Biophy.cours 1/5 En vrac…cryométrie, absorption lumineuse. ultracentrifugation et électrophorèse. Biophysique. Ce cours est très bordélique… c’est d’ailleurs la façon dont il a été fait… il n’est peut-être pas complet et sûrement inintéressant… Cryométrie. Soit la différence de température de congélation T = Tcongsoluté – Tcongsolvant. T = -K.n. Avec K = 1,86°C et n en osmol.l-1. -abaissement cryoscopique. -propriétés coligatives. Soit une solution contenant du glucose à 30g/L (Mglucose = 180). D’où T = -1,86 x (30/180) 0,31°C c'est à dire q’une solution d’eau contenant 30g par litre, de glucose va congeler à –0,31°C. Absorption de la lumière. Elle est liée au fait que les molécules absorbent la lumière (si changement de couleur dans la lumière blanche, alors, il y a absorption). *les molécules absorbent à une longueur d’onde bien précise : 0 t 0 t = e-amx. a : coefficient linéaire d’atténuation. m : molarité. x : épaisseur de la cuve. La densité optique D.O. = log10 0 t -1 = ln( 2,3 t 0 1 = amx 2,3 si on considère que a/2,3 = alors D.O. = mx. est appelé coefficient d’extinction spécifique. ).e-amx. Biophy.cours 2/5 En vrac…cryométrie, absorption lumineuse. ultracentrifugation et électrophorèse. Exercice : Pour un = 45000 L.mol-1.cm-1, avec x = 1cm, M = 90g.mol-1 et une DO = 1. Quelle est la concentration en g.l-1 ? DO = mx = 1 = 45000 x m x 1 m = DO/x = 1/45000 x 1 = 2.10-5 mol.l-1. Mais C = M/ = 90/45000 = 2/1000 = 1/500 = 2.10-3 g.l-1. Spectrophotométrie : le spectre d’absorption représente la variation d’absorption de la lumière par une solution selon la longueur d’onde. on obtient la courbe suivante : Source. Monochromateur. Densité optique (DO). Echantillon. Référence. Photo-multiplicateur. Longueur d’onde (). Cette courbe définit les caractéristiques d’une molécule et de ses Différence de DO. groupements chimiques. C’est un excellent moyen de dosage et d’identification. Ultracentrifugation. Définitions : V : volume. : masse volumique. : accélération. f : coefficient de friction. 0 : masse volumique du solvant. Quand une molécule se déplace à vitesse v, elle subit des frottements F = f.v. = .r ( : vitesse angulaire en rad.s-1). Cela permet de connaître la vitesse limite de sédimentation d’une molécule. On peut calculer la masse de la molécule en connaissant le coefficient de diffusion. la molécule va subir 1 force centrifuge vers le fond du tube et 2 forces centripètes (Archimède et les forces de frictions). Biophy.cours 3/5 En vrac…cryométrie, absorption lumineuse. ultracentrifugation et électrophorèse. Fg (force gravitationnelle) = V( – 0) Ff = Fv = V( – 0). v v = r = V( – 0) x 1 f = s (constante de sédimentation en seconde). On utilise comme unité le Svedberg = 10-13s. Expérience de diffusion : calculer le coefficient de diffusion. M kT V= D= f 1 x M : masse molaire. : avogadro. : masse volumique. v s= s= = v M = ( – 0) x V 1 x s..k.T M= D(1 – (0/)) ( – 0) x 1 f D kT SRT = D(1 – (0/)) Expériences : centrifugation en gradient de saccharose (cf. cours de Teyssier en biocell). Les forces s’annulent quand = 0 : la molécule ne migre plus. Electrophorèse. Si on considère des molécules de charge électrique dans un champ électrique : elles vont migrer dans ce champ électrique (alcalin vers anode et acide vers cathode) et s’arrêter au point isoélectrique. (cf. chromatographie échangeuse d’ions de Lemaire en biochimie). La mobilité électrophorétique () se fait en phase + liquide et le support peut être une sorte de papier ou un gel (polyacrylamide). = v/E pH. Réalisation pratique : – Biophy.cours 4/5 En vrac…cryométrie, absorption lumineuse. ultracentrifugation et électrophorèse. Electrophorèse de sérum humain normal : Albumine (majorité des protéines) 42 g/L. On peut ainsi mettre en évidence des désordres pathologiques. Chute de 1 1 : 3g/l. 2 : 6g/l. : 10g/l. : 13g/l. l’albumine par exemple dans les cirrhoses : + Albumine. 2 1 L’électrophorèse est donc une technique très 2 Migration des protéines. puissant qui s’est associer avec d’autres méthodes de différenciation des protéines : Apparition d’axes de précipitation. -radioactivité (proteines marquées). -avec des anticorps divers et variés qui permettent une double migration (électrophorétique et anticorps). Dépôt d’anticorps. Champ électrique. Chaque arc correspond à un degré de migration. Electrofocalisation : On fait migrer dans un champ électrique, sur une colonne dont le pH varie (chromatographie échangeuse d’ion). Les acides aminés s’arrêtent à leur pH isoélectrique (précision de 0,05 sur l’échelle des pH très précis). L’aspartate : pHi = 2,8. L’arginine = 10,8. La cystéine = 5. La chromatographie : C’est une technique qui utilise la répartition d’un constituant entre 2 phases (mobiles et stationnaire). Phase mobile : soit solvant (liquide ou gaz qui contient la molécule à étudier). Phase stationnaire : elle doit possédé certaines propriétés qui lui permettent de retenir les molécules. Les molécules sont arrêtées en étant adsorbé, selon le principe d’affinité (avec des gels) ou avec des échanges d’ions. Biophy.cours 5/5 En vrac…cryométrie, absorption lumineuse. ultracentrifugation et électrophorèse. Par exemple : la séparation sur gel : sephadex. C’est EXACTEMENT la même technique que celle vue avec Lemaire pour la répartition des protéines à l’aide d’un gel de filtration… La phase stationnaire peut également être du papier. La phase mobile n’est pas forcément de l’eau, elle peut être gazeuse ou mieux : de l’alcool… Chochoï… HPLC : le flux de la substance mobile doit être plus important que la diffusion (effet de l’apesanteur) pour ne pas être faussé, ce qui est souvent le cas sauf… quand on réalise le tout, sous PRESSION !!! HPLC : High Pressure (ou Performance quand tu te la pètes) Liquid Chromatography… C’est une technique très développée (quoi que coûteuse) qui permet d’accélérer le passage du flux en augmentant la pression. Réservoir à solvant. Générateur de hautes pressions. Colonne de chromatographie. Détecteur. (ex : spectromètre). Collecteur d’échantillon. Technique très performante.