BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT VEGETAL
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BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT VEGETAL PARTIE II : EMBRYOLOGIE CHAPITRE I : GENETIQUE VEGETALE L’embryon suit un cycle de développement. La graine est dérivée du fruit et est protégée. Elle va germer, donnant un premier aspect du développement, le développement végétatif. Celui-ci bascule, via la transition florale, à un développement reproducteur, à la suite d’un grand nombre de processus. Dans cette forme, on aura mise en place des gamètes et formation de l’embryon suivant. La reproduction chez les plantes est double, c'est-à-dire qu’on à un zygote primaire, l’embryon, et un zygote secondaire, l’albumen, un tissu triploïde. La capacité à effectuer cette transition est due à un élément encore inconnu, le florigène (voir partie I) qui est peut-être une protéine, FT (voir chapitres suivants). On utilise la génétique pour essayer d’illustrer l’action de celui-ci. La transition en ellemême se fait par la régulation et gènes qui peut passer par la configuration des histones qui, en se modifiant, peuvent provoquer la condensation ou décondensation de la chromatine, bloquant ou activant un gène particulier. I – MODELES GENETIQUES Pour étudier le développement par la génétique, on aura forcément besoin de modèles. Certains paramètres sont à définir pour avoir un bon modèle : • Taille du génome, parce que l’idée c’est de connaitre celui-ci en entier. Moins limitant depuis l’essor des méthodes de séquençage de génome modernes. Celle-ci n’est pas toujours établie avec précision. La fourchette pour la taille du génome du riz par exemple est énorme. A noter qu’il s’agit aussi d’un exemple de paradoxe de la C-Value : il existe plus de gènes chez le riz que chez l’homme ! Les séquences répétées sont en partie responsable de ce phénomène (ARNr, ARNt, mais surtout satellites en tandem et transposons) et il n’y a donc aucune relation avec la complexité de l’organisme. • Ploïdie, toujours limitant, car il est très intéressant de bosser sur du diploïde. On retrouve des modèles chez les légumineuses, une des familles les plus évoluées (medicago, lotus, soja). • Intérêt agronomique, c’est toujours mieux qu’il y en ait un ou que le modèle en question soit proche d’une plante qui en est un. On peut ainsi avoir synthénie, c'est-à-dire qu’on va retrouver des régions similaires chez deux plantes qui sont parfois même de familles différentes. Les modèles les plus utilisés sont l’arabette des dames, les mousses, le riz, les algues et le peuplier (arbre utile pour l’industrie du papier notamment). L’arabette des dames ou Arabidopsis thaliana est certainement le modèle le plus connu. Il dispose d’un nombre important d’avantages : petit génome, cycle de vie court, facile à cultiver et à transformer (méthode tumefaciens), et l’on en dispose désormais d’une vaste collection de mutant. II – GENOME ET EMPLOI DE LA GENETIQUE Le gène est une région transcrite contenant des exons, introns, des UTR, un promoteur qui va conditionner l’expression du gène. Pour séquencer le génome de l’arabette, on a découpé celui, puis on l’a intégré dans des BACs. Tout a été donc relu et c’est donc un des génomes eucaryotes les mieux connus. A notre époque, on y va de manière brutale (digestion et lecture) beaucoup plus rapide mais avec un taux d’erreur plus important. Au niveau de la répartition, on peut voir qu’il y a beaucoup moins de gènes au niveau centromère, en revanche on retrouve énormément d’EST et d’éléments transposables. En revanche, on peut s’apercevoir que tout le génome est au moins dupliqué une fois ailleurs, du fait d’un ancêtre tétraploïde. Par étude in silico de la fonction des gènes, il résulte à chaque fois un bon 30 % de gènes qu’on n’arrive pas à classer. C’est pour cette raison que l’on va employer la génétique : • Directe : on fait des mutants, on regarde le phénotype et on essaye d’identifier le gène. On peut utiliser pour ça plusieurs techniques : Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 1 o L’ADN-T o Les transposons o La mutagénèse o Les modifications de balances hormonales o Les rayons γ o L’EMS La redondance que l’on retrouve dans le génome du végétal constitue un inconvénient pour ce genre de techniques. De plus, on est limité par notre propre crible. • Inverse : j’ai un gène inconnu, je le mute et je regarde ce qu’il se passe. Le travail est ici bien plus ciblé et peut se faire par deux approches : o Approche mutants : soit on cherche des mutants pour le gène voulu dans la population, soit on le mute nousmêmes. On pourra ensuite repérer les mutants pour ce gène via PCR après mutagenèse. On peut utiliser des bases de données pour avoir des infos. o Approche Biologie Moléculaire : On va inactiver le gène (antisens), le détruire par interférence ARN (dsRNA clivé par la DICER en siRNA, pris en charge par RISC qui le dissocie, cible les ARNm et les détruit) ou le surexprimer au contraire (via un promoteur viral par exemple). La génétique inverse permet d’étudier des gènes intéressant sur la base de profils d’expression. En revanche, il arrive souvent qu’on se retrouve avec pas de phénotype, auquel cas on n’est pas vraiment avancé. CHAPITRE II : EMBRYOLOGIE ET MERISTEMES Le sac embryonnaire dispose de 7 cellules (3 antipodes, 2 synergides, une oosphère, et la cellule centrale à deux noyaux). La fécondation est double : un gamète male féconde l’oosphère, l’autre rejoint la cellule centrale et forme l’albumen. Commence alors l’embryogénèse du végétal. Il faut commencer par mettre en place les axes de divisions : • Apico-basal (cotylédons, méristèmes, hypocotyles, racines) • Radial (épiderme, écorce, tissus conducteurs) Il y aura ensuite des divisions anticlines ou transverses, qui sont perpendiculaires à l’axe, et les périclines ou longitudinales, qui elles sont parallèles à l’axe. Ces processus vont nécessiter des hormones, en particulier l’auxine pour le développement et les gibbérellines pour la maturation de la graine. I – EMBRYOGENESE L’oosphère mènera au zygote, qui va s’allonger et finira par aboutir à une plantule. Cela passe par des divisions : - Première division anticline asymétrique : la cellule apicale reçoit la plupart du cytoplasme et sera donc fortement active. La cellule basale sera très vacuolisée. - Au niveau du domaine apical, deux anticlines et une péricline vont donner le stade 8-cellules ou octant. La partie basale se divise de façon anticline transversale pour entrainer la formation d’un suspenseur, qui fera la connexion entre la plante et son embryon. La cellule au contact entre l’octant et la partie basale est nommée hypophyse. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 2 - Par de nouvelles divisions anticlines, on passe à un stade 16-cellules, ébauche du futur épiderme, que l’on appelle le protoderme. Mis à par l’hypophyse, le reste du suspenseur commence un processus d’apoptose. - Les cellules centrales de l’embryon se divisent (anticlines et périclines) et forment le stade globulaire. Des axes de symétrie commencent à se voir. - Une période de transition s’installe alors qu’on évolue vers une symétrie bilatérale : les primordia cotylédonaires se mettent en place. Dans la partie basale, le méristème apical racinaire (RAM en anglais) commence à se former à partir de l’hypophyse. - On arrive au stade cordiforme ou les deux cotylédons ont commencé à se former. Le méristème apical caulinaire (SAM en anglais) apparait entre les deux. Les cellules du suspenseur commencent à mourir alors que les différents tissus s’établissent (cortex, tissus pro-vasculaires). - On évolue alors vers le stade torpille ou les vaisseaux vasculaire deviennent visibles. Les cotylédons et l’hypocotyle sont établis. L’embryon mature se forme. Chez certaines plantes, on a une courbure des cotylédons. L’embryon s’arrête alors et attends la dessiccation ou la dormance. On peut avoir une perte d’eau de 60 à 80 %. Les axes et les régions méristématiques se définissent définitivement. Chez les monocotylées, c’est un peu la même chose mais avec un seul cotylédon ou scutellum. On a à nouveau un pro-embryon avec un territoire basal et apical, allant vers l’établissement d’un MAC et d’un MAR. On distinguera alors le coléoptile, gaine de protection enveloppant le MAC, et le coléorhize, graine de protection enveloppant le MAR. - Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 3 Les méristèmes sont des groupes de petites cellules de même diamètre qui ont les caractéristiques embryonnaire, un peu comme des cellules souches. Ils peuvent être végétatifs (c'est-à-dire qu’ils formeront les tiges et racines et se régénèrent continuellement) ou reproducteur (inflorescentiels, primaire ou secondaire) selon le stade du développement. II – ACTEURS DE L’EMBRYOGENESE Par approche mutant exécutée afin d’identifier les acteurs de ce développement, on a pu identifier : • Mutants sans MAC (shootless) • Mutants avec des problèmes de taille de MAC • Mutants sans MAR • Mutants sans partie apicale (phénotype gurke) • Mutants sans partie centrale (phénotype fackel) • Mutants sans partie basale (phénotype monopteris) • Mutants sans méristèmes (phénotype gnom). Cette protéine oriente les composés pariétaux. En cas de mutation, l’orientation devient anarchique et on perd ou inverse la polarité, d’où le fait que l’on obtient une boule. Pour étudier cette fois la symétrie de l’embryon, on utilisera un marqueur de la polarité : AtLTP1, protéine de transfert lipidique de la cuticule. Celle-ci n’est donc exprimée que dans la partie apicale. On pourra alors utiliser des gènes rapporteurs, ou, si l’on ne veut pas faire de transgénèse, faire de l’immunocytomarquage ou de l’hybridation in situ c'est-à-dire qu’on prélèvera les embryons, on en fait des tranches, et, en utilisant in vitro de l’ARN antisens marqué, on localise précisément le gène. Toutefois, la division asymétrique du zygote n’est pas une condition obligatoire pour la formation de la polarité. Celle-ci peut se faire même si les divisions sont anormales. L’axe apico-basal se forme alors selon un gradient indépendant de l’embryon. Il y a donc ici un rôle de l’auxine. Pour localiser celle-ci, on utilisera les systèmes rapporteurs : • L’élément DR5, un motif TGTCTC, est un élément de réponse à l’auxine. Disposé en 9 exemplaires de façon inversée en aval d’un promoteur, on obtiendra une meilleure sensibilité. • Le transport de l’auxine peut être mis en évidence par le suivi de pin1, qui permet de transporter l’hormone. On fabrique alors la construction PIN1::PIN1:GFP (Promoteur PIN1 + Début de protéine PIN1 + GFP, donc fusion transcriptionnelle) et cela nous permet de savoir que l’auxine est transportée de la partie inférieure à la partie supérieure. Le MAR et les cotylédons sont bourrés d’auxine car ils en ont besoin pour le développement. Par contre le MAC lui est totalement vide et ne dépend donc pas de l’auxine. Il existe 8 protéines PIN chez la plante, mais le phénotype n’est remarquable que si pin1 perd sa fonction. Les autres mutants, s’ils sont mutés seuls, ne donnent rien de remarquable. Mais avec plusieurs mutations à la fois, on peut obtenir : - Fusion des cotylédons et raccourcissement de l’hypocotyle si on mute pin4 et pin7 - Fusion des cotylédons et raccourcissement de l’hypocotyle et de la racine si on mute pin1, pin4 et pin7 - Affection grave des cotylédons, de l’hypocotyle et de la racine si on mute pin1, pin3, pin4 et pin7. Ces protéines ont toutes un effet différent : Pin1 est uniformément localisé au départ, puis s’accumule en partie basale. Pin3 s’accumule au stade cordiforme au niveau du futur pôle racinaire. Il ne joue toutefois pas de rôle important dans le développement. Pin4 s’accumule dans la descendance des cellules pro-vasculaires et de l’hypophyse (envoie vers le suspenseur) Pin7 transporte du pôle basal au pôle apical au stade 2 cellules, puis change subitement de polarité au stade globulaire (de l’hypophyse vers le suspenseur) Mise à part Pin, il y a d’autres gènes impliqués dans la signalisation de l’auxine : Monopteros, Bodenlos, et AXR6. On peut constater que : Les mutants pour chacun de ces gènes sont altérés au niveau de la formation de l’axe embryonnaire et de la différentiation vasculaire. Les mutants pour Monopteros et bodenlos (qui correspond au gène IAA12 impliqué dans la réponse à l’auxine), au stade globulaire, présentent une forte erreur dans la division des cellules de l’hypophyse. La mutation bodenlos correspond à une transition G A changeant une proline en sérine. MP et BDL sont dans le noyau et ont des interactions. Elles jouent donc possiblement un rôle dans le développement. On a proposé un modèle : BDL est associé à MP. Lorsqu’il y a un afflux d’auxine, pin4 entraine une liaison de l’auxine à BDL, qui TIR1 sera alors dégradé par un complexe SCF . MP, libéré, pourra alors se lier aux éléments de réponse à l’auxine qui vont mener à la formation du MAR. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 4 III – ARCHITECTURE RACINAIRE Une racine est définie en plusieurs zones : 1. La coiffe 2. La zone méristématique qui contient le centre quiescent dont les cellules proviennent de l’hypophyse. 3. La zone d’élongation 4. La zone de maturation avec les poils absorbants Au-delà, les racines latérales se forment. Un certain nombre de cellules disposent de la capacité de cellules souches, notamment le centre quiescent bien sûr, mais aussi d’autres tissus primaires. Le MAR dispose aussi de phénotypes mutants possibles ayant conduit à la caractérisation de protéines : • Scarecrow, ou SCR. On constate une forte accumulation du messager codant pour cette protéine au niveau du centre quiescent, de l’endoderme et des cellules filles. • Shortroot, ou SHR, qui est nécessaire à l’activation de SCR et à la division des cellules filles qui donneront les cellules de l’endoderme (un mutant shr n’est pas capable de former l’endoderme) et du cortex. SHR est transcrit dans les vaisseaux, puis se déplace dans le centre quiescent, les cellules filles, et celles de l’endoderme. La, il se lie à SCR et l’entraîne dans le noyau, activant celui-ci, et contrôlant ainsi la mise en place des tissus pendant le développement racinaire. - Woodenleg, ou WOL. Le mutant wol voit l’apparition d’un tissu assez verdâtre – Il y a un problème de différenciation conduisant à la non-formation de xylème. On s’est rendu compte plus tard que la protéine WOL identifié à la suite de ce mutant n’est autre que CRE1, le récepteur à la cytokinine. Celles-ci jouent donc un rôle crucial, à l’instar de l’auxine, dans la mise en place du méristème. Il existe différentes types de racines. Sur les plantes, peuvent se mettre en place des racines latérales, qui émergent au-dessus de la zone de différenciation. Ces racines proviennent du péricycle et croissent au travers du cortex et de l’épiderme. C’est l’auxine qui stimule les cellules qui vont alors se diviser pour induire l’apex racinaire. Les gènes ALF3 et ALF4 sont nécessaire pour initier et maintenir la formation de ces racines. Au contraire, le gène AFL1 inhibe l’arrivée d’auxine et réprime cette formation. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 5 Egalement, on peut voir la formation de racines adventives, qui peuvent provenir de tissus non-racinaires. Elles sont issues d’un amas de cellules matures, qui vont retrouver une activité mitotique après stimulation par de l’auxine, entrainant la formation d’apex racinaires. Pour induire le développement de parties transgéniques, on peut utiliser Agrobacterium rhizogenes afin de déréguler la balance hormonale : Comme A. tumefaciens, A. rhizogenes nous permet d’utiliser un T-DNA, mais avec un second plasmide ou les gènes de biosynthèse de l’auxine sont maintenus, provoquant un déséquilibre hormonal. Pour cela, on découpe l’apex racinaire, et on introduira les agrobactéries avec un marqueur de sélection et le gène d’intérêt. On obtiendra alors, après un mois, des racines adventives. L’avantage, c’est que ce n’est donc pas la totalité de la plante qui est transformée, mais uniquement une racine transgénique qui sera induite. La transformation de la luzerne avec A. tumefaciens ne fonctionne pas, on utilise donc la culture in vitro. IV – LE MAC Le MAC est composé d’un certain nombre de zones : - La zone centrale correspondant aux cellules souches - La zone périphérique, de part et d’autre de cette zone, qui va permettre la formation du dôme du méristème et des organes latéraux - La rib zone, zone profonde qui permettra le maintien et la croissance indéterminée du méristème La première assise cellulaire, ou L1, se divise de façon anticline et sera responsable de la mise en place de l’épiderme. La seconde assise, L2, se divise également de façon anticline et génère les tissus internes, de même que L3, le massif profond, qui elle se divise de façon aléatoire. Le méristème apical caulinaire se forme à l’endroit où l’auxine est faiblement concentré. C’est le gène CUC qui est responsable de la répartition de l’auxine. Une mutation sur ce gène CUC induit une répartition très homogène de l’auxine, et on aura donc plus deux cotylédons séparés par un MAC pauvre en auxine. Il se forme alors une coupe, sans cotylédon ni méristème avec les cellules périphériques correspondant à la face abaxiale (dorsale), et la partie supérieure à l’adaxiale (ventrale). Mais CUC n’est pas seul responsable de la formation du MAC. Si celui-ci peut s’exprimer, mais que les transporteurs de l’auxine (gènes PIN) sont bloqués, une structure ressemblant au MAC émerge bien, mais sans les cotylédons associés. L’auxine est donc, sous l’influence de CUC, transporté par PIN dans les cotylédons, induisant la formation de ceux-ci mais aussi une déplétion dans la zone centrale, causant la formation du MAC, qui se différencie bien du MAR lequel nécessite au contraire l’auxine. Comme pour la racine, il existe des gènes importants pour le maintien du MAC chez Arabidopsis, notamment : Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 6 • • STM, qui tire son nom de l’aspect du mutant pour elle : Shoot Meristemless, son absence causant une absence de méristème avec déplétion rapide des cellules souches. On retrouve cette protéine, qui est un facteur de transcription de type KNOX, dans la zone centrale et périphérique, où il réprime les gènes spécifiques de la production d’organes AS1 et AS2. Ainsi, il empêche la différenciation prématurée de ces zones, chapotant tout le méristème. Une boucle de régulation qui passe par deux gènes, Wuschel ou WUS et Clavata3 ou CLV3 empêchant la trop grosse prolifération du centre. o WUS se trouve dans le centre organisationnel de la zone centrale. Cette protéine à homéodomaine (domaine protéique se liant à l’ADN) induit l’expression de CLV et maintient les cellules souches du MAC. WUS est exprimé dès le stade 16-cellules. o CLV3, exprimé dans les cellules souches au-dessus de celles de WUS, code pour une protéine libérée dans l’espace extracellulaire. Celle-ci est prise en charge par une protéine encore inconnue et amenée à un récepteur membranaire de la couche L3, juste au-dessus des cellules qui expriment WUS, et composé de deux protéines transmembranaires : CLV1 (qui possède un domaine kinase cytosolique) et CLV2. Le domaine kinase s’autophosphoryle en présence d’ATP, et par une cascade faisant agir de nombreux acteurs come KAPP et ROP et éléments de signalisation (MAPK ?), inhibe WUS, restreignant donc la taille de la zone centrale et donc le nombre de cellules souches. Clavata3 ne s’exprime qu’à la fin du stade cordiforme, laissant le temps à WUS de développer les cellules souches. Les différents gènes qui vont permettre de former le MAC sont donc exprimés comme suit : CHAPITRE III : EMBRYOGENESE TARDIVE ET DEVELOPPEMENT DE LA GRAINE I – FORMATION DE LA GRAINE L’ovule dispose de téguments qui deviendront ceux de la graine après maturation. Le tissu central de l’ovule, le nucelle, contient le sac embryonnaire à l’origine du gamète. Le tube pollinique entre dans l’ovule par le micropyle, permettant la double fécondation de l’oosphère et de la cellule centrale qui donnera l’albumen (= endosperme), un tissu triploïde de réserve de l’embryon, qui fournit les nutriments et signaux dont l’embryon aura besoin. On retrouve différentes morphologies, en fonction du type de graine : • A périsperme (primitives) • Albuminées (fort développement de l’albumen, au détriment du zygote – céréales, poacées). L’albumen est donc très développé chez la plupart des monocotylées. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 7 Exalbuminées (albumen présent de façon très restreinte, le reste de la graine étant pris en charge par les cotylédons). C’est le cas des eudicotylédones. Les stades de développement de l’endosperme ne sont pas clairement déterminés. • Dans le caryopse de maïs, on retrouvera les téguments qui englobent le tout, le péricarpe, suivi de trois types de cellules : les cellules de l’aleurone, tissu digestif sécrétant l’amylase, l’albumen en lui-même, réserve glucidique et protéique importante, et la couche de transfert basale, permettant le transfert de la plante mère à la graine. La composition en nutriments est également très variable. L’étude des graines est un point très important pour les entreprises semencières françaises qui sont les premières au niveau international. II – MATURATION DE L’EMBRYON ET DE LA GRAINE En règle générale durant la maturation, c’est le poids sec qui commence à augmenter de façon importante, à la différence de la formation ou on avait une augmentation du poids frais. La teneur en eau va donc fortement chuter jusqu'à des valeurs très faibles. Entre ces deux phases, il y a élongation cellulaire avec pic d’acide abscissique dans les dernières phases de l’embryogénèse, en particulier au stade torpille, ou le stock d’amidon commencera à être dégradé au profit du saccharose. Comme toujours, les hormones auront leur lot d’importance dans la maturation de l’embryon : • Cytokinines : taux élevé au début du développement embryonnaire, contribuent aux divisions cellulaires. • Auxines : taux élevé durant les phases intermédiaires (mise en place des méristèmes), contribuent à la division cellulaire, l’élargissement et la différenciation durant l’embryogénèse. • Gibbérellines : taux élevé durant les phases intermédiaires (mise en place des méristèmes), régulent l’élargissement des cellules durant l’embryogénèse. • Acide Abscissique : apparait durant la maturation et donc les phases tardives de l’embryogénèse, stimule l’accumulation des protéines de réserves, permet la tolérance à la dessiccation, et prévient la germination précoce. III – DORMANCE L’acide abscissique est associé à la dormance. Lorsque les graines en dormance sont placées en conditions favorables, elles ne vont pas germer pour autant. En agronomie, on a visé à obtenir des variétés peu ou pas dormantes. Il existe deux types de dormances : - Dormance tégumentaire : C’est une dormance permettant simplement de passer la mauvaise saison. Elle arrive tardivement au cours de la maturation lorsque 95 % de l’eau disparait, provoquant la diminution du métabolisme. Les téguments se sclérifient alors, provoquant l’inhibition tégumentaire de type imperméabilité (empêchant la graine de se réhydrater) ou limitation des échanges gazeux. Elle est facile à mettre en évidence – si l’on enlève les téguments de la graine, l’embryon va germer. Pour les enlever, il faut scarifier les graines par traitement chimique ou frottage au papier de verre. - Dormance embryonnaire : c’est la vraie dormance. Elle dépend de l’embryon et de son taux d’acide abscissique, lequel peut être levé par les gibbérellines, auquel cas l’activité métabolique reprend, mais l’élongation de la radicule est bloquée. Pour lever la dormance définitivement, on va faire une stratification : les graines sont stockées au sec puis soumises à un froid humide. IV – GERMINATION Au début de la germination, les niveaux de GA augmentent, provoquant la fin de la dormance (les mutants de synthèse des GA ne peuvent germer à moins d’avoir un apport exogène de GA, et ceux de signalisation des GA eux ne peuvent pas germer du tout). En effet, l’acide gibbérellique se déplace de l’embryon vers l’aleurone, ou il stimule la synthèse d’α-amylase et de protéases, ces dernières activant les β-amylases qui s’associeront aux α-amylase pour former une enzyme capable de digérer facilement l’amidon. Le glucose obtenu permet alors de lancer la germination. Le GA est donc l’hormone majeure du démarrage de la germination, car elle aide à percevoir les conditions de germinations. Au contraire, l’ABA, lui, est l’hormone majeure de la mise en dormance. Suite à ça, il y a entrée d’eau et d’oxygène, provoquant la réhydratation des cellules, et la reprise des activités enzymatiques se déroulant dans le cytosol (réparation des ADN, organites). On aura alors la production de protéines à partir de messagers néosynthétisés, et on entre dans une phase post-germinative dans laquelle on verra l’élongation des cellules de la radicule et la croissance de la jeune plantule grâce à l’action des auxines. En résumé, nous aurons le schéma d’action des hormones suivant : Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 8 La rupture des téguments et l’émergence de la radicule se fera en une seule étape pour les graines exalbuminées. Pour les albuminées, l’opération se fait en deux étapes. CHAPITRE IV : LA TRANSITION FLORALE I – ACTEURS DE LA TRANSITION FLORALE La transition florale passe avant tout par une transition au niveau du MAC : dès le moment de la perception des signaux qui vont provoquer le passage au niveau reproducteur, on aura bouleversement du MAC, qui passe d’un MAC végétatif à une MAC inflorescentiel. Ces signaux sont : • Les signaux endogènes o Hormones, spécialement le GA o Nutriments : diminution de saccharose en zone apical. • Les signaux exogènes o Lumière : photopériode et qualité de la lumière (voir RPE). On considère 3 catégories de plantes – les plantes qui ne sont pas sensibles à la photopériode, celles qui préfèreront les jours longs (photopériodiques) et celles qui préfèreront les jours courts (nyctipériodiques). o Température : vernalisation, c'est-à-dire période difficile pour la plante, i.e. chez nous l’hiver. La vernalisation est une des voies intégratives de la transition florale. Elle est composée de système répresseurs pouvant jouer sur des systèmes inducteurs, et est donc un acteur permettant de passer à la plante d’un état végétatif à un état reproducteur. La plante doit pouvoir comprendre la période dans laquelle on est, pour pouvoir se renforcer suffisamment au niveau végétatif avant de passer au mode reproducteur. On constate ça assez bien chez l’arabette des dames, une plante binaire car le passage au mode reproducteur est bien marqué par la disparition d’une quelconque forme d’émergence végétative, laissant place à des structure reproductives à croissance déterminée. On aura donc des bouleversements de l’environnement déclarant que le moment est favorable, provoquant une régulation génique qui va entraîner la conversion du méristème. Au début de l’étude de la transition florale, on avait baptisé florigène la substance abstraite et mobile capable d’induire la transition florale même sur une autre plante via une greffe (et même sur des plantes greffées en boucles). Afin de comprendre à quoi correspondait cet élément, des mutants sont réalisés, mettant en évidence une protéine essentielle à la transition florale : Le coactivateur transcriptionnel constant CO, dont les messagers s’accumulent en conditions de transition florale. Ce messager est dépendant de la photopériode car il est inhibé par le rouge du matin (lumière captée par le photorécepteur phyB qui va alors réprimer le gène CO) et activé par le rouge lointain/bleu en fin de journée (agissant sur les gènes de l’horloge biologique qui vont activer la transcription de CO). Il s’accumule donc petit à petit au fil de la journée et atteint un maximum au début de la nyctipériode ou il diminue doucement puis brutalement en entrée de photopériode. L’accumulation de CO, dans la journée donc, coïncide avec l’accumulation du messager codant le gène FT. La protéine FT, issu de ce gène transcrit donc à l’aide de CO, se fait en jour long uniquement. Pour les plantes de jours courts, CO et FT sont remplacées par des orthologues, respectivement HD1 et HD3A. En 2005, 5 auteurs annoncent par une étude que FT est l’élément florigène tant recherché. Deux ans plus tard, une autre équipe, en travaillant sur la tomate, démontrent que c’est le cas, mais que FT est la seulement protéine du florigène, pas le Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 9 messager lui-même. On dit alors qu’il s’agit de la forme protéique du florigène, qui est trimballé jusqu’au méristème ou il provoque sa métamorphose et le début de la transition florale. II – LA VERNALISATION La vernalisation est donc un phénomène accélérant la floraison, qui passe par de longues périodes à basses températures. Ces périodes varient selon la plante (10 à 12 jours chez le céleri, 4 semaines chez A. thaliana). C’est une adaptation de synchronisation entre la floraison et la progression des saisons. Certaines plantes, comme le colza d’hiver, nécessite une vernalisation obligatoire. On le plantera donc en automne pour avoir quelques feuilles en hiver, ou la croissance végétative et bloquée, et dès le printemps, les organes reproducteurs apparaissent. Si l’hiver n’est pas assez froid, le colza sera uniquement végétatif. Cette nécessité induira finalement une répartition géographique des espèces/écotypes, et on s’attèlera à obtenir des variétés d’hiver et de printemps pour chaque céréale. Chez l’arabette des dames, la vernalisation induit deux notions : • La nécessité : sans vernalisation, on reste bloqué au stade végétatif. • La réponse : chez un mutant de certaines voies de signalisation, la transition est retardée ou inexistante. La transition florale est donc régulée par de nombreuses voies de signalisation, qui vont converger vers les gènes d’identité méristématique, en répression ou activation de ceux-ci. La vernalisation étant un phénomène quantitatif, plus elle dure longtemps, plus la période avant la floraison est courte ensuite. Le froid sera donc perçu par les cellules en division (celles du méristème). Toutefois, la vernalisation n’est pas transmise à la descendance qui devra être vernalisée à son tour. En jouant sur la vernalisation, on a pu constater un effet dose concernant l’accumulation du messager codant pour la protéine FLC, de manière inversement proportionnelle à la période de vernalisation. FLC est donc un répresseur à la transition florale liant l’ADN (facteur de transcription). Le messager de FLC lui-même est plus favorablement transcrit par la protéine Frigida, codée par un seul gène, dont l’action est donc contrebalancée par vernalisation (elle est donc ce qui rend le phénomène obligatoire pour réduire FLC et provoquer la floraison). Il s’agit d’un déterminant majeur de la variation naturelle de la transition florale, notamment entre les écotypes. C’est la raison pour laquelle on fait beaucoup d’études de nos jours sur la variabilité de loci comme celui de Frigida entre les écotypes. Ainsi, l’écotype Landsberg possède naturellement, dans son fond génétique, un frigida mutant. Complémenté avec un frigida dominant, on bloque la transition florale (mais on peut lever cette répression). Frigida donc permet de court-circuiter la voie de la photopériode. Frigida n’est pas homologue à des protéines connues. Elle est exprimée dans les noyaux des cellules méristématique, et est composée de trois exons et deux introns. C’est le premier exon qui sera le plus variable dans les différents écotypes provoquant des pertes de fonction de frigida en Europe Centrale, en rapport au frigida actif d’Europe du Nord : • Col : délétion de 16 nt en fin d’exon 1 • Ler : délétion de 376 nt à cheval sur le promoteur et l’exon 1 • Cvi : conversion d’AAA en TAA en fin d’exon 1 Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 10 Il existe une voie autonome nommée FCA faisant agir un certain nombre de ce gène. Les mutants fca présentent une induction florale retardée, contrebalancée par vernalisation : il s’agit donc d’une autre voie réprimant FLC en contrôlant le niveau d’accumulation de celle-ci par liaison sur l’ARN. Mais FCA possède aussi un domaine de liaison protéique, essentiel à ce contrôle. Mais si un mutant fca est capable de faire la transition florale par vernalisation, ce n’est pas le cas si celui-ci est également muté pour la vernalisation. Les protéines qui contrôlent cette voie sont nombreuses et issus de gènes connus pour contribuer à la structure de la chromatine : ce sont les VRN 1 à 6. Les mutants pour ces protéines auront une réponse à la vernalisation plus ou moins affectée. Un double mutant vrn1/vrn2 mène à une abolition totale de réponse. Contrairement à FCA qui lie l’ARN, la protéine VRN lie l’ADN durant la mitose : elle est donc évidemment nucléaire. Il existe deux mutations connues pour cette protéine : vrn1-1 avec une substitution T G dans le premier motif B3 et vrn1-2, délétion d’un nucléotide en fin de NLS. Elle possède des régions riches en P, E, S et T. Cette protéine n’est pas spécifique lors de ses liaisons à l’ADN car elle peut se lier à 27 fragments génomiques différents, même si elle se lie à FLC 95 % du temps. Ceci a été vérifié par deux expériences de Biologie Moléculaire : • BIACORE : Une des molécules d’intérêt est fixé sur un support physique sur lequel on fait passer des molécules susceptibles d’interagir et on regarde le niveau de liaison. Lorsque quelque chose est retenu, on a augmentation du signal. • Retard sur Gel : On fait deux puits, le premier avec la molécule seule, la deuxième avec la molécule et quelque chose que l’on soupçonne interagir avec. Si tel est le cas, étant plus lourd, le complexe formé migrera moins loin et entrainera la formation d’un retard. La surexpression du gène codant pour VRN1 entraine : - Accélération de floraison - Feuilles courbées - Siliques avec un angle altéré - Pédicelles (petit axe portant à son sommet une seule fleur) plus courts - Fleurs moins compactes VRN1 dispose d’un processus de floraison indépendant de la vernalisation, qui passe par FT et AGL20 mais pas par l’inhibition de FLC. VRN2 présente des homologies avec les protéines EMF2 et FIS2, mais aussi avec une protéine de type Pc-G de la drosophile. Les protéines de ce groupe interviennent sous forme de complexes multi-protéiques, se liant de façon spécifique à des régions proche des gènes de l’ADN, entrainant une modification de la chromatine vers un état permettant de maintenir la répression de régulateurs clés du développement. Ces modifications peuvent être à la base du mécanisme de mémoire cellulaire de la vernalisation. Cette protéine se retrouve dans les noyaux des cellules méristématiques et des racines. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 11 VRN1 et VRN2 sont nécessaires au maintien de la répression de FLC. Sans vernalisation il y a forte accumulation de FLC, qui faiblit avec l’allongement de la vernalisation vraiment significative au bout de 3 semaines. En levant la vernalisation, il suffit de 10 jours ensuite pour voir la réapparition des messagers. La vernalisation entraine une modification des nucléosomes (acétylation, méthiolation de lysine, ubiquitinylation, phosphorylation de sérine) et la liaison de VRN1 et VRN2 permet de maintenir cet état : In fine, en replaçant ces notions dans le cycle de l’arabette des dames, nous avons donc : 1. Répression de la floraison en fin d’été, avant les saisons froides, via le système FRI – FLC. 2. Levée de répression après l’hiver suite à l’action de VRN1/2 ou FCA. 3. Floraison avec augmentation de l’activité lumineuse (photopériode) dès le printemps. CHAPITRE V : MORPHOLOGIE FLORALE I – DISPOSITION DES PIECES Dans le système reproductif de la plante, on distingue 2 types de pièces : • Pièces Stériles dont la fonction est de protéger les pièces fertiles (Sépales et Pétales) • Pièces Fertiles qui sont les organes reproducteurs (Etamines et Carpelles). La morphologie de ces pièces est directement liée à l’attrait des insectes pour assurer une meilleure pollinisation. On désigne par Gynécée ou Pistil l’ensemble Ovaire / Style / Stigmate, l’ovaire contenant un ou plusieurs carpelles, et par Androcée l’ensemble des étamines. er On désigne par verticille les « anneaux » de pièces. Pour une plante ordinaire, les sépales constituent donc le 1 verticille, les ème pétales le deuxième, les étamines le 3 et les carpelles le dernier. Chez les brassicacées comme A. thaliana, il y a 4 sépales, 4 pétales et 6 étamines, comme sur le diagramme suivant. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 12 Certaines fleurs disposent d’une symétrie axiale et d’autres bilatérales. II – ABCDAIRE DE LA MORPHOLOGIE FLORALE La morphologie forale est répartie en 3 fonctions codant pour les 4 pièces : • Fonction A : Sépales • Fonction A+B : Pétales • Fonction B+C : Etamines • Fonction C : Carpelles Attention : tous les noms de gènes qui vont suivre concernent uniquement la plante Arabidopsis thaliana. Si toutes les plantes disposent du système ABC, chacune aura ses propres gènes dans le fonctionnement de celui-ci. FONCTION A La perte de fonction de A induit les mutants apetala ap1 et ap2 correspondant à la perte des pétales. Suite à l’absence de A, la fonction C se propage sur l’ensemble des verticilles et on retrouvera donc des étamines un peu particulières s’étalant sur les autres verticilles. La fonction A correspond donc aux pièces stériles mais également à une inhibition de la fonction C, confinée à l’intérieur des verticilles 3 et 4. En faisant un double mutant, on a pu découvrir un autre gène qui permet la mise en place de A : il s’agit du gène cauliflower, cal. Le double mutant ap1/cal conduit à une structure « en chou-fleur » avec un étalement de C encore plus prononcé. Pour s’assurer de la liaison entre A et le gène cal, on a surexprimé celui-ci dans un double mutant, conduisant à la restauration de ce gène, mais aussi parfois à la restauration des deux pertes de fonctions, cal et ap1. La connaissance de ces gènes est essentielle en agronomie, puisque le chou-fleur est en fait un organisme entièrement crée en permettant l’expansion des méristèmes floraux indifférenciés chez Brassica oleracea. Il est issu d’une sélection variétale. Le mutant pour les fonctions B et C induira donc un étalement maximum de la fonction A, qui induira 4 verticilles de sépales. FONCTION B Par mutation, on a pu identifier ici deux allèles : pistillata, perte de fonction du gène pi, avec des étamines ayant une structure de pistil, et apetala3 (ap3). La fleur affectée pour la fonction B disposera donc des sépales sur les 2 premiers verticilles et des carpelles sur les deux derniers. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 13 FONCTION C Le mutant identifié pour cette condition est Agamous, du gène ag. Ce mutant présente uniquement des pièces stériles, les fertiles étant codées par C. A l’instar de C avec les mutants pour A, la fonction A a ici profité de l’absence de C pour s’étaler. La fleur disposera donc de l’organisation suivante : En absence de A et B, donc pour un quadruple mutant ap1/ap2/ap3/pi, la fonction C se retrouve seule, et permet donc la création de Carpelles uniquement. La triple perte de fonction (donc quintuple mutant avec ag en plus) induit une fleur composée de feuilles uniquement, toutefois l’assemblage des verticilles est conservés, démontrant une activité inchangée du méristème. La transition florale consiste donc à la transformation de feuilles en pièces florales à l’aide de gènes. La technique d’hybridation in situ permet de localiser les gènes comme ag et ap3 que l’on retrouve dans le centre du méristème floral. FONCTIONNEMENT DU SYSTEME ABC L’ensemble des gènes du système ABC codent pour des protéines qui appartiennent à la famille des facteurs de transcription MADS, protéines disposant d’un N-Term servant à la spécialisation, d’un domaine MADS très conservé de 56 acides aminés qui assure la dimérisation et la fixation à l’ADN, juxtaposé à un domaine I variable, un domaine K assez conservé, qui assure des interactions protéine-protéine, et un C-Term très faiblement conservé. Ces facteurs de transcriptions de dimérisent donc (MAD1/MAD2) et s’associent à l’ADN pour activer la transcription. Leur fonctionnement a été identifié chez le muflier ou on s’est aperçu que c’est l’association de Globosa et Deficiens (respectivement pi et ap3 chez l’arabette des dames) qui permettait d’activer les promoteurs de leur propre gène à tout les deux, dans une boucle d’autorégulation. Toutefois, l’expression de tous les gènes des fonctions À, B, et C n’est pas suffisante pour permettre la formation des pièces florales. III – LA FONCTION E En s’intéressant à la phylogénie des MADS, des auteurs ont été en mesure d’identifier un autre groupe composé de 3 gènes aux fortes homologies de séquences avec ceux des fonctions A, B et C tout en étant déconnectés. Ces gènes, agl2, agl4, et agl9, lorsqu’ils sont en perte de fonction, n’induisent aucun phénotype séparément. En triple mutant tout de fois, on ne verra que des sépales comme dans le cas d’un mutant B et C. Suite à ça, ces gènes ont été renommés Sepallata (Sep1, Sep2, et Sep3) et sont ème donc nécessaires pour l’accomplissement des fonctions B et C. C’est un peu plus tard qu’un 4 gène Sepallata a été découvert, Sep4 (correspondant à l’ancien Agl6). Si celui-ci est muté, on perdra également la fonction A. Les gènes Sepallata sont donc nécessaires à la mise en place de TOUTES les pièces florales. Cette fonction chapeautant l’ensemble a été appelée fonction E (le D correspondant déjà à une autre fonction régissant la mise en place des ovules). Suite à ça, ces auteurs ont proposé le quartet model : - La formation de sépales nécessite les fonctions A et E, donc les gènes Sep ainsi qu’ap1/2. Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 14 - La formation de pétales nécessite les fonctions A, B, et E donc les gènes Sep, ap1/2, ap3, et pi. - La formation d’étamines nécessite les fonctions B, C, et E donc les gènes Sep, ap3, pi et ag. - La formation de carpelles nécessite les fonctions C et E donc les gènes Sep et ag. Ce modèle est suffisant pour la formation florale. IV – MISE EN PLACE DU MERISTEME INFLORESCENTIEL Chez le muflier, on retrouve des transposons thermosensibles sautant d’un élément à un autre (généralement à la suite d’un passage au froid) et jouant sur le niveau de pigmentation des fleurs. Il s’agit d’une fleur renversée zygomorphe avec 5 pétales. On peut trouver un mutant peloric avec un plan d’organisation radial au lieu du plan bilatéral que le gène cyc de la plante instaure assez tôt dans le développement. Cette zygomorphie est due à trois acteurs principaux : - Les deux gènes d’identité méristématique Tfl1 et Lfy, le premier codant pour un système végétatif, le second pour un système inflorescentiel. Ils sont donc antagonistes. Ces gènes sont sous le contrôle des facteurs de l’environnement. o Un mutant lfy présentera donc un retard de floraison (qui aura quand même bien lieu) avec altération morphologique. o Un mutant tfl1 au contraire aura une transition florale précoce. o Le double mutant lfy/ap1 démontre une incapacité totale à fleurir, de la même manière que si l’on surexprime tfl1, auquel cas on constate une baisse de la protéine LFY. o Les construction 35S::LFY / 35S::AP1 démontrent d’un baisse de TFL1. - La protéine UFO qui s’exprime en zone latérale du méristème et est donc absente du dôme qui va servir à l’induction de certains gènes MADS L’expression des différents gènes MADS se fait comme suit : • Le méristème est rendu floral par LFY • AP1 est induit par LFY dans l’ensemble du méristème • AP3 est induit par l’action combinée de LFY et UFO dans les cellules périphériques • PI est induit naturellement dans l’ensemble du méristème puis, en dimère avec AP3, permet l’autorégulation de ces deux protéines dans les cellules périphériques • AG est induit par LFY et WUS dans la partie haute du méristème, puis inhibe ce dernier. Contrairement à clv3, le gène ag a besoin de WUS pour démarrer et n’en a plus besoin ensuite. La répression de WUS induit l’arrêt du méristème. En temps normal, AG réprime également AP1 pour mettre l’instauration de pièces fertiles. Dans un mutant d’agamous, le MAC floral sera totipotent et continuera à se développer avec les fonctions A et B (pièces stériles). L’organisation finale de ces gènes sera alors : Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/) Page 15
