’élaboration d’options
thérapeutiques alternatives sont essentielles pour éradiquer durablement le clone leucémique.
Devant l’inhérente inefficacité des protocoles thérapeutiques actuels, l’immunothérapie constitue une
approche alternative et prometteuse. Cependant, l’efficience des stratégies d’immunothérapie est dépendante de
la rupture préalable des dialogues immunosubversifs qui existent entre cellules leucémiques et acteurs de la
surveillance anti-tumorale. Dans ce contexte, la chimiothérapie a le potentiel de reverser les phénomènes
d’immunosélection mis en place par les cellules tumorales. Dans la LLC-B, nous montrons qu’en plus d’une
survie privilégiée des populations NK, le protocole FCR (Fludarabine Cyclophosphamide Rituximab) restaure
les capacités cytotoxiques naturelles des lymphocytes du sang périphérique (PBL), qui se retrouvent amplifiées
par la présence de Rituximab. Néanmoins, en présence d’une maladie résiduelle évolutive caractérisée par un
taux élevé de cellules CD4+, la fonction des cellules NK apparaît inhibée, laissant présager l’occurrence
d’évènements immunosélectifs précoces post-thérapie.
Bien que le contrôle immunologique des cellules en rechute constitue un paramètre important,
l’élucidation de l’hétérogénéité cellulaire, qui permet à une population leucémique d’échapper à l’effet
cytotoxique des thérapies, reste fondamentale. Afin d’étudier cette base cellulaire de la chimiorésistance, nous
avons utilisé le phénotype Side Population (SP) pour définir une nouvelle hétérogénéité intra-clonale des cellules
de LLC-B du sang périphérique. Présent avant thérapie et amplifié dans des échantillons post-thérapeutiques, le
compartiment mineur SP récapitule les caractéristiques phénotypiques et cytogénétiques du clone leucémique.
De plus, les traitements Fludarabine et Bendamustine in vitro permettent de sélectionner exclusivement les
cellules pourvues d’un phénotype SP ABCG2+BMI-1+. Incidemment, cet enrichissement implique en partie
l’acquisition du phénotype SP par une proportion mineure de cellules non-SP sous pression chimiothérapeutique.
La prolifération du compartiment SP trié ou obtenu par sélection chimiothérapeutique permet la reconstitution
partielle du compartiment majoritaire non-SP. Ces données suggèrent, à l’aide de conditions prolifératives non
physiologiques, le potentiel des cellules SP à participer à l’expansion du clone leucémique post-thérapie.
En perspective, le ratio effecteurs/cibles favorable post-thérapie ainsi que la restauration des fonctions
cytotoxiques PBL combinés à la chimiorésistance de la fraction SP, suggèrent fortement le potentiel
thérapeutique de l’immunomodulation NK.