Recherche sur la differenciation proteique au cours

Recherche sur la differenciation proteique au cours
du developpement des Amphibiens
par H. DENIS
1
Laboratoire de Morphologie Animale, Universite de Liege
INTRODUCTION
Au cours du developpement embryonnaire, la differenciation proteique constitue
probablement le phenomene fondamental qui entraine la determination des
cellules et leur specialisation en differents tissus. Diverses methodes ont ete
utilisees en vue de suivre revolution des proteines au cours du developpement.
La methode immunologique a ete appliquee pour la premiere fois a des oeufs
d'Amphibiens par Cooper (1946, 1948, 1950). Cet auteur constate la presence
de 6 a 8 groupes antigeniques dans l'ceuf indivis aussi bien que dans la jeune
neurula de Rana
pipiens. Par une methode analogue, Flickinger & Nace (1952)
observent l'apparition d'un nouvel antigene au stade bourgeon caudal. Spar
(1953) montre l'existence d'antigenes propres a des stades determines (blastula,
gastrula, neurula) et absents aux autres stades. Clayton (1953) met en evidence
une synthese de materiel antigenique d'abord entre le stade blastula et gastrula,
ensuite avant la neurulation et enfin entre la neurulation et l'apparition du bour-
geon caudal.
Plusieurs auteurs se sont egalement efforces de separer les proteines embryon-
naires par la technique de Felectrophorese. Par cette methode, Flickinger &
Nace (1952) observent une fraction proteique supplemental dans tous les
extraits d'oeufs et d'embryons plus ages que le stade petit oocyte. Barth & Barth
(1954) separent la portion extractible du vitellus de R. pipiens en deux elements,
l'un phosphore, l'autre non phosphore. Selon Flickinger (1956), cette derniere
fraction possede une activite phosphoproteinephosphatasique et jouerait un
role capital dans l'induction embryonnaire. Spiegel (1958, 1960) soumet a
l'electrophorese sur papier filtre des extraits d'oeufs et d'embryons de R. pipiens.
L'auteur obtient a partir de l'oeuf vierge 7 bandes colorables par le bleu de
bromophenol et une bande fluorescente qui ne semble pas de nature proteique.
Au stade 21, trois de ces bandes ont disparu et la concentration totale en
proteine soluble a diminue fortement.
Les resultats serologiques obtenus jusqu'a present donnent a penser que le
developpement des Amphibiens s'accompagne de l'apparition, a des moments
varies, de nouvelles proteines. Si ces resultats n'ont pas ete jusqu'ici confirmes
1
Author's address: Institut Ed. Van Beneden, quai Van Beneden 22, Ltege, Belgium.
[J. Embryol. exp. Morph. Vol. 9, Part 3, pp. 422-445, September 1961]

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par les donnees recueillies par electrophorese, c'est probablement parce que les
procedes electrophoretiques disponibles ne permettaient pas de deceler des frac-
tions de tres faible concentration ou de separer des elements de mobilite tres
voisine.
Cependant Kohn (1958) a decrit un nouveau milieu-support pour electro-
phorese (l'acetate de cellulose) qui permet de separer de minuscules echantillons
de proteine (3-4 /ul.) de maniere tres satisfaisante. II m'a semble interessant de
soumettre a P electrophorese sur ce nouveau milieu des extraits provenant d'un
seul embryon et meme de fragments d'embryon. Des essais preliminaries (Denis,
1960) ont montre que Pceuf d'Amphibien contient suffisamment de proteines
pour fournir un spectre electrophoretique clair sur acetate de cellulose.
MATERIEL ET METHODES
Les experiences ont porte sur PUrodele Pleurodeles waltii. Deux pontes seule-
ment ont ete utilisees: l'une a fourni les embryons pour les extraits totaux;
Pautre a servi pour
le prelevement des fragments d'embryon. De la sorte, la varia-
bilite de ponte a ponte se trouve eliminee dans chaque serie d'experiences.
Les stades ont ete determines d'apres la table de Gallien & Durocher (1957).
Isolement du materiel
Apres deganguage et rincage, les embryons de divers stades (0-37) sont trans-
feres dans une solution saline (NaCl 0,65 pour cent) ajustee a pH 8,6 par Paddi-
tion de tampon veronal 0,02 M.
Chaque embryon est immediatement aspire a Pinterieur d'un tube capillaire
(diametre interieur 1 mm.) dans dz 5/al. de solution saline. Le tube est ensuite
scelle a la flamme d'un cote, bouche et conserve a la glaciere (— 20° C.) jusqu'au
moment de Putilisation. Un seul embryon sert pour chaque electrophorese.
Pour le prelevement de fragments de tissu, six embryons de meme stade sont
utilises. L'operation est accomplie en solution de Holtfreter normale refroidie
dans un bain de glace. Cette precaution facilite grandement la separation des
couches cellulaires du germe et d'autre part permet de conserver les embryons
rigoureusement au meme stade pendant toute la duree de l'operation.
Les tissus suivants ont ete isoles et debarrasses soigneusement de toute
cellule etrangere au moyen d'une boucle de platine: au stade blastula (6-7),
ectoderme animal et endoderme; au stade jeune gastrula
(8-9), ectoderme animal,
endoderme et levre dorsale du blastopore; au stade gastrula agee et neurula
(11-15), toute la plaque neurale, le toit de l'archenteron, ectoderme ventral et
endoderme; aux stades ulterieurs (15-27), le tube neural, Paxe chordo-somitique,
ectoderme ventral et endoderme.
Les fragments de tissu provenant des six embryons operes en meme temps
sont ensuite transferes en solution saline (NaCl 0,65 pour cent) rinces trois fois
dans celle-ci et enfin aspirds dans 5 /A. de liquide. La conservation est assuree
par congelation a —20° C, comme pour les embryons entiers.

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Extraction
Le materiel mis en reserve est degele juste avant l'emploi. Les embryons et les
fragments de tissu sont broyes soigneusement a l'interieur de leur tube a l'aide
d'un minuscule pilon de verre. La largeur de celui-ci correspond exactement au
diametre interieur du capillaire, de sorte que le materiel se trouve rapidement
reduit en une pulpe de couleur grisatre.
Les homogenats sont ensuite centrifuges a 10.000 g pendant 20 minutes.
Le culot de centrifugation est elimine et seul le surnageant limpide est utilise
pour l'electrophorese.
Electrophorese
L'electrophorese est conduite dans une solution de tampon veronal de pH 8,6
et force ionique ^ = 0,05. Chaque extrait est applique rapidement a l'aide
du tube capillaire qui le contient sur une bande d'acetate de cellulose
de
10 x 5 cm. La ligne de depart (3,5 cm. de long et 1 mm. de large) se trouve
a egale distance du pole positif et du pole
negatif. Une goutte de serum de coq
est aussi deposee sur la ligne de depart. L'albumine et les globulines seriques
serviront comme reference pour l'etude de la mobilite des proteines embryon-
naires. Un courant d'intensite constante (1,25 mA. par bande) est alors applique
pendant une heure a raison de 10 volts par cm. Quatre bandes sont soumises
a l'electrophorese en meme temps.
Coloration
Une fois l'electrophorese terminee, les feuilles sont plongees, sans sechage
prealable, dans une solution tres diluee de nigrosine (1/20.000), contenant
3 pour
cent d'acide trichloracetique (fixateur). Apres 18 heures, la coloration atteint
son maximum. Les feuilles sont alors rincees puis sechees.
£tude quantitative
En vue d'estimer la quantite de proteine presente sur chacune des bandes
d'electrophorese, celles-ci ont ete examinees au spectrophotometre en lumiere
visible (jaune). Avant l'examen, les feuilles sont eclaircies a l'huile de paraffine
et pressees entre deux lames de verre. L'extinction est mesuree mm. par mm.
a l'aide d'un pinceau lumineux de 1 mm. de large et de 15 mm. de long. Les
valeurs lues sont portees en graphique ou figurent en ordonnee les mesures
d'extinction et en abscisse les distances de la ligne de depart. La surface com-
prise entre l'axe des abscisses et la courbe d'extinction donne une mesure
(conventionnelle) de la quantite de proteines presente sur la feuille d'electro-
phorese. Pour chaque proteinogramme, cette surface a ete estimee par pesee.

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RESULTATS
Ext raits totaux
Resultats qualitatifs
Environ 110 electrophoreses
(2 a 5 par stade) portant sur des extraits d'em-
bryons entiers ont ete menees
a bien. Les resultats sont resumes qualitativement
en
un graphique (fig. 1) portant en ordonnee les mobilites electrophoretiques
(en cm.
par heure) et en abscisse la racine carree du temps de developpement
a 18°
C. On peut ainsi suivre facilement le sort des bandes electrophoretiques
6 9 M {213 * J582122* 262726
cm
FIG. 1. Evolution du spectre electrophoretique au cours du developpement. La ligne d'abscisse est
graduee en -vV.
durant toute l'ontogeneese. L'echelle des abscisses a ete graduee en <lt afin de
reduire l'espacement entre les stades avances (30 a 37). En effet, les stades
larvaires ages sont difficiles
a distinguer les uns des autres et ne correspondent
pas toujours
aux images donnees par la table de developpement. Les cons6-
quences
de confusions possibles sont attenuees par le rapprochement, sur le
diagramme, des points representant les dernieres etapes de l'ontogenese.
Nomenclature. Les bandes proteiques sont designees par les lettres de l'alpha-
bet en commencant par les plus rapides (les plus proches
du pole positif). Dans
cette nomenclature,
il n'est pas tenu compte du moment d'apparition des
diverses bandes. Lorsque l'intensite ou la mobilite d'un element du spectre
electrophoretique change
de fa?on appreciable au cours du developpement,
la lettre qui
le designe est affectee d'une apostrophe.
Dans l'ceuf indivis,
11 bandes d'intensite tres differente peuvent etre

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distinguees: 7 du cote positif de la ligne de depart et 4 du cote negatif. Deux
d'entre elles, tres faibles (d et e), ne sont pas visibles dans tous les cas.
Toutefois, la repartition des bandes proteiques de chaque cote de la ligne de
depart ne signifie nullement que les unes ont une charge positive et les autres
une charge negative au pH etudie. Par suite de l'electroendosmose (Block,
Durrum, & Zweig, 1958), toutes les bandes proteiques et la ligne de depart se
trouvent decalees vers le pole negatif a la fin de Pelectrophorese.
La ligne de depart reelle doit etre placee legerement en dessous de la bande m
(—1,45 cm.). De la sorte, toutes les bandes du spectre apparaissent au stade 0
comme electronegatives.
nlincl'ton
0.*
0,3
0,2
0,1
i
V
>
\^
+ 35 30 25 20 15 10 5 0 5 10 15 20 25 30 -
dislinetlen mm) de la ligne de depart
FIG. 2. Courbe d'extinction, de trois proteinogrammes a trois stades differents du developpement.
Durant la segmentation, la bande h s'elargit et trois autres elements (k, I et
n) se renforcent. Au debut de la gastrulation (stades 8-9), k et / s'intensifient de
facon considerable et s'ecartent legerement de la ligne de depart. La bande h
atteint a ce moment sa largeur maximum. Vers le stade 8, un element de faible
intensite (m) apparait entre / et n.
Pendant le reste de la gastrulation et la neurulation, l'intensite de k et /
diminue fortement; celle de n s'attenue aussi quelque peu. La largeur de h
s'amenuise et redevient a peu pres ce qu'elle etait au cours de la segmentation.
Entre les stades 12 et 15, la bande m se renforce de facon tres notable.
Du stade 19 au stade 26, aucune transformation importante ne se produit.
Seule est a noter une obliteration progressive de l'espace clair situe entre les
bandesy" et k. A partir du stade 26, la bande m se renforce et s'eloigne legerement
de la ligne de depart. Elle finit par recouvrir tout a fait la bande n qui s'affaiblit
de plus en plus.
Au stade 33, la bande b commence a s'elargir. E, f, i, j, k et / se marquent