purification du lysozyme du blanc d`?

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CONCOURS EXTERNE
DE TECHNICIEN DE LABORATOIRE
Session de 2010
Vendredi 23 avril 2010
De 14h à 16h
Épreuve d’admissibilité
Épreuve écrite à caractère scientifique
Durée 2 heures – Coefficient 1
SPECIALITE A :
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ET BIOTECHNOLOGIE
Avertissement
Ce livret comprend 28 pages et est composé de trois parties :
• Une partie commune, pages 2 à 14 qui doit être traitée par tous les candidats ;
• Une partie option « biotechnologie », pages 15 à 22 ;
• Une partie option « sciences de la vie et de la Terre », pages 23 à 28.
Chaque candidat devra traiter la partie commune et la partie correspondant à l’option
choisie au moment de son inscription. Toute composition dans une autre option
entraînera l’annulation de l’épreuve.
Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il
le signale sur sa copie et poursuit sa composition en précisant les initiatives qu’il prend
pour la rédaction de sa solution.
Le sujet se présente sous forme de QCM. Pour chaque question, plusieurs réponses sont
proposées. Suivant le cas, il y a une ou plusieurs réponse(s) juste(s). Vous devez cocher
toutes les réponses justes.
Le livret sera rendu dans son intégralité en fin d’épreuve.
S’agissant d’un concours de recrutement de personnel administratif présentant une spécificité technique
particulière, l’utilisation d’une calculatrice électronique programmable est autorisée conformément aux
dispositions de la circulaire n° 99-186 du 16 novembre 1999.
L’usage de tout ouvrage de référence, de tout document et de tout autre matériel électronique est
rigoureusement interdit.
Vous devez impérativement vous abstenir de signer ou d’identifier votre copie.
Hormis l’en-tête détachable, la copie que vous rendrez ne devra, conformément au principe
d’anonymat, comporter aucun signe distinctif, tel que nom, signature, origine, etc. Toute
annotation distinctive mènera à l’annulation de votre épreuve.

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Partie commune
Doit être traitée par tous les candidats
FICHE 1 - Purification du lysozyme du blanc d’œuf
DONNÉES TECHNIQUES
Le lysozyme isolé du blanc d’œuf de poule est une enzyme monomérique de149 acides
aminés, dont la structure est stabilisée par quatre ponts disulfure.
Le lysozyme ou muramidase catalyse l’hydrolyse des liaisons β 1Æ4 entre l’acide
N-acétylmuramique et les résidus de N-acétylglucosamine du peptidoglycane composant
les parois bactériennes.
MANIPULATION
Le lysozyme représente 7 à 8 % des protéines du blanc d’œuf. Son pHi, égal à 11, est
nettement supérieur à celui des autres protéines du blanc d’œuf.
La première étape de purification du lysozyme du blanc d’œuf consiste en une
chromatographie d’échange d’ions, sur carboxyméthylcellulose, résine échangeuse de
cations.
Étape 1 : rétention du lysozyme sur la résine échangeuse d’ions
• Peser 1 g de carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) directement dans le
tube à centrifuger.
• Ajouter 7,5 mL de tampon pH 10 (tampon glycine 0,1 mol.L-1 – NaOH).
• Ajouter 2,5 mL de blanc d’œuf filtré.
• Agiter soigneusement à l’aide d’un agitateur de verre pour permettre
l’adsorption du lysozyme sur la résine.
• Laisser reposer 15 min, puis centrifuger 10 min à 3000 tours.min-1.
• Conserver le surnageant, qui constitue la fraction F1, dans la glace.
Étape 2 : lavages
• Laver le culot avec 20 mL de tampon pH 10. Agiter soigneusement par
rotations manuelles.
• Laisser reposer 10 min et centrifuger à nouveau : récupérer le culot
cellulosique.
• Renouveler la même opération avec 20 mL de tampon pH 10 : récupérer
le culot cellulosique C2, à conserver dans la glace.
Étape 3 : élution
• Reprendre le culot C2 dans 10 mL de tampon pH 10 + NaCl (tampon
glycine 0,1 mol.L-1 - NaOH - NaCl 0,5 mol.L-1).
• Agiter soigneusement à l’aide d’un agitateur de verre.
• Laisser reposer 10 min et centrifuger : récupérer le surnageant F3, à
conserver dans la glace.

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QUESTIONS
1. Parmi les propositions suivantes concernant la structure du lysozyme, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le lysozyme est la protéine majeure du blanc d’œuf.
B. Le lysozyme est une enzyme à une seule sous-unité.
C. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles reliant deux groupements sulfates
entre deux liaisons peptidiques.
D. Les ponts disulfure sont des liaisons covalentes reliant deux résidus de cystéine.
E. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles stabilisant les feuillets β.
2. Parmi les propositions suivantes concernant l’activité du lysozyme, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le lysozyme est une hydrolase.
B. Le lysozyme est une ligase.
C. Le lysozyme est une protéase.
D. Le lysozyme est une isomérase.
E. Le lysozyme est une enzyme lytique capable de lyser les bactéries, notamment
à Gram positif.
3. Sachant que le pHi du lysozyme est de 11, et que les étapes de rétention et de
lavage sur la résine sont effectuées à pH 10, indiquer parmi les propositions
suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. À pH 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont déprotonées.
B. À pH 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont protonées.
C. À pH 10, le lysozyme est chargé positivement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont déprotonées.
D. À pH 10, le lysozyme est chargé positivement, car des chaînes latérales des
résidus d’acides aminés sont protonées.
E. À pH 10, le lysozyme est neutre car le blanc d’œuf est dilué dans une solution
tampon.
4. La résine échangeuse de cations utilisée, la carboxyméthylcellulose, est un
polyoside dont les propriétés permettent de retenir le lysozyme. Parmi les
propositions suivantes indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations faible.
B. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations forte.
C. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont protonés à
pH 10.
D. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont déprotonés à
pH 10.
E. À pH 10, les autres protéines du blanc d’œuf sont chargées négativement.

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5. L’élution est effectuée à l’aide d’un tampon pH 10 (glycine 0,1 mol.L-1 - NaOH -
NaCl 0,5 mol.L-1). Parmi les propositions suivantes concernant cette étape,
indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Les phases de lavage et de centrifugation ont pour objectif d’éliminer les protéines
libres et celles fixées non spécifiquement à la carboxyméthylcellulose.
B. L’élution permet d’éliminer un maximum de contaminants protéiques et non
protéiques du blanc d’œuf.
C. L’élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine en jouant sur la
force ionique des ions sodium, supérieure à celle du lysozyme.
D. L’élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine par modification du
pH.
E. Les ions chlorure jouent un rôle essentiel dans l’élution.

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Fiche 2 – Amidon et saccharose
DONNÉES TECHNIQUES
Les formules des deux polymères constitutifs de l’amidon ainsi que la formule du
saccharose sont rappelées ci-dessous :
Amidon = mélange d’amylose et d’amylopectine, dont les proportions varient
en fonction de l’origine végétale.
Saccharose = α-D-glucopyranosyl-(1―>2)-β-D-fructofuranoside
MANIPULATION 1 :
Hydrolyse chimique de l’amidon :
Dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL, verser :
- 50 mL d’empois d’amidon à 0,5 %,
- 10 mL d’acide chlorhydrique concentré.
Bien homogénéiser puis placer la fiole au bain-marie.
Toutes les trois minutes, pendant trente minutes, prélever 3 mL d’hydrolysat, à placer
immédiatement dans la glace. Ajouter trois gouttes de NaOH à 1%.
Pour chaque prélèvement, faire le test à la liqueur de Fehling et à l’eau iodée.