memoire de magister-asmaa - Université d`Oran 1 Ahmed Ben Bella

‫الجمھورية الجزائرية الدمقراطية الشعبية‬
République Algérienne Démocratique et Populaire
‫وزارة التعليم العالي و البحث العلمي‬
Ministère de l’Enseignement et de la Recherche Scientifique
Faculté des Sciences
Département de Biotechnologie
Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Ecosystèmes microbiens complexes
Présenté par
Asmaa GHALOUNI
Intitulé
Approche méthodologique à la modélisation
de la croissance sur lait de deux souches
de bactéries lactiques.
Devant le Jury :
Président
ZADI KARAM Halima
Pr., Université d’Oran
Examinateurs
DALACHE Fatiha
Dr. Université de Mostaganem
HADDI Mohamed El-Aid
Dr. Université de Constantine
Rapporteur
KARAM Nour-Eddine
Pr. Université d’Oran
Co-Rapporteur
HASSAINE Omar
MAA., Université d’Oran
Soutenu le :
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/
REMERCIEMENTS
REMERCIEMENTS
‫الحمد و الشكر الكريم على التوفيق‬
Ce travail est le fruit d’une aventure de 3 ans qui n’aurait pas pu voir le jour sans le soutien de
nombreuses personnes que je tiens à remercier ici.
Monsieur NOUR-EDDINE KARAM
Directeur du Laboratoire de biologie des microorganismes et de Biotechnologie de l’université
d’Oran Es-Sénia, Rapporteur de mon mémoire.
Recevez, Monsieur, mes plus sincères remerciements pour m'avoir accueilli dans votre
laboratoire et d'avoir encadré mon travail.
Madame ZADI KARAM HALIMA
Professeur à la faculté des sciences de l’université d’Oran, Je suis particulièrement
reconnaissante à vous madame et je vous remercie pour m’avoir fait l’honneur de présider le
jury de mon mémoire.
J’adresse également mes remerciements,
A Mademoiselle
FATIHA, maitre de conférences à l’université de
DALACHE
Mostaganem ainsi qu’ A Monsieur HADDI MOHAMED EL-AID, maitre de conférences à
l’université de Constantine, pour m’avoir fait l’honneur d’examiner mes travaux de mémoire.
Veuillez accepter, mademoiselle, monsieur, mes plus vifs remerciements pour votre présence
dans ce jury et soyez assuré de tout mon respect et de ma profonde gratitude.
Bien évidemment, un immense merci revient
A Monsieur HASSAINE OMAR,
Co-rapporteur de mon mémoire
Les remerciements exprimés ici ne seront jamais à la hauteur de votre implication dans ce travail
de mémoire qui n'aurait jamais pu aboutir sans vos nombreux conseils. Je vous exprime toute ma
reconnaissance pour votre aide, votre soutien, votre disponibilité et votre bonne humeur.
Je tiens également à remercier tous
LE PERSONNEL DU
LBMB qui en font un lieu de travail
sympathique et agréable.
Et bien sur je n’oublie pas mes collègues, je leur dois bien plus qu’un merci… Cette aventure
aurait probablement été moins belle sans les moments partagés avec AMARIA, HALIMA,
WASSILA, MILOUD, MOHAMED et MUSTAPHA.
DEDICACES
DEDICACES
Je souhaite dédier ce mémoire de fin d’études,
En témoignage de ma reconnaissance envers le soutien de tous les instants qui
m'a permis de mener à bien ce travail, les sacrifies et tous les efforts qu’elle a
faits pour mon éducation ainsi que ma formation.
Merci très chère mère pour m'avoir toujours encouragé. Rien n'aurait été
possible sans ta compréhension et ton amour.
Pour leur affection, compréhension et patience
Tous ceux qui ont une relation de proche ou de loin
avec la réalisation du présent rapport.
Asmaa.
SOMMAIRE
SOMMAIRE
Liste des Tableaux
Liste des Figures
Liste des Abréviations
Pages
i
ii
iii
1. Introduction.
1.1. Les bactéries lactiques.
1.1.1. Caractéristiques générales des bactéries lactiques
1.1.2. Les genres Lactoccocus et Entérococcus
1.1.3. Exigences nutritionnelles des bacteries lactiques
1.1.4. Rôles des bactéries lactiques
1.1.5. Caractérisation technologique des bactéries lactiques
1.1.5.1. L’activité protéolytique
1.1.5.2. Le pouvoir acidifiant
1.2. Modélisation.
1.2.1. Introduction
1.2.2. Définition
1.2.3. Microbiologie prévisionnelle
1.2.4. Démarche de modélisation
1.2.5. La cinétique de croissance bactérienne
1.2.5.1. Description de la cinétique de croissance
1.2.5.2. Expression mathématique de la croissance
1.2.6. Modélisation de la croissance bactérienne
1.2.7. Classification des modèles
1.2.7.1. Modèles primaires de croissance
1.2.7.2. Modèles secondaires de croissance
1.3. La méthodologie des plans d’expériences (MPE).
1.3.1. Introduction à la modélisation
1.3.2. Expérimentations
1.3.3. MPE et Modélisation
1.3.3.1. Facteurs et niveaux
1.3.3.2. Réponse
1.3.3.3. Modélisation de la réponse
1.3.3.4. Principales composantes de la MPE
1.3.3.4.1. La technique de criblage
1.3.3.4.2. La méthodologie des surfaces de réponse (MSR)
1.3.4. Plans composite centraux
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2. Matériel et Méthodes.
2.1. Matériel biologique
2.2. Milieux de culture
2.3. Vérification de la pureté des souches
30
30
31
SOMMAIRE
2.4. Conservation des souches.
2.5. Cinétique de croissance bactérienne
2.6. Etude des effets combinés de la température, de l’acidité et du pH sur les paramètres
cinétiques de croissance.
2.6.1. Concept expérimental
2.6.2. Suivi de la croissance des deux souches en lait.
2.6.3. Estimation des paramètres de croissance (les quatre réponses).
2.6.4. Evaluation des effets des interactions combinées des trois facteurs physicochimiques sur les paramètres de croissance.
2.7. Etude des effets combinés de la température, de l’acidité et du pH sur deux
activités à intérêt technologique (l’activité protéolytique et le pouvoir acidifiant)
des deux souches.
2.7.1. Dosage de l’activité protéolytique
2.7.2. Dosage de l’acide lactique.
3. Résultats et Discussion.
3.1. Vérification de la pureté des souches
3.1.1. Examen macroscopique.
3.1.2. Examen microscopique
3.1.3. Recherche de la Catalase
3.2. Cinétique de croissance bactérienne
3.3. Evaluation de l’effet combiné de la température, du pH et de la concentration en
NaCl, sur les paramètres cinétiques de croissance des deux souches.
3.3.1. Conception expérimentale
3.3.2. Estimation des paramètres de croissance
3.3.3. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur Nmax
3.3.4. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur µ max
3.3.5. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur T-lag
3.4. Evaluation de l’effet combiné de la température, du pH et de la concentration en
NaCl, sur l’activité protéolytique et le pouvoir acidifiant des deux souches.
3.4.1. Dosage de l’activité protéolytique.
3.4.2. Dosage de l’Acidité
3.4.3. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur l’activité protéolytique
des deux souches.
3.4.4. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur le pouvoir acidifiant des
deux souches.
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56
4. Conclusion et perspectives.
60
5. Références bibliographiques.
62
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES TABLEAUX.
Tableau 1. Modèles primaires et secondaires publiés.
21
Tableau 2. Calcul des niveaux des facteurs.
27
Tableau 3. Calcul des cinq niveaux du facteur « Température ».
29
Tableau 4. Plan d’expérience conçu pour l’étude des effets combinés du pH,
température et de la concentration en NaCl sur des réponses choisies.
Tableau 5. Matrice d’expérience ou tableau récapitulatif des niveaux expérimentaux de
chaque facteur étudié.
Tableau 6. Établissement de la gamme d’étalonnage.
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33
35
Tableau 7. Paramètres de croissance sur lait écrémé des souches LCL et CHT4,
déterminées par Micro Fit©.
Tableau 8. Aptitudes et seuil de croissance de la souche LCL sur du lait écrémé
additionné de différentes concentrations en NaCl.
Tableau 9. Les réponses mesurées pour les quatres paramètres de croissance des deux
souches.
Tableau 10. Estimation des coefficients du modèle relatif à la densité cellulaire
maximale (Nmax) des deux souches.
Tableau 11. Estimation des coefficients du modèle relatif au taux maximum de
croissance (µ max) des deux souches.
Tableau 12. Estimation des coefficients du modèle relatif au temps de latence (T-lag)
des deux souches.
Tableau 13. Les réponses obtenues pour les 17 essais du CCD relatives à l’activité
protéolytique et au pouvoir acidifiant, mesurées en fin de croissance des
deux souches.
Estimation
des coefficients du modèle relatif au pouvoir protéolytique des
Tableau 14.
deux souches.
Tableau 15. Estimation des coefficients du modèle relatif au pouvoir acidifiant des deux
souches.
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56
i
LISTE DES FIGURES
LISTE DES FIGURES.
Figure 1. Les différentes phases de croissance bactérienne en milieu liquide décrites
par Buchanan, (1918).
Figure 2. Principales phases de la courbe de croissance bactérienne et paramètres qui
les caractérisent.
Figure 3. La boîte noire du processus.
13
Figure 4. Surface de Réponse.
26
Figure 5. Plan composite centré pour 3 facteurs.
27
Figure 6.
Figure 7.
Figure 8.
Figure 9.
Figure 10.
Figure 11.
Figure 12.
Figure 13.
Figure 14.
Figure 15.
Figure 16.
Figure 17.
Figure 18.
Figure 19.
Figure 20.
Figure 21.
15
22
Cinétique de croissance des deux souches LCL et CHT4 sur milieu lait
écrémé.
L’interface du logiciel MicroFit utilisé pour l’estimation des paramètres de
croissance des deux souches.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à Nmax : densité
cellulaire maximale des deux souches LCL et CHT4.
Représentations tridimensionnelles des effets de l’interaction [pH] × [T°]
sur la densité cellulaire maximale (Nmax) des souches LCL (a) et CHT4 (b).
Représentations tridimensionnelles des effets de l’interaction [NaCl] × [T°]
sur la densité cellulaire maximale (Nmax) des souches LCL (a) et CHT4(b).
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à µ max : le taux
maximum de croissance des deux souches LCL et CHT4.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [pH] × [NaCl]
sur le taux de croissance de la souche LCL.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [pH] × [NaCl]
sur le taux de croissance de la souche CHT4.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à T-lag : Temps
de latence des deux souches LCL et CHT4.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [NaCl] ×[T°]
sur la durée de la phase de latence (T-lag) des souches LCL (a) et CHT4(b).
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif au pouvoir
protéolytique des deux souches LCL et CHT4.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°] et
[T°] × [NaCl] sur l’activité protéolytique de la souche LCL.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°]
(a), [pH] × [NaCl] (b) et [T°] × [NaCl] (c) sur l’activité protéolytique de la
souche CHT4.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif au pouvoir
acidifiant des deux souches LCL et CHT4.
Représentation tridimensionnelle des effets de l’interaction [T°] × [NaCl]
sur le pouvoir acidifiant de la souche LCL.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°]
(a), [pH] × [NaCl] (b) et [T°] × [NaCl] (c), sur le pouvoir acidifiant de la
souche CHT4.
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ii
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES ABREVIATIONS.
%: pourcentage
aw : activité de l’eau
βi : coefficient du modèle
λ : longueur d’onde
C ou [ ] : concentration
C: Degré Celsius
CCD : Central Composite Design « plan d’expérience »
CHT4: souche Enterococcus faecium CHT4
D : Degré Dornic
DO : densité optique
Ec. : Genre Enterococcus
EDTA : Acide diamine-éthylène-tétra-acétique
Eh : potentiel redox
g : gramme
g: Temps de génération
G+C %: Pourcentage d’ADN en Guanine et Cytosine
h : heure
Lc. : Genre Lactococcus
LCL: Lactococcus lactis LCL
lag : temps de latence
ln : logarithme népérien
Log : logarithme décimal
µ : Vitesse spécifique de croissance
µmax : Vitesse spécifique de croissance maximale « taux maximum de croissance »
µl : microlitre
M : la masse molaire
Max : maximum
Min : minimum
min : minute
MPE : méthodologie des plans d’expériences
MSR : méthodologie des surfaces de réponse
N : normalité
N0 : densité cellulaire initiale
Nmax : densité cellulaire maximale
NaCl : Chlorure de sodium
nm : nanomètre
pH : degré d’acidité
rpm : nombre de tours par minute
t : temps
T : Température
TCA : Acide Trichloro-acétique
ufc : unité formant colonie
V : volume
Veq : volume équivalent
x : variable
X : Biomasse
yexp et yest : les réponses expérimentale et estimée
iii
INTRODUCTION
INTRODUCTION
Les bactéries lactiques, comme tous les micro-organismes, possèdent des systèmes de
croissance et de métabolisme soumis à des régulations imposées par leur environnement. Ce
dernier est défini par un nombre important de paramètres physicochimiques.
En microbiologie alimentaire, la réponse d'une bactérie aux variations des paramètres
physicochimiques relève d'une grande complexité et son étude nécessite de bien caractériser
la nature de cette réponse, afin de prévoir le comportement de ces bactéries, par exemple dans
des fromages. En effet même si de nombreuses mesures physiques et chimiques sont possibles
aujourd’hui en industrie fromagère, de nombreux verrous subsistent lorsqu'il s'agit de
caractériser les produits alimentaires en cours de fabrication où les grandeurs biologiques et
les cinétiques réactionnelles sont très difficiles à déterminer en temps réel, alors qu'elles
conditionnent la qualité des fromages et la durée du procédé. L’un des moyens de contourner
ces difficultés est d'associer des modèles mathématiques afin d'estimer et/ou de prédire des
grandeurs clés, caractéristiques des produits et des procédés, qui ne peuvent être mesurées
directement.
Une modélisation de l'influence de ces facteurs s'avère donc très utile et permet de construire
un modèle de description de l'évolution d'une population bactérienne, pour ensuite réaliser des
prédictions de ce développement dans de nouvelles conditions environnementales.
Ce travail de mémoire est une approche à la modélisation, il a été inspiré d’une étude italienne
publiée en 2001 par Gardini et ses collaborateurs et conçue pour l’étude de l’effet combiné du
pH, de la température et de la concentration en chlorure de sodium sur la cinétique de
croissance, l’activité protéolytique et la production d’amines biogènes chez Enterococcus
faecalis.
Notre travail s'inscrit dans cette même démarche. Il s’intéresse à l’étude des effets des mêmes
facteurs cités ci-dessus sur les paramètres cinétiques de croissance ainsi que des activités à
intérêt technologique chez deux souches de bactéries lactiques, Lactococcus lactis LCL et
Enterococcus faecium CHT4, appartenant à la collection du Laboratoire de Biologie des
Microorganismes et de Biotechnologie.
-1-
INTRODUCTION
Notre étude a été conduite exclusivement en milieu lait en adoptant le même plan
d’expérience à 17 essais décrit par (Gardini et al., 2001) et en utilisant des outils
informatiques pour pouvoir développer des représentations graphiques et des modèles
mathématiques capables de décrire et de prédire les effets des interactions des trois facteurs
physicochimiques étudiées sur l’évolution des deux souches choisies pour cette étude.
La présentation des résultats de ce travail sera précédée d’une synthèse bibliographie relatant
des connaissances sur les bactéries lactiques, la modélisation et la méthodologie des plans
d’expérience, suivie des procédures expérimentales.
-2-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Les bactéries lactiques.
Les bactéries lactiques ont été utilisées pour la fermentation des aliments depuis plus de 4000
ans sans pour autant comprendre la base scientifique de leur utilisation, mais tout en essayant
de produire des aliments de meilleure conservation et de meilleure qualité (Saloffe Coste,
1994). Ce n’est qu’à la fin du 19ème siècle, époque des grandes découvertes de la
microbiologie, que certains chercheurs ont pu isoler un streptocoque (De Roissart, 1986).
Le groupe des bactéries lactiques a été défini pour la première fois par Orla-Jensen, (1919),
il réunit plusieurs genres caractérisés par leurs capacités à fermenter les glucides en
produisant de l’acide lactique (Novel, 1993). Les bactéries lactiques sont des cellules
procaryotes, hétérotrophes et chimioorganotrophes (De Roissart, 1986).
1.1.1. Caractéristiques générales des bactéries lactiques.
Les bactéries lactiques sont des cocci ou des bâtonnets, elles sont en générale aérotolérantes
(Larpent, 1989). Cependant certaines espèces habitant par exemple le tube digestif des
animaux sont anaérobies strictes, même en présence d'O2 , elles sont incapables de réaliser la
phosphorylation oxydative. Elles sont Gram-positif; généralement immobiles et asporulées,
ne possédant ni catalase, ni nitrate réductase, ni cytochrome oxydase. En plus de cela elles ne
liquéfient pas la gélatine et ne produisent pas d'indole ni d'hydrogène sulfureux (Dellaglio et
al., 1973).
Elles produisent des quantités abondantes d’acide lactique par fermentation de substances
hydrocarbonées et se caractérisent par un métabolisme exclusivement fermentaire qui les
conduit à produire à partir du glucose des quantités importantes de cet acide, accompagné
dans certains cas d’autres métabolites tels que : éthanol, CO2 et autres acides organiques
(Luquet, 1986).
Les bactéries lactiques sont ubiquistes et on les trouve dans différentes niches écologiques
comme le lait et les produits laitiers, les végétaux, la viande, le poisson, les muqueuses
humaines et animales et dans le tractus digestif (Luquet, 1986).
-3-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. 2. Les genres Lactoccocus et Enteroccocus.
1.1.2.1.Genre Lactoccocus.
Ce genre regroupe des bactéries lactiques en forme de coque disposées en chaines de longueur
variable, elles ont un métabolisme homofermentaire et produisent exclusivement de l’acide
L(+) lactique. Les lactocoques se distinguent par la présence dans leur enveloppe, d’antigène
du groupe N, par leur caractère faiblement hémolytique mais non pathogène pour la plupart,
par leur température de croissance minimale inférieure ou égale à 10°C et optimale voisine de
30°C, par leur thermosensibilité et leur inaptitude à croitre en présence de 6.5% de NaCl et à
pH=9.6 (Schleifer et al., 1985).
Les habitats les plus importants de Lactococcus (Lc.) demeurent le lait, les laits fermentés et
les fromages, ou on les trouve en quantité dominante. Utilisés en cultures pures ou en
association avec d’autres microorganismes, ils jouent dans les produits laitiers fermentés un
rôle irremplaçable pour y assurer la structure, le gout, la conservation et la salubrité.
L’espèce type Lc. lactis, forme un groupe unique d’hybridation ADN/ADN comprenant
plusieurs sous espèces, elle possède un peptidoglycane de type : Lys-D- Asp et un contenu en
G+C de 34-36% (Luquet, 1986).
1.1.2.2.Genre Enteroccocus.
Comme les lactocoques, les entérocoques (Ec.) ont un métabolisme homofermentaire et
produisent de l’acide L(+) lactique .On peut les distinguer des autres coques lactiques par la
présence d’antigène du groupe D et par leur aptitude à croitre à 10 et 45°C, en présence de
6.5% de NaCl ou de 40% de bile ou à pH=9.6 (Sherman, 1937).
Les entérocoques sont les hôtes normaux du tractus intestinal des animaux à sang chaud, mais
sont aussi présents sur les plantes et chez les insectes. Plusieurs espèces peuvent avoir un
caractère pathogène (Andrewes et Horder, 1906 ; Schleifer et Kilpper-Balz, 1984).
Les entérocoques sont formés d’espèces dont les contenus en G+C sont voisins (37.5-44%).
Les études phylogéniques réalisées à partir des caractéristiques de l’ARNr 16S et de
l’hybridation ADN/ARN ont confirmé l’autonomie de ce genre. Ainsi les streptocoques
fécaux Ec. faecalis (espèce type de ce genre) et Ec. faecium ont formé le premier embryon du
genre Enterococcus (Svec et al., 2001).
-4-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
La dispersion des entérocoques est très grande, et leurs présence dans les produits alimentaire
est souvent l’indice de contamination fécale. Cependant, pour divers fromages traditionnels,
le maintien des caractères organoleptiques typiques est lié au développement de souches
particulières d’Ec. faecium qui dans certains cas (Fontina), peuvent dominer la microflore
lactique du lait mis en œuvre (De Roissart, 1986).
1.1.3. Exigences nutritionnelles des bacteries lactiques.
Les bactéries lactiques ont une faible aptitude de biosynthèse et sont géneralement incapables
d’assimiler les principaux précurseurs de l’environnement. Elles sont considérées comme un
des groupes bactériens les plus exigeants du point de vue nutritionnel, parce qu’elles
requièrent non seulement des substrats complexes carbonés, azotés, phosphatés et soufrés,
mais aussi des facteurs de croissance comme les vitamines et les oligoéléments cations, dont
le rôle de coenzymes est important (Lenoir et al., 1992).
1.1.3.1. Exigences en vitamines: les vitamines jouent un rôle irremplaçable de coenzymes
dans le métabolisme des bactéries lactiques, en effet ces dernières sont incapables de les
synthétiser, plus particulièrement les vitamines du groupe B (les lactocoques exigent, en
particulier l’acide nicotinique (B3), l’acide pantothénique (B5) et la biotine (B8), les
lactobacilles ont un besoin absolu en pantothénate de calcium (B5) et en niacine (B3)
(Desmazeaud, 1983).
1.1.3.2. Exigences en cations: certains travaux ont montré le rôle précis des cations dans la
résistance à l’oxygène et dans les différentes réactions métaboliques. Il a été montré que les
ions Fe3+, Mg2+, Mo4+ et So4+ pouvaient intervenir dans la nutrition des lactocoques (Reiter et
Moller-Madsen, 1963; Law, 1982) et les ions Mg2+, Mn2+ et Fe2+ dans celle des lactobacilles
(De Man et al., 1960; Ledesma et al., 1977).
1.1.3.3. Exigences en acides aminés: les bactéries lactiques ont besoin pour croitre de
plusieurs acides aminés qu’elles ne peuvent synthétiser à partir d’une source azotée simple.
Parmi ces bactéries, les lactobacilles et les leuconostocs sont les plus exigeants : Leuconostoc
mesenteroides a besoin de 17 acides aminés pour se développer (De Roissart, 1986).
-5-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1.4. Rôles des bactéries lactiques.
Les bactéries lactiques interviennent dans de nombreuses transformations du lait (crème
maturée, laits fermentés, yaourts, fromages frais et affinés), mais également dans la
vinification (fermentation malolactique), la fabrication des salaisons, la fermentation des
végétaux (choucroute et ensilages) et en boulangerie. Les technologies laitières représentent
toutefois le principal secteur d’application des bactéries lactiques.
Dans la fabrication fromagère, elles jouent un rôle primordial dans les premières étapes de
la transformation du lait, et elles interviennent aussi, directement et indirectement, dans la
phase d’affinage et dans la qualité sanitaire des produits.
Les bactéries lactiques sont introduites dans le lait sous forme de «levains» lactiques, appelés
«ferments». Leur action dans la fabrication fromagère est liée principalement à deux aspects
de leur métabolisme: la production d’acide lactique et l’activité protéolytique.
La coagulation : Principale fonction des bactéries lactiques, correspond à la précipitation des
protéines rendues insolubles par l’abaissement du pH dû à l’acide lactique. L’intérêt de la
coagulation est de permettre la concentration des constituants du lait, par la séparation du
caillé (concentré) et du lactosérum (très riche en eau).
L’affinage : L’intervention des bactéries lactiques durant cette phase tient principalement à
leur activité protéolytique. Le fractionnement des caséines modifie la texture de la pâte,
certains des peptides et acides aminés libérés sont des précurseurs de substances aromatiques.
Par ailleurs, l’activité métabolique des bactéries, en modifiant le milieu (abaissement du
potentiel d’oxydoréduction), crée des conditions favorables à toute une flore anaérobie, à
laquelle appartient de nombreux micro-organismes d’affinage (Sutra et Federighi, 1998).
La conservation : Par leur production d’acide lactique, les bactéries lactiques jouent un rôle
important dans l’inhibition des flores non lactiques. Elles sont aussi reconnues par leur
production de bactériocines qui sont des peptides antimicrobiens synthétisés par un très grand
nombre d’entre elles. Les bactériocines sont généralement thermorésistantes et actives
seulement sur des bactéries à Gram+ (Laurent et al., 1998).
-6-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Qualité sanitaire des produits : Les bactéries lactiques ont un rôle fondamental dans
l’inhibition des flores non lactiques, dont certaines sont pathogènes ou préjudiciables à la
qualité des fromages. Cette action est due à l’abaissement du pH (qui inhibe la croissance de
la plupart des germes non-lactiques), à la toxicité propre de l’acide lactique, mais aussi à la
sécrétion de bactériocines (facteurs bactéricides) dont la nisine est le meilleur exemple
(Desmazeaud, 1998).
Les bactéries lactiques assurent de plus une amélioration de la digestibilité du lactose,
l’abaissement du taux de cholestérol sanguin et peuvent avoir des effets sur l’activation du
système immunitaire, l’inactivation de composés toxiques et la protection contre certaines
infections intestinales.
1.1.5. Caractérisation technologique des bactéries lactiques.
Les enjeux industriels correspondants à la production et à l’usage des bactéries lactiques sont
très importants en raison du nombre élevé de produits dans lesquels elles sont utilisées et de la
taille des marchés correspondants, en particulier dans le secteur des produits laitiers. Il est
donc essentiel de disposer de moyens permettant de caractériser aux mieux les propriétés
fonctionnelles des bactéries lactiques.
Ces dernières années, des avancées notables ont été obtenues en matière de modélisation de la
croissance et d’un certains nombre d’activités à intérêts technologiques des bactéries lactiques
pour la mise en œuvre de ferments lactiques dans les procédés industriels.
Les fonctionnalités mises en valeur du ferment lactique différent selon le type d’application
visée. En résumé, elles relèvent d’un certains nombre de propriétés dont on peut citer les
suivantes :
1.1.5.1. L’Activité protéolytique.
La protéolyse constitue l’un des phénomènes majeurs de l’affinage des fromages. Elle agit
aussi bien sur la texture de la pate que sur sa saveur et son arôme (Fox, 1993).
Dans le lait, la croissance des bactéries lactiques est fortement dépendante de l’hydrolyse des
caséines qui constituent leur principale source d’azote (Mills et Thomas, 1981; Juillard et
al., 1995).
-7-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Du fait de leurs nombreuses auxotrophies pour les acides aminés et de la pauvreté du lait en
ces derniers, la croissance des bactéries lactiques dans ce milieu repose en grande partie sur le
système protéolytique. Ce système multi-protéique fait intervenir en premier lieu une protéase
de paroi (PrtP), qui dégrade les protéines du lait en peptides généralement hydrophobes,
riches en proline et trop longs pour pouvoir traverser la membrane plasmique. Ceux-ci, ainsi
que les peptides libres du lait, sont ensuite transportés dans la cellule via trois systèmes de
transport spécifiques (Opp, DtpT et DtpP). Enfin au cytoplasme, ces peptides sont
hydrolysés en acides aminés par une vingtaine de peptidases. La nutrition azotée des
bactéries lactiques et par conséquent leur croissance optimale nécessite donc l’action de ces
peptidases. Outre leur rôle dans la nutrition azotée, les peptidases permettent, dans un
contexte fromager, l'hydrolyse des peptides amers et la libération d'acides aminés libres et de
petits peptides, précurseurs de composés d'arôme. Elles participent donc aussi à l'apparition
recherchée des qualités organoleptiques des fromages (Monnet et al., 1993 ; Guédon et al.,
2001 ; Raynaud, 2006).
Il est désormais établi que la maturation d’un fromage et ses qualités gustatives finales
découlent, en grande partie, du potentiel enzymatique des ferments utilisés. Ces dernières
années, de nombreux travaux ont démontré le rôle majeur du catabolisme des acides aminés
dans l’aromatisation des fromages, notamment celui des acides aminés aromatiques, des
acides aminés à chaîne carbonée ramifiée et de la L-méthionine (Cholet, 2006).
La protéolyse est donc à l'origine de l'apparition de nombreux composés aromatiques ou de
leurs précurseurs. Sur le plan organoleptique, un autre rôle majeur de la dégradation des
protéines porte sur la texture des fromages car les protéines représentent la phase solide de la
pâte fromagère et elles constituent le réseau tridimensionnel qui piège les globules gras et le
lactosérum. Aussi, toute modification de la nature des protéines présentes dans le fromage
influera sur ses caractères rhéologiques. Pour certains types de fromages à pâte molle, les
modifications de texture sont très prononcées entre le début et la fin de l'affinage.
En conclusion, au cours de l'affinage, l'hydrolyse des protéines joue un rôle essentiel sur les
propriétés organoleptiques des fromages puisqu'elle participe à la fois à l'assouplissement de
la pâte et au développement de la flaveur des fromages (Agioux, 2003).
-8-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
La comparaison de fromages expérimentaux (type Comté) fabriqués à partir de lait cru, lait
pasteurisé (72 °C-30 s) ou microfiltré (épuration du lait écrémé à 35°C, avec pasteurisation de
la crème) a mis en évidence le rôle prépondérant de la microflore naturelle du lait cru sur la
qualité finale des fromages. En effet, l’élimination de la microflore indigène du lait entraîne
une diminution de l’intensité du goût, de la typicité, ainsi qu’une augmentation de l’amertume
et du mauvais goût (Bouton et Grappin, 1995; Beuvier et al., 1997). Selon les différentes
flores en présence, la nature et la quantité des composés d’arôme varient ce qui conduit, en fin
d’affinage, à la typicité de chaque fromage.
1.1.5.2. Le pouvoir acidifiant.
La fonction acidifiante constitue la propriété métabolique la plus recherchée des bactéries
lactiques utilisées dans les industries alimentaires. En effet, l’acidification a pendant très
longtemps constituée une méthode privilégiée de conservation des aliments traditionnels.
Le processus d’acidification, étroitement associé à la croissance bactérienne, se traduit par
l’accumulation progressive d’acide lactique dans le milieu de culture. Les conséquences
peuvent être d’ordre physico-chimique et/ou microbiologique (Corrieu et Luquet, 2008).
De manière générale, la conversion du lactose en lactate entraîne une chute de pH qui va avoir
un impact sur la fabrication et l’affinage du fromage. En effet, l’acide produit accélère la
coagulation des caséines pendant la fabrication du fromage et favorise la synérèse, c’est-à-dire
l’expulsion du lactosérum du caillé. Il servira également de substrat à des flores secondaires
telles que les bactéries lactiques « non-levain » ou les moisissures. Par ailleurs, le pH acide et
la faible activité de l’eau réduisent la croissance de certains micro-organismes indésirables
tels que les Clostridium, Listeria ou Staphylococcus (Holzapfel et al., 1995).
Enfin, les caractéristiques physico-chimiques crées par l’acidification préparent les conditions
de développement des micro-organismes responsables de l'affinage (essentiellement levures et
moisissures) et régulent l’activité des enzymes qui interviendront ultérieurement dans la
modification des constituants du caillé (Cholet, 2006).
La participation des bactéries lactiques à la qualité du produit fini a été décrite par de
nombreux auteurs, notamment via la mise en évidence de certaines propriétés biochimiques
pouvant agir pendant l’affinage.
-9-
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.2. Modélisation.
1.2.1. Introduction à la modélisation.
Selon la définition du National Research Council (1990), un modèle mathématique est une
tentative systématique de traduire la compréhension conceptuelle d'un système réel en des
termes mathématiques. C'est donc un moyen intéressant de compréhension d'un processus se
produisant dans le système considéré. Si la conceptualisation est bonne, le modèle devrait
reproduire les phénomènes pertinents. Ainsi, un modèle mathématique est un outil valable
pour vérifier notre compréhension de la façon dont un système fonctionne (Riahi, 2006).
1.2.2. Définition.
Un modèle est une représentation simplifiée de la réalité, facilitant la prédiction ou
l’estimation et est exprimée en langage mathématique (Brown et Rothery, 1993; Pavé,
1994 ; Witzjes, 1996 ; Bréand, 1998).
En microbiologie, la modélisation consiste en la construction d’un modèle de description de
l'évolution d'une population bactérienne, pour ensuite réaliser des prédictions de ce
développement dans de nouvelles conditions environnementales (Mc Meekin et al., 1993).
L'intérêt portait surtout sur la phase de croissance exponentielle. En 1983, Roberts et Jarvis
ont qualifié cette démarche de “microbiologie prévisionnelle”.
1.2.3. Microbiologie prévisionnelle.
L'hypothèse à la base de la microbiologie prévisionnelle est que l’évolution d'une population
bactérienne dans des conditions environnementales données est reproductible (Rosso, 1995a).
Ainsi en considérant les conditions environnementales comme les contraintes définissant un
domaine d'étude, il est possible à partir d'observations passées de prédire la réponse des
microorganismes.
La microbiologie prévisionnelle est un outil combinant des éléments microbiologiques,
mathématiques et statistiques permettant de développer des modèles décrivant la croissance
ou la destruction des populations microbiennes sous certaines conditions environnementales.
- 10 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Ces modèles permettent lorsqu’il n’est pas possible de mesurer directement l’exposition
(pourcentage de contamination et concentration du microorganisme dans l’aliment au moment
de sa consommation), de la prédire en fonction de la contamination primaire (matière
première), des conditions d’environnement ou du traitement subi tout au long de la chaîne de
production et de distribution de l’aliment.
Les principaux facteurs affectant la croissance microbienne sont le pH, l’activité de l’eau (aw),
le potentiel d’oxydoréduction (Eh), la température et la présence de certains acides organiques
comme le lactate (Ross et Mc Meekin, 1994 ; Bréand, 1998).
1.2.4. Démarche de modélisation.
Approches mécaniste et descriptive.
Les modèles publiés décrivant la croissance des micro-organismes sont pour la plupart des
modèles empiriques, c'est-à-dire qu'ils sont développés à partir d'observations de faits
expérimentaux. Il existe également des modèles dits mécanistes qui sont construits à partir de
théories sur le comportement des micro-organismes et qui sont donc intellectuellement plus
satisfaisants (Cole et al., 1990); ces modèles mécanistes sont basés sur les phénomènes
biologiques et leur compréhension, et sont parfois appelés modèles phénoménologiques
(Heitzer et al., 1991).
En pratique, les deux conceptions, dans certaines des études sur la croissance des microorganismes, sont imbriquées, les modèles associant alors concepts mécanistes et observations
empiriques. De même, beaucoup de modèles, conçus à la base de façon totalement empirique,
peuvent finalement trouver des justifications mécanistes.
Quelle que soit l'approche choisie, descriptive ou mécaniste, le critère de parcimonie (nombre
minimum de paramètres), et la signification biologique ou graphique des paramètres devront
toujours être respectés. Cette dernière condition permet en effet de donner aux paramètres, en
vue de l'ajustement du modèle à des données expérimentales, une estimation initiale cohérente
avec la réalité biologique (Rosso, 1995a).
- 11 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.2.5. La cinétique de croissance bactérienne.
Il existe plusieurs méthodes expérimentales permettant de mesurer l’évolution des populations
de micro-organismes (Charles-Bajard, 1996 ; Corrieu et Luquet, 2008) :
•
Détection et dénombrement direct microscopique : cette technique consiste en
l’utilisation de lames de microscope spéciales, parfois munies de quadrillages (cellules de
Thomas ou de Malassez) pour le dénombrement des bactéries après coloration au bleu de
méthylène.
•
Dénombrement sur milieu nutritif : consiste à ensemencer plusieurs dilutions d’une
suspension cellulaire sur un milieu nutritif stérile, gélosé et coulé dans des boites de pétri.
Chaque cellule ou chaine de cellule donne naissance après incubation, à une colonie ou
clone, bien individualisé ; il s’agit donc d’unité formant colonie (ufc).
•
Détermination de la masse sèche : méthode utilisée surtout pour les cultures denses dont
le milieu contient, proportionnellement, peu d’éléments insolubles. Le poids sec est
mesuré après centrifugation ou filtration de l’échantillon de culture suivi du lavage et du
séchage des cellules.
•
Mesure de la turbidité : mesure du trouble d'une suspension bactérienne proportionnel à
la biomasse présente dans la suspension. Elle ne distingue pas la biomasse morte de la
vivante, mais son intérêt principal est sa rapidité et sa facilité d'application, notamment
pour l'analyse dite "en ligne" c'est-à-dire en continu pour mesurer la biomasse dans un
fermenteur par exemple.
•
Mesure de l’activité métabolique des bactéries : par dosage par exemple de l'ATP
(Adénosine
Triphosphate)
intracellulaire ;
mesure
d'émission
lumineuse ;
bioluminescence, due à l'utilisation d'un substrat par la bactérie, la luciférine par exemple.
•
Dosage des produits du métabolisme : corrélation entre les productions du métabolisme
et la croissance bactérienne ; exemple de l’acide lactique : la croissance du Lactobacillus
est proportionnelle à la production d'acide lactique.
•
Mesure des variations physicochimiques du milieu : corrélation entre la variation des
paramètres physicochimiques du milieu et la croissance ; exemple du pH, la croissance
des bactéries lactiques s’accompagne d’un abaissement du pH du milieu.
- 12 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.2.5.1. Description de la cinétique de croissance.
Lorsque les conditions de milieu sont favorables (présence de nutriments, Température,
activité de l'eau, pH, absence d’antiseptiques ou d'antibiotiques...), la croissance microbienne
suit la courbe de la figure 1 (Buchanan, 1918).
Figure 1.
Les différentes phases de croissance bactérienne en milieu liquide décrites par
Buchanan (1918).
On reconnaît classiquement les six phases successives suivantes (De Roissart, 1986;
Augustin, 2005) :
•
La phase de latence (µ=0), elle suit immédiatement l’ensemencement du milieu par
l’inoculum bactérien. Cette phase correspond à une période d'adaptation de l'inoculum à
son nouvel environnement de croissance et sa durée dépend de la nature du milieu
d'accueil, de l'état physiologique des cellules inoculées et éventuellement de la taille de
l'inoculum.
•
La phase d’accélération (µ augmente), pendant laquelle le métabolisme cellulaire
reprend et la croissance démarre.
•
La phase exponentielle (µ=µmax constant), au cours de laquelle toutes les bactéries se
trouvent dans leur état physiologique optimal et se multiplient a leur taux de croissance
maximum. Cette phase se présente sous la forme d'une portion linéaire lorsque l'on
représente l'évolution du logarithme de la concentration bactérienne ou de la biomasse en
fonction du temps.
- 13 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
•
La phase de ralentissement (µ diminue), elle est due à l’épuisement d’un ou de
plusieurs substrats limitants (sucres, acides aminés…), à l’accumulation de produits
toxiques (acide lactique, acide acétique, peroxydes.) ou simplement à l’abaissement du
pH.
•
La phase stationnaire (µ=0) qui correspond à un arrêt de la croissance, la culture atteint
alors sa densité maximale.
•
La phase de déclin (µ négatif), qui correspond à la mort des bactéries et éventuellement à
leur lyse par manque des réserves énergétiques ou par intoxication.
1.2.5.2. Expression mathématique de la croissance.
Après une phase de latence plus ou moins longue, la croissance est exponentielle, et peut être
décrite par l’un des deux paramètres suivants: le temps de génération (g) ou le taux de
croissance exponentielle (µ).
•
(g) est le temps de dédoublement de la population, c’est l’intervalle de temps en heures
(h) qui s’écoule entre deux divisions cellulaires.
•
Le taux de croissance (µ), se définit comme la vitesse spécifique de croissance en (h-1 )
c'est-à-dire la vitesse de croissance (dX/dt) rapportée à l’unité de biomasse(X).
On peut définir une relation simple entre le taux de croissance et le temps de génération :
Soit :
µ = ln2 /g
- 14 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
•
La figure2 représente aussi une courbe de croissance (en coordonnées semi
logarithmiques) décrivant mieux les paramètres de croissance (Augustin, 2005).
Figure 2.
Principales phases de la courbe de croissance bactérienne et paramètres qui les
caractérisent ; lag (temps de latence), µmax (taux maximum croissance),
x0 et xmax (densités cellulaires initiale et maximale).
•
Le temps de latence, lag, est défini par convention comme étant l'intersection de la droite
correspondant à la phase exponentielle avec la droite horizontale passant par la
concentration initiale, x0.
•
La vitesse de multiplication ou taux de croissance (vitesse de croissance par unité de
densité) maximum, µmax, est la pente correspondant à la phase exponentielle (en
coordonnées semi-logarithmiques).
1.2.6. Modélisation de la croissance bactérienne.
Les cinétiques de croissance observées en pratique sont loin de correspondre au schéma
simple et classique de la figure2 et présentent une grande variabilité. Des efforts ont
cependant été fournis pour modéliser les quatre ou cinq premières phases de cette cinétique.
La complexité de ce phénomène biologique nécessite l’utilisation de modèles non linéaires
pour identifier les paramètres de croissance. Le terme d’identification des paramètres est
entendu ici comme l’estimation des paramètres par la minimisation d’un critère de
convergence.
- 15 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Les cinétiques de croissance bactérienne sont le plus souvent représentées en coordonnées
semi-logarithmiques, et la méthode la plus évidente et classique d’estimation du taux de
croissance maximum est donc une analyse par régression linéaire dans la partie linéaire de la
courbe correspondant à la phase de croissance exponentielle.
1.2.7. Classification des modèles.
Whiting et Buchanan (1993) ont proposé trois classes de modèles; les modèles primaires,
secondaires et tertiaires.
Les modèles primaires décrivent l’évolution au cours du temps de la population microbienne
dans un environnement spécifique. Selon leur complexité, ils sont caractérisés par un ou
plusieurs paramètres comme le temps de latence, le taux de croissance, la densité maximale,
etc..., Ces paramètres sont spécifiques à des conditions d’environnement constantes au cours
du temps.
Les modèles décrivant l’effet des conditions d’environnement (par exemple pH, température,
acides) sur les paramètres des modèles primaires sont appelés modèles secondaires.
Les modèles utilisant les systèmes experts et de bases de données pour faire le lien entre les
modèles primaires et secondaires sont appelés modèles tertiaires.
En parallèle à cette classification, on peut définir des modèles dynamiques permettant de
prédire la croissance microbienne en fonction des paramètres des modèles primaires qui
varient au cours du temps (conditions d’environnement variant au cours du temps) (Sanaa,
2002).
1.2.7.1. Modèles primaires de croissance.
Le modèle le plus simple est le modèle exponentiel (McMeekin et al., 1993), qui ajuste bien
la phase exponentielle de croissance, mais il est mal adapté pour décrire les croissances que
l’on observe dans la nature et qui sont généralement limitées.
Des modèles plus complexes permettant de généraliser le modèle exponentiel en intégrant les
phases de croissance stationnaire et les transitions entre les différentes phases de croissance
ont été proposés par de nombreux auteurs qui utilisent le modèle de Gompertz (Gompertz,
1825) appliqué sur le logarithme décimal de la concentration bactérienne (Gibson et al.,
1988; Zwietering et al.,1990) de Baranyi (Baranyi et al., 1993; Baranyi et Roberts, 1994)
- 16 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
ou le modèle logistique avec délai et rupture (Kono, 1968; Broughall et al., 1983; Rosso,
1995b).
Zamora et Zaritzky en 1985 ont proposé une extension simple du modèle exponentiel
permettant de tenir compte de la phase de latence ; ce modèle suppose que le démarrage de la
croissance exponentielle se fait brutalement sans phase de transition et ne prend en compte ni
la saturation du milieu ni la décroissance.
Gibson et al. (1987) ont proposé l’utilisation des modèles logistique et Gompertz qui
diffèrent du modèle exponentiel par l’introduction d’une fonction de freinage spécifique.
Zwietering et al. (1990) ont proposé une simplification de ces deux modèles en faisant
apparaître les paramètres classiques ; concentration initiale (N0), concentration maximale
(Nmax), temps de latence (lag) et taux de croissance (µ) ; ils ont proposé les deux modèles ;
Gompertz et le modèle logistique. Les deux supposent que la croissance est maximale dès la
fin du temps de latence, ce qui ne correspond pas forcément à la réalité.
Baranyi et al. (1993) ont proposé un modèle combinant la fonction de freinage logistique et
une cinétique du passage des cellules de la phase de latence à la phase exponentielle.
Rosso (1995a) a proposé le modèle logistique avec délai de rupture. Il suppose l’absence de
croissance durant la phase de latence et de transition entre cette phase et la phase de
croissance exponentielle (rupture).
Nous retiendrons dans notre étude, pour décrire la cinétique de croissance des souches LCL
et CHT4, le modèle de Baranyi (Baranyi et Roberts, 1994), qui introduit, outre la fonction
de freinage f(x) permettant de décrire les phases 4 et 5, une fonction d’adaptation (t) pour
décrire les phases 1 et 2 :
- 17 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
La fonction (t) est une fonction sigmoïde strictement croissante, à valeurs dans [0,1] et
tendant vers 1 lorsque t tend vers l’infini. La fonction q(t) est l'état physiologique de la
cellule.
La forme intégrée de ce modèle est la suivante (Baranyi et Roberts, 1994) :
Ce modèle repose sur l’hypothèse que l’adaptation se fait au taux de croissance µmax et que
donc :
Le modèle de Baranyi est un modèle non linéaire à quatre paramètres avec :
•
y0 = ln(x0) le logarithme népérien de la concentration bactérienne initiale,
•
ymax = ln (xmax) le logarithme népérien de la concentration bactérienne maximale que
peut atteindre la population de départ,
•
µmax le taux de croissance maximum,
•
h0 une constante égale au produit du taux de croissance par le temps de latence
(Linton, 1958 ; Cooper, 1963; Zwietering et al., 1994). D’après une version plus
générale du modèle de Baranyi (Rosso, 1995a), la constante h0 peut être prise égale à
h0 = µopt × lagmin
Les paramètres µopt et lagmin sont respectivement les taux de croissance et temps de latence à
la température optimale de croissance.
Le modèle de croissance de Baranyi est un modèle primaire car il permet de relier la
concentration de la population bactérienne au temps; il appartient au premier niveau de
modélisation. Les modèles secondaires correspondant au modèle de Baranyi peuvent s’écrire
sous la forme :
µmax ou h0 = f (T, pH, aw ; θ)
T et pH désignent respectivement la température et le pH, aw est une variable corrélée à la
teneur en sel du milieu de culture. θ est le vecteur des paramètres.
- 18 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.2.7.2. Modèles secondaires de croissance.
Ces modèles décrivent l'évolution des paramètres du modèle primaire (le temps de latence, le
taux de croissance et la concentration cellulaire maximale) en fonction des facteurs
environnementaux. Ces derniers peuvent être classés dans deux groupes (Sanaa, 2002) :
•
Abiotiques: température, taux d’oxygène, structure de l’aliment, substances
antimicrobiennes, nitrites, acides organiques, etc.
•
Biotiques:
compétition
entre
différentes
espèces
microbiennes,
production
d’inhibiteur spécifique, état physiologique de l’inoculum, etc.
On distingue essentiellement deux approches dans l'élaboration de ces modèles secondaires :
La première approche permet de décrire l'effet simultané de plusieurs facteurs
environnementaux à l'aide de modèles polynomiaux ou modèles surface de réponse.
Ces modèles polynomiaux de degré 2 ou 3 sont utilisés pour décrire l'évolution du temps de
latence ou du taux de croissance en fonction de facteurs tels que la température, le pH, le taux
de sel, le taux de nitrite ou d'autres substances inhibitrices (Buchanan et Phillips, 1990;
Palumbo et al., 1991 ; Jones et al., 1994; Zaika et al., 1994; Fernández et al., 1997).
Ces modèles sont très efficaces lors des procédures d'ajustement aux données et permettent de
prendre en compte les interactions entre facteurs environnementaux.
La deuxième approche s'appuie sur l'étude de l'effet des facteurs environnementaux pris
individuellement. Contrairement à l'approche précédente, elle met en œuvre des modèles
robustes comportant peu de paramètres qui généralement ont une signification biologique.
Ces modèles peuvent être complexifiés en prenant en compte progressivement plusieurs
facteurs écologiques. L'inconvénient de cette approche est que les interactions entre facteurs
écologiques sont négligées sur le domaine de croissance des microorganismes (Augustin,
1999).
- 19 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Les modèles secondaires les plus populaires sont les modèles de type racine carrée qui ont la
forme suivante (cas de la modélisation du taux de croissance):
Où g est une fonction reliant les facteurs d’environnement pris en compte (X) et β les
paramètres du modèle secondaire. La transformation racine carrée permet d’améliorer la
qualité d’ajustement en stabilisant la variance.
Ces modèles ont généralement été développés pour décrire l'évolution du taux de croissance
maximum en fonction des facteurs environnementaux. En ce qui concerne le temps de latence,
il est généralement admis que, quelles que soient les conditions de croissance, celui-ci est
inversement proportionnel au taux de croissance maximum (Zwietering et al., 1994; Rosso,
1995a, 1998 a, b).
Les différents modèles primaires de croissance proposés dans la littérature permettent de
décrire de façon satisfaisante la cinétique de croissance des populations bactériennes
mais elles fournissent des estimations différentes des paramètres de croissance. Pour la
suite de notre étude, notre choix se portera sur le modèle de Baranyi [éq 4, tableau1]
qui présente les avantages d'être simple, d'être adapté à la qualité des données issues de
notre travail et avec les deux logiciels informatiques utilisés, il va nous permettre de faire
des estimations des paramètres de croissance (au moyen du Micro Fit ) et au moyen des
surfaces de réponses générées par le logiciel Statistica, d'obtenir des modèles
secondaires simples permettant de décrire convenablement les effets combinés des
facteurs physicochimiques sur les paramètres cinétiques de croissance ainsi que sur des
activités a intérêt technologique des deux souches .
- 20 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau 1.
Modèles primaires et secondaires publiés (Augustin, 1999).
Modèles
primaires
éq 1
éq 2
éq 3
éq 4
éq 5
Modèles
secondair
es
éq 6
éq 7
- 21 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.3. La méthodologie des plans d’expériences (MPE).
1.3.1. Introduction.
L'utilisation des "plans d'expériences" dans les domaines de la recherche et l’industrie donne
une stratégie dans le choix des méthodes d'expérimentation. Le succès des plans d'expériences
est lié au besoin de compétitivité des entreprises ; ils permettent une amélioration de la qualité
et une réduction des coûts. La méthode des plans d'expériences a été mise au point au début
du siècle, dans les années 1920, par le statisticien anglais Sir Ronald A. Fisher (1925), dans
le cadre d'études agronomiques. Elle a pris un essor considérable avec le développement de
l'informatique et la puissance de calcul qui l'accompagne. La grande nouveauté de la méthode
des plans d'expériences est qu'elle propose une expérimentation factorielle, c'est-à-dire que
tous les facteurs varient simultanément. Le traitement des résultats se fait à l'aide de la
régression linéaire multiple et l'analyse de variance.
La méthode des plans d'expériences (MPE) peut s’appliquer à tous les phénomènes type boite
noire (Figure 3) où l’on cherche à optimiser les données de sortie (les réponses) en réglant
les données d’entrée (les facteurs). Ces derniers peuvent être contrôlés, mais il existe parfois
des facteurs qui ne peuvent pas l’être, ce sont les ‘’facteurs bruits’’.
Figure 3.
La boîte noire du processus
Les objectifs des plans d’expériences sont de :
•
diminuer le nombre d’essais (ou de calculs),
•
connaitre les effets des paramètres,
•
déduire les paramètres les plus influents,
•
évaluer les interactions entre paramètres,
•
avoir une meilleure précision sur les résultats,
•
établir une modélisation mathématique de la réponse.
- 22 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Le terme plan d’expériences vient de l’anglais Design of Experiments qui se traduit par
planification des expériences. En fait la méthode englobe aussi bien la définition de la
séquence d’essais à réaliser pour étudier un problème donné que l’analyse statistique des
résultats de ces essais.
D’une manière générale cette technique est expérimentale et les réponses sont obtenues à
partir d’essais (ou calculs numériques simulant les essais). Elle permet d’obtenir un maximum
d’informations concernant l’influence des paramètres opératoires sur un processus ou un
système (Schimmerling et al., 1998) ainsi que la meilleure précision possible sur la
modélisation des résultats (Goupy, 1999).
1.3.2. Expérimentations.
Une expérimentation est une évaluation ou une série d’évaluations permettant d’explorer, de
définir et de construire des données (résultats d’essais) pour modéliser ou prévoir le
comportement d’un système ou d’un procédé (Fowlkes et Creveling, 1998).
Un plan d'expériences est une suite d’essais rigoureusement organisés, afin de déterminer
avec un minimum d’essais et un maximum de précision, l’influence respective des différents
paramètres de conception ou de fabrication d’un produit, afin d’en optimiser les performances
(Linder,2005).
1.3.3. Méthode des plans d'expériences (MPE) et Modélisation.
1.3.3.1. Facteurs et niveaux.
La première étape consiste à recenser les paramètres du système. Ces derniers correspondent à
des grandeurs physiques, que l'on peut régler directement ou que l'on s'autorise à modifier. La
seconde étape est de préciser les valeurs que l'on souhaite leur donner.
Les paramètres que l'on fait varier au cours des essais sont appelés facteurs, et les valeurs
possibles que l'on attribue à un facteur sont appelées niveaux.
Nous modélisons ces facteurs par des variables via une échelle ou une normalisation.
L'hypothèse de base est d'assigner à chaque facteur sa valeur la plus basse (− 1) et sa valeur la
plus haute (+1).Ainsi, pour k facteurs, on se retrouve avec un ensemble de 2k valeurs possibles
(Goupy et Creighton, 2006).
- 23 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.3.3.2. Réponse.
La réponse est la grandeur mesurée lors de l'essai c’est-à-dire le résultat de chaque
expérimentation.
1.3.3.3. Modélisation de la réponse.
Lorsqu’on réalise une étude expérimentale d’un phénomène ou d’un procédé, on la caractérise
par des réponses dont on suit les variations en fonction de divers paramètres (facteurs)
influents. Généralement, l’illustration des résultats est donnée par la représentation graphique
de la réponse (surface de réponse) en fonction de deux paramètres (on est limité à l’espace en
trois dimensions).
Si on considère une réponse théorique Yth, dépendant de n facteurs x1, x2, ..., xn on peut
écrire :
Yth = F(x1, x2, …., xn)
Mais la réponse théorique diffère de celle obtenue par voie expérimentale Yexp à cause des
erreurs expérimentales inhérentes. L’expression précédente devient :
Yexp = Yth + ε = F(x1, x2,…, xn) + ε
D’une manière générale pour la modélisation d’un système n’ayant que deux variables, on
peut écrire le modèle comme suit :
Y = β0 + β1 · x1 + β 2 · x2 + β 3 · x3
Ce modèle explique la variation de la réponse Y en fonction des deux variables x1, x2, en
supposant que la relation est linéaire. Cette hypothèse nous amène à utiliser la régression
linéaire pour obtenir les coefficients du modèle (Montgomery, 2001).
Le plan est ajusté selon le principe des moindres carrés ou les sommes des carrés des erreurs
d’estimation de la variable dépendante sont minimisées. S’il y a plus de deux variables, on
peut étendre la méthode en ajoutant les variables et leurs paramètres :
Y = β0 + β1 · x1 + β2 · x2 + ..... + βp · xp
Les paramètres βi sont appelés coefficients de régression (Lepadatu, 2006).
1.3.3.4. Principales composantes de la MPE.
La MPE est une approche visant tous les phénomènes de type boîte noire pour lesquelles on
cherche les valeurs optimales des données d’entrée "les facteurs", qui permettent une
meilleure maitrise des données de sortie "les réponses". Les deux principales composantes de
la MPE sont :
- 24 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.3.3.4.1. La technique de criblage (ou de "screening" appellation anglo-saxonne).
L’analyse d’un système ou d’un processus commence toujours par une identification de toutes
les causes susceptibles d’influencer d’une manière significative le bon déroulement du
processus. La technique de criblage permet de déterminer, parmi les facteurs recensés par
l’expérimentateur, ceux qui ont une influence statistiquement non négligeable sur la variation
de la réponse.
Un facteur est jugé influent si son action sur la réponse étudiée est statistiquement supérieure
à un certain niveau, fixé par l’expérimentateur. Il s’agit en fait de l’analyse de la variance,
cette analyse permet de détecter et de hiérarchiser les influences des paramètres d’un modèle
(Benoist et al., 1994).
Dans cette approche, les facteurs qui, séparément, n’ont aucun effet, sont éliminés à l’étape du
criblage. Or ils peuvent avoir un effet lorsqu’ils sont couples.
1.3.3.4.2. La Méthodologie des Surfaces de Réponse (MSR).
La Méthodologie des Surfaces de Réponse (Guan et Melchers, 2001 ;Byeng et Youn, 2003 ;
Noordin et al., 2003 ; Onur et Necip, 2003) est une collection de stratégies expérimentales
de méthodes mathématiques et statistiques qui permet à un expérimentateur de choisir la
meilleure des combinaisons des niveaux des paramètres qui optimise un processus.
La MSR est une approche d’optimisation développée au début des années 50 par Box et
Wilson (Box et Wilson, 1951). De nombreux chercheurs ont contribué à enrichir cette
méthode (Cornell, 1990; Montgomery, 2001 ; Quesada et al., 2004 ).
L’objectif d’une telle méthodologie est de :
•
déterminer les conditions de fonctionnement optimales pour un système ou un
processus,
•
déterminer une région de l’espace des facteurs dans laquelle les caractéristiques de
fonctionnement (les réponses) sont satisfaites,
•
modéliser et analyser un processus pour lequel la réponse est influencée par plusieurs
variables,
•
établir un rapport (équation de la surface de réponse) entre la réponse et les variables
indépendantes, qui est dans la plupart des cas inconnu.
- 25 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Cette technique, issue des techniques de plans d’expériences, vise à déterminer d’une façon
quantitative les variations de la fonction réponse vis-à-vis des facteurs d’influence
significative d’un processus ou système.
La MSR est basée sur une relation d’approximation entre la réponse mesurée Y et n variables
aléatoires (les facteurs) en utilisant les données observées d’un processus. La réponse est
généralement obtenue par des essais réels ou des simulations numériques. Dans la plupart des
cas, la fonction Y qui est une approximation de la réponse mesurée y, est un modèle
polynomial du premier ou du deuxième degré. Généralement le modèle est donné par :
Ce modèle est appelé surface de réponse (Figure 4) et il est très classique pour décrire des
phénomènes physiques. Afin de prévoir plus exactement la réponse, un modèle de second
ordre est utilise pour chercher le caractère non linéaire du phénomène étudie. De même la
fonction Y d’approximation, peut-être écrite sous la forme matricielle comme suit :
Dans la relation ci-dessus X est la matrice de calcul des effets ou la matrice d’expériences, β
est le vecteur des coefficients du modèle qui contient seulement les coefficients qui ne sont
pas connus, mais qui sont déterminés généralement en minimisant la somme des carrés des
résidus ε (Lepadatu, 2006).
Figure 4.
Surface de Réponse.
- 26 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.3.4. Plans Composites Centraux.
Les plans composites centraux sont développés, en particulier, dans la méthodologie des
Surfaces de Réponse, ils permettent l’étude d’un modèle quadratique, dans la plupart des cas
des phénomènes non linéaires. Tous les facteurs pour lesquels on souhaite tester l’influence
quadratique auront 5 niveaux. Les plans composites centraux sont constitues de trois parties,
ce qui permet une démarche séquentielle (Benoist et al., 1994) :
1. Le point au centre du domaine expérimental (Figure 5),
usuellement noté par 0 répété plusieurs (n0) fois pour
estimer la variance de répétabilité.
2. Un plan orthogonal en NF essais, qui est le plus souvent
un plan factoriel et qui combine des facteurs à 2 niveaux
usuellement notés +1 et -1.
3. Les points en étoile (Figure 5). Ces points représentent 2
essais par facteur, usuellement notés +α et – α.
Figure 5.
Plan composite centré pour 3 facteurs
Le domaine de variation des facteurs est ramené à [-α; +α]. Ainsi, un facteur variant dans
l’intervalle [Min ; Max] sera découpé en 5 niveaux : -α, -1, 0, +1, +α calculés selon le
tableau 2 :
Tableau 2.
Calcul des niveaux des facteurs
- 27 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Le paramètre α est supérieur à 1 et est calculé grâce à la formule :
Ou : NF est le nombre d’essais du plan orthogonal
Le nombre total des essais N peut être calculé grâce à la formule :
N= NF + Nα + n0 = 2k + 2k + n0
Ou :
NF = 2k est le nombre des essais pour le plan factoriel 2k (Figure 5 – les points en rouge).
Nα = 2k est le nombre des essais appelé en étoile (Figure 5).
n0 est le nombre des essais au centre du domaine pour estimer la variance de répétabilité
(Figure 5 - le point en bleu ou le point central).
•
l’utilité des points au centre du domaine d’étude.
Parce qu’un plan composite centré n’est pas orthogonal en augmentant le nombre de
répétitions des essais au centre du domaine on tend vers l’orthogonalité. Les points au centre
du domaine d’étude changent les propriétés des plans utilisés et nous apportent aussi des
informations supplémentaires sur le modèle utilisé. Lorsque le nombre de points centraux
augmente, on obtient une zone dans laquelle l’erreur de prédiction est uniforme (Goupy,
1999) et par conséquent la qualité de la modélisation croît.
Les essais au centre du domaine d’étude sont des essais répétés plusieurs fois dans les mêmes
conditions afin d’estimer la variance de répétabilité (Lepadatu, 2006).
Dans notre étude on peut compter trois variables d’entrée qui correspondent aux trois
facteurs physicochimiques : «T, pH, [NaCl]» avec cinq valeurs expérimentales pour
chacune (cinq niveaux), nous sommes donc conduits à effectuer 53 =125 expériences. Ce
nombre élevé dépasse les limites de faisabilité tant en temps qu'en coût. Il faut donc
réduire le nombre d'expériences à effectuer sans pour autant perdre sur la qualité des
résultats recherchés.
Pour déterminer les effets des trois facteurs avec leurs interactions combinées, le choix
s’est porté sur un plan centré composite (3 facteurs, 5 niveaux). Celui-ci est composé
d'un plan factoriel 2k pour déterminer les facteurs significatifs, puis de points étoiles et
centraux pour optimiser la réponse.
- 28 -
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Le plan centré composite comporte (2k + 2k + 3) combinaisons où k correspond au
nombre de facteurs (dans notre cas k=3), le nombre de combinaisons possibles est de 17
(2k + 2k =14+3 points centraux).
À chacun des niveaux des différents facteurs sont attribués, pour faciliter l'analyse
statistique, les codes suivants : -α, -1, 0, +1, +α . Dans notre cas, α ≈ 2 (Box et al.,
1978), Aux différents symboles: -2, -1, 0, +1,+ 2 correspondent les valeurs à tester des 3
facteurs (Huchet et al., 1995).
Ainsi si on prend l’exemple du facteur «Température» dans notre étude :
Tableau 3.
Calcul des cinq niveaux du facteur « Température »
Aux symboles -2, -1, 0, +1, +2 correspondent respectivement les valeurs : 16, 23, 30, 37, 44.
Le point au centre du domaine expérimental codé par 0 est répété 3 fois pour estimer la
variance de répétabilité (9ème, 10ème et 17ème essais).
- 29 -
MATERIEL
ET
METHODES
MATERIEL ET METHODES
2.1. Matériel biologique.
Nous avons utilisé deux souches de bactéries lactiques de la collection du Laboratoire de
Biologie des Microorganismes et de Biotechnologie (LBMB) de l’Université d’Oran Essenia. Il s’agit de la souche Lactococcus lactis LCL et la souche Enterococcus faecium
CHT4.
2.2. Milieux de culture.
2.2.1. Le milieu M17, décrit par Terzaghi et Sandine, (1975) a été utilisé pour la culture des
deux souches. Il est constitué d’une solution de base et une solution de lactose. Le milieu M17
solide est obtenu par addition de 15 g/l d’Agar-agar.
Solution de base.
Peptone trypsique de caséine
2.5g
Peptone pepsique de viande
2.5g
Peptone papainique de Soja
5.0g
Extrait de levure
2.5g
Extrait de viande
5.0g
ß- glycérophosphate de sodium
19g
Sulfate de magnésium
0.25g
Acide ascorbique
0.5g
Eau distillée
qsp
950 ml
Le pH est ajusté à 7.2 et la stérilisation a été effectuée à 120 °C pendant 20 minutes.
Solution de lactose.
Lactose
5.0 g
Eau distillée
50 ml
Stérilisation à 110 °C pendant 10 minutes.
Après stérilisation les deux solutions sont mélangées stérilement.
- 30 -
MATERIEL ET METHODES
2.2.2. Lait écrémé.
Nous avons utilisé au long de notre travail du Lait écrémé commercialisé par la firme Candia
sous le nom de Silhouette, ce milieu a été utilisé pour la culture des bactéries et sa
stérilisation a été effectuée à 110°C pendant 10 minutes.
2.3. Vérification de la pureté des souches.
Les deux souches (LCL et CHT4) ont été mises en culture sur milieu M17 solide à 30 et
37°C respectivement et après incubation, on a effectué sur ces dernières les vérifications
suivantes :
- Examen macroscopique.
- Coloration de Gram et examen microscopique.
- Recherche de la catalase.
2.4. Conservation des souches.
Les deux souches ont été conservées sur lait écrémé stérile à – 20°C pour des périodes
prolongées (plusieurs mois), par contre pour des conservations à moyen terme (quelques
semaines) les souches ont été conservées en gélose inclinée.
2.5. Cinétique de croissance bactérienne.
Nous avons suivi la croissance des deux souches sur milieu lait écrémé stérile, afin de
déterminer les différentes phases de croissance ainsi que les paramètres cinétiques de
croissance, à savoir la durée de la phase de latence (T- lag), le taux de croissance (µmax) et la
densité cellulaire maximale atteinte (N).
200ml de lait écrémé stérile est ensemencé avec des précultures effectuées dans le même
milieu pour les deux souches (LCL et CHT4) à raison de 1% et porté à incubation au bain
marie à 30°C et 37°C pour la souche LCL et CHT4 respectivement.
- 31 -
MATERIEL ET METHODES
À chaque intervalle de temps régulier de 30 min la DO est lue à trois longueurs d’ondes
(λ=560, 590 et 600 nm) après transparisation du lait par une solution d’EDTA (1%, pH=12)
comme décrit par (Boutrou et al., 1998).
2.6. Etude de l’effet combiné de la température, du pH du milieu et de la concentration
en NaCl, sur les paramètres cinétiques de croissance.
2.6.1. Concept expérimental.
Nous avons suivi le même plan expérimental établi par Gardini et al. (2001), pour étudier
l’effet des interactions de trois facteurs physico-chimiques « Température d’incubation, pH du
milieu et la concentration en NaCl » sur trois paramètres cinétiques de croissance «la densité
cellulaire maximale (Nmax) , le taux maximum de croissance(µmax) et le temps de latence (Tlag) » (Tableau 4).
Il s’agit d’un plan à 17 essais conçu pour 3 facteurs et 5 niveaux (tableau 5).
Une adaptation au niveau de la concentration en NaCl pour la souche LCL a été apportée
étant donné que cette dernière ne pousse pas en présence d’une concentration en NaCl dans le
milieu supérieure à 4%.
Cette expérimentation est conduite exclusivement en milieu lait, car les travaux de Gardini et
al., (2001), ont été menés en milieu synthétique (M17) pour évaluer l’influence des ces
mêmes facteurs sur la production des amines biogènes et un éventuel lien avec la protéolyse.
- 32 -
MATERIEL ET METHODES
Tableau 4.
Plan d’expérience ou CCD « Central Composite Design » conçu pour l’étude des effets
combinés du pH, Température et de la concentration en NaCl sur des réponses choisies.
Essai n°
pH
Température
(°C)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
5.8
6.6
5.8
6.6
5.8
6.6
5.8
6.6
6.2
6.2
5.4
7
6.2
6.2
6.2
6.2
6.2
23
23
37
37
23
23
37
37
30
30
30
30
16
44
30
30
30
Concentration en
NaCl (%)
LCL
2.5
2.5
2.5
2.5
3.5
3.5
3.5
3.5
3
3
3
3
3
3
2
4
3
Concentration en
NaCl (%)
CHT4
3
3
3
3
5
5
5
5
4
4
4
4
4
4
2
6
4
Chaque essai a été conduit comme indiqué sur le tableau du plan d’expérience, c’est-a-dire,
une concentration en NaCl, un pH et une température d’incubation.
Tableau 5.
Matrice d’expérience ou tableau récapitulatif des niveaux expérimentaux de chaque
facteur étudié.
Niveau des
Facteurs
Température
(°C)
pH
NaCl (%)
LCL
CHT4
-2
-1
0
+1
+2
16
23
30
37
44
5.4
5.8
6.2
6.6
7.0
2
2
2.5
3
3
4
3.5
5
4
6
- 33 -
MATERIEL ET METHODES
2.6.2. Suivi de la croissance des deux souches en lait.
A intervalle de temps régulier de 1 heure, un prélèvement de 1ml a été effectué pour évaluer
la croissance des deux souches par mesure de la densité optique à une longueur d’onde
λ=560nm après transparisation du lait comme décrit par (Boutrou et al., 1998).
2.6.3. Estimation des paramètres de croissance (les quatre réponses).
Les valeurs de DO obtenues pour chaque Essai du plan d’expérience ont été importées dans
un logiciel spécialisé, il s’agit de MicroFit© version 1.0 de l’ «Institute of Food Research
(IFR), UK » conçu par Dr Peter D G Wilson selon le modèle de croissance de Baranyi.
(Baranyi et Roberts, 1994) pour pouvoir générer les paramètres cinétiques de croissance
ciblés [la densité cellulaire initiale (N0 ) et maximale (Nmax), le taux maximum de croissance
(µmax) et le temps de latence (T-lag)] .
2.6.4. Evaluation de l’effet des interactions combinées des trois facteurs physicochimiques sur les paramètres de croissance.
Les réponses générées par le premier logiciel (MicroFit©) pour l’ensemble des 17 essais, ont
été à leur tours importées et traitées par un second logiciel Statistica® version 5.0 qui nous a
permis d’évaluer les effets des interactions: [(pH -T), ([NaCl] - pH) et ([NaCl] -T)], sur [la
densité cellulaire maximale (Nmax), le taux maximum de croissance (µmax) et le temps de
latence (T-lag)], par le moyen des représentations graphiques tridimensionnelles.
Les équations mathématiques correspondantes sont à leurs tours générées à l’aide d’un calcule
matriciel facilité par l’utilisation de Microsoft Excel®.
2.7. Etude de l’effet combiné de la température, de l’acidité et de la concentration en
NaCl sur deux activités à intérêt technologique (l’activité protéolytique et le pouvoir
acidifiant) des deux souches.
Pour l’ensemble des essais du plan expérimental, nous avons effectué au point final de la
croissance des deux souches (après 92h d’incubation), des mesures de l’activité protéolytique
et du pouvoir acidifiant.
- 34 -
MATERIEL ET METHODES
Les donnés collectées à ce niveau sont à leurs tours importées et traitées par le logiciel
Statistica® version 5.0 dans un but d’évaluer les effets des interactions : [(pH-T), ([NaCl]pH) & ([NaCl]-T)] et d’établir des représentations graphiques tridimensionnelles (surfaces de
réponse) avec les équations mathématiques correspondantes.
2.7.1. Dosage de l’activité protéolytique.
L’activité protéolytique a été évaluée en milieu lait écrémé après 92h d’incubation (point
final) pour l’ensemble des essais du plan d’expérience. Cette activité a été exprimée en
milligramme d’équivalent tyrosine par litre de lait (mg eq tyrosine/l) et la DO a été lue à une
longueur d’onde de 750 nm selon la méthode décrite par Lowry, (1951) en utilisant le réactif
de Folin.
2.7.1.1. Préparation de la gamme étalon.
La gamme étalon a été établie avec une solution de Tyrosine (50 mg/l) solubilisée dans de
l’HCl 0.2 N. Une série de tubes a été préparée comme indiqué dans le tableau 6 :
Tableau 6.
Établissement de la gamme d’étalonnage.
Tube n°
0
1
2
3
4
5
Tyrosine 50mg/l (µl)
0
100
200
300
400
500
HCl 0.2N (µl)
500
400
300
200
100
0
NaOH 0.2N (µl)
- - - - - - - - 2500 µl par tube - - - - - - -
Réactif de Folin
- - - - - - - - 2500 µl par tube - - - - - - -
(dilué au ½)
Après agitation des tubes et une mise à l’obscurité de 15 min, l’absorbance est lue à 750nm.
2.7.1.2. Dosage des échantillons.
À 2 ml de chaque échantillon à doser, le même volume d’une solution de TCA à 12% a été
ajouté et le mélange est laissé à température ambiante pendant 15 min.
- 35 -
MATERIEL ET METHODES
Après centrifugation (5000 rpm, 10min) des échantillons, 2,5 ml d’une solution de NaOH
0.2N et 0.25ml du réactif de Folin (dilué au ½) sont ajoutés à 0,5ml de surnageant.
L’absorbance est lue à 750 nm après un temps de mise à l’obscurité de 15 min.
2.7.2. Dosage de l’acide lactique.
Ce dosage a été effectué après 92h d’incubation en lait écrémé des deux souches selon le plan
d’expérience décrit-en (2-6-1). Le degré d’acidité du milieu est exprimé en °D « degré
dornic » : 1 D° correspond à 0.1 g d’Acide lactique par litre de lait.
2.7.2.1. Mode opératoire.
À 10 ml d’échantillon de lait à doser, on a ajouté quelques gouttes de phénolphtaléine et par la
suite on a titré avec une solution de NaOH N/9 placée dans une burette, avec agitation
jusqu'au virage de la coloration au rose correspondant à la zone d’équivalence. On note le
volume de la solution de NaOH (Veq).
2.7.2.2. Calcul de l’Acidité.
Equation de la réaction :
AH + OH-
A- + H2O
Calcul de la concentration d’acide lactique contenu dans un litre de lait C0(g/l)
C0 = C1 x Veq x Mac / V0
(g/l)
Où on a :
C1 = [NaOH] = N/9
Veq = volume de NaOH qui correspond à la zone de virage au rose.
Mac= masse molaire de l’acide lactique = 90 g /mol
V0 = volume initiale de l’échantillon de lait = 10 ml
Calcul du degré Dornic «° D » : D = C0 / 0.1
- 36 -
RESULTATS
ET
DISCUSSIONS
RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1. Vérification de la pureté des souches.
3.1.1. Examen macroscopique.
En milieu M17 solide, les deux souches donnent de petites colonies blanchâtres, de surface
lisse plus ou moins bombées et à contour régulier.
3.1.2. Examen microscopique.
Après coloration de Gram, l’observation microscopique montre des cellules colorées en violet
donc à Gram positif en forme de cocci isolées ou regroupées en petites chainettes.
3.1.3 Recherche de la Catalase.
Le test est négatif et nos souches sont donc dépourvues de la catalase.
Ces résultats prouvent la pureté de nos souches et confirment leur appartenance au groupe des
bactéries lactiques.
3.2. Cinétique de croissance bactérienne.
L’évolution de la croissance des deux souches sur lait écrémé stérile a été déterminée par
suivi de l’évolution de la densité optique mesurée après clarification du lait par l’EDTA à
chaque demi heure à λ= 560nm. Cette longueur d’onde a été retenue parmi les deux autres
parce qu’elle nous a permis d’obtenir la meilleure absorbance (figure 6).
La culture sur lait écrémé nous a permis de définir les différentes phases des courbes de
croissance des deux souches ainsi que les paramètres de croissance correspondants cités dans
le tableau 7. N0 : densité cellulaire initiale, Nmax: densité cellulaire maximale, µmax : taux
maximum de croissance et T-lag : la durée de la phase de latence.
- 37 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
DO (560nm)
6
5
4
LCL
3
CHT4
2
1
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
Temps (h)
Figure 6.
Cinétique de croissance des deux souches LCL et CHT4 sur milieu lait écrémé.
Tableau 7.
Paramètres de croissance sur lait écrémé des souches LCL et CHT4,
Déterminées par Micro Fit©
LCL
CHT4
0.73
0.31
4.93
4.79
µmax (h )
1.99
2.59
T-lag (h)
3.5
5.5
N0
Nmax
-1
3.3. Evaluation de l’effet combiné de la température, du pH et de la concentration en
NaCl, sur les paramètres cinétiques de croissance des deux souches.
3.3.1 Conception expérimentale.
On a retenu pour notre étude le même plan d’expérience établi par Gardini et al. (2001), sauf
que des adaptations ont été apportées pour la souche LCL relatives à la concentration en NaCl
dans le milieu de culture, car on a observé que cette souche est plus sensible à des
concentrations élevées (tableau 8), et donc on a adopté pour elle une gamme de concentration
entre 2 et 4% avec un pas de 0.5, au lieu de 2 à 6% avec un pas de 1 pour la souche CHT4.
- 38 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Tableau 8.
Aptitudes et seuil de croissance de la souche LCL sur du lait écrémé additionné de
différentes concentrations en NaCl
+++ : Trouble important dans le milieu semblable à celui du témoin (à 0% en NaCl).
++ : Trouble moins important dans le milieu par rapport au témoin (à 0% en NaCl).
+
: Trouble faible dans le milieu par rapport au témoin (à 0% en NaCl).
-
:
Absence du trouble dans le milieu.
3.3.2. Estimation des paramètres de croissance.
La figure 7 montre l’interface du logiciel MicroFit© dans lequel on a fait une simple
importation des valeurs de densité optique obtenues lors de la croissance des deux souches.
Ce logiciel nous a permis d’obtenir une représentation graphique de l’évolution de la densité
optique en fonction du temps d’incubation selon le modèle de Baranyi (Baranyi et Roberts,
1994) avec une estimation des paramètres cinétiques de croissance (encadré rouge).
Figure 7.
Interface du logiciel MicroFit© utilisé pour l’estimation des paramètres de croissance des
deux souches.
- 39 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Les résultats générés par ce logiciel, pour chaque essai du plan d’expérience exécuté, sont
donnés dans le tableau ci-dessous pour les quatre paramètres cinétiques de croissance : N0,
Nmax , µmax et T-lag.
Tableau 9.
Les réponses mesurées pour les quatres paramètres de croissance des deux souches.
LCL
Essai
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
N0
(DO)
0.91
0.45
0.73
0.59
0.73
0.56
0.84
0.56
0.77
0.77
0.73
0.73
0.56
0.70
0.73
0.80
0.77
Nmax
(DO)
3.15
2.45
3.29
2.80
2.62
2.52
2.97
3.04
2.10
2.10
2.13
2.45
1.82
2.41
2.06
2.06
2.10
µmax
(DO/h)
0.14
0.07
0.14
0.14
0.14
0.14
0.10
0.10
0.07
0.07
0.07
0.07
0.21
0.10
0.07
0.03
0.07
CHT4
T-lag
(h)
20
15
6.0
5.0
28
19
7.0
6.0
9.0
9.0
13
7.0
41
5.0
7.0
13
9.0
N0
(DO)
0.70
0.70
0.66
0.73
0.70
0.66
0.73
0.73
0.66
0.66
0.63
0.70
0.49
0.70
0.70
0.80
0.66
Nmax
(DO)
2.03
1.68
2.13
1.58
2.03
1.75
2.06
2.06
1.92
1.92
2.03
2.17
1.43
2.03
2.13
1.82
1.92
µmax
(DO/h)
0.10
0.07
0.07
0.10
0.14
0.07
0.07
0.07
0.07
0.07
0.14
0.10
0.24
0.07
0.07
0.07
0.07
T-lag
(h)
24
19
12
10
33
24
11
10
15
15
18
12
46
9.0
10
19
15
Par la suite, les effets des interactions (pH x T), ([NaCl] x pH) et ([NaCl] x T) sur trois
paramètres cinétiques choisis (Nmax , µmax et T-lag) ont été déterminés au moyen des
représentations graphiques tridimensionnelles générées par le logiciel Statistica®.
De même, le modèle mathématique correspondant est établi après un calcul matriciel.
- 40 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.3.3. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur Nmax (la densité cellulaire
maximale) des deux souches.
Tableau 10.
Estimation des coefficients du modèle relatif à la densité cellulaire maximale (Nmax) des
deux souches.
Réponse
expérimentale
yexp
yexp
LCL
CHT4
3.15
2.03
Réponse
estimée
yest
yest
LCL
CHT4
2.736
2.014
Coefficients du modèle
(βi)
βi (LCL)
βi (CHT4)
2.45
1.68
2.251
1.716
β0 =
2.0535634
1.9205629
3.29
2.13
2.89
2.122
β1 =
-0.0500117
-0.0619137
2.8
1.68
2.595
1.913
β2 =
0.1723147
0.106121
2.62
2.03
2.271
1.804
β3 =
-0.0395755
-0.0103189
2.52
1.75
2.366
1.765
β11 =
0.2227315
0.0618915
2.97
2.06
2.616
2.031
β22 =
0.1607276
-0.0692026
3.04
2.06
2.901
2.082
β33 =
0.1412406
0.0176029
2.13
2.03
2.766
2.199
β12 =
0.0475
0.0225
2.45
2.17
2.598
1.991
β13 =
0.145
0.065
1.82
1.43
2.218
1.547
β23 =
0.0475
0.03
2.41
2.03
2.797
1.904
2.06
2.13
2.519
1.988
2.06
1.82
2.386
1.953
2.1
1.92
2.054
1.921
2.1
1.92
2.054
1.921
2.1
1.92
2.054
1.921
0.25
0.2
0.15
0.1
βi (LCL)
βi(CHT4)
0.05
0
β1
β2
β3
β11
β22
β33
β12
β13
β23
-0.05
-0.1
Figure8.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à Nmax : densité cellulaire
maximale des deux souches LCL et CHT4.
- 41 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Les coefficients du modèle permettent d’aboutir à l’équation donnant la densité cellulaire
maximale de croissance dans le lait prévue en fonction des trois facteurs étudiés, elle s’écrit
sous la forme suivante ;
y = β0 + β1 x1 + β2 x2 + β3 x3 +β11 x12+β22 x22 + β33 x32 + β12 x1x2 + β13 x1x3 + β23 x2x3
Modèle pour la souche LCL.
y=2.05-0.05 x1+ 0.17 x2 -0.03 x3 +0.22 x12+ 0.16 x22 +0.14 x32 +0.04 x1x2 + 0.14 x1x3 +0.04x2x3
Modèle pour la souche CHT4.
y=1.92-0.06 x1+0.1x2 -0.01 x3 +0.06 x12+ 0.06 x22 +0.017 x32 +0.022 x1x2+ 0.06 x1x3+0.03 x2x3
Avec x1 = pH, x2= Température et x3= concentration en NaCl, en valeurs non codées.
Les effets des trois facteurs physico-chimiques transcrits sous forme de surfaces de réponses
montrent d’après la figure 9 (a, b) relative à l’interaction conjuguée [pH-T] que la
température est le facteur prépondérant affectant par rapport au pH du milieu, la densité
cellulaire maximale des deux souches.
En effet, cette dernière s’accroit avec l’augmentation de la température et peut atteindre son
maximum au voisinage de 46°C.
(a)
(b)
Figure 9.
Représentations tridimensionnelles des effets de l’interaction [pH] × [T°] sur la densité
cellulaire maximale (Nmax) des souches LCL (a) et CHT4 (b).
- 42 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
L’effet de l’interaction conjuguée ([NaCl] x pH) sur la densité cellulaire maximale est quasi
nulle. Ce résultat est valable pour les deux souches.
Par contre, l’effet de l’interaction ([NaCl] x T) présentée dans la figure 10 (a, b) montre que
la densité cellulaire maximale des deux souches s’accroit lorsqu’il s’agit de l’effet conjugué
de la température au delà de 38°C et celui du NaCl aux faibles concentrations avoisinantes
3% pour la souche LCL et 4.5 % pour la souche CHT4 qui tolère des concentrations plus
élevés en NaCl.
(a)
(b)
Figure 10.
Représentations tridimensionnelles des effets de l’interaction [NaCl] × [T°] sur la densité
cellulaire maximale (Nmax) des souches LCL (a) et CHT4(b).
Les modèles établis concernant la densité cellulaire maximale mesurée en fin de croissance
des deux souches et la figure 8 confirment les résultats obtenus au moyen des surfaces de
réponses. Il semble que l'effet linéaire direct de la variable (T) est le plus important parmi
ceux étudiés.
L’impact positif d’une telle augmentation de la température d’incubation sur la densité
cellulaire finale des deux souches, est vraisemblablement lié à l’activation des enzymes
cellulaires notamment les enzymes du métabolisme et celles impliquées dans les réactions de
production d’énergie et par conséquent une augmentation rapide de la concentration cellulaire
en fin de fermentation (Raynaud, 2006).
- 43 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Pour améliorer la concentration cellulaire finale des deux souches, nos résultats proposent
pour l’interaction [NaCl] × [T°] des intervalles bien précis afin de situer ces dernières dans un
contexte appliqué. En effet, une telle évaluation directe des deux paramètres interagissant
ensemble permet de définir les conditions optimales pour des processus industriel assavoir
dans notre cas une amélioration de la biomasse produite au point final, par exemple, améliorer
le rendement de production des « ferments lactiques » utilisés pour l’ensemencement du
milieu fromager. De plus, selon (Lucas et Reyrolle, 1989), la température qui constitue un
facteur important de propagation des ferments est déterminante pour la qualité finale du
ferment obtenu.
3.3.4. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur µmax : le taux maximum de
croissance des deux souches.
Tableau 11.
Estimation des coefficients du modèle relatif au taux maximum de croissance (µmax) des
deux souches.
Réponse
expérimentale
yexp
yexp
LCL
CHT4
0.14
0.10
Réponse
estimée
yest
yest
LCL
CHT4
0.133
0.132
0.07
0.07
0.088
0.097
β0 =
0.0681186
0.0721054
0.14
0.07
0.125
0.065
β1 =
-0.0051302
-0.0100551
0.14
0.10
0.115
0.095
β2 =
-0.0142765
-0.0260612
0.14
0.14
0.142
0.169
β3 =
-0.0056578
0.0007328
0.14
0.07
0.132
0.099
β11 =
0.0062964
0.0106688
0.10
0.07
0.058
0.067
β22 =
0.0364126
0.0230696
0.10
0.07
0.083
0.062
β33 =
-0.0007897
-0.0070465
0.07
0.14
0.094
0.119
β12 =
0.00875
0.01625
0.07
0.10
0.077
0.085
β13 =
0.00875
-0.00875
0.21
0.24
0.194
0.181
β23 =
-0.01875
-0.00875
0.10
0.07
0.146
0.093
0.07
0.07
0.075
0.050
0.03
0.07
0.056
0.053
0.07
0.07
0.068
0.072
0.07
0.07
0.068
0.072
0.07
0.07
0.068
0.072
Coefficients du modèle
(βi )
βi (LCL)
βi(CHT4)
- 44 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
0.04
0.03
0.02
0.01
βi (LCL)
βi(CHT4)
0
-0.01
β1
β2
β3
β11 β22 β33 β12 β13 β23
-0.02
-0.03
Figure 11.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à µmax : le taux maximum de
croissance des deux souches LCL et CHT4.
Modèle pour la souche LCL.
y=0.06 - 0.005x1 -0.014x2 -0.005x3 +0.006 x12+ 0.036 x22 -0.0007x32+0.008 x1x2 +0.008 x1x3 0.018 x2x3
Modèle pour la souche CHT4.
y = 0.07 - 0.01 x1 - 0.02 x2 +0.0007 x3 +0.01 x12+ 0.02 x22 - 0.007 x32 + 0.01 x1x2 - 0.008 x1x3 0.008 x2x3
Avec x1 = pH, x2= Température et x3= concentration en NaCl, en valeurs non codées.
Les surfaces de réponses établies concernant le taux maximum de croissance des deux
souches montrent que ce dernier est affecté par l’effet conjugué [NaCl-pH] par rapport aux
deux autres interactions [pH-T] et [NaCl-T] dont l’effet parait négligeable.
Concernant la souche LCL, et pour la même interaction [NaCl-pH], les effets de la
concentration en chlorure de sodium du milieu et du pH se manifestent de façon similaire sur
le taux de croissance (figure 12), ce dernier prend une valeur maximale (µmax ≥0.13 h-1) dans
une zone optimale des deux facteurs : 6.0 ≤ pH ≤ 6.8 et 3.0 % ≤ [NaCl] ≤ 3.8 %, de part et
d’autre de cette zone, la croissance se ralentit. Et donc la variation du taux de croissance de
cette souche en fonction de la concentration en NaCl et du pH se présente, selon une courbe
en forme de cloche au voisinage de l’optimum, par analogie avec l’enzymologie.
- 45 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Figure 12.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [pH] × [NaCl] sur le taux de
croissance de la souche LCL.
Pour la souche CHT4, et pour la même interaction [NaCl-pH], la figure 13 montre que l’effet
de la concentration en chlorure de sodium est plus prononcé par rapport à celui du pH, et le
taux de croissance atteint son maximum (µmax ≥0.12 h-1) à une concentration en NaCl
dépassant les 4.5 % dans le milieu.
Figure 13.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [pH] × [NaCl] sur le taux de
croissance de la souche CHT4.
- 46 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Ces résultats sont liés aux termes mathématiques des modèles établis pour les deux souches,
En effet, d’après la figure 11 on peut enregistrer un effet positif de l’interaction (pH ×
[NaCl]) sur le taux de croissance de la souche LCL par contre pour la souche CHT4, le taux
de croissance est sensible à un terme linéaire du NaCl .
La sensibilité du taux de croissance des deux souches vis-à-vis de la concentration en
chlorure de sodium est différente, car la souche CHT4 montre une meilleure aptitude à la
croissance en présence d’une concentration plus importante en NaCl dans le milieu par
rapport à la souche LCL qui nécessite un ajustement de ce facteur en une concentration bien
déterminée (faible par rapport à celle de la souche CHT4) pour que sa vitesse de croissance
soit maximale.
L’osmotolérance des deux souches est différente et semble avoir un effet direct sur
l’accélération de leurs vitesses de croissance. La souche CHT4 présente une osmotolérance
plus importante par rapport à la souche LCL, car elle appartient à un lot de souches originaires
du lait de chamelles du sud algérien, qui possèdent un mécanisme d’osmorésistance montré
par plusieurs travaux au niveau de notre laboratoire (Bouras-Boublenza, 2003).
Pour accélérer la vitesse spécifique de croissance des deux souches lors de leur mise en œuvre
dans un contexte industriel, nous proposons de maintenir constante pendant toute la durée de
culture la concentration en NaCl, à la valeur optimale propre à chaque souche. De plus un
ajustement du pH du milieu serait indispensable pour la souche LCL. Une telle régulation se
fait dans un contexte industriel par neutralisation (addition d’une base) et/ ou par élimination
de l’acide lactique produit au cours de la fermentation (filtration sur membrane).
Le potentiel d’osmotolérance de la souche CHT4 peut être une carte de plus en faveur de ce
type de souches pour une éventuelle utilisation industrielle, c’est le cas par exemple des
produits à transformer qui contiennent dans leurs mixtures du sel « NaCl » ou qui passent par
une étape de salaison au cours de leur fabrication.
- 47 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.3.5. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur T-lag: le temps de latence des
deux souches.
Tableau 12.
Estimation des coefficients du modèle relatif au temps de latence (T-lag) des deux
souches.
Réponse
expérimentale
yexp
yexp
LCL
CHT4
20
24
Réponse
estimée
yest
yest
LCL
CHT4
22.39
26.2
Coefficients du modèle
(βi)
βi (LCL)
βi(CHT4)
15
19
16.57
20.23
β0 =
9.0945969
15.091781
6
12
4.527
9.738
β1 =
-1.9113508
-1.9846388
5
10
4.704
9.268
β2 =
-8.6831614
-8.7329972
28
33
29.42
34.83
β3 =
1.7647749
2.0608583
19
24
21.6
27.36
β11 =
0.0377135
-0.3071717
7
11
6.557
10.86
β22 =
4.6437226
4.1216832
6
10
4.734
8.89
β33 =
0.0377135
-0.4843259
13
18
12.41
17.56
β12 =
1.5
1.375
7
12
5.99
10.89
β13 =
-0.5
-0.375
41
46
36.79
41.4
β23 =
-1.25
-1.875
5
9
7.613
12.05
7
10
6.236
10.26
13
19
12.17
17.19
9
15
9.095
15.09
9
15
9.095
15.09
9
15
9.095
15.09
6
4
βi (LCL)
2
βi(CHT4)
0
-2
β1
β2
β3
β11 β22 β33 β12 β13 β23
-4
-6
-8
-10
Figure 14.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif à T-lag : Temps de latence
des deux souches LCL et CHT4.
- 48 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Modèle pour la souche LCL.
y = 9.09 – 1.91 x1 – 8.68 x2 +1.76 x3 +0.03 x12+ 4.64 x22 +0.03 x32 + 1.5 x1x2 -0.5 x1x3 – 1.25
x2 x3
Modèle pour la souche CHT4.
y = 15.09 – 1.98 x1 – 8.73 x2 +2.06 x3 -0.3 x12+ 4.12 x22 - 0.48 x32 + 1.37 x1x2 - 0.37 x1x3 – 1.87
x2 x3
Avec x1 = pH, x2= Température et x3= concentration en NaCl, en valeurs non codées.
En examinant les surfaces de réponses présentant les interactions des trois facteurs étudiés sur
la durée de la phase de latence des deux souches, nous avons constaté que cette phase est
réduite au minimum lorsqu’il s’agit de l’effet conjugué de la température d’incubation au delà
de 30°C et celui du NaCl aux faibles concentrations (figure 15 a, b).
(a)
(b)
Figure 15.
Représentation tridimensionnelle de l’effet de l’interaction [NaCl] ×[T°] sur la durée de
la phase de latence (T-lag) des souches LCL (a) et CHT4 (b).
De leur part, les modèles mathématiques établis pour les deux souches montrent en particulier
un effet positif de l’augmentation de la température d’incubation sur la réduction du temps de
latence. Ce dernier est sensible selon la figure 14 à un terme quadratique (T2).
La phase de latence est une phase d’adaptation des cellules de bactéries à leur environnement.
Sa durée dépend en premier lieu de la physiologie des souches et leurs aptitudes à s’adapter
aux conditions de culture (composition du milieu, température, pH, salinité….).
- 49 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
L’augmentation de la température semble favoriser l’activité des bactéries lactiques, elle
permet d’activer la synthèse des enzymes et des médiateurs de transport inductibles,
nécessaires au fractionnement des composes du milieu, à la pénétration et à l’utilisation des
substrats dans le cytoplasme bactérien, le temps nécessaire à l’adaptation des souches au
milieu sera donc plus court. Par contre, la baisse de température entraine des modifications
physiologiques importantes, tout d’abord une diminution de la fluidité membranaire, une
stabilisation des structures secondaires des acides nucléiques, ainsi qu’une diminution de
l’efficacité de la réplication, de la transcription et de la traduction et un ralentissement du
métabolisme, ce qui va prolonger le temps de latence (Raynaud, 2006).
De sa part une augmentation de la concentration en NaCl dans le milieu, fait que les deux
souches vont être soumises à une variation de l’osmolarité qui va affecter leur métabolisme et
leur physiologie entière et conduit a un ralentissement de leur activités cellulaires et par
conséquent un ralentissement de leurs aptitudes d’adaptation au milieu. Le temps de latence
sera plus long.
Dans un souci de rentabilité ou de synchronisation des procédés de fabrication, ces résultats
peuvent être exploités et généralisés à d’autres bactéries du même genre pour un contexte
industriel (accélérer un procédé de fermentation lactique destiné soit à la production d’un
ferment, soit à la fabrication d’un produit).
3.4. Évaluation de l’effet combiné de la température, du pH et de la concentration en
NaCl, sur l’activité protéolytique et le pouvoir acidifiant des deux souches.
3.4.1. Dosage de l’activité protéolytique.
A partir de la courbe étalon, on a pu déduire la concentration massique en tyrosine libre qui
reflète l’activité protéolytique dosée en fin de croissance des deux souches et cela dans tous
nos échantillons de lait.
3.4.2. Dosage de l’acidité.
On a pu doser par titration le degré d’acidité de nos échantillons de lait après 92h
d’incubation. Ce paramètre est exprimé en degré Dornic (°D) : 1 degré Dornic °D
correspond à 0,1g d’acide lactique par litre de lait, même si l’acide lactique n’est pas le
seul acide présent.
- 50 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
L’ensemble des résultats relatifs à l’activité protéolytique et au pouvoir acidifiant des deux
souches mesurés au point final de la croissance (après 92h d’incubation) sont mentionnés dans
le tableau suivant :
Tableau 13.
Réponses obtenues pour les 17 essais du CCD relatives à l’activité protéolytique
et au pouvoir acidifiant, mesurées en fin de croissance des deux souches.
Essais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
LCL
Protéolyse
Acidité
(mg/l de Tyr libre)
(°D)
08.32
09.64
11.64
12.64
09.32
08.98
11.32
13.98
11.32
11.32
11.64
10.32
07.98
13.98
09.98
10.64
11.32
66.33
61.38
63.36
59.40
57.42
57.42
59.40
54.45
72.27
72.27
70.29
66.33
69.30
63.36
72.20
68.31
72.27
CHT4
Protéolyse
Acidité
(mg/l de Tyrosine libre)
(°D)
09.98
07.32
10.64
12.98
08.64
08.98
11.64
10.64
12.64
12.64
10.64
23.80
09.98
08.98
08.64
09.98
12.64
52.47
22.77
47.52
37.62
31.68
27.74
37.62
31.68
33.66
33.66
35.64
59.40
31.68
36.63
37.62
29.70
33.66
- 51 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.4.3. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur l’activité protéolytique des
deux souches.
Tableau 14.
Estimation des coefficients du modèle relatif au pouvoir protéolytique des deux souches.
Réponse
expérimentale
yexp
yexp
LCL
CHT4
8.32
9.98
Réponse
estimée
yest
yest
LCL
CHT4
8.98
8.729
Coefficients du modèle
(βi)
βi (LCL)
βi(CHT4)
9.64
7.32
8.653
11
β0 =
11.343035
12.764053
11.64
10.64
11.56
9.592
β1 =
0.1775328
1.5484873
12.64
12.98
12.58
13.69
β2 =
1.714939
0.6815783
9.32
8.64
9.652
9.409
β3 =
0.4271811
0.0902322
8.98
8.98
9.337
11.51
β11 =
-0.1975594
1.2075542
11.32
11.64
12.58
9.443
β22 =
-0.1975594
-1.5347927
13.98
10.64
13.61
13.37
β33 =
-0.0806377
-1.5950251
11.64
10.64
10.49
13.57
β12 =
0.335
0.4575
10.32
23.8
11.08
18.77
β13 =
0
-0.0425
7.98
9.98
7.904
7.287
β23 =
0.085
-0.2075
13.98
8.98
13.67
9.577
9.98
8.64
10.4
8.111
12.64
9.98
11.83
8.414
11.32
12.64
11.34
12.76
11.32
12.64
11.34
12.76
11.32
12.64
11.34
12.76
2
1.5
1
βi (LCL)
0.5
βi(CHT4)
0
β1
β2
β3
β11
β22
β33
β12
β13
β23
-0.5
-1
-1.5
-2
Figure 16.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif au pouvoir protéolytique
des deux souches LCL et CHT4.
- 52 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Modèle pour la souche LCL.
y = 11.34+ 0.17 x1 +1.71 x2 +0.42 x3 -0.19 x12-0.19 x22 -0.08 x32 + 0.33 x1x2 +0.085 x2x3
Modèle pour la souche CHT4.
y = 12.76 +1.54 x1 +0.68 x2+0.09 x3 +1.2 x12-1.53x22 – 1.59 x32 + 0.45 x1x2 - 0.04 x1x3 –0.2x2x3
Avec x1 = pH, x2= Température et x3= concentration en NaCl, en valeurs non codées.
A l’examen des deux surfaces de réponses relatives aux effets des interactions [pH-T] et [TNaCl] (figure 17a et b), nous avons constaté que l’activité protéolytique de la souche LCL
est fortement liée à une augmentation de la température d’incubation et cela quelque soit le
niveau des deux autres facteurs dans le milieu. Nous avons aussi enregistré que l’interaction
([NaCl] x pH) a un effet quasiment négligeable sur l’activité protéolytique de cette souche.
Par contre, chez la souche CHT4, l’examen des surfaces de réponses (figure 18 a, b) nous a
montré un autre résultat qui s’oppose à celui enregistré pour la souche LCL, car pour cette
souche CHT4, l’activité protéolytique exprimée semble être affectée par le pH. Les deux
autres facteurs en interaction avec le pH ont un effet quasiment nul. Par contre, une
interaction positive [NaCl-T] a été enregistrée (graphique sous forme de cloche, figure 18 c)
avec un optimum de température donné au voisinage de 30°C et une concentration de NaCl
dans le milieu aux alentours de 5%.
(a)
(b)
Figure 17.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°] et [T°] ×
[NaCl] sur l’activité protéolytique de la souche LCL
- 53 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
(b)
(a)
(c)
Figure 18.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°] (a), [pH] ×
[NaCl] (b) et [T°]× [NaCl] (c) sur l’activité protéolytique de la souche CHT4.
La représentation graphique des coefficients du modèle (figure 16) confirme les résultats
obtenus au moyen des surfaces de réponses et montre en particulier les effets linéaires positifs
de la (T) et du (pH) sur la protéolyse des deux souches LCL et CHT4 respectivement.
L’activité protéolytique de la souche LCL appartenant au groupe des lactocoques, dépend en
premier lieu de la présence de protéases extracellulaires dont la production semble soumise à
un système de régulation qui dépend non seulement de la composition du milieu mais aussi
des facteurs physicochimiques environnants (Hugenholtz et al., 1987 ; Monnet et al., 1987).
Parmi ces facteurs, il y a la température, qui dans notre cas semble avoir le plus important
impact. Une augmentation de cette dernière au delà de 34°C est responsable de la production
des enzymes protéolytiques (protéases et peptidases) et aussi de leur activation.
- 54 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
L’augmentation de la température peut être aussi à l’origine d’une activation des systèmes de
transport membranaire des peptides énergie-dépendants (Smid et al., 1989).
De la même façon, dans notre étude le pH semble avoir un impact positif sur l’activité
protéolytique de la souche CHT4, cela suppose que l’effet de ce dernier sur les activités des
enzymes protéolytiques de cette souche peut constituer un élément très important de
régulation du métabolisme protéique.
La vitesse des réactions de protéolyse de la souche CHT4 est, de plus, fonction des deux
facteurs (T) et ([NaCl]) et décrit pour eux une courbe composite, en forme de cloche qui
résulte de deux phénomènes conjugués ; l’effet positif de la température d’incubation au
voisinage de 30°C et celui de la concentration en NaCl aux alentours de 5%.En effet
l’osmotolérance de la souche CHT4 parait une nouvelle fois apte à jouer un rôle important
dans l’accélération des réactions enzymatiques de cette souche. Ceci est vraisemblablement
lié à une physiologie plus adaptée de cette souche à ces conditions de salinité. Ce caractère est
probablement en relation avec le biotope où la bactérie a été isolée, il s’agit du lait de
chamelle du sud algérien qui est marqué par son caractère salé (Zadi-Karam et al., 2004) et
de ce fait, il peut être un caractère avantageux pour cette souche pour d’éventuelles
applications industrielles.
Nos résultats présentent un intérêt exploitable à l’échelle industrielle, du fait des ajustements
des facteurs physico-chimiques pour lesquelles ces deux souches présentent un optimum de
protéolyse activité très importante pour l'hydrolyse des protéines du lait, des peptides amers
et la libération des acides aminés et de petits peptides, précurseurs de nombreux composés
d'arômes.
- 55 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.4.4. Évaluation de l’effet combiné des trois facteurs sur le pouvoir acidifiant des deux
souches.
Tableau 15.
Estimation des coefficients du modèle relatif au pouvoir acidifiant des deux souches.
Réponse
expérimentale
yexp
yexp
LCL
CHT4
66.33
52.47
Réponse
estimée
yest
yest
LCL
CHT4
68.37
50.85
Coefficients du modèle
(βi)
βi (LCL)
βi(CHT4)
61.38
22.77
65.37
37.57
β0 =
72.813569
34.188222
63.36
47.52
66.04
50.53
β1 =
-1.5033419
-0.7008677
59.4
37.62
61.05
46.15
β2 =
-1.1666862
2.0590994
57.42
31.68
62.24
29.45
β3 =
-2.0751642
-6.9891534
57.42
27.74
61.22
31.03
β11 =
-3.2222644
3.1428721
59.4
37.62
61.89
29.11
β22 =
-3.923795
-1.5924595
54.45
31.68
58.88
39.59
β33 =
-2.5331346
3.5467837
70.29
35.64
66.24
44.24
β12 =
-0.495
2.225
66.33
59.4
61.19
41.88
β13 =
0.495
3.715
69.3
31.68
63.7
26.23
β23 =
0.495
-0.0025
63.36
36.63
59.78
33.15
72.2
67.62
69.15
55.94
68.31
29.7
62.18
32.46
72.27
33.66
72.81
34.19
72.27
33.66
72.81
34.19
72.27
33.66
72.81
34.19
6
4
βi (LCL)
2
βi(CHT4)
0
-2
β1
β2
β3
β11
β22
β33
β12
β13
β23
-4
-6
-8
Figure 19.
Représentation graphique des coefficients du modèle relatif au pouvoir acidifiant des
deux souches LCL et CHT4.
- 56 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Modèle pour la souche LCL.
y = 72.81-1.5 x1 -1.16 x2 -2.07 x3 -3.22 x12-3.92 x22 -2.53 x32 -0.49x1x2 +0.49 x1x3 +0.49x2x3
Modèle pour la souche CHT4.
y = 34.18-0.7x1+2.05 x2 -6.98 x3 +3.1 x12-1.59x22 +3.54x32 + 2.22 x1x2 +3.71x1x3 – 0.0025 x2x3
Avec x1 = pH, x2= Température et x3= concentration en NaCl, en valeurs non codées.
L’examen de la surface de réponse (figure 20) relative à l’interaction combinée [T°] × [NaCl]
montre un effet positif de la réduction de la concentration en NaCl du milieu sur l’activité
acidifiante de la souche LCL quelle que soit la température d’incubation. Les effets des deux
autres facteurs sur ce paramètre sont quasiment nuls.
Concernant la souche CHT4, les effets des interactions conjuguées des trois facteurs
physicochimiques, présentés sous forme de surfaces de réponses (figure 21), montrent
respectivement une influence positive de l’augmentation de la température au delà de 38 °C
pour l’interaction (pH x T) en (a), de la réduction de la concentration en NaCl au dessous de
4.5% pour l’interaction (pH x [NaCl]) en (b) et de l’effet conjugué de la température allant
de 30°C à 46°C et celui de la concentration en NaCl entre 2.5 et 4.5% pour l’interaction (Tx
[NaCl]) présentée en (c).
Figure 20.
Représentation tridimensionnelle des effets de l’interaction [T°]×[NaCl] sur le pouvoir
acidifiant de la souche LCL .
- 57 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
(b)
(a)
(c)
Figure 21.
Représentations tridimensionnelles des effets des interactions [pH] × [T°](a), [pH]
×[NaCl ] (b)et [T°]×[NaCl ] (c), sur le pouvoir acidifiant de la souche CHT4.
La représentation des coefficients du modèle (figure 19) confirme ces résultats et montre en
particulier un effet linéaire positif (T) exclusivement pour la souche CHT4, par contre l’effet
linéaire négatif de l’augmentation de la concentration en NaCl est enregistré chez les deux
souches.
Une augmentation de la concentration en NaCl dans le milieu réduit le pouvoir acidifiant de la
souche LCL. Cela est dû à une variation de l’osmolarité environnante de la souche, il y a
diffusion de l’eau de l’intérieur vers l’extérieur. Cette perte d’eau va inhiber certains
processus physiologiques comme le transport des nutriments, la biosynthèse des
macromolécules et certaines fonctions biologiques dont le pouvoir acidifiant (Glaasker et al.,
1998).
- 58 -
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Selon (Thomas, 1976), un phénomène de découplage de la production d’énergie et du
métabolisme cellulaire, peut avoir lieu en présence d’une concentration saline élevée dans le
milieu. Dans notre cas, une absence d’énergie nécessaire pour l’activation des réactions
d’acidification peut être à l’ origine de la diminution du pouvoir acidifiant de la souche.
L’impact positif de l’augmentation de la température d’incubation sur le pouvoir acidifiant de
la souche CHT4 peut être expliqué par une activation des systèmes de transport et du
métabolisme des sucres et une stimulation de l’activité des enzymes impliqués dans les voies
de fermentations et de bioconversion des sucres en acide lactique.
De même, un ajustement de la concentration en NaCl dans le milieu au dessous de 4.5%
s’avère indispensable pour améliorer le pouvoir acidifiant de cette souche.
Ces résultats permettent donc de proposer des ajustements des facteurs physico-chimiques
pour ces deux souches dans un but appliqué, en se positionnant dans une voie où on peut
projeter un maximum de production d’acide lactique, acide reconnu pour ses diverses
utilisations comme conservateur, acidulant ou additif alimentaire dans de nombreux produits
grâce à son léger gout acide qui ne masque pas les flaveurs naturelles aromatiques, et en
fromagerie, l’acide lactique est utilisé pour régler le pH du lait avant l’emprésurage.
- 59 -
CONCLUSION
ET
PERSPECTIVES
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Ce travail se proposait de modéliser les effets des interactions conjuguées de trois facteurs
physicochimiques (température, pH et concentration en NaCl) sur la croissance plus
particulièrement les paramètres cinétiques de croissance (densité cellulaire maximale, taux
maximum de croissance et temps de latence) ainsi que sur des caractères à intérêt
technologique (le pouvoir protéolytique et acidifiant) de deux souches de bactéries lactiques
appartenant à la collection du laboratoire de biologie des microorganismes et biotechnologie
(LBMB) de l’université d’Oran Es-senia, il s’agit de Lactococcus lactis LCL et Enterococcus
faecium CHT4.
Une étude de la cinétique de croissance des deux souches sur lait a tout d’abord été menée.
Les profils cinétiques montrent une meilleure aptitude de la croissance sur lait de la souche
LCL par rapport à la souche CHT4.
Par la suite nous avons étudié l’effet des facteurs physicochimiques sur les paramètres
cinétiques de croissance et les activités protéolytique et acidifiante mesurées en fin de
croissance des deux souches (après 92h d’incubation) par le bais d’un plan d’expériences à 17
essais il s’agit d’un plan composite centré conçu pour 3 facteurs et 5 niveaux.
Les paramètres de croissance ont été estimés à l’aide d’une application MicroFit© version 1.0
selon le modèle de Baranyi et les effets des facteurs physicochimiques sur toutes les réponses
étudiées ont été évalués au moyen des surfaces de réponses générées par une seconde
application Statistica® version 5.0.
Une analyse matricielle a été réalisée pour chaque réponse afin d’estimer les coefficients du
modèle, ces derniers permettent d’aboutir à l’équation donnant la réponse en fonction des
trois facteurs étudiés. Les modèles établis permettent de plus de déterminer pour chaque
réponse les facteurs les plus influents.
Les résultats acquis dans ce travail montrent que la densité cellulaire finale des deux souches
est affectée positivement par un terme linéaire de la température, son maximum a été détecté
au voisinage de 46°C et par l’interaction conjuguée de la température au delà de 38°C et du
NaCl aux faibles concentrations. Le taux de croissance des deux souches est affecté par
l’interaction conjuguée [NaCl-pH] ; concernant la souche LCL, les effets de la concentration
en chlorure de sodium du milieu et du pH se manifestent de façon similaire sur le taux de
croissance par contre pour la souche CHT4 l’effet NaCl est plus prononcé. Le temps de
- 60 -
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
latence des deux souches est réduit au minimum lorsqu’il s’agit de l’effet conjugué de la
température au delà de 30°C et celui de NaCl aux faibles concentrations. Le pouvoir
protéolytique de la souche LCL est affecté en particulier par la température quelle que soit la
valeur des deux autres facteurs dans le milieu, celui de la souche CHT4 par un terme linéaire
du pH et par l’interaction conjuguée de la température au voisinage de 30°C et une
concentration de NaCl dans le milieu aux alentours de 5%.
Une réduction de la concentration saline dans le milieu semble avoir un rôle important dans
l’activation du pouvoir acidifiant des deux souches, pour la souche CHT4, une influence
positive de l’augmentation de la température au delà de 38 °C et de l’effet conjugué de la
température allant de 30°C à 46°C et celui de la concentration en NaCl entre 2.5 et 4.5%,
s’avèrent de plus indispensable pour améliorer son degré d’acidification du milieu.
Enfin, dans ce travail qui est une approche à la modélisation on a essayé d’apporter de
nouvelles approches dans la compréhension des réponses mesurées chez les deux souches visà-vis des facteurs physicochimiques étudiés et de proposer des ajustements de ces derniers
pour lesquelles lors d’une application des deux souches à l’échelle industrielle, ces dernières
présentent des meilleures aptitudes de croissance et de production.
Néanmoins, il faudra réaliser plusieurs études pour essayer d’élucider des nombreuses
questions. Ainsi, nous allons proposer quelques perspectives qui seraient intéressantes de
mener pour compléter ces travaux.
Il serait intéressant de valider et de développer des modèles qui permettraient d’étudier l’effet
d’autres facteurs affectant la croissance des deux souches, par exemple, l’effet de l’oxygène
ou l’activité de l’eau, ou bien étudier les effets des facteurs physicochimiques sur d’autres
activités des deux souches tels que la production des amines biogènes ou le potentiel redox
(paramètre peu étudié) et dont on essaye actuellement de proposer des ajustement des facteurs
physico-chimiques pour lesquelles les souches de bactéries lactiques expriment dans le lait
des propriétés réductrices dont l’impact semble positif. En effet, un potentiel redox faible ou
même négatif pouvait induire dans des fromages tels que le cheddar des qualités sensorielles
plus stables et plus appréciées.
- 61 -
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RESUME
La modélisation de l’influence de trois facteurs physicochimiques T°, pH et [NaCl] sur les paramètres
cinétiques de croissance (Nmax), (µmax) et (T-lag) ainsi que sur le pouvoir protéolytique et acidifiant de deux
souches de bactéries lactiques Lactococcus lactis (LCL) et Enterococcus faecium (CHT4) a été étudiée, lors
de leur culture sur milieu lait.
L'étude de la croissance des deux souches a été réalisée dans une gamme de valeurs (Température de 16 à
44°C, le pH de 5,4 à 7 et la concentration en NaCl de 2 à 4% et de 2 à 6% respectivement pour la souche
LCL et CHT4) et le recueil des données a été effectué selon un plan centré composite (3 facteurs, 5 niveaux)
de 17 essais.
Les résultats obtenus montrent que la densité cellulaire finale des deux souches est affectée positivement par
l’augmentation de la température et par son interaction avec le NaCl aux faibles concentrations. Le taux de
croissance des deux souches est affecté par l’interaction conjuguée [NaCl-pH], avec un effet NaCl plus
prononcé chez la souche CHT4. Le temps de latence des deux souches est réduit au minimum lorsqu’il
s’agit de l’effet conjugué de la température au delà de 30°C et celui du NaCl aux faibles concentrations. Le
pouvoir protéolytique de la souche LCL est affecté en particulier par la température, celui de la souche
CHT4 par un terme linéaire pH et par l’interaction conjuguée de la température au voisinage de 30°C et une
concentration de NaCl dans le milieu aux alentours de 5%. Le pouvoir acidifiant des deux souches est
affecté positivement par la réduction de la concentration saline dans le milieu, pour la souche CHT4, une
augmentation de la température et son interaction avec une concentration en NaCl entre 2.5 et 4.5%,
s’avèrent de plus indispensable pour améliorer son degré d’acidification du milieu.
ABSTRACT
Modelling the influence of three physicochemical factors T °, pH and [NaCl] on the kinetics of growth
(Nmax), (µmax) and (T-lag) and on the proteolytic and acidifying power of two strains of lactic acid bacteria
Lactococcus lactis (LCL) and Enterococcus faecium (CHT4) were studied when cultured on medium milk.
The study of the growth of both strains was performed in a range of values (temperature 16 to 44 °C, pH 5.4
to 7 and the NaCl concentration from 2 to 4% and from 2% to 6% respectively for the strains LCL and
CHT4) and data collection was done under a central composite design (3 factors, 5 levels) of 17 trials.
The results obtained show that the final cell density of the two strains is positively affected by increased
temperature and its interaction with NaCl at low concentrations. The rate of growth of both strains is
affected by the combined interaction [NaCl-pH] with an effect of NaCl more pronounced in strain CHT4.
The latency of the two strains is minimized when the combined effect of temperature beyond 30 °C and that
of NaCl at low concentrations. Proteolytic power of the LCL strain is particularly affected by temperature,
the strain CHT4 by a linear term pH and by the combined interaction of temperature around 30 ° C and
NaCl concentration in the medium around 5%. The acidifying power of the two strains is affected positively
by reducing the salt concentration in the ambient, for strain CHT4, an increase of temperature and its
interaction with NaCl concentration between 2.5 and 4.5%, are proving increasingly essential to improve
the degree of acidification.
‫ملخص‬
‫ درجة الحموضة و تركيز كلوريد‬, ‫ درجة الحرارة‬: ‫تقترح ھذه الدراسة انجاز نماذج قادرة على توضيح مدى تأثير ثالث عوامل فيزيوكيميائية‬
LCL Lactococcus lactis ‫التحلل البروتيني و درجة تحميض الوسط لساللتين من البكتيريا اللبنية‬,‫الصوديوم على معايير حركية النمو‬
. -‫عند زرعھا في وسط – حليب منزوع الدسم‬,CHT4 Enterococcus faecium ‫و‬
‫ وتركيز كلوريد‬7-5,4 ‫ درجة الحموضة‬، ‫ درجة مئوية‬44-16 ‫تمت دراسة نمو الساللتين في مجاالت معينة من القيم )درجة الحرارة‬
‫ ( وجمع البيانات بموجب مخطط تجريبي مركب‬CHT4‫ و‬LCL ‫ على التوالي للساللتين‬6 % ‫ الى‬2% ‫ ومن‬4% ‫ الى‬2% ‫الصوديوم من‬
.‫ محاولة‬17 ‫ مستويات( من‬5 ، ‫عوامل‬3)
‫النتائج المحصل عليھا توضح أن ھناك تأثير إيجابي الرتفاع درجة الحرارة و تفاعلھا مع تراكيز منخفضة من كلوريد الصوديوم على الكثافة‬
‫ أن معدل نمو كل من الساللتين يتأثر بالتفاعل المشترك لدرجة حموضة الوسط مع تركيز كلوريد الصوديوم و يتضح‬.‫النھائية للساللتين‬
‫ درجة‬30 ‫ و أنه يمكن تقليص زمن استتار الساللتين بالتأثير المشترك لدرجة الحرارة عندما تتجاوز‬CHT4‫أكثرتأثير ھذا األخير لدى الساللة‬