purification du lysozyme du blanc d`?

CONCOURS EXTERNE
DE TECHNICIEN DE LABORATOIRE
Épreuve d’admissibilité
Épreuve écrite à caractère scientifique
Session de 2010
Durée 2 heures – Coefficient 1
Vendredi 23 avril 2010
De 14h à 16h
SPECIALITE A :
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ET BIOTECHNOLOGIE
Avertissement
Ce livret comprend 28 pages et est composé de trois parties :
•
Une partie commune, pages 2 à 14 qui doit être traitée par tous les candidats ;
•
•
Une partie option « biotechnologie », pages 15 à 22 ;
Une partie option « sciences de la vie et de la Terre », pages 23 à 28.
Chaque candidat devra traiter la partie commune et la partie correspondant à l’option
choisie au moment de son inscription. Toute composition dans une autre option
entraînera l’annulation de l’épreuve.
Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il
le signale sur sa copie et poursuit sa composition en précisant les initiatives qu’il prend
pour la rédaction de sa solution.
Le sujet se présente sous forme de QCM. Pour chaque question, plusieurs réponses sont
proposées. Suivant le cas, il y a une ou plusieurs réponse(s) juste(s). Vous devez cocher
toutes les réponses justes.
Le livret sera rendu dans son intégralité en fin d’épreuve.
S’agissant d’un concours de recrutement de personnel administratif présentant une spécificité technique
particulière, l’utilisation d’une calculatrice électronique programmable est autorisée conformément aux
dispositions de la circulaire n° 99-186 du 16 novembre 1999.
L’usage de tout ouvrage de référence, de tout document et de tout autre matériel électronique est
rigoureusement interdit.
Vous devez impérativement vous abstenir de signer ou d’identifier votre copie.
Hormis l’en-tête détachable, la copie que vous rendrez ne devra, conformément au principe
d’anonymat, comporter aucun signe distinctif, tel que nom, signature, origine, etc. Toute
annotation distinctive mènera à l’annulation de votre épreuve.
-1-
Partie commune
Doit être traitée par tous les candidats
FICHE 1 - Purification du lysozyme du blanc d’œuf
DONNÉES TECHNIQUES
Le lysozyme isolé du blanc d’œuf de poule est une enzyme monomérique de149 acides
aminés, dont la structure est stabilisée par quatre ponts disulfure.
Le lysozyme ou muramidase catalyse l’hydrolyse des liaisons β 1Æ4 entre l’acide
N-acétylmuramique et les résidus de N-acétylglucosamine du peptidoglycane composant
les parois bactériennes.
MANIPULATION
Le lysozyme représente 7 à 8 % des protéines du blanc d’œuf. Son pHi, égal à 11, est
nettement supérieur à celui des autres protéines du blanc d’œuf.
La première étape de purification du lysozyme du blanc d’œuf consiste en une
chromatographie d’échange d’ions, sur carboxyméthylcellulose, résine échangeuse de
cations.
Étape 1 : rétention du lysozyme sur la résine échangeuse d’ions
• Peser 1 g de carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) directement dans le
tube à centrifuger.
• Ajouter 7,5 mL de tampon pH 10 (tampon glycine 0,1 mol.L-1 – NaOH).
• Ajouter 2,5 mL de blanc d’œuf filtré.
• Agiter soigneusement à l’aide d’un agitateur de verre pour permettre
l’adsorption du lysozyme sur la résine.
• Laisser reposer 15 min, puis centrifuger 10 min à 3000 tours.min-1.
• Conserver le surnageant, qui constitue la fraction F1, dans la glace.
Étape 2 : lavages
• Laver le culot avec 20 mL de tampon pH 10. Agiter soigneusement par
rotations manuelles.
• Laisser reposer 10 min et centrifuger à nouveau : récupérer le culot
cellulosique.
• Renouveler la même opération avec 20 mL de tampon pH 10 : récupérer
le culot cellulosique C2, à conserver dans la glace.
Étape 3 : élution
• Reprendre le culot C2 dans 10 mL de tampon pH 10 + NaCl (tampon
glycine 0,1 mol.L-1 - NaOH - NaCl 0,5 mol.L-1).
• Agiter soigneusement à l’aide d’un agitateur de verre.
• Laisser reposer 10 min et centrifuger : récupérer le surnageant F3, à
conserver dans la glace.
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QUESTIONS
1. Parmi les propositions suivantes concernant la structure du lysozyme, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le lysozyme est la protéine majeure du blanc d’œuf.
B. Le lysozyme est une enzyme à une seule sous-unité.
C. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles reliant deux groupements sulfates
entre deux liaisons peptidiques.
D. Les ponts disulfure sont des liaisons covalentes reliant deux résidus de cystéine.
E. Les ponts disulfure sont des liaisons faibles stabilisant les feuillets β.
2. Parmi les propositions suivantes concernant l’activité du lysozyme, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le lysozyme est une hydrolase.
B. Le lysozyme est une ligase.
C. Le lysozyme est une protéase.
D. Le lysozyme est une isomérase.
E. Le lysozyme est une enzyme lytique capable de lyser les bactéries, notamment
à Gram positif.
3. Sachant que le pHi du lysozyme est de 11, et que les étapes de rétention et de
lavage sur la résine sont effectuées à pH 10, indiquer parmi les propositions
suivantes celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. À pH 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont déprotonées.
B. À pH 10, le lysozyme est chargé négativement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont protonées.
C. À pH 10, le lysozyme est chargé positivement, car une majorité de chaînes
latérales des résidus d’acides aminés sont déprotonées.
D. À pH 10, le lysozyme est chargé positivement, car des chaînes latérales des
résidus d’acides aminés sont protonées.
E. À pH 10, le lysozyme est neutre car le blanc d’œuf est dilué dans une solution
tampon.
4. La résine échangeuse de cations utilisée, la carboxyméthylcellulose, est un
polyoside dont les propriétés permettent de retenir le lysozyme. Parmi les
propositions suivantes indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations faible.
B. La carboxyméthylcellulose est une résine échangeuse de cations forte.
C. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont protonés à
pH 10.
D. Les groupements fonctionnels de la carboxyméthylcellulose sont déprotonés à
pH 10.
E. À pH 10, les autres protéines du blanc d’œuf sont chargées négativement.
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5. L’élution est effectuée à l’aide d’un tampon pH 10 (glycine 0,1 mol.L-1 - NaOH NaCl 0,5 mol.L-1). Parmi les propositions suivantes concernant cette étape,
indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Les phases de lavage et de centrifugation ont pour objectif d’éliminer les protéines
libres et celles fixées non spécifiquement à la carboxyméthylcellulose.
B. L’élution permet d’éliminer un maximum de contaminants protéiques et non
protéiques du blanc d’œuf.
C. L’élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine en jouant sur la
force ionique des ions sodium, supérieure à celle du lysozyme.
D. L’élution permet de récupérer le lysozyme retenu sur la résine par modification du
pH.
E. Les ions chlorure jouent un rôle essentiel dans l’élution.
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Fiche 2 – Amidon et saccharose
DONNÉES TECHNIQUES
Les formules des deux polymères constitutifs de l’amidon ainsi que la formule du
saccharose sont rappelées ci-dessous :
Amidon = mélange d’amylose et d’amylopectine, dont les proportions varient
en fonction de l’origine végétale.
Saccharose = α-D-glucopyranosyl-(1―>2)-β-D-fructofuranoside
MANIPULATION 1 :
Hydrolyse chimique de l’amidon :
Dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL, verser :
- 50 mL d’empois d’amidon à 0,5 %,
- 10 mL d’acide chlorhydrique concentré.
Bien homogénéiser puis placer la fiole au bain-marie.
Toutes les trois minutes, pendant trente minutes, prélever 3 mL d’hydrolysat, à placer
immédiatement dans la glace. Ajouter trois gouttes de NaOH à 1%.
Pour chaque prélèvement, faire le test à la liqueur de Fehling et à l’eau iodée.
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MANIPULATION 2 :
Hydrolyse chimique du saccharose :
Dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL, verser :
- 50 mL de sacharose à 1 %,
- 3 mL d’acide chlorhydrique concentré.
Bien homogénéiser puis placer la fiole au bain-marie.
Toutes les trois minutes, pendant trente minutes, prélever 3 mL d’hydrolysat, à placer
immédiatement dans la glace. Ajouter trois gouttes de NaOH à 1%.
Pour chaque prélèvement, faire le test à la liqueur de Fehling.
QUESTIONS
6. Choisir, parmi les propositions suivantes, celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le saccharose est un hétéroside.
B. Le saccharose est un diholoside.
C. Le saccharose est un ose.
D. L’amidon est un polyholoside homogène.
E. L’amidon est polymère glucidique de réserve.
7. Parmi les propositions suivantes concernant l’hydrolyse chimique de l’amidon et
du saccharose, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. L’hydrolyse chimique entraîne la rupture des liaisons faibles stabilisatrices.
B. L’hydrolyse chimique entraîne la rupture des liaisons osidiques.
C. L’hydrolyse chimique entraîne la rupture des ponts oxydiques.
D. L’hydrolyse chimique est effectuée en milieu acide pour les deux manipulations.
E. L’hydrolyse chimique est effectuée en milieu basique pour les deux manipulations.
8. Les hydrolysats obtenus sont analysés au cours de l’hydrolyse par des tests à
l’eau iodée ou à la liqueur de Fehling. Parmi les propositions suivantes, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de sucres
réducteurs.
B. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de saccharose.
C. La liqueur de Fehling permet de mettre en évidence la présence de sucres
réducteurs par une coloration rouge.
D. L’eau iodée permet de mettre en évidence la présence d’amidon par une
coloration rouge.
E. L’eau iodée permet de rendre totale l’hydrolyse de l’amidon.
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9. Au bout de 60 minutes, l’hydrolyse est totale pour les deux hydrolysats étudiés.
Ils sont alors analysés par chromatographie sur couche mince. Parmi les
propositions suivantes, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
Hydrolysat issu de l’amidon
Hydrolysat issu du saccharose
A. On obtient un seul spot
correspondant au glucose.
B.
On
obtient
deux
spots
correspondant au glucose et au
maltose.
C. On obtient un seul spot
correspondant au fructose.
D.
On
obtient
deux
spots
correspondant au glucose et au
fructose.
E.
On
obtient
deux
spots
correspondant au glucose et au
galactose.
10. La chromatographie mise en œuvre utilise une phase fixe de silice et une phase
mobile composée de méthanol (1V), acide éthanoïque (1V), méthylcellosolve
(3V). Parmi les propositions suivantes concernant cette technique, indiquer
celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Plus un soluté analysé est soluble dans la phase mobile, plus il migre loin.
B. Il est conseillé d’immerger complètement la ligne de dépôt dans la phase mobile,
pour faciliter la solubilité des solutés analysés.
C. La rétention est due à l’établissement de liaisons de surface de faible énergie
entre la silice et les solutés analysés.
D. Les solutés sont séparés en fonction de leur masse molaire.
E. La technique mise en œuvre est une chromatographie d’adsorption.
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Fiche 3 – Culture de levures auxotrophes
DONNÉES SUR LA CULTURE DE LEVURES AUXOTROPHES
LEVURES AUXOTROPHES MISES À DISPOSITION
On dispose de différents mutants haploïdes auxotrophes de Saccharomyces cerevisiae.
La liste ci-dessous donne les auxotrophies pour chacun de ces mutants.
- Souche A : ade–, leu–
- Souche B : leu–, trp–
- Souche C : trp–
- Souche D: ade–
NB : seuls les caractères déficients sont notés. Les autres caractères sont donc
sauvages.
ade : gènes de la voie de biosynthèse de l’adénine
leu : gènes de la voie de biosynthèse de la leucine
trp : gènes de la voie de biosynthèse du tryptophane
MILIEU DE CULTURE
Le milieu de culture est le milieu de base YNB glucosé*, additionné des substances
appropriées**, en fonction des auxotrophies.
* YNB glucosé : composition
1,7 g
20 g
5g
20 g
qsp 1 L
Yeast nitrogen base
Glucose
Sulfate d’ammonium
Agar
Eau distillée
pH 6,2
** Substances à rajouter à la gélose YNB en surfusion (supplémentation)
Substance à
dissoudre
Concentration
initiale (%)
Solvant
Concentration
finale (mg.L-1)
Arginine
Leucine
Sérine
Thréonine
Tryptophane
1
1
8
4
1
eau
eau
eau
eau
NaHCO3 5 g.L-1
50
50
400
100
50
Adénine
Uracile
0,2
0,2
HCl 50 mmoL
NaHCO3 5 g.L-1
10
20
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QUESTIONS
11. Parmi les propositions suivantes concernant les milieux de culture appropriés pour
les souches à disposition, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La souche A cultive sur milieu YNB glucosé de base.
B. Les souches A, B, C et D cultivent sur un milieu YNB glucosé additionné d’adénine, de
leucine et de tryptophane.
C. Seule la souche A cultive sur un milieu YNB glucosé additionné d’adénine et de
leucine.
D. Seule la souche C cultive sur un milieu YNB glucosé additionné de tryptophane.
E. Les souches A et B ne cultivent que sur un milieu complet YNB glucosé additionné de
tous les suppléments proposés dans le tableau.
12. En ce qui concerne la préparation des milieux supplémentés, indiquer la (les)
proposition(s) exacte(s) (le volume de substance à ajouter reste négligeable devant le
volume de gélose) :
A. La leucine doit être ajoutée à raison de 100 µL pour 20 mL de gélose en surfusion.
B. La leucine doit être ajoutée à raison de 10 µL pour 20 mL de gélose en surfusion.
C. La thréonine doit être ajoutée à raison de 50 µL pour 20 mL de gélose en surfusion.
D. L’adénine doit être ajoutée à raison de 200 µL pour 20 mL de gélose en surfusion.
E. L’uracile doit être ajoutée à raison de 200 µL pour 20 mL de gélose en surfusion.
13. Après croisement des souches C et D, on obtient un hybride diploïde, qui subit la
méiose une fois cultivé sur milieu appauvri. Au final, on obtient quatre types de
spores haploïdes. Leurs phénotypes sont :
A. [ade–, TRP+]
B. [ade–, TRP+]
C. [ade–, TRP+]
D. [ade–, TRP+]
E. [ade–, trp–]
[ADE+, TRP+]
[ade–, trp–]
[ade–, trp–]
[ADE+, trp–]
[ADE+, TRP+]
[ade–, trp–]
[ade–, trp–]
[ade–, TRP+]
[ade–, trp–]
[ade–, trp–]
[ADE+, TRP+]
[ADE+, TRP+]
[ade–, trp–]
[ADE+, TRP+]
[ADE+, trp–]
14. Indiquer quel(s) milieu(x) permettra(ont) la culture du nouveau mutant double
auxotrophe créé, après croisement des souches C et D.
A. YNB glucosé additionné de tous les suppléments proposés dans le tableau
B. YNB glucosé additionné d’adénine et de tryptophane
C. YNB glucosé additionné d’adénine, de tryptophane et de leucine
D. YNB glucosé additionné d’adénine et de leucine
E. Aucun des milieux proposés
15. Parmi les propositions suivantes concernant le(s) milieu(x) de culture approprié(s)
spécifique(s) de ce nouveau mutant double auxotrophe, indiquer celle(s) qui est
(sont) exacte(s) :
(rappel : un milieu spécifique correspond à un milieu permettant la culture exclusive
de ce mutant)
A. YNB glucosé additionné de tous les suppléments proposés dans le tableau
B. YNB glucosé additionné d’adénine et de tryptophane
C. YNB glucosé additionné d’adénine, de tryptophane et de leucine
D. YNB glucosé additionné d’adénine et de leucine
E. Aucun des milieux proposés
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Fiche 4 – Les réserves végétales
16 - . Le radis stocke ses réserves au niveau de son :
o rhizome
o stolon
o tubercule
17 - Pour mettre en évidence des réserves de glucose, vous
utilisez en classe :
o
o
o
o
la carotte
la pomme de terre
l’oignon
le radis
18 - La pomme de terre
est un tubercule :
o racinaire
o caulinaire
o hypocotylaire
A
B
C
19 - Pour mettre en évidence les amyloplastes cicontre, extraits de parenchyme de pomme de
terre, vous utilisez :
o du bleu de méthylène
o du Lugol
o du rouge Soudan
20 - Pour obtenir les clichés de gauche des
amyloplastes et montrer ainsi l’utilisation de
leurs réserves, vous utilisez la pomme de terre
photographiée ci-dessus en :
o A
o B
o C
21 - Compte-tenu de l’échelle indiquée sur le cliché de droite, à quel grossissement avez-vous
réalisé ces observations ?
o
o
o
o
40
80
400
800
- 10 -
Fiche 5 - Séparation des protéines
22 - Purifier une protéine c’est :
o la séparer d’autres protéines
o la cristalliser
o séparer ses sous-unités
o connaître sa composition en acides aminés
23 - Les protéines peuvent être séparées les unes des autres en utilisant leurs différences :
o de solubilité en milieu salin
o de masse molaire
o de charge globale
o d’hydrophobicité
24 - Deux protéines X et Y ont respectivement des pHi de 5 et 7. Quel pH choisira-t-on pour les
séparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ?
o pH = 3
o pH = 6
o pH = 9
o pH = 12
25 - La masse molaire d’une protéine peut-elle être déterminée par :
o précipitation fractionnée en milieu salin
o chromatographie par filtration sur gel
o électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes
o chromatographie échangeuse d’ions
26 - Parmi les agents chimiques suivants, quels sont ceux qui peuvent provoquer la dénaturation
d’une protéine in vitro ?
o urée 8 mol.L-1
o détergent SDS (sodium dodecylsulfate) 5%
o β-mercaptoéthanol 10 %
o tampon phosphate 0,1 mol.L-1, pH=7
27 - On réalise une électrophorèse sur feuille d’acétate de cellulose en faisant un dépôt
d’hémoglobine A, normale, et à côté, un dépôt d’hémoglobine S, anormale. L’hémoglobine
anormale S ne diffère de l’hémoglobine normale A que par un acide aminé de la chaîne β en
position 6 : l’acide glutamique est remplacé par la valine.
Chaîne latérale de l’acide glutamique : CH2-CH2-COOH (pKa = 4,3)
Chaîne latérale de la valine : CH-CH3
CH3
27.1. Les bandes d’acétate que l’on va utiliser sont conditionnées dans le tampon TrisVéronal. Il faut ensuite les placer dans la cuve à électrophorèse et empêcher leur
déshydratation en :
o plaçant les bandes entières sous le niveau du tampon
o plaçant les extrémités des bandes seules dans le tampon
o fermant le couvercle de la cuve
- 11 -
27.2. Les solutions d’hémoglobine formées sont maintenues avant utilisation :
o à température ambiante
o dans des bacs de glace
o à 37°C
27.3. Connaissant les masses molaires atomiques données ci-dessous :
Carbone : 12 g.mol-1, Oxygène : 16 g.mol-1, Hydrogène : 1 g.mol-1,
quelle est, exprimée en grammes par mole, la masse molaire de l’acide glutamique
et de la valine :
- pour l’acide glutamique (en g.mol-1)
o 150
o 147
o 120
o 73
- pour la valine (en g.mol-1)
o 150
o 130
o 43
o 35
27.4. La chaîne latérale de l’acide glutamique dans le tampon Tris-Véronal (pH = 9,2)
est :
o chargée positivement
o chargée négativement
o globalement neutre
27.5. La migration se fait vers l’anode pendant 45 minutes à 180V et la révélation
permet de montrer que HbA est plus rapide. Le critère dominant ici est donc :
o les masses molaires
o les charges électriques
o les conformations protéiques
27.6. La révélation des protéines HbA et HbS, ayant migré sur feuille d’acétate de
cellulose, se réalise grâce au colorant :
o ninhydrine
o rouge Ponceau
o bleu de Coomassie
28 - On veut déterminer la structure d’une protéine de masse moléculaire estimée à 230 kD. Une
électrophorèse dans certaines conditions dénaturantes, n’entrainant pas la rupture des ponts
disulfures, fait apparaître une bande à 115 kD. Après action du β-mercaptoéthanol (agent
réducteur de ponts disulfures), on obtient, dans les mêmes conditions d’électrophorèse, deux
bandes, l’une de 80 kD et l’autre de 35 kD. On peut en déduire que cette protéine est :
o monomérique
o multimérique
o constituées de 2 sous-unités de masses identiques unies par des ponts disulfures
o constituées de 4 sous-unités de masses identiques
o constituées de 4 sous-unités de masses identiques 2 à 2
- 12 -
Fiche 6 - Fossiles et microfossiles
29 - Cette photo représente :
† Un fossile de gastéropode
† Une corne de bélier fossilisée
† Un fossile d'ammonite
30 - Ce fossile a été trouvé :
† Dans une roche métamorphique
† Dans une roche sédimentaire
† Dans une roche plutonique
31 - Cette photo représente :
† Un cnidaire fossilisé
† Un rotifère fossilisé
† Un foraminifère fossilisé
32 - Les fossiles inclus dans l'échantillon sont :
1cm
† des orbitulines
† des nummulites
† des alvéolines
(photo mnhn)
- 13 -
33 - Le fossile de la photo ci contre est :
† une vertèbre
† un œuf de requin
† l'axe d'une fougère arborescente
34 - L'inclusion fossilisée de l'échantillon cicontre correspond à :
† des branchies de mollusques
† des fougères
† un organisme colonial
35 – La nature de la roche est d’origine :
† carbonatée
† carbonée
† évaporitique
- 14 -
Partie spécifique : option biotechnologie
Fiche 1 – Dénombrement bactérien
DONNÉES GÉNÉRALES
Pour les besoins d’une séance de travaux pratiques, 50 mL d’une suspension de
Lactococcus doivent être ajustés à exactement 1,0.105 bactéries.mL–1.
Le préparateur estime, dans un premier temps, la densité de deux précultures (A et B)
par la technique de Breed, puis réalise, pour la préculture B, un dénombrement en
surface d’un milieu gélosé M17 spécifique des Lactococcus.
DONNÉES SUR LA TECHNIQUE DE BREED
La technique de Breed permet d’estimer la densité d’une population microbienne à partir
d’un frottis coloré et calibré.
Ce frottis est réalisé à partir de 10 µL de préculture, préalablement diluée au ½, étalés
sur une surface de 1 cm2.
Le frottis est observé au microscope à l’objectif x 100 sous huile à immersion.
On détermine le nombre moyen de microorganismes par champ après avoir compté 20 à
30 champs.
La concentration cellulaire N est déterminée en utilisant la formule suivante.
N = n×
S 1
× × Fd
s V
N = concentration cellulaire en bactéries. mL–1
n = nombre moyen de bactéries comptées par champ
S = surface totale du frottis en cm2
s = surface d’un champ microscopique en cm2
V = volume d’échantillon (mL)
Fd = facteur de dilution
Information complémentaire et résultats :
- Diamètre d’un champ microscopique = 180 µm
- Préculture A : n = 24 bactéries comptées par champ
- Préculture B : N = 7,1.106 bactéries. mL–1
- 15 -
QUESTIONS
1. Parmi les propositions suivantes concernant la technique de dénombrement par la
technique de Breed, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La technique de Breed aurait pu être remplacée par un dénombrement en
hématimètre de Malassez.
B. Cette technique n’est valide que si la répartition des cellules sur l’ensemble des
champs est relativement homogène.
C. Le comptage de 20 à 30 champs a pour objectif de vérifier l’absence de
contaminants.
D. La surface s de chaque champ microscopique est de 2,54.10–4 cm2.
E. La surface s de chaque champ microscopique est de 3,05.10–6 cm2.
2. Parmi les propositions suivantes concernant les résultats des dénombrements de
la préculture A par la méthode de Breed, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. N préculture A = 1,9. 107 bactéries. mL–1
B. N préculture A = 4,8. 108 bactéries. mL–1
C. N préculture A = 9,4. 106 bactéries. mL–1
D. N préculture A = 9,4. 107 bactéries. mL–1
E. N préculture A = 1,6. 109 bactéries. mL–1
3. Parmi les propositions suivantes concernant les résultats des dénombrements de
la préculture B par la méthode de Breed, indiquer le nombre moyen de bactéries
comptées par champ :
A. n préculture B = 21
B. n préculture B = 13
C. n préculture B = 29
D. n préculture B = 5
E. n préculture B = 9
4. Les dilutions à ensemencer pour le dénombrement des bactéries de la préculture
B en milieu M17 sont :
A. 10–1, 10–2 et 10–3
B. 10–-2, 10–3 et 10–4
C. 10–3, 10–4 et 10–5
D. 10–4, 10–5 et 10–6
E. 10–5, 10–6 et 10–7
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5. Parmi les propositions suivantes concernant la réalisation de 50 mL de
suspension ajustée à 1,0.105 bactéries.mL–1 pour la séance de travaux pratiques,
indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
Donnée :
Le dénombrement en milieu solide donne le résultat suivant :
N préculture B = 3,5.106 bactéries.mL–1.
A. La préculture est diluée au 1/350ème et 16,6 mL sont ajoutés à 33,4 mL de milieu
de culture.
B. La préculture est diluée au 1/10ème puis 14,3 mL sont ajoutés à 35,7 mL de milieu
de culture.
C. La préculture est diluée au 1/35ème sous un volume final de 50 mL.
D. L’ajustage est réalisé en fiole jaugée de 50 mL.
E. L’ajustage est réalisé en bécher de 50 mL.
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Fiche 2 – Culture cellulaire
DONNÉES SUR L’ENTRETIEN ET LA CULTURE D’UNE LIGNÉE CELLULAIRE
INFORMATIONS GÉNÉRALES AU SUJET DES CELLULES COS
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La lignée COS (CV-1 Origin, SV40) est dérivée de fibloblastes CV-1 de rein de singe
adulte africain, le singe vert (Cercopithecus aethiops), transformés par le virus SV40
déficient.
Elles sont envoyées congelées et doivent être mises en culture dans un milieu
approprié.
MILIEU ET CONDITIONS DE CULTURE
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Milieu de culture complet : les cellules COS peuvent être cultivées en RPMI (Roswell
Park Memorial Institute) complet, préparé à partir du milieu de base RPMI 1640*. Le
milieu complet est préparé par ajout au milieu de base des additifs suivants :
o 10% de sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté
o 1% d’antibiotiques (mélange de streptomycine et pénicilline)
o 0,3 mg.L–1 de L-Glutamine (à partir d’une solution à 300 mg.L–1)
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Atmosphère :
o air, 95 %
o dioxyde de carbone (CO2), 5 %
-
Température : 37,0°C
* RPMI 1640 : composition en mg.L–1
Ions minéraux
NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, MgSO4, CaCl2, Ca(NO3)2, Na2HPO4
L-amino-acides
Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Pro, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser,
Thr, Trp, Val
Autres molécules
D-Glucose
Glutathion réduit
Rouge de phénol, sel de sodium
Vitamines
Biotine, choline, acide panthoténique, acide folique, myo-inositol,
niacinamide, acide amino-benzoïque, nicotinamide, pyridoxine,
riboflavine, thiamine, cobalamine
total = 9341,0
total = 694,0
2000,0
1,0
5,3
total = 43,7
REPIQUAGE
Les cellules doivent être régulièrement repiquées en milieu complet neuf, et ajustées à la
concentration désirée.
Le repiquage se fera selon la méthode classique suivante :
- Trypsination à 37°C ;
- Ajout de milieu neuf complet ;
- Centrifugation et resuspension, afin de laver les cellules ;
- Numération d’un aliquot ;
- Réensemencement à la concentration choisie.
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QUESTIONS
6. Parmi les propositions suivantes concernant la composition, la nature, et la
préparation du milieu de culture, indiquer celle(s) qui est (sont) exactes :
A. Le milieu de base RPMI est un milieu empirique.
B. La glutamine est une base azotée fragile et peu stable, c’est pourquoi on doit
l’ajouter au dernier moment.
C. Le SVF contient de la trypsine et des facteurs de croissance.
D. La décomplémentation du SVF est nécessaire pour éliminer les composants
thermolabiles du complément.
E. Les antibiotiques ajoutés préviennent les contaminations bactériennes.
7. Dans le but de repiquer les cellules, on a besoin de préparer 250 mL de milieu
complet. Indiquer quels sont les volumes des solutions d’additifs à ajouter au
milieu de base :
A. 10 mL de SVF, 2,5 mL d’antibiotiques, et 50 µL de glutamine, ajoutés à 250 mL de
milieu de base.
B. 10 mL de SVF, 1 mL d’antibiotiques, et 250 µL de glutamine, ajoutés à environ
240 mL de milieu de base.
C. 10 mL de SVF, 2,5 mL d’antibiotiques, et 50 µL de glutamine, ajoutés à environ
240 mL de milieu de base.
D. 25 mL de SVF, 2,5 mL d’antibiotiques, et 250 µL de glutamine, ajoutés à environ
220 mL de milieu de base.
E. 25 mL de SVF, 2,5 mL d’antibiotiques, et 0,25 mL de glutamine, ajoutés à environ
220 mL de milieu de base.
8. Parmi les propositions suivantes concernant l’entretien de la lignée cellulaire,
indiquer celle(s) qui est (sont) exactes :
A. Un milieu de couleur jaune en 24 h indique une croissance optimale des cellules
en culture.
B. Une atmosphère à 5% de CO2 est assurée en reliant l’étuve à une bonbonne de
CO2.
C. La trypsine doit être laissée plus de 8 h en contact avec les cellules pour assurer
leur dissociation et leur décollement.
D. Le CO2 de l’atmosphère de culture joue un rôle dans le maintien du pH du milieu,
en association avec le NaCl du milieu.
E. L’ajout de milieu complet après l’étape de trypsination sert à arrêter l’action de la
trypsine.
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9. Après trypsination, les cellules sont centrifugées, puis remises en suspension
dans 5 mL de milieu frais. Un aliquot est prélevé et dilué au demi en bleu Trypan.
La suspension obtenue est alors numérée sous hématimètre de Malassez. Les
résultats de la numération pour 11 rectangles sont :
ƒ nombre de cellules bleues :
13
ƒ nombre de cellules totales :
207
Rappel : volume d’un rectangle de numération = 0,01 µL
A. Le pourcentage de viabilité est d’environ 94 % et la concentration en cellules
viables est de 1,8.106 cellules.mL–1.
B. Le pourcentage de viabilité est d’environ 94 % et la concentration en cellules
viables est de 4,2.106 cellules.mL–1.
C. Le pourcentage de viabilité est d’environ 94 % et la concentration en cellules
viables est de 3,5.106 cellules.mL–1.
D. Le pourcentage de viabilité est d’environ 6 % et la concentration en cellules
viables est de 3,5.106 cellules.mL–1.
E. Le nombre de cellules viables décollées est d’environ 1,8.107 cellules.
10. Dans le cadre de la préparation de flasks de culture pour un groupe de
quinze élèves, on cherche à ensemencer les cellules précédemment dénombrées
à une concentration finale de 105 cellules.mL–1, dans des flasks de 5 mL. Indiquer
la (les) proposition(s) exacte(s) :
A. On doit disposer d’au moins 7,5.107 cellules, donc la suspension précédemment
dénombrée ne suffit pas.
B. On doit disposer d’au moins 7,5.106 cellules, donc la suspension précédemment
dénombrée suffit.
C. On introduit environ 150 µL de la suspension précédemment dénombrée et 4,3 mL
de milieu complet par flask.
D. On introduit environ 30 µL de la suspension précédemment dénombrée et 4,97 mL
de milieu complet par flask.
E. La suspension cellulaire est finalement diluée au 1/35.
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Fiche 3 – Dosage enzymatique de substrats
DONNÉES TECHNIQUES
On se propose de réaliser le contrôle quantitatif du glucose et du fructose d’une boisson
sucrée, par méthode enzymatique en point final (test UV à 340 nm)
1- Principe
D-Glucose + ATP
⎯hexokinase
⎯ ⎯⎯→ D-Glucose-6-phosphate + ADP
D-Fructose + ATP ⎯⎯ ⎯⎯→ D-Fructose-6-phosphate + ADP
hexokinase
glu cos e − 6 − phosphate − deshydrogénase
⎯→ D-gluconate-6-phosphate + NADH +
D-Glucose-6-phosphate + NAD+ ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯
H+
phosphoglu cos e −isomérase
D-Fructose-6-phosphate ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ D-Glucose-6-phosphate
2- Linéarité de la méthode
Le dosage est linéaire pour des quantités allant de 5 à 80 µg de D-glucose + D-fructose
dans les conditions du dosage.
3- Réactifs
• R1 : Tampon pH 7,5, NAD+, ATP. Prêt à l’emploi.
• R2 : Hexokinase (300 U.mL-1), Glucose-6-phosphate Deshydrogénase
(400 U.mL-1). Prêt à l’emploi.
• R3 : Phosphoglucose-isomérase (450 U.mL-1). Prêt à l’emploi.
Les réactifs doivent être conservés à 2-8°C.
4-
Mode opératoire
longueur d’onde : 340 nm
trajet optique : 1 cm
température 20-25°C
mesure contre l’air ou l’eau distillée
Réactifs et solutions
R1 (mL)
Eau distillée (mL)
Echantillon (mL)
Témoin réactifs
Essai
1,000
1,000
2,000
1,900
0
0,100
Mélanger. Lire les absorbances (A1).
Ajouter ensuite
R2 (mL)
0,020
0,020
Mélanger. Lire les absorbances (A2) après environ 15 minutes. Vérifier que la réaction est terminée en
effectuant une relecture après quelques minutes.
Ajouter ensuite
R3 (mL)
0,020
0,020
Mélanger. Lire les absorbances (A3) après environ 15 minutes. Vérifier que la réaction est terminée en
effectuant une relecture après quelques minutes.
Données :
M(glucose) = M(fructose) = 180,16 g.mol-1
2
−1
ε 340
NADPH = 630 m .mol
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QUESTIONS
11. Parmi les propositions suivantes concernant le principe du dosage mis en œuvre,
indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. Le dosage est spécifique de tous les oses.
B. Le dosage est spécifique du glucose et du fructose.
C. La réaction indicatrice du système réactionnel utilisé fait intervenir l’hexokinase.
D. Au cours du dosage, on mesure une diminution d’absorbance à 340 nm.
E. Au cours du dosage, on mesure une augmentation d’absorbance à 340 nm.
12. Parmi les propositions suivantes concernant les conditions opératoires du
dosage, indiquer celle(s) qui est (sont) exacte(s) :
A. La température d’incubation n’est pas rigoureusement fixée au cours du dosage.
B. La concentration en ATP doit être très proche de celle du glucose et du fructose.
C. Les KM de l’hexokinase pour le glucose et le fructose doivent être très élevés.
D. Les temps d’incubation dépendent de la température d’incubation.
E. Le pH du tampon doit correspondre au pH optimum des différentes activités
enzymatiques.
13. Sachant que les concentrations attendues en glucose, comme en fructose, sont
de l’ordre de 20 g par litre de boisson, parmi les propositions suivantes, indiquer
celle qui est exacte :
A. Il n’est pas utile d’effectuer une dilution de la boisson préalablement au dosage ;
B. Il faut diluer la boisson au 1/10.
C. Il faut diluer la boisson au 1/25.
D. Il faut diluer la boisson au 1/100.
E. Il faut diluer la boisson au 1/1000.
14. Parmi les propositions suivantes concernant les variations d’absorbance
uniquement liées à la présence de fructose, ΔAfructose, et de glucose, ΔAglucose
indiquer celle(s) qui est(sont) exacte(s) :
A. ΔAfructose= (A2-A1)essai – (A2-A1)témoin réactifs
B. ΔAfructose= (A3-A1)essai – (A3-A1)témoin réactifs
C. ΔAfructose= (A3-A2)essai – (A3-A2)témoin réactifs
D. ΔAglucose= (A2-A1)essai – (A2-A1)témoin réactifs
E. ΔAglucose= (A3- A1)essai – (A3-A1)témoin réactifs
15. Parmi les propositions suivantes concernant la formule de calcul de la
concentration en glucose Cmglucose (en g.L-1) dans l’échantillon, indiquer celle qui
est exacte :
A. Cmglucose = 869,3 x ΔAglucose
B. Cmglucose = 0,8636 x ΔAglucose
C. Cmglucose = 0,02860 x ΔAglucose
D. Cmglucose = 28,60 x ΔAglucose
E. Cmglucose = 0,2860 x ΔAglucose
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Partie spécifique : option sciences de la vie et de la
Terre
Fiche 1 : enzyme et cinétique enzymatique
1 - On purifie une enzyme d’un tissu hépatique. Avant la purification, on avait une activité de
1000 unités internationales et 100 mg de protéines. Après purification, on a une activité de 500
unités internationales pour 1 mg de protéines. On a purifié l’enzyme :
o 10 fois
o 20 fois
o 50 fois
o 100 fois
o 500 fois
2 - Le foie contient deux enzymes, l’hexokinase et la glucokinase capables de phosphoryler le
glucose selon la réaction suivante :
Glucose + ATP -> glucose 6P + ADP
Les deux cinétiques des enzymes sont présentées ci-dessous
Taux de glucose dans le sang
Vitesse de la réaction
Hexokinase
Glucokinase
Concentration en glucose (en
mol.L-1)
5x10-5 mol.L-1
2x10-2 mol.L-1
2.1. Le taux de glucose dans le sang est d’environ :
o 1 mg.L-1
o 10 mg. L-1
o 1 g.mL-1
o 1 g. L-1
2.2. Sachant que la masse molaire du glucose est 180 g.mol-1 quel est le taux de glucose dans
le sang :
o 5,5 x10-4 mol. L-1
o 2 x10-4 mol. L-1
o 5,5 x10-3 mol. L-1
o 2 x10-3 mol. L-1
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2.3. D’après les cinétiques obtenues ci-dessus, on déduit de ces courbes que :
o le Km de l’hexokinase est supérieur à celui de la glucokinase
o L’affinité pour le glucose de la glucokinase est plus forte que celle de la glucokinase
o L’affinité pour le glucose de l’hexokinase est plus forte que celle de la glucokinase
2.4. Si on rajoute au milieu réactionnel de départ du glucose 6P, on observe les résultats
suivants :
enzymes
hexokinase
glucokinase
Glucose 6-P
0,4 mmol. L-1
65 mmol. L-1
Km
constant
augmenté
Vm
Diminuée
constant
Ces résultats indiquent :
o Le glucose 6P est un inhibiteur compétitif pour l’hexokinase
o Le glucose 6P est un inhibiteur non compétitif pour l’hexokinase
o Le glucose 6P est un inhibiteur compétitif pour la glucokinase
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Fiche 2 : Mise en évidence expérimentale de structures
végétales
3 - Pour mettre en évidence des chloroplastes, il est souvent proposé aux élèves une observation
de feuille d’Elodée. Le choix de cette plante réside dans le fait que l’Elodée est une :
o plante aquatique
o plante particulièrement riche en chloroplastes
o plante qui possède des feuilles particulièrement fines (une ou deux assises cellulaires
seulement)
o plante qui possède des chloroplastes particulièrement gros
4 - La photo A montre l’extrémité de feuille d’Elodée et à plus fort grossissement, le cliché B
montre les chloroplastes. La matière organique présente dans les chloroplastes a été mise en
évidence grâce à du Lugol (cliché C). Pour obtenir ce résultat, il a fallu :
o placer préalablement l’Elodée dans une solution d’hydrogénocarbonate 1%
o placer préalablement l’Elodée dans une solution NaCl 35 g.L-1
o placer préalablement l’Elodée sous une lampe
o placer la préparation sur la platine du microscope et attendre un moment avec la lampe
allumée
A
B
C
Portion de feuille d'élodée (taille réelle 10 mm)
5 - Pour obtenir les états de turgescence et de plasmolyse photographiés ci-dessous, l’épiderme
d’un oignon rouge a été monté :
o pour D : dans de l’eau du robinet
o pour D : dans une solution saccharose 0,6 mol.L-1
o pour E : dans une solution saccharose 0,6 mol.L-1
o pour E : dans une solution KH2PO4 40 g.L-1
D
E
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6 - Les vacuoles des cellules épidermiques d’oignon rouge sont bien visibles car elles
contiennent :
o du lycopène
o du carotène
o de l’anthocyane
o des xanthophyllles
7 - Si on ne dispose pas d’oignon rouge, on peut néanmoins utiliser de l’oignon blanc et un
colorant pour reproduire le même résultat. Il suffit d’utiliser :
o du rouge Soudan
o du rouge neutre
o du rouge Congo
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Fiche 3 : Tomographie sismique
valeurs
élevées
B
profondeur
A
valeurs
faibles
Coupe de tomographie sismique (d'après Ritsema et al., 1999 cité par King 2003). Les points
verts représentent les épicentres et les foyers des séismes.
Question 8 - Sur la coupe de tomographie sismique, les valeurs représentées sont :
† Les anomalies de vitesses des ondes sismiques en fonction de la profondeur
† Les anomalies magnétiques en fonction de la profondeur
† Les pourcentages de fusion des roches en fonction de la profondeur
Question 9 - La zone notée A :
† est une zone d'obduction
† est une zone de subduction
† autre
Question 10 - La zone notée B correspond :
† à une marge passive
† à une zone de divergence de la lithosphère
† à une zone de convergence de la lithosphère
Question 11 - Vers 200 km de profondeur, on observe la transition entre :
† la croûte et le manteau
† la lithosphère et l'asthénosphère
† le manteau supérieur et le manteau inférieur
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Fiche 4 : Propriétés des roches et des minéraux
Question 12 - La dureté des minéraux :
† Le gypse est rayé par l'ongle et l'orthose est plus dur que le quartz
† L'acier est plus dur que tous les minéraux sauf le diamant
† Le topaze est plus dur que le quartz mais moins dur que le corindon
Question 13 - L'effervescence à l'acide chlorhydrique dilué à froid est observée :
† avec un échantillon de calcaire
† avec un échantillon de calcite pur
† avec un échantillon de calcium pur
Question 14 - Les roches magmatiques :
† correspondent aux roches volcaniques et plutoniques
† ont toutes une composition globale identique avec une minéralogie variable
† ont toutes une minéralogie identique avec une composition chimique variable
Question 15 - les roches sédimentaires :
† ne contiennent jamais de minéraux
† contiennent toujours des fossiles
† peuvent se former par précipitation
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