Opérateur lac

Cours
Module L5-BH-05
Régulation de l’expression des génomes
Mercredi de 13h30 à 15h30 & Jeudi de 8h00 à 10h00 (sem. 0 à 5/6)
Université d’Orléans – UFR Sciences & Centre de Biophysique Moléculaire UPR4301
S. Bourgerie
[email protected]
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PLAN des COURS n°1 & n°2
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1- Introduction
1.1 pourquoi y-a-t-il régulation?
1.2 niveaux de régulation
1.3 quelques définitions
1.4 notion d’opéron
2- Régulation de la transcription
2.1 stratégies de contrôle de l’initiation de la transcription
2.2 contrôles positif-négatif
2.3 rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
3- Opéron lactose
3.1 organisation générale
3.2 phénomène d’induction - inducteur
3.3 lacZ - lacY - lacA
3.4 mutants de l’opéron
3.5 régulations
3.5.1 négative (répresseur)
3.5.1.1 expérience Pajamo
3.5.1.2 rôle du répresseur
3.5.1.3 structure du répresseur
3.5.1.4 opérateur
3.5.2 positive : répression catabolique
3.5.2.1 diauxie
3.5.2.2 AMPc
3.5.2.3 scénarios
3.5.2.4 structure-fonction CRP
3.5.2.5 opérateurs
3.6 récapitulatif
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Introduction
Pourquoi y-a-t-il régulation de l’expression des gènes ?
Pour répondre aux conditions changeantes
de l’environnement immédiat
Sept mécanismes susceptibles de modifier la concentration à l’équilibre d’une protéine ;
Sites possibles de régulation :
1- synthèse du transcrit primaire
2- maturation post-transcriptionnelle de l’ARNm
3- dégradation de l’ARNm
4- synthèse protéique
5- modifications post-traductionnelles
6- ciblage et transport des protéines
7- dégradation des protéines
*
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1
2
3
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5
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Quelques définitions
Les séquences codant des produits agissant en trans
Les séquences agissant en cis
Un locus agit en cis sur un autre locus s’il est sur la même molécule d’ADN ;
L’opérateur est un élément d’activation en cis car il fonctionne uniquement
s’il est fixé sur le gène dont il contrôle l’expression.
Un locus agit en trans s’il peut contrôler un autre locus, même à partir d’une molécule
d’ADN différente.
Le gène du répresseur du lactose (lacI) agit en trans car il peut réguler l’expression
de l’opéron lactose même s’il est enlevé du génome d’E. coli et placé sur un plasmide.
élément régulateur en cis : site pour une protéine de liaison à l’ADN, situé le plus souvent,
en amont du gène régulé.
élément agissant en trans : protéine elle-même, qui diffuse dans la cellule depuis
son site de synthèse jusqu’à son site de liaison sur l’ADN.
*
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Quelques définitions (2)
Gène structural
gène qui code une protéine (ou un ARN)
Gène régulateur
gène structural qui code une protéine impliquée dans la régulation de l’expression d’autres gènes.
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Quelques définitions (3)
OPERON
Gènes structuraux organisés en groupes contenant des gènes codant des protéines
dont les fonctions sont apparentées
(gènes co-transcrits pour former une molécule d’ARN polycistronique)
À côté de ces gènes, on retrouve :
- des séquences adjacentes requises
pour la transcription (promoteurs, opérateurs)
- des séquences impliquées dans la régulation.
Exemple :
*
Les gènes des enzymes successives
d’une voie métabolique
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Quelques rappels sur l’initiation de la transcription chez les procaryotes
« Idées fortes »
¾ l’ARN polymérase copie en ARN un brin du duplex d’ADN
¾ une unité de transcription est une séquence d’ADN transcrite en un ARN unique,
qui débute au niveau du promoteur et se termine au terminateur
¾ la transcription a lieu dans une « bulle », à l’intérieur de laquelle l’ARN est synthétisé par appariement des bases
avec un brin d’ADN de la région transitoirement déroulée
¾ au fur et à mesure de la progression de la bulle, le duplex d’ADN se reforme après son passage.
¾ l’ARN polymérase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester qui résulte d’une attaque du groupement 3’-OH
du dernier nucléotide de la chaîne sur le groupement 5-triphosphate du nucléotide entrant, ce qui s’accompagne
d’une libération de pyrophosphate
¾ la transcription comprend 4 étapes qui impliquent différents types d’interactions entre l’ARN polymérase et l’ADN :
1- reconnaissance de la matrice
2- initiation
3- élongation
4- terminaison
¾ le facteur σ contrôle la liaison à l’ADN de l’ARN polymérase.
¾ la reconnaissance du promoteur dépend de séquences consensus.
¾ il existe deux modes principaux de terminaison.
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Promoteurs bactériens : organisation
ARN polymérase
β’
155613
β
150618
σ
70263
α
36512
ω
10105
Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA.
*
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ARN polymérase : organisation - structure
*
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régulation de la transcription
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST NEGATIF :
Répresseur : protéine qui empêche l’expression d’un gène.
Opérateur : site cible de la protéine répresseur.
Lorsque la protéine répresseur se fixe à l’opérateur, l’ARN polymérase
ne peut plus initier la transcription ce qui empêche l’expression du gène.
INDUCTION
Cas du répresseur
lac avec l’IPTG p.e.
En vert : gène régulateur
En bleu : gène structural
répresseur
répresseur inactif
inducteur
*
REPRIME
INDUIT
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régulation de la transcription
CONTRÔLE NEGATIF DE LA TRANSCRIPTION
REPRESSION
répresseur actif
Répresseur inactif
corépresseur
INDUIT
*
REPRIME
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régulation de la transcription
LORSQUE LE CONTRÔLE DE LA TRANSCRIPTION EST POSITIF :
Un facteur de transcription doit assister l’ARN polymérase pour l’initiation
au niveau du promoteur.
INDUCTION
ARN polymérase
activateur inactif
activateur actif
inducteur
REPRIME
INDUIT
Cas de la CRP associée au l’AMPc
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régulation de la transcription
CONTRÔLE POSITIF DE LA TRANSCRIPTION
REPRESSION
activateur actif
activateur inactif
corépresseur
INDUIT
*
REPRIME
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Opéron lactose
L’opéron lac : organisation
1040 pb
3510 pb
780 pb
825 pb
3 gènes structuraux: z, y & a
- codant pour les enzymes impliquées dans le métabolisme du lactose
- sont exprimés continuellement à faible taux
- sont induits environ 1000 fois quand le lactose est présent
- sont modulés par le taux de glucose du milieu
laci : un gène adjacent n’appartenant pas à l’opéron, codant pour le répresseur lac
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Opéron lactose
Lactose
Glucose
Lactose
Glucose-6P
glycolyse
Glucose
Galactose
Galactose-1P
Glucose-1P
Croissance d’E. coli sur un mélange de glucose et lactose
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Opéron lactose
Les enzymes du métabolisme du lactose sont inductibles
Cinétique d’induction de
l’activité β-galactosidase
chez E. coli
(d’après Cohn, M. J. Bacteriol. (1957) 21, 156)
ARNm
Temps (min)
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2
8
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Les inducteurs de l’opéron lac
•
•
•
Opéron lactose
Lactose, (substrate de l’opéron), converti en son isomère (par transglycosylation), l’allolactose.
Allolactose, inducteur naturel (ou inducteur physiologique, isomère du lactose).
inducteur gratuit : induit l’opéron mais pas métabolisé.
Par exemple : isopropylthiogalactoside (IPTG)
OH OH
OH OH
OH
O
O
O
O
HO
OH
O
HO
OH
HO
OH
OH
O
HO
lactose
OH
HO
OH
OH
allolactose
OH
O
CH3
S
HO
OH
C
H
CH3
*
IPTG ou isopropylthiogalactoside
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lacZ
Opéron lactose
code l’enzyme β-galactosidase dont la forme active est un tétramère d’environ 500kDa
Réaction catalysée : coupe les β-galactosides et libère les sucres qui les constituent
Exemple : le lactose est hydrolysé en glucose et galactose
Equation de la réaction catalysée par la β-galactosidase
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Opéron lactose
E2
E1
CYCLE de TRANSPORT
Membrane
Ext.
lactose H+
E2
E2-H+-lactose
*
Int.
H+ + lactose
E1
E1-H+-lactose
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Opéron lactose
*
21
Opéron lactose
*
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Opéron lactose
RECAPITULATIF
mutations Oc
Les mutations de l’opérateur sont constitutives, car le promoteur est incapable de fixer la protéine répresseur;
Ceci permet à l’ARN polymérase d’avoir libre accès au promoteur.
Les mutations Oc agissent en cis, car elles ne touchent que les gènes structuraux qui leur sont contigus.
mutations du type lacILes mutations qui inactivent le gène lacI entraînent l’expression constitutive de l’opéron,
car la protéine du répresseur mutant ne peut plus se fixer sur l’opérateur.
Les mutations constitutives du gène lacI sont récessives.
Les mutations non inductibles lacIS sont dominantes.
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Quel est la nature du produit codé par le gène I ?
Opéron lactose
Expérience PAJAMO (Pardee AB et al. (1959) J. Mol. Biol. 1, 173)
Conjugaison Hfr I+Z+ x F- I-ZOn ne s’intéresse qu’aux cellules receveuses;
les cellules donneuses sont tuées.
Démonstration de l’existence du répresseur lac : Expérience de conjugaison
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Opéron lactose
Fonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en l’absence de lactose
La protéine répresseur se fixe à l’opérateur et empêche
la transcription.
L’ARN polymérase peut se fixer au promoteur quand
le répresseur est présent sur l’opérateur mais il ne peut
y avoir initiation de la transcription.
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Opéron lactose
Fonctionnement de l’opéron lac d’E. coli en présence de lactose
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répresseur lac
Opéron lactose
Répresseur lac (suite)
Le répresseur lac :
- un tétramère de sous-unités identiques de 360 résidus disposées selon 3 axes de symétrie
d’ordre 2, mutuellement complémentaires
(chaque sous-unité lie une molécule d’IPTG avec une constante de dissociation K = 10-6M)
1- en l’absence d’inducteur, liaison non spécifique du répresseur sous forme tétramérique à l’ADN double brin
(K = 10-4M)
2- en présence d’inducteur, liaison spécifique du répresseur opérateur lac (affinité supérieure K = 10-13M).
Deux domaines fonctionnels pour chaque sous-unité :
- un domaine N-terminal de 58 résidus : liaison à l’ADN (mais pas à l’IPTG)
- le restant : liaison à l’IPTG.
Le répresseur lac trouve l’opérateur en se liant de façon non spécifique à l’ADN et en diffusant
sur sa longueur selon une recherche à une dimension.
Le répresseur se fixe à un ADN double-brin contenant la séquence de l'opérateur lac de type sauvage.
Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant Oc.
L'addition d’IPTG in vitro libère le répresseur de l'ADN opérateur.
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27
répresseur lac
Opéron lactose
Pièce maîtresse
Fixation à l’opérateur
cœur
Fixation de l’inducteur
Domaine C-terminal
*
Structure de la sous-unité du répresseur lac.
Il existe plusieurs domaines indépendants
dans la molécule.
(Lewis et al. (1996) Science 271, 1247)
Oligomérisation
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répresseur lac
Opéron lactose
IMPLICATIONS STRUCTURALES de l’INDUCTION
Changement de la structure du noyau par l’inducteur :
les pièces maîtresses d’un répresseur
ne sont plus dans une orientation qui permet la fixation à l’ADN.
En bleu : domaine de fixation à l’ADN
En rouge : hélices α impliquées dans la tétramérisation
En vert : sites de fixation de l’inducteur
En jaune: petites hélices de liaison
*
Structure d’un dimère du répresseur lac
29
opérateur
Opéron lactose
Opérateur lac
- l’opérateur lac occupe ~ 35 bp
- il est situé en aval du promoteur et couvre celui-ci
- il présente 2 séquences symétriques (séq. palidromique imparfaite)
- ~22 bp sont protégées des nucléases lors d’une expérience
d’empreinte
- l’affinité du répresseur pour l’opérateur est 4x106 plus forte que
pour une séquence d’ADN quelconque
Séquence de l’opérateur
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30
opérateur
Interactions entre l’opérateur et le répresseur
Opéron lactose
La séquence des bases de l’opérateur lac
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31
Opéron lactose
résumé
Séquence nucléotidique de la région promoteur lac-opérateur lac d’E. coli, depuis
la région C-terminale de lacI (à gauche) à la région N-terminale de lacZ.
Les séquences palindromiques de l’opérateur et le site de liaison de CAP sont surlignées
ou soulignées (d’après Dickson RC et al., Science 1975 187, 32)
Le répresseur et l’ARN polymérase se fixent sur des sites qui se chevauchent au niveau du point de départ de l’opéron lac.
*
32
opérateur
Opéron lactose
L’opéron lac comprend 3 sites de fixation pour le répresseur lac.
*
33
Opéron lactose
Répression catabolique : mis en évidence
Phénomène de diauxie
Le colibacille (E. coli) utilise le glucose du milieu
comme source d’énergie.
Si on remplace le glucose par du lactose, la
croissance cesse.
La croissance reprend rapidement lorsque les
cellules ont produit les enzymes nécessaires à la
conversion du lactose en glucose.
Quand deux sources de carbone particulière sont présentes ensembles dans le milieu de culture,
la courbe de croissance est biphasique : phénomène de diauxie.
*
34
Opéron lactose
Répression catabolique
Cinétique de synthèse de l’ARNm de
l’opéron lac suite à l’induction par l’IPTG
puis après addition de glucose.
Glucose : métabolite de choix d’E. coli
*
35
Opéron lactose
Entrée du glucose dans la cellule bactérienne
Glucose
Glucose-6-phosphate
EN PRESENCE DE GLUCOSE
Production d’AMPc
ACTIVATION de GENES
*
36
Opéron lactose
Répression catabolique
CRP (cyclic AMP [cAMP] receptor protein), également appelée CAP (catabolite activator protein)
L’AMPc s’accumule quand le glucose est absent.
Quand le glucose est présent
- l’adénylate cyclase est inhibée
- AMPc phosphodiestérase est activée.
glucose
Adénylcyclase
AMPc
ATP
AMPc phosphodiestérase
+
glucose
AMP
*
37
Opéron lactose
Répression catabolique
Sucre(s) dans le milieu de
culture
Quantité relative de βgalactosidase
Glucose
1
induction
*
répression
Glucose + lactose
50
Lactose
2500
38
Opéron lactose
CAP est un régulateur positif et l’AMPc la molécule inductrice
Le produit du gène I (répresseur lac) est un régulateur négatif;
le lactose ou l’IPTG la molécule inductrice.
*
39
Opéron lactose
CRP
CAP : ce qu’il faut retenir
1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription
global).
2- protéine d’environ 45 kDa qui se fixe à l’ADN sous la forme d’un dimère (2 sousunités identiques.
3- le 1er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le 1er pour
lequel la structure 3D a été déterminée.
4- en présence d’AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquence
cible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu’il contrôle
5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l’ARN
polymérase
*
40
La protéine CRP : organisation structurale
*
Opéron lactose
41
Opéron lactose
La fixation coopérative du répresseur lac entraîne la formation d’une boucle sur l’ARN.
Lac Repressor = tetramer
O1
*
O2
42
Opéron lactose
CRP
Site de fixation de l’AMPc-CAP
Mutations rendant le promoteur
indifférent à CAP
A
T
T
A
-70
-60
-50
5’ATGTGAGTTAGCTCACACATT
3’TACACTCAATCGAGTGTGTAA
Axe de symétrie
Nucléotides aux contacts de
l’AMPc-CAP
Promoteur
*
43
Opéron lactose
Positions et séquences
des 3 opérateurs
Effets de mutations
sur chacun des 3 opérateurs
*
44
Opéron lactose
Le répresseur lac inhibe la transcription en formant une boucle dans l’ADN
Différents modèles
1- région promotrice de l’opéron lac
2- transcription
3- répression : modèle 1 :
fixation du répresseur en O1 & O3,
promoteur libre,
site CAP toujours occupé
ARN pol. pas fixée au promoteur
4- répression : modèle 2 :
fixation du répresseur lac en O1 & O2,
site CAP toujours occupé,
ARN pol fixée au promoteur mais pas de synthèse d’ARN car blocage de l’ARN pol. par le répresseur
*
45
Opéron lactose
Pour résumer
- en l’absence de lactose, une protéine tétramérique, possédant deux sites de fixation à l’ADN se fixe,
en premier lieu, sur le principal opérateur O1 puis soit sur O2 soit sur O3.
Deux des quatre sous-unités du répresseur reconnaissent O1; les deux restantes reconnaissant soit O2 soit O3.
- en général le répresseur se fixe en O1 & O3 provoquant la formation d’une structure en boucle de l’ADN entre
les deux sites ce qui empêche l’ARN polymérase de se fixer au promoteur et donc d’initier la transcription.
- en fait la transcription n’est pas complètement bloquée : une faible transcription a lieu même en la présence
du répresseur fixé en ses opérateurs.
- en présence de lactose, la lactose perméase permet, dans un premier temps, l’entrée d’une petite quantité de
lactose, lequel est transformé en allolactose (un isomère structural du lactose) par la β-galactosidase.
- l’allolactose se fixe alors en des sites de la protéine répresseur provoquant un changement de conformation
de celle-ci ce qui la rend incapable de se fixer aux séquences opérateur.
- ainsi, avec l’opérateur « libéré » du répresseur, l’ARN polymérase peut se fixer à la région promotrice et initier
la transcription.
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46
α-peptide
site actif
lacZ
α-peptide
délétion de 90pb
site actif
lacZ’
lacZ (∆M15)
Protéine dimérique
INACTIVE
α-complémentation
α-peptide
Protéine tétramérique
ACTIVE
Protéine ACTIVE
*
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