III - Description du protocole expérimental

61
Partie C : Description du protocole expérimental pour la mesure de la
réponse en fréquence du cytosquelette testée par magnétocytométrie
Ce chapitre décrit la méthode expérimentale pour mesurer et analyser les propriétés
viscoélastiques de cellules adhérentes testées par la technique de magnétocytométrie (MTC) en
conditions oscillantes, dans le but de contribuer à vérifier les prédictions du présent modèle de
tenségrité viscoélastique (MTV) établissant la viscoélasticité structurale du cytosquelette. En effet,
la MTC fait partie des procédés de micromanipulation cellulaire particulièrement adaptés à l’étude
de la réponse mécanique spécifique du cytosquelette. Le dispositif expérimental de MTC, décrit
dans le paragraphe I, a été fabriqué par l’équipe « Biomécanique cellulaire et respiratoire » de
l’INSERM UMR 492 et amélioré par Valérie M. Laurent au cours de sa thèse [Laurent 2000].
Elaboré au départ pour effectuer des études en conditions quasi statiques (épreuves de fluage et
de recouvrement) ce banc de MTC a dû être modifié (paragraphe II) afin de caractériser les
propriétés viscoélastiques du cytosquelette en conditions oscillantes, c’est à dire sous contraintes
mécaniques harmoniques (oscillations imposées). Quelques études expérimentales récentes font,
en effet, apparaître que les propriétés viscoélastiques des cellules adhérentes dépendent de la
fréquence imposée (voir Partie A paragraphe II-1-1). Cette propriété a été attribuée à la structure
polymérique complexe du CSQ [Maksym et coll. 2000].
Les cellules testées dans la présente étude sont des cellules de l’épithélium alvéolaire
(lignée A549) cultivées au sein de l’INSERM UMR 492, le protocole expérimental suivi étant
exposé dans le paragraphe III, qui n’ont jamais été testées précédemment en conditions
oscillantes.

62
I – Description du banc de magnétocytométrie (MTC)
Figure C1 : Schéma représentatif du banc expérimental de magnétocytométrie.
L’expérience de micromanipulation cellulaire par magnétocytométrie peut être
schématisée en 3 étapes :
La première consiste à placer des microbilles ferromagnétiques sur une mono-couche de
cellules adhérentes à l’aide de liguants spécifiques des mécanorécepteurs transmembranaires, de
type intégrines, liés au cytosquelette. La deuxième phase permet ensuite de magnétiser ces billes
selon une direction donnée par un champ bref et de haute intensité. Enfin, la troisième étape
consiste à générer un champ magnétique uniforme et perpendiculaire à la direction de
Moteur (10Hz)
Détection Synchrone
Magnétomètre
Générateur
de courant Détection
IR
sonde Carte d’acquisition
Cellule
s
+
billes
sonde
nTesla
1 minute
Bo Bt
temps
2
1
0
Blindage
Moteur (10Hz)
Détection Synchrone
Magnétomètre
Générateur
de courant
Générateur
de courant Détection
IR
sonde Carte d’acquisition
Cellule
s
+
billes
sonde
nTesla
1 minute
Bo Bt
temps
2
1
0
Blindage

63
magnétisation initiale des billes. Ce champ génère un couple magnétique (correspondant à une
contrainte magnétique) appliqué sur les billes, les entraînant dans une rotation. La déviation
angulaire résultant de la rotation est déterminée à partir des changements dans les propriétés
moyennes du moment magnétique rémanent des billes mesuré par un magnétomètre.
La magnétisation des microbilles fixées sur les mécanorécepteurs des cellules s’effectue au
moyen de bobines de Helmholtz créant un champ vertical, perpendiculaire au plan horizontal de
la culture cellulaire, et alimentées par un circuit électrique qui permet de charger et de décharger
un circuit résonnant, impliquant un condensateur de 330µF. La décharge de ce circuit dans les
bobines produit une impulsion de courant d’une intensité maximale avoisinant les 1700A,
générant un champ magnétique horizontal de 150mT (1500 Gauss) très bref (150 µs). La distance
entre les bobines de Helmholtz est choisie égale à leur rayon (31mm) afin d’obtenir un champ
magnétique uniforme dans la zone centrale de leur axe, où est placé le puits cellulaire (6mm).
Les microbilles ferromagnétiques (Spherotec, USA) sont ainsi toutes identiquement magnétisées
suivant une même direction horizontale. Ces billes sont composées d’un cœur en polystyrène
recouvert de particules de dioxyde de chromium, pour un diamètre moyen de 4,5µm et une masse
volumique (bille ) légèrement supérieure à celle de l’air (air  1,8 kg/m3), c’est à dire une densité
de 1,5 (bille /air = 1,5).
Les puits cellulaires à tester sont alors placés dans une chambre expérimentale
magnétiquement blindée, ce qui permet de protéger la mesure du champ rémanent des billes des
variations des champs extérieurs parasites, comme le champ magnétique terrestre (~0,045mT) ou
encore les champs magnétiques provenant des appareils électriques voisins (ordinateurs,
alimentations, etc.). Deux autres bobines de Helmholtz reliées à trois alimentations monopolaires
en série produisent un courant électrique d’une intensité maximale de 15A, donc un champ

64
magnétique d’une intensité maximale de 6,3mT pendant 1 min dans une direction verticale
perpendiculaire à la direction d’orientation magnétique des billes. L’espace entre ces bobines est
d’une part réduit afin de permettre la production d’un champ magnétique uniforme au niveau du
puit cellulaire et, d’autre part, suffisamment grand (plus de 11mm) pour permettre le passage des
sondes du magnétomètre au plus près du puits ce qui permet d’augmenter le niveau du signal
mesuré (signal du champ rémanent des billes). C’est, en effet, la mesure de la projection du
champ rémanent des billes dans le plan de la culture cellulaire par les sondes reliées au
magnétomètre (Magnetoscop 1.068 Forster, Allemagne) et maintenues selon une configuration
antiparallèle (voir figure C1) qui permet d’évaluer la déviation angulaire des billes
(b(t)=b0cos((t)) où b0 est le champ rémanent initial mesuré avant l’application du couple
magnétique et b(t) le champ rémanent mesuré à l’instant t ; b  b0) pendant l’application du
couple magnétique. Cette déviation dépend de la « résistance » cellulaire à la rotation des billes
reliées au cytosquelette, donc à la déformation du CSQ, reflétant ainsi les propriétés mécaniques
de la structure cytosquelettique.
Par ailleurs, si le blindage magnétique permet de s’affranchir de l’effet des bruits
magnétiques parasites extérieurs (champ magnétique terrestre, ordinateurs et autres appareils
électriques) sur le signal mesuré, il est nécessaire d’utiliser une détection synchrone afin d’éliminer
l’ensemble des bruits magnétiques perturbant le signal brut du champ rémanent des billes et dont
une partie non négligeable est d’origine interne au dispositif expérimental. En effet, malgré toutes
les précautions prises pour le montage du banc expérimental, les sondes de mesures ne sont pas
parfaitement alignées et horizontales, ce qui perturbe le signal mesuré d’une valeur dépendant
plus ou moins du champ magnétique vertical. Bien que celui-ci soit beaucoup plus grand (106fois)
que le champ rémanent des billes (de l’ordre du nanoTesla) cette perturbation est manifeste mais
peut être éliminée par la détection synchrone (dont le principe est énoncé en annexe A4). De
plus, la circulation du courant dans les bobines en échauffe les fils de cuivre, ce qui peut induire

65
des déformations du plastique entourant les sondes et/ou du support des sondes (PVC) pouvant
ainsi entraîner une modification du signal mesuré. Les mesures par détection synchrone
nécessitent de faire osciller le signal étudié à une fréquence connue, en pratique mesurée en
permanence par un détecteur. Pour cela, le puits cellulaire est entraîné dans un mouvement de
rotation par un moteur à courant continu (voir figure C1) et un système infrarouge permet de
mesurer en permanence la fréquence de rotation du puits (environs 10Hz). Ce détecteur
synchrone est assorti d’un filtre passe bas, dont la constante de temps définissant la fréquence de
coupure (c=1/(2fc ), avec fc la fréquence de coupure du filtre) est un compromis entre
l’élimination du bruit et la préservation des variations rapides du champ rémanent ; une constante
de temps de 300 ms a été finalement choisie.
Les signaux sont enfin recueillis sur un ordinateur à l’aide du système d’acquisition
Acqknowledge (Biopac, USA) qui permet de visualiser les variations de ces signaux (champs
magnétique perpendiculaire, champs rémanent) au cours du temps et de les enregistrer. Le post-
traitement de ces données permet de déterminer la relation contrainte–déformation sous la forme
d’une relation entre le couple magnétique appliqué rapporté au volume de la microbilles
(homogène à une contrainte) et la déviation angulaire (homogène à une déformation du CSQ).
II – Transformation du dispositif expérimental
L’objectif, dans le cadre du présent projet, est de pouvoir mesurer les propriétés
mécaniques spécifiques du cytosquelette de cellules adhérentes en réponse à diverses sollicitations
harmoniques afin de pouvoir apprécier le rôle de la fréquence sur les propriétés viscoélastiques
cellulaires. Les sondes étant placées horizontalement (c’est à dire dans le plan de la culture
cellulaire) le signal qu’elles recueillent est lié à la rotation des billes via le cosinus « moyen » de