Fixation des tissus: notions et rappels Jean

Fixation des tissus: notions et rappels
Jean-Pierre Brion
Laboratoire d’Histologie et de Neuropathologie
Université libre de Bruxelles
B-1070 Bruxelles, Belgique
Emmanuel Gilissen
Musée Royal de l’Afrique Centrale
Département de Zoologie Africaine
Gestion des collections et des données biologiques
Leuvensesteenweg 13
B-3080 Tervuren, Belgique
Email: [email protected]
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Avant-propos
Les notes qui suivent ont été rédigées afin d’accompagner une présentation réalisée par Jean-Pierre
Brion dans le cadre des séminaires du Laboratoire d’Histologie et de Neuropathologie de l’ Université
libre de Bruxelles, ces notes reprennent et commentent l’ensemble des diapositives de cette
présentation.
Des annexes ont été ajoutées au fil de ces notes. Elles n’ont d’autre prétention que de fournir le
background nécessaire à une compréhension complète de la partie de l’exposé qui les suit, sans
prérequis supposés. La matière de ces annexes fait partie de la culture « biologique » générale et a été
glanée dans diverses sources.
Seule l’annexe concernant la technique immunocytochimique (ou immunohistochimique) consiste en
diapositives reprises du cours d’histologie dispensé en seconde année de sciences de la santé (médecins,
dentistes et bioingénieurs) à l’Université libre de Bruxelles.
La thématique de la fixation des tissus s’adresse autant aux conservateurs de collections biologiques
qu’à ceux qui désirent utiliser les diverses techniques histologiques. Même si le lecteur de ces notes ne
compte pas réaliser de travaux histologiques dans l’immédiat, les différents aspects de ce qu’est une
fixation s’appréhendent au niveau cellulaire. Il sera donc beaucoup fait appel dans ces notes à des
observations réalisées lors de travaux d’histologie.
2
Dia 1 : titre
Dia 2 : Fixation: définition
Il s’agit d’un processus physique ou d’une réaction chimique qui produit les effets suivants :
•
Insolubilisation des composants cellulaires
•
Préservation de leur localisation spatiale
La fixation produit donc une image « instantanée » d’un tissu biologique (« tissu » dans la suite de ces
notes) ou d’une cellule, et ce du point de vue structural.
Dès lors, si un tissu ou des cellules, dans le cas de cellules en culture, sont plongés dans un fixateur, que
se passe-t-il ?
Dia 3 : Constituants de la cellule en terme de macromolécules responsables de la « structure » des
tissus :
•
Lipoprotéines (membranes cellulaires...)
•
Lipides et hydrates de carbone (cytoplasme, organelles)
•
Acides nucléiques (noyau)
•
Protéines fibrillaires du cystosquelette
La matrice extracellulaire est constituée de
•
Protéines fibrillaires extracellulaires
•
Glycosaminoglycanes extracellulaires
3
Annexe: la structure générale des protéines
Un polypeptide est une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. On parle de
polypeptide lorsque la chaîne contient entre 10 et 100 acides aminés. Au-dessus de 100 acides aminés
on parle généralement de protéine. La structure primaire, ou séquence, d'une protéine correspond à la
succession linéaire des acides aminés la constituant sans référence à une configuration spatiale.
La structure secondaire décrit le repliement local de la chaîne principale d'une protéine. L'hélice ou
chaîne alpha est une des deux grandes structures secondaires (avec les feuillets bêta). Elle est formée
par l'enroulement régulier d'une chaîne polypeptidique sur elle-même.
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Les feuillets bêta ou feuillets bêta plissés sont des structures secondaires qui s'observent dans des
portions de protéines. Ils se matérialisent sous forme d'un pli successif avec différentes ondulations de
la chaîne polypeptidique (comme un accordéon). C'est une structure plus lâche et plus plane que l'hélice
alpha. Un feuillet bêta donnera lieu à des interactions d'acides aminés d'une même chaîne
polypeptidique qui sera repliée sur elle-même. Les groupements CO et NH forment des liaisons
hydrogènes (liaison plus lâche que dans les hélices alpha).
La structure tertiaire d'une protéine correspond au repliement de la chaîne polypeptidique dans
l'espace. On parle plus couramment de structure tridimensionnelle (3D). Les liaisons hydrogènes
interviennent également dans la mise en place de la structure tertiaire. La structure tridimensionnelle
d'une protéine est intimement liée à sa fonction: lorsque cette structure est cassée par l'emploi d'agents
dénaturants, la protéine perd sa fonction: elle est dénaturée.
La figure ci-dessous représente la structure 3D de la myoglobine, les hélices alpha forment une structure
3D complexe. Cette protéine fut la première dont la structure a été identifiée par cristallographie aux
rayons X en1958. Cette protéine est le transporteur intracellulaire principal de l'oxygène dans les tissus
musculaires et stocke l'oxygène dans les muscles.
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On parlera de structure ou de conformation. La structure tertiaire définit le site enzymatique, et donc la
fonction de la protéine.
Dénaturer une protéine cause un changement de fonction (perte) et un changement de solubilité. C’est
ce qui se passe lorsqu’on cuit un œuf ; frais, on peut dissoudre le blanc et le jaune, cuit, le contenu de
l’œuf est insoluble. Cuire un œuf, c’est dénaturer les macromolécules (les protéines), les figer en leur
faisant perdre leur conformation. L’activité enzymatique est perdue et les protéines deviennent
insolubles.
6
Dia 4 : Fixation, morphologie et colorations1
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Bloom 1.14. Fixateurs alcools et acides (Bouin, zenker acetic): blocs chromatine, disparition mitochondries.
« neutral formalin » réfère à une solution tamponnée car le formol est acide.
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Les modes de fixation (ex : « frozen-dried ») ou fixateurs (formol, bouin, …) sont indiqués à la première
ligne des légendes sous les figures. La seconde ligne précise les types de coloration.
Par exemple : fixation au Zenker-formol avec une coloration Mallory-azan. La troisième série présente
des cellules fixées de façons diverses mais toutes colorées à l’hématoxyline-éosine (H+E).
On constate que l’image « instantanée » d’une cellule varie de manière considérable en fonction du
mode de fixation et de la coloration choisis.
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Dia 5 : Méthodes de fixation physiques2
•
Chaleur
–
Four à microondes
•
•
Seul ou avec fixateur
Congélation
–
Cryoprotection (DMSO, glycérol, sucrose) : il s’agit ici de bains pour empêcher la
formation de cristaux de glace qui font éclater les cellules
•
isopentane ( Fp: - 170°C), N2 (Ls: -196°C)
Il faut noter ici que l’azote liquide (N2) est plus froid que l’isopentane mais congèlera moins vite les
tissus. Il est cependant beaucoup utilisé car il est moins cher que l’isopentane.
L’isopentane congèle les tissus de manière presque instantanée, sa conductivité thermique est
excellente, le refroidissement du tissu se fait donc beaucoup plus rapidement
Plus la conductivité thermique est rapide, plus la vitesse de refroidissement est grande, prenant ainsi
« de vitesse » (et donc évitant) la formation de cristaux de glace dans les cellules
La conductivité thermique est un facteur très important. Le refroidissement doit se faire plus vite que la
formation de cristaux de glace car ceux-ci détruisent la structure cellulaire. De la viande placée dans un
congélateur à -20°C mettra beaucoup de temps à congeler et, au microscope, présentera l’aspect de
l’image de gauche de la dia 6 (voir plus loin). Dans l’isopentane, le refroidissement serait plus rapide.
Que dire alors de la congélation de corps humains dans l’azote et de la réanimation cellulaire ? Il n’est
pas certain que les cellules des corps ainsi congelés ne soient pas remplis de cristaux de glace.
Un excellent conducteur thermique est un tube de cuivre refroidit dans l’azote liquide. Un morceau de
tissu, une fois adapté sur ce tube de cuivre, est quasi instantanément congelé, les cristaux de glace n’ont
pas le temps de se former grâce à la remarquable conductivité thermique du cuivre. On utilise ce
procédé pour réaliser des coupes destinées à la microscopie électronique à transmission (TEM). Un
challenge technique reste bien sûr la conservation de la chaîne du froid, et ce jusqu’à la platine du
microscope.
2
Fp: freezing point
Ls: liquid state
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La formation de cristaux de glace et leur effet délétère peuvent cependant être utilisés de manière
positive comme méthode pour créer des homogénats de bactéries. La création d’homogénats peut être
utile pour isoler un composant donné, comme une protéine spécifique. Comme la formation de cristaux
de glace fait éclater la paroi des cellules, on peut concevoir une procédure par laquelle on gèle, puis
décongèle, puis gèle, puis décongèle jusqu’à ce que la cellule bactérienne éclate et libère son contenu.
•
Freeze-drying
Ce procédé consiste en une congélation à faible pression atmosphérique, ainsi l’eau s’échappe
du tissu, il s’agit donc d’une congélation avec déshydratation sous vide.
Il faut noter que ce procédé est équivalent à celui, classique, utilisé pour l’enrobage des tissus dans la
paraffine. Pour ce faire, on passe le tissu dans des bains d’alcool (à 70%, 80%, 90% puis 100%) puis dans
un solvant organique (toluène) pour en enlever l’eau du tissu. La différence (et le problème potentiel)
est que les lipides disparaissent également car il sont solubles dans le toluène. On passe par des bains
d’alcool car l’alcool, et pas l’eau, est miscible avec le toluène (solvant organique). A son tour, c’est le
toluène qui est miscible avec la paraffine dont on enrobera le tissu afin de le sectionner.
Par « freeze-drying », on enlève l’eau et on conditionne le tissu pour réaliser des coupes histologiques
sans perdre de composants tels que les lipides.
•
Freeze substitution
Enrobage d’un tissu sous vide et congélation
10
Annexe : L’eau est d’une importance primordiale pour maintenir les tissus vivants et, récemment, est
devenu un élément qui permet leur visualisation
L’eau est le principal constituant du corps humain. La quantité moyenne d’eau contenue dans un
organisme adulte est de 65 %, ce qui correspond à environ 45 litres d’eau pour une personne de 70
kilogrammes (http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/doseau/decouv/usages/eauOrga.html).
Hormis son importance physiologique, signalons que la présence d’eau dans l’organisme a permis le
développement de nouvelles technologies d’imagerie médicale, comme l’imagerie par résonance
magnétique (IRM). Les examens sont réalisés par un appareil qui produit un champ magnétique grâce à
un aimant très puissant. L’illustration qui suit nous montre la machine, essentiellement constituée d’un
aimant, et les images générées par la résonance magnétique nucléaire.
L’imagerie par résonance magnétique est l’imagerie de l’eau présente dans le corps, rien de plus, rien de
moins.
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Dia 6 : Congélation: artefacts en l’absence de cryoprotection
Les images ci-dessous représentent des portions coupes de cortex humain (postmortem) colorés à
l’hématoxyline-éosine (H&E)
Sur l’image de gauche, le tissu cortical a été congelé à l’azote liquide (N2), conservé à -80°C, et coupé au
cryostat. Il n’a toutefois pas fait l’objet d’une cryoprotection (par exemple, par des bains de sucrose) afin
d’empêcher la formation de cristaux de glace. Ces derniers se sont donc formés et ont fait éclater les
cellules, ce qui a produit les nombreuses lacunes visibles dans le tissu.
Sur l’image de droite, selon une procédure classique, le tissu cortical a été fixé au formol 10%, inclus
dans la paraffine, coupé au microtome, puis coloré (H&E)
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Dia 7 : Congélation : avantages
Dans l’exemple ci-dessous, on voit une coupe réalisée au cryostat après fixation du tissu au
formaldéhyde 4% suivie de bains de sucrose. On a pas utilisé d’enrobage de paraffine. Après
cryoprotection (sucrose), le tissu a été coupé à congélation (cryostat).
Mise en évidence de l’activité de l’acétylcholinestérase (AChE) dans le cerveau du rat adulte (au-dessus
et ci-dessus à gauche) et dans le cerveau humain (à droite)
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La fixation au formaldéhyde suivie de la congélation avec cryoprotection puis de la coupe au cryostat
permet l’histochimie et donc par exemple la mise en évidence de l’activité enzymatique des neurones.
Dans cet exemple, on met en évidence l’activité de l’acétylcholinestérase (AChE), qui hydrolyse
l’acétylcholine, tout en conservant la morphologie. La détection de l’activité enzymatique serait en effet
dénaturée par la paraffine.
Dia 8 : Méthodes de fixation chimiques
•
Fixateurs coagulants
La coagulation est ce qui se passe par exemple lors de la cuisson de l’œuf. Il s’agit d’un processus qui
peut s’assimiler à la dénaturation des protéines. Il s’agit donc d’une modification de leur
conformation mais pas d’une réaction chimique.
•
–
acétone, éthanol, méthanol, acide trichloroacétique (TCA)
–
chlorure de mercure(II) ou chlorure mercurique (HgCl2) (qui entre dans la composition
du liquide de Bouin), acide picrique, acide acétique, trioxyde de chrome (CrO3)
Fixateurs non-coagulants
Dans ce cas la fixation s’opère par réaction chimique, en l’occurrence par la création de liaisons
covalentes entre les protéines
–
tétroxyde d'osmium (OsO4), utilisé en microscopie électronique à transmission comme
second fixateur, il fixe les lipides
–
Formaldéhyde, glutaraldéhyde (utilisé en microscopie électronique à transmission
comme premier fixateur)
Il est souvent utile de travailler avec un détergent (par exemple le Triton) qui solubilise en partie les
lipides membranaires, de manière à faciliter la pénétration intracellulaire des fixateurs ou des anticorps
(dans le cas de l’immunohistochimie, voir plus loin). Ceci est d’autant plus vrai si on coupe au cryostat
car on est pas passé par les bains d’alcool nécessaires à l’inclusion dans la paraffine et où, dans ce cas,
les membranes ont été traitées.
L’usage d’un détergent est d’autant plus utile si on coupe au vibratome à t° ambiante, car le tissu a
seulement été fixé à 4°C au paraformaldéhyde sans autre traitement. Il faut un peu de détergent pour
une bonne pénétration des anticorps (on coupe à 20-50 microns).
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Pour l’anecdote, le technicien et manager des collections de mammifères du MRAC converse les
morceaux de savon usagés pour les mettre dans les récipients avec le fixateur et le spécimen à fixer.
Dans le cas spécifique de l’usage du formol, le savon (détergent) s’attaque en effet aux lipides
membranaires, facilitant la pénétration intracellulaire du fixateur et donc la réalisation de liaisons
covalentes entre les protéines ou « réaction chimique de fixation ».
Dia 9 : Fixateurs coagulants: alcools, acétone
•
Dénaturation des protéines
–
•
↓Liaisons hydrogènes: ↓structure tertiaire
Extraction des lipides
L’acétone, comme le toluène, solubilise les lipides, l’acétone est cependant miscible avec l’eau et sera
donc utilisé comme fixateur, pas le toluène
•
Acides nucléiques et hydrates de carbone (glucides, glycogène) préservés
•
Faible fixation du cytoplasme (organelles), et ceci à la différence des fixateurs comme le formol
ou le glutaraldéhyde
•
Pénétration par la paraffine : +++
–
Coupe plus facile
15
Dia 10 : Exemple de fixation à l’alcool3
Il s’agit ici d’un fibroblaste vu en
contraste de phase (donc non fixé, la cellule est vivante)
•
et en fixation par le méthanol
La fixation a bien préservé la morphologie générale mais pas les organelles. Les fibroblastes sont des
cellules présentes dans le tissu conjonctif; également appelées cellule de soutien. Ce sont notamment
des cellules résidentes du derme et qui en assurent la cohérence et la souplesse.
3
Bloom fig 1.7
A: lipid droplets and mitochondria
B: + coloration. Précipitation protéines cytoplasmiques et nucléaires. Disparition des organelles
16
Dia 11 : Fixateurs non-coagulants
•
Cross-linking des protéines
Il s’agit bien ici d’une réaction chimique par la création de liaisons covalentes
•
Préservation des lipides et des acides nucléiques
•
Préservation partielle des hydrates de carbone (ex glycogène)
Comme le glycogène est soluble dans l'eau, une bonne partie en est solubilisée dans les solutions
aqueuses, y compris dans la solution de formol
•
Bonne fixation du cytoplasme (organelles)
•
Pénétration par la paraffine: ++
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Dia 12 : Fixateurs coagulants ou non coagulants ? Le formol et l’extraction4 du glycogène.
L’exemple suivant montre des coupes de tissu hépatique (foie) coloré au rouge carmin afin de mettre en
évidence le glycogène.
Le glycogène est un glucide complexe polymère du glucose, utilisé par les animaux pour stocker de
l'énergie, et qui permet de libérer rapidement du glucose, principalement dans le foie et dans les
cellules musculaires au même titre que l'amidon chez les végétaux.
A gauche, la coloration a été faite sur du tissu fixé au formol en solution aqueuse (40% formaldéhyde ou
4% paraformaldéhyde, en solution aqueuse). Solubilisé, le glycogène a disparu.
A droite, la coloration a été faite sur du tissu fixé au methacarn (alcool, acide acétique, acétone). Ce
fixateur est coagulant, le glycogène ne s’y est pas solubilisé et apparaît en rouge vif.
4
une extraction correspond à une solubilisation sur une certaine durée
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Dia 13 : Fixateurs coagulants ou non coagulants ? L’alcool et l’extraction des lipides5
Les images ci-dessous montrent du tissu adipeux, fixé à la formaldéhyde 4% (w/v)6
A gauche, on observe une section de coupe réalisée dans une préparation classique après passage dans
les bains d’alcool, de toluène et l’inclusion dans la paraffine. Les solvants organiques (alcool, toluène)
ont solubilisé les lipides.
A droite7, la coupe a été réalisée à congélation (cryostat), sans passage par l’alcool et le toluène, les
lipides sont fixés et la gouttelette lipidique (T) des adipocytes est bien visible.
5
Fig 4.11b, kerr
6
“w/v” signifie “weight/volume”, soit dans ce cas 4 gr/100 ml
7
T = triglycéride ; v = veinule
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Dia 14 : Modifications physiques des tissus à l’issue de la fixation
•
Durcissement
•
Rétrécissement
-
formol/paraffine: Vol final=0.6xVol initial
c’est véritablement l’inclusion finale à la paraffine qui rétrécit le tissu
-
Gonflement
-
Alcools
Ceci persiste si on n’utilise pas la paraffine.
Dia 15 : La vitesse de pénétration, un paramètre analogue à la conductivité thermique
Il faut bien distinguer entre « vitesse de pénétration » et « rapidité de la fixation » qui sont deux
propriétés différentes d’un fixateur.
La rapidité de fixation concerne en effet la réaction chimique de fixation, due aux aldéhydes à l’origine
du cross linking des protéines, avec conservation des structures.
•
Fixateur à pénétration rapide (ex : formol)
–
•
Fixateur à pénétration lente (ex : glutaraldéhyde)
–
•
8
Bloc < 5mm8: 24h
Bloc < 2mm: 24h
Rapidité de la fixation (dans ce cas par exemple, le glutaraldéhyde est meilleur que le formol)
5 mm de côté
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Annexe: la technique immunocytochimique
Pour illustrer cette technique, nous allons d’abord « marquer » les neurones d’un morceau de tissu
nerveux.
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Nous allons maintenant « marquer » les astrocytes (cellules gliales) de ce même morceau de tissu
nerveux.
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Dia 16 : Fixation par immersion
L’illustration ci-dessous montre les coupes parasagittales de cerveaux de rats de 10 jours, fixés au
methacarn (alcool, acide acétique, acétone)
On illustre ici un artefact, dû au fait que l’activité enzymatique post mortem est plus rapide que la
fixation au methacarn.
L’activité enzymatique postmortem est due aux protéases, on l’observe dans le cas de l’autolyse
postmortem des tissus, les enzymes protéases étant encore actifs.
Sur les coupes de gauche, on a réalisé un marquage immunohistochimique qui reconnaît les protéines
Tau du cytosquelette, qu’elles soient ou non déphosphorylées par la phosphatase (enzyme actif). Il s’agit
donc d’un marquage « anti-Tau total ».
Sur les coupes de droite, on a réalisé un marquage immunohistochimique qui, parmi les protéines Tau
du cytosquelette, reconnaît uniquement celles qui sont phosphorylées. Il s’agit donc d’un marquage
« anti-Tau phosphorylé ».
L’anticorps utilisé pour ce second marquage (coupes de droite) reconnaît un épitope (une structure
moléculaire) phosphorylé. On observe que le centre des coupes de droite est non-marqué, donc non
reconnu par l’anticorps. La phosphatase, l’enzyme actif qui enlève le groupe phosphate des protéines
Tau, a en effet continué post-mortem à déphosphoryler les protéines avant que le méthacarn n’ait
pénétré suffisamment profond dans la structure et n’ait pu dénaturer l’activité enzymatique. Sur le
pourtour de la coupe, le méthacarn a par contre pu pénétrer suffisamment vite pour faire cesser
l’activité enzymatique de la phosphatase.
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On a donc au centre de la coupe des protéines déphosphorylées « artéfactuellement ».
On observe un effet analogue avec des cerveaux de petits animaux (comme des insectivores) postfixés
dans l’alcool, ce fixateur a pénétré le pourtour du cerveau mais n’est pas allé suffisamment vite
suffisamment profond, et l’histologie réalisée sur ce matériel conservé plus de deux ans dans l’alcool ne
donne aucun résultat (le centre de la coupe tombe en poussière à cause de la mauvaise fixation).
Dia 17 : Formaldéhyde
Un aldéhyde est un composé organique dont l'un des atomes de carbone primaire (relié au plus à 1
atome de carbone) de la chaîne carbonée porte un groupement carbonyle. Un aldéhyde contient donc la
séquence
Où R représente une chaîne carbonée.
•
Formaldéhyde. Il s’agit de l'aldéhyde le plus simple. Le formaldéhyde « 100% » est un gaz!
(boiling point : -21°C). On l’utilise pour les désinfections (section SPF des animaleries, chaîne de
fabrication des médicaments).
•
Formol: 40% formaldéhyde (w/v) in H20, soit 40 gr / 100 ml. Le formaldéhyde est donc appelé
formol lorsqu'il est en solution aqueuse
Il s’agit ici du formol commercial ou « stock solution ». Il est en solution aqueuse, non tamponnée, ce
qui serait meilleur pour réaliser des coupes histologiques.
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On utilise le formol dilué 10x. La solution finale utilisée pour les fixations est donc du « formol 10% », ce
qui équivaut à de la « formaldéhyde 4% »
•
Paraformaldéhyde: HO(CH2O)nH
Le paraformaldéhyde (n=6-100) (polymère solide) est préparé extemporanément car il est moins stable
que le formaldéhyde. Paraformaldéhyde 4%, soit 4 gr / 100 ml
Dia 18 : Formaldéhyde (suite)
La formaldéhyde en solution aqueuse produit le méthylène hydrate, qui sera la molécule chimiquement
active dans le processus de fixation
Formaldéhyde
méthylène hydrate
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Dia 19 : Formaldéhyde : cross linking
Il s’agit ici de la réaction chimique de fixation par l’interaction des amines (-NH2) des protéines avec le
formaldéhyde (en l’occurrence le méthylène hydrate)
La liaison méthylène se fait entre deux protéines adjacentes
Plus précisément, la liaison se fait avec l’azote (N) des:
-Groupements ε−amine des lysines
Les lysines ont un groupement amine (-NH2) sur une chaîne latérale. « ε » signifie « en position
terminale » sur la chaîne latérale de la lysine.
-Groupements amide (-NH) des liaisons peptidiques. Ce n’est pas un groupement latéral sur un
acide aminé mais bien un groupement entre deux acides aminés, sur la chaîne des acides
aminés.
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Les liaisons avec ces deux groupements (-NH et NH2) sont illustrées ci-dessous
Dans cet exemple, La L-lysine, ou acide 2,6-diaminohexanoïque, est un des 20 acides aminés les plus
courants constituant les protéines.
La glycine, jadis appelée glycocolle ou acide aminoacétique, est un acide α-aminé neutre. C'est le plus
simple des acides aminés (le plus petit).
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Dia 20 : Fixation: extraction
Suivant la qualité du fixateur, les extractions présenteront des différences. Le meilleur fixateur n’est pas
toujours celui qu’il faut utiliser. L’exemple suivant le démontre.
Dans cet exemple, on a encore recours à l’immunohistochimie. L’anti-tubuline est un anticorps contre
les microtubules et anti-Tau est un anticorps contre les protéines Tau du cytosquelette. Il s’agit ici de
cellules en culture qui ont été fixées soit avec le paraformaldéhyde 4% (4% PAF), soit avec le méthanol.
Le méthanol est un coagulant, il ne produit pas de réactions de cross-linking comme le
paraformaldéhyde. Comparé à ce dernier, le méthanol est un mauvais fixateur. Cependant, le
cytosquelette se voit mieux après fixation au méthanol. Une bonne partie du contenu cytosolique a en
effet disparu, a été solubilisée au cours de la procédure (dans le cas des cellules en culture, il s’agit de
lavage, ect…) mais le cytosquelette reste.
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Dia 21 : Paraformaldéhyde
Paraformaldéhyde
méthylène hydrate
La paraformaldéhyde en solution aqueuse produit aussi le méthylène hydrate, molécule active
La fixation est lente
La solubilisation ↑↑à pH neutre (pH 7) et en ↑ la t°
La préparation est extemporanée, elle se dégrade en effet au bout de 2-3 semaines, tandis que le formol
reste stable
4% (w/v) (para)formaldéhyde, soit 4 gr / 100 ml
On solubilise le paraformaldéhyde en poudre dans un tampon phosphate (un mélange aqueux de deux
sels de phosphate pour avoir un pH neutre)
Dia 22 : « Formol » (40% formaldéhyde ou « stock solution »)
Ce fixateur se conserve bien mais il y a quelques problèmes qui apparaissent :
•
Contient polymères HO(CH2O)nH (n=2-8)! Il s’en suit la formation continue et la précipitation de
paraformaldéhyde.
En effet, le formaldéhyde a tendance à se polymériser et à donner du paraformaldéhyde qui forme un
précipité laiteux. On peut inhiber ce processus par le méthanol (10% v/v), soit 10 ml / 100 ml
•
Formation d’acide formique (et ↓pH) (acidification)
On peut inhiber ce processus par des blocs de CaCo3 pour conserver le formol
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Dia 23 : « Formol 10% » (formol dilué 10x)
•
Solution à 10% (v/v) dans H2O, soit 10 ml / 100 ml
–
Traces de méthanol et d’acide formique
–
Préparer au moins un jour à l’avance
•
Solubilisation des polymères HO(CH2O)nH qui précipitent
Paraformaldéhyde
méthylène hydrate
La solution de formol aqueuse est le meilleur fixateur si on envisage l’enrobage à la paraffine pour un
traitement histologique
Dia 24 : Formol « tamponné »
•
Tampon phosphate 0.1M, pH 7.2-7.4
–
formol 10 % (v/v), soit 10 ml / 100 ml
–
4% formaldéhyde (w/v), soit 4 gr / 100 ml
•
Utilisation immédiate possible
•
Osmolarité ↑
Il y a un problème d’osmose car le tissu se gorge de sels Na-phosphate. Il y a aussi le problème de la
cristallisation de ces sels. Le tissus sera donc plus dur une fois enrobé à la paraffine. Par contre, il n’y
aura aucun inconvénient de ce genre si on envisage de coupe le tissu au cryostat ou au vibratome.
Dia 25 : Temps de fixation (formaldéhyde)
•
Réaction LENTE (malgré pénétration rapide). Il s’agit de la réaction chimique de fixation, donc de
la formation des cross linking au niveau des groupements amine/amide
–
Par immersion: 10x vol du specimen
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–
1 à 2 semaines à t° ambiante pour fixation complète
–
Si >:
•
Durcissement excessif (« surfixation »)
•
↓ certaines colorations
•
Pigment formolique (haematin) (à pH acide)
L’hémoglobine réagit avec le formol et produit une pigmentation à l’haematine, qui est donc un
artefact.
Si on veut conserver certaines activités enzymatiques, comme celle de l’acetylcholinesterase par
exemple, et donc effectuer de l’histochimie, on laissera le spécimen à fixer de 12 à 24h à 4°C sinon ces
enzymes sont dénaturés. On arrête la réaction de fixation avant la dénaturation complète de ces
enzymes.
Dia 26 : Glutaraldéhyde
Le glutaraldéhyde se polymérise en solution aqueuse
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Dia 27 : Glutaraldéhyde (suite)
Le glutaraldéhyde est indiqué ci-dessous par R-CHO
H2N est un groupement amine
R’ est un acide aminé quelconque
H2N-R’ représente donc une protéine
On constate la formation d’une double liaison par cross linking entre deux protéines adjacentes.
Dia 28 : Cellules chromafines (Fig 16.9b, kerr)
Coupe semifine, le glutaraldéhyde est utilisé pour la microscopie électronique
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Dia 29 : Pour la microscopie électronique, la qualité de la fixation est très importante
Les images ci-dessous illustrent du cortex cérébral humain fixé postmortem. Entre le paraformaldéhyde
et le glutaraldéhyde, la différence de qualité morphologique est considérable
4% (w/v) paraformaldéhyde
4% (v/v) glutaraldéhyde
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Dia 30 : Temps de fixation (glutaraldéhyde)
•
Fixation RAPIDE (pénétration lente)
–
Complète après quelques heures
C’est donc bien l’inverse du formaldéhyde, le formol 10% requiert en effet quelque 24h
Avec le glutaraldéhyde, quelques heures seulement sont requises avant de passer au tampon
phosphate. Les échantillons traités au glutaraldéhyde sont petits, de l’ordre de 1 mm3, et destinés à la
microscopie électronique.
Ce produit est dangereux, la molécule est très réactive chimiquement (formation des cross linking)
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