Biophysique.

Biophy.cours
En vrac…cryométrie, absorption lumineuse.
ultracentrifugation et électrophorèse.
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Biophysique.
Ce cours est très bordélique… c’est d’ailleurs la façon dont il a été fait… il n’est peut-être pas
complet et sûrement inintéressant…
Cryométrie.
Soit la différence de température de congélation T = Tcongsoluté – Tcongsolvant.
T = -K.n.
Avec K = 1,86°C et n en osmol.l-1.
-abaissement cryoscopique.
-propriétés coligatives.
Soit une solution contenant du glucose à 30g/L (Mglucose = 180).
D’où T = -1,86 x (30/180)  0,31°C
 c'est à dire q’une solution d’eau contenant 30g par litre, de glucose va congeler à –0,31°C.
Absorption de la lumière.
Elle est liée au fait que les molécules absorbent la lumière (si changement de couleur
dans la lumière blanche, alors, il y a absorption). *les molécules absorbent à une longueur
d’onde bien précise :
a : coefficient linéaire d’atténuation.
m : molarité.
x : épaisseur de la cuve.
La densité optique D.O. = log10 0
t = -1 2,3 ln( t 0 ).e-amx.
=
1
2,3 amx
 si on considère que a/2,3 =  alors D.O. = mx.
 est appelé coefficient d’extinction spécifique.
0
t = e-amx.
0 t

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Exercice :
Pour un  = 45000 L.mol-1.cm-1, avec x = 1cm, M = 90g.mol-1 et une DO = 1. Quelle est la
concentration en g.l-1 ?
DO = mx = 1 = 45000 x m x 1  m = DO/x = 1/45000 x 1 = 2.10-5 mol.l-1.
Mais C = M/ = 90/45000 = 2/1000 = 1/500 = 2.10-3 g.l-1.
Spectrophotométrie : le spectre d’absorption représente la variation d’absorption de la lumière
par une solution selon la longueur d’onde.
on obtient la courbe suivante :
Cette courbe définit les caractéristiques d’une molécule et de ses
groupements chimiques. C’est un excellent moyen de dosage et
d’identification.
Ultracentrifugation.
Définitions :
V : volume.  : masse volumique. 0 : masse volumique du solvant.
 : accélération. f : coefficient de friction.
Quand une molécule se déplace à vitesse v, elle subit des frottements F = f.v.
 = .r ( : vitesse angulaire en rad.s-1).
Cela permet de connaître la vitesse limite de sédimentation d’une molécule.
On peut calculer la masse de la molécule en connaissant le coefficient de
diffusion.
 la molécule va subir 1 force centrifuge vers le fond du tube et 2 forces centripètes
(Archimède et les forces de frictions).
Source. Monochromateur.
Echantillon. Référence.
Photo-multi
p
licateur.
Différence de DO.
Longueur
d’onde
(
)
.
Densité
o
p
ti
q
ue
(
DO
)
.

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Fg (force gravitationnelle) = V( – 0)
 Ff = Fv = V( – 0).
v
 =
v
r
= V( – 0) x
1
f = s (constante de sédimentation en seconde).
On utilise comme unité le Svedberg = 10-13s.
Expérience de diffusion : calculer le coefficient de diffusion.
D =
kT
f V= M  x
1
M : masse molaire.
 : avogadro.
 : masse volumique.
s =
v
= V ( – 0) x
1
f
 s =
v
=
M
 x
1
 ( – 0) x
D
kT
M =
s..k.T
D(1 – (0/))
=
SRT
D(1 – (0/))
Expériences : centrifugation en gradient de saccharose (cf. cours de Teyssier en biocell).
Les forces s’annulent quand  = 0 : la molécule ne migre plus.
Electrophorèse.
Si on considère des molécules de charge électrique dans un champ électrique : elles vont
migrer dans ce champ électrique (alcalin vers anode et acide vers cathode) et s’arrêter au point
isoélectrique. (cf. chromatographie échangeuse d’ions de Lemaire en biochimie).
La mobilité électrophorétique () se fait en phase
liquide et le support peut être une sorte de papier ou un gel
(polyacrylamide).  = v/E
Réalisation pratique :
pH.
+
–

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Electrophorèse de sérum humain normal :
On peut ainsi mettre en évidence
des désordres pathologiques. Chute de
l’albumine par exemple dans les
cirrhoses :
L’électrophorèse est donc une technique très
puissant qui s’est associer avec d’autres méthodes de
différenciation des protéines :
-radioactivité (proteines marquées).
-avec des anticorps divers et variés qui permettent
une double migration (électrophorétique et anticorps).
Chaque arc correspond à un degré de migration.
Electrofocalisation :
On fait migrer dans un champ électrique, sur une colonne dont le pH varie (chromatographie
échangeuse d’ion). Les acides aminés s’arrêtent à leur pH isoélectrique (précision de 0,05 sur
l’échelle des pH  très précis).
L’aspartate : pHi = 2,8.
L’arginine = 10,8.
La cystéine = 5.
La chromatographie :
C’est une technique qui utilise la répartition d’un constituant entre 2 phases (mobiles et
stationnaire).
Phase mobile : soit solvant (liquide ou gaz qui contient la molécule à étudier).
Phase stationnaire : elle doit possédé certaines propriétés qui lui permettent de retenir
les molécules. Les molécules sont arrêtées en étant adsorbé, selon le principe d’affinité (avec
des gels) ou avec des échanges d’ions.
Albumine (majorité des protéines) 42 g/L.
1 2
1 : 3g/l.
2 : 6g/l.
 : 10g/l.
: 13
g
/l.
1 2
 + 
Albumine.
Migration des
p
rotéines.
Dépôt
d’anticor
p
s.
Champ
électri
q
ue.
Apparition
d’axes de
p
réci
p
itation.

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Par exemple : la séparation sur gel : sephadex.
C’est EXACTEMENT la même technique que celle vue avec Lemaire pour la
répartition des protéines à l’aide d’un gel de filtration…
La phase stationnaire peut également être du papier.
La phase mobile n’est pas forcément de l’eau, elle peut être gazeuse ou mieux : de
l’alcool… Chochoï…
HPLC : le flux de la substance mobile doit être plus important que la diffusion (effet de
l’apesanteur) pour ne pas être faussé, ce qui est souvent le cas sauf… quand on réalise le tout,
sous PRESSION !!!
HPLC : High Pressure (ou Performance quand tu te la pètes) Liquid Chromatography…
C’est une technique très développée (quoi que coûteuse) qui permet d’accélérer le
passage du flux en augmentant la pression.
Technique très performante.
Réservoir à
solvant. Générateur de hautes
p
ressions.
Colonne de
chromato
g
ra
p
hie.
Détecteur.
(
ex : s
p
ectromètre
)
.
Collecteur
d’échantillon.