L`influence favorable du foie embryonnaire sur Fhematopoiese in

/ . Embryol. exp. Morph., Vol. 17, 2, pp. 359-365, April 1967
With 2 plates
Printed in Great Britain
359
L'influence favorable
du foie embryonnaire sur Fhematopoiese in vitro
dans la moelle osseuse de Fembryon de poulet
ParGERMANO SALVATORELLI1
Institut d'Embryologie experimental du College de France et du
C.N.R.S., Directeur: Professeur Etienne Wolff
Pendant le developpement embryonnaire du poulet, on peut noter la succession de differents foyers d'erythropoiiese (Romanoff, 1960; Le Douarin, 1966):
(a) les ilots de Wolff dont l'activite se deroule entre le ler et 2eme jour
d'incubation;
(b) le sac vitellin erythropoietiquement actif du 4eme au 19eme jour d'incubation;
(c) le foie et la rate dont la faible activite se deroule entre le 7eme et le lOeme
jour d'incubation;
(d) la moelle osseuse dont l'activite commence au 12eme jour d'incubation et
qui deviendra chez l'adulte le seul organe ayant une activite erythropoietique.
On connait mal les facteurs necessaires a une erythropoiese normale, c'est-adire a l'activation des cellules mesenchymateuses et a leur differentiation dans
les diverses lignees sanguines. De recentes recherches ont demontre la presence
de facteurs erythropoietiques dans le plasma. Mais, comme nous le verrons par
la suite, leur action ne peut pas expliquer entierement le processus de l'hemopoiiese. La methode de culture in vitro permet d'etudier dans des conditions
relativement simples les phenomenes de l'erythropoiese, mais il faut remarquer
que, avec les methodes habituelles de culture, les differentes lignees sanguines
s'epuisent apres 24 a 48 heures de culture. Les cellules qui subsistent et qui
peuvent etre cultivees plus longtemps ne sont que des elements du systeme
reticulo-endothelial.
La methode de culture de Wolff & Haffen (1952) a permis au contraire de
garder pendant plusieurs jours de culture les differentes lignees sanguines, soit
des explants de moelle osseuse de poule (Pourreau-Schneider, 1962), soit des
explants de moelle osseuse humaine normale et leucemique (Pourreau-Schneider,
Bernard, Boiron & Wolff, 1963), soit d'aire vasculaire d'embryon de poulet
(Manelli, 1963; Raunich & Manelli, 1965; Raunich, Manelli, Mastrolia &
Gardenghi, 1966), soit de foie embryonnaire de souris (Gallien-Lartigue, 1966).
1
Adresse de Vauteur: 49 bis, avenue de la Belle Gabrielle, 94-Nogent S/Marne, France.
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JEEM 17
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Nous avons done applique cette methode de culture a l'etude de l'hematopoiiese
medullaire pendant le developpement embryonnaire du poulet. Dans la presente
note, nous exposons les resultats que nous avons obtenus en cultivant la moelle
osseuse d'embryons de poulet de 18 a 19 jours d'incubation, seule ou associee
a d'autres organes embryonnaires. A ce stade, les phenomenes de l'erythropoiiese sont en effet particulierement actifs (Sandreuter, 1951).
MATERIEL ET METHODES
La moelle osseuse de femur ou de tibia d'embryon de poulets de 18 a 19 jours
a ete explante"e selon la technique de Wolff & Haffen (1952) sur un milieu solide
recouvert de fragments de membrane vitelline d'oeuf de poule non incube
(Wolff, 1961). Le milieu solide se compose de: 10 gouttes de gelose en solution a
1 % dans le liquide de Gey; 4 gouttes de jus d'embryon de poulet de 8 jours et
demi d'incubation; 4 gouttes de serum de cheval.
En general, on n'a pas ajoute d'antibiotiques au milieu de culture. Nous
n'avons jamais eu d'infection dans nos cultures grace aux conditions de
rigoureuse asepsie dans lesquelles nous avons effectue nos experiences. Dans
une premiere serie experimentale, la moelle osseuse a ete cultivee seule; dans une
deuxieme serie, elle a ete associee au mesonephros d'embryons de poulet de 8
jours et demi; enfin dans une troisieme serie, au foie d'embryons de poulet de
7 a 11 jours.
Au total, on a cultive avec ces differentes techniques 1.200 explants environ,
dont une partie a ete fixee avec le melange de Helly ou de Bouin, et coloree au
Giemsa; l'autre partie a ete utilisee pour faire des frottis, colores ensuite par la
methode de May-Grunwald-Giemsa selon Pappenheim.
RESULTATS
(a) Moelle osseuse cultivee seule
La survie des explants ne depasse pas une semaine de culture. Pendant les
trois premiers jours de culture les explants gardent leur composition cellulaire
normale: la differentiation des cellules souches qui sont toujours presentes dans
nos explants, aussi bien que la maturation des elements, soit de la serie rouge,
soit de la serie blanche, continuent normalement.
A partir du 4eme jour de culture, on peut observer que la composition cellulaire des explants a subi une brusque variation: les erythrocytes montrent des
signes evidents de degenerescence; les erythroblastes deviennent de plus en plus
rares, et, au 6eme jour de culture, ont presque disparu. Les cellules souches et
les elements de la serie granulocytaire, au contraire, meme apres 5 a 6 jours de
culture, sont tres nombreux et maintiennent leur capacite de se diviser par
mitose (Planche 2, figs. A, B).
Dans certains explants, on peut observer apres 4 a 5 jours de culture, la
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PLANCHE 1
Fig. A. Moelle osseuse associee au mesonephros apres 2 jours de culture. Les granulocytes ont
envahi les espaces intertubulaires. x 450.
Fig. B. Moelle osseuse associee au foie embryonnaire apres 14 jours de culture: presence
d'une grande lacune vasculaire pleine d'elements sanguins. x 1125.
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PLANCHE 2
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Fig. A. Moelle osseuse cultivee seule sur le milieu de culture apres 4 jours (frottis): une cellule
souche en mitose et quatre myelocytes. x 1400.
Fig. B. Moelle osseuse caltivee seule sur le milieu de culture apres 5 jours (frottis): un macrophage et un myelocyte en mitose. x 1400.
Fig. C. Moelle osseuse cultivee seule sur le milieu de culture apres 4 jours (frottis): trois
monocytes et un myelocyte. xl300.
Fig. D. Moelle osseuse associee avec du foie embryonnaire (frottis) apres 15 jours de culture:
un element non determine en mitose, deux erithrocytes et un granulocyte. x 1400.
Fig. E. Moelle osseuse cultivee associee avec du foie embryonnaire apres 15 jours (frottis): un
proerithroblaste et deux erithrocytes. x 1400.
Fig. F. Moelle osseuse cultivee associee avec du foie embryonnaire apres 15 jours (frottis):
deux erithroblastes, deux erithrocytes et un granulocyte. x 1400.
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presence d'un nombre tres eleve de macrophages (Planche 2, fig. B), souvent
pleins d'elements sanguins phagocytes. Les elements monocytaires qui etaient
assez rares pendant les premiers jours de culture, deviennent, a partir du 3eme
jour, les elements cellulaires les plus frequents (Planche 2, fig. C).
(b) Culture de moelle osseuse associee au mesonephros
Dans ce cas aussi on ne peut maintenir l'hematopoiese normale pendant plus
de 3 a 4 jours de culture, et les resultats sont tout a fait comparables a ceux
qu'on obtient en explantant la moelle osseuse seule sur le milieu de culture.
Le mesonephros garde, apres 5 a 6 jours de culture, un aspect normal, tandis
que la moelle osseuse est caracterisee par un extreme appauvrissement dans sa
composition cellulaire: les elements de la serie rouge disparaissent bientot et
apres quelques jours de culture on ne trouve dans les explants que des cellules
souches et des elements de la serie granulocytaire et monocytaire. En ce qui
concerne le comportement du tissu myeloide vis-a-vis du tissu mesonephrique,
on peut noter que les deux tissus conservent en general leur individualite, mais
dans certains cas, quelques elements de la moelle osseuse, surtout des granulocytes, montrent un pouvoir d'invasion tres intense (Planche 1, fig. A). Us
colonisent les espaces intertubulaires et penetrent a l'interieur des tubes
renaux.
(c) Culture de moelle osseuse associee aufoie
En associant la moelle osseuse au foie embryonnaire, nous avons obtenu des
resultats tout a fait differents de ceux que nous avons obtenus avec les deux
premieres methodes de culture. Meme apres quinze jours de culture, la structure
et la composition cellulaire sont comparables a celles qu'on peut observer in
vivo. A l'examen macroscopique les explants de moelle sont d'une couleur rouge
vif. Dans certains cas, on peut noter, a leur surface, un voile liquide de sang
nouvellement forme. L'examen microscopique des coupes nous montre l'existence de lacunes vasculaires remplies de cellules sanguines a differents stades de
leur maturation (Planche 1, fig. B). Le tissu hepatique maintient, pendant
toute la periode de culture, sa structure normale, a l'exception de sa partie
centrale ou Ton peut observer des phenomenes de necrose, surtout si l'explant
n'etait pas suffisamment mince. II faut aussi remarquer qu'on ne trouve jamais
dans le foie des centres d'hematopoiiese. La penetration des leucocytes de la
moelle osseuse dans le tissu hepatique est un phenomene tres rare a cause de la
structure compacte de son parenchyme. Les frottis de la moelle cultivee en
association avec le foie sont tres riches en elements soit de la serie rouge, soit de
la serie blanche (Planche 2, figs. D, E, F). Tous les stades de la differentiation
cellulaire depuis la cellule souche jusqu'a la cellule sanguine mure, sont presents
dans nos explants et dans des proportions comparables a ceux existant dans la
moelle osseuse normale (voir Tableau 1). Les erythrocytes qui avec les autres
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methodes de culture degenerent au bout de quelques jours, sont aussi nombreux
qu'zVz vivo, et ils nous paraissent tout a fait normaux.
Tableau 1. Repartition des cellules hemopoietiques entre les divers stades de
maturation des series blanche et rouge dans des frottis de la moelle osseuse
d'embryons depoulet de 18 jours, normale et cultivee pendant 15 jours en association avec dufoie embryonnaire de 8 jours et demi
Les comptages ont ete faits sur 3.000 elements et rapportes a 100 cellules.
Hemocytoblastes
Proerythroblastes
Erythroblastes basophiles
Erythroblastes polychromatophiles
Erythroplastides
Erythrocytes
Myeloblastes
Myelocytes
Granulocytes
Trombocytes
Elements en mitose
Normale
Cultivee
1,3
0,9
0,27
0,57
2,90
1,30
0,10
78,60
0,90
0,87
14,1
0,13
0,26
2,20
4,50
0,10
70,25
3,66
3,33
12,77
0,43
0,56
DISCUSSION
Le processus de l'erythropoiese peut etre divise en trois phases: (a) differentiation de la cellule myeloiide multipotentielle en erythroblaste; (b) maturation des
erythroblastes; (c) synthese de Phemoglobine.
Des recherches experimentales sur les facteurs erythropoietiques ont demontre
que l'erythropoiese est sous le controle d'une hormone, l'erithropoietine, dont la
principale source est le rein. Sa structure est celle d'une glycoproteine et elle
serait presente en faibles quantites dans le plasma sanguin normal.
Nous avons demontre que, dans les conditions de nos experiences, le tissu
hepatique embryonnaire ajoute a la moelle osseuse joue un role indispensable
dans la differentiation et la maturation des elements de la serie rouge. Le foie
doit agir d'une facon specifique, car la culture de moelle osseuse, seule ou bien
en association avec le mesonephros, ne permet qu'une survie tres limitee des
differentes lignees sanguines; dans ces conditions de culture, les erythroblastes
continuent leur maturation, tandis que la differentiation des cellules souches
subit un arret, bien que leur activite mitotique reste normale.
L'hypothese d'un passage de substances de la cellule hepatique aux elements
myeloiides nous semble tres probable. Nous pensons que l'action du tissu
hepatique sur le processus de l'erythropoiese est beaucoup plus complexe que la
simple action des facteurs erythropoietiques du plasma. En comparant les
resultats obtenus dans nos trois series d'experiences, on peut conclure que la
Uhematopo'iese in vitro
363
presence du foie conditionne la differentiation des cellules souches en erythroblastes, et leur maturation ulterieure.
En ce qui concerne Faction de l'erithropoietine sur des cellules sanguines
cultivees in vitro, on a demontre (Krantz & Goldwasser, 1965) que ce ou ces
facteurs erythropoietiques favorisent la synthese du nouveau RNA messager
qui conditionne la differentiation fonctionnelle de la cellule sanguine. Au contraire, on ignore quel est ou quels sont les facteurs hepatiques agissant dans le
determinisme de l'erythropoiese in vitro de la moelle osseuse d'embryon de
poulet. Par consequent, il n'est pas possible de savoir si Tun d'entre eux est
identifiable avec l'erythropoietine plasmatique. II nous semble cependant que
l'action primaire du foie sur la moelle osseuse puisse s'identifier avec un effet
specifique sur les cellules souches: elles acquerraient de nouvelles proprietes en
se differenciant vers la serie rouge, et, sous cet aspect, ou peut voir une certaine
analogie d'action entre le foie et l'erythropoietine.
D'ailleurs, on sait que l'erythropoietine provoque dans les cultures la synthese
de l'heme dans les cellules de moelle osseuse de rat cultivees in vitro (Krantz,
Gallien-Lartigue & Goldwasser, 1963).
II faut enfin rappeler que l'addition d'erythropoietine a des cultures organotypiques de foie foetal de souris peut prolonger l'erythropoiese de quelques jours,
mais l'amelioration obtenue avec cette methode n'est que transitoire: les capacites erithropoietiques des explants s'epuisent rapidement; la maturation continue,
mais la differentiation s'arrete (Gallien-Lartigue, 1966).
On ne peut comparer exactement nos resultats et ceux obtenus par GallienLartigue, etant donne la difference du material utilise. Mais si le foie de mammifere est un centre de production de facteurs erythropoietiques (comme cela
nous semble etre le cas du foie embryonnaire de poulet), on ne comprend pas
pourquoi dans les cultures organotypiques de foie de souris cultive en milieu
prive d'erythropoietine, l'erythropoiese s'arrete apres quelques jours de culture.
Au contraire, l'apport de ce facteur dans le milieu peut exercer une action favorable sur la differentiation et la maturation de la lignee erythrocytaire. Dans
l'etat actuel de nos recherches, il n'est pas encore possible d'identifier le ou les
facteurs presents dans le foie embryonnaire de poulet dont Faction s'est montree
aussi favorable a l'erythropoiese medullaire.
Mais quelle qu'en soit la cause, nos experiences ont permis d'obtenir, en associant la moelle osseuse au foie embryonnaire, une hematopoiese durable; ceci
constitue un bon point de depart pour l'etude, dans des conditions experimentales,
des facteurs qui influencent la differentiation des elements sanguins.
RESUME
On a cultive la moelle osseuse d'embryon de poulet de 18 a 19 jours d'incubation sur le milieu de culture de Wolff & Haffen, seule, en association avec du
mesonephros, en association avec du foie embryonnaire de poulet.
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1. L'association du foie avec la moelle osseuse s'est montree tres favorable au
maintien du processus de l'erythropoiese medullaire.
2. Les explants gardent pendant au moins quinze jours de culture leur structure et leur composition cellulaires normales: ils sont tres riches soit en elements
de la serie blanche, soit en elements de la serie rouge.
3. Tous les elements de passage de la cellule souche a la cellule sanguine
mure sont presents dans nos explants. Ce qui prouve que l'erythropoiese continue
pendant toute la periode de culture.
4. Le foie doit agir d'une facon specifique sur la differentiation et la maturation des elements de la serie rouge, puis que la culture de la moelle seule, ou bien
association avec le mesonephros, ne permet qu'une survie limitee des elements
de la serie rouge.
SUMMARY
The promotion of haemopoiesis in cultured chick embryonic bone
marrow by embryonic liver
Bone marrow of chick embryos of 18-19 days of incubation has been cultivated on the culture medium of Wolff & Haffen, alone or associated with mesonephros or liver of chick embryo.
1. The association of liver with bone marrow is shown to favour continuing
medullary erythropoiesis.
3. These explants maintain their normal structure and cellular composition
for at least 15 days of culture, and they are very rich in cells of the white and
red series.
3. All stages of transition from stem cells to mature blood elements are
present in these cultures. This is proof that erythropoiesis continues during the
whole of the culture period.
4. The liver seems therefore to act specifically on the differentiation and
maturation of the cells of the erythroid series, as culture of bone marrow alone
or associated to mesonephros allows only a short survival of the cells of the
red series.
Ce travail a ete fait grace a l'aide d'une bourse du Ministero della Pubblica Istruzione et
grace a une subvention du C.N.R. de la Republique Italienne.
L'auteur tient a exprimer sa reconnaissance au Professeur Etienne Wolff pour l'hospitalite
qu'il lui a accordee dans son laboratoire et pour son encouragement durant ces recherches.
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