le diagnostic bacteriologique d*une infection bacterienne

DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE
D’UNE MALADIE INFECTIEUSE
D.TIOUIT-F .YAMOUNI
Cours de microbiologie-résidanat 1ère année
INTRODUCTION
 Deux méthodes de diagnostic sont utilisées.
 Le diagnostic direct: permet la MEE de tout ou une partie de la
bactérie (antigènes spécifiques …)
 Le diagnostic indirect: permet la détection de marqueurs
biologiques(réponse humorale ou cellulaire) témoins de la
multiplication bactérienne dans l’organisme.
INTRODUCTION
Analyses effectuées en suivant les phases suivantes:
. Phase pré-analytique :
- prescription et renseignements cliniques
NB : BIEN ETIQUETER LES PRELEVEMENTS !
- prélèvement (transport, conservation)
. Phase analytique
. Phase post-analytique :
- expression
- interprétation
- et transmission des résultats
Procédures écrites et contrôles de qualité
DIAGNOSTIC DIRECT
PRELEVEMENTS
 QUALITE DU PRELEVEMENT TRES IMPORTANTE +++
d’où des contraintes de :
. Aseptie :respect des conditions de stérilité
. Méthode :
- Prélèvement superficiel (seringue, curette, biopsie)
Rq : écouvillon à déconseiller (sauf pour téguments et muqueuses)
- Prélèvement profond (jamais à l’écouvillon !)
. Transport : plus rapide possible
< 30 min pour LCR, liquides de ponction, prél. per-opératoires
Sinon utilisation de milieux de transport (ex. : Portagerm™)
.Conservation :
Dépend de la nature du prélèvement
Dépend de la nature du germe suspecté
EXAMEN DIRECT (1)
 Aspect : clair, légèrement trouble, trouble, purulent, hématique,
xanthochromique…
 État frais (× 40) :
. Entre lame et lamelle : morphologie et mobilité des germes
. En cellule de Malassez : numération des éléments et hématies (μl ou ml)
pour liquides de ponction, urines
 Examen après colorations:
GRAM (entérobactéries, staphylocoques…), BM (peu utilisée),
MGG (formule leucocytaire), Ziehl- Neelsen(BAAR),
imprégnation argentique (tréponèmes)
 autres techniques:
*Immunologiques: immunofluorescence directe et indirecte (chlamydia,
coxiella, BK)
*Examen à fond noir ( treponema pallidum)
EXAMEN DIRECT (2)
EXAMEN DIRECT
EXAMEN DIRECT (3)
INTERET
 Permet d’avoir des informations morpho-tinctoriales sur le germe , la
richesse bactérienne, la présence de cellules polynucléaires ou
lymphocytaires.
 Oriente les recherches ultérieures pour le choix des milieux à ensemencer,
les tests à lancer rapidement .
 Permet parfois de donner un diagnostic de forte présomption au clinicien
qui peut commencer le bon traitement immédiatement.
CULTURE ET ISOLEMENT (1)
Différents types de milieux sont utilisés:(selon le germe suspecté)
 Milieux de base (GN)
 Milieux sélectifs (Chapman, hektoen)
 Milieux enrichis (GSC, GSF)
 Milieux d’enrichissement (SFM)
 Milieux chromogènes pour l’identification présomptive
CULTURE ET ISOLEMENT (2)
• Conditions d’incubation
 Température ( 37, 30 ou 42° )
 Tension d’oxygène: aérobie, anaérobie ou microaérophilie
 Tension de CO2:5%
 Durée d’incubation ( 18h, 24h, 48h, jours ou semaines)
 Cas particulier des hémocultures: incubation des flacons dans un
automate qui détecte la croissance des germes (si + GRAM et isolement)
 Culture des Mycobactéries: pousse très lente (plusieurs semaines)
sur milieux solides (Löwenstein-Jensen,Coletsos)
CULTURE ET ISOLEMENT
HK
col lac +
Muller Hinton
Chapman
col Man +
BCP
Jaune : lac+
Pourpre:lac_
Loweinstein jensen
col en chou fleur
SS
Col noir: H2S +
Identification phénotypique (1)
 L’étude microscopique (état frais et colorations constituent des
étapes de l’identification)
 Caractères culturaux (morphologie, durée, conditions
physiologiques)
 Tests biochimiques explorant le métabolisme glucidique, protidique
et lipidique
 Tests explorant les conséquences du métabolisme
 Détection de produits de dégradation métabolique ou
 d’enzymes impliquées dans la réaction ou
 de témoins de l’activité d’une enzyme
Identification phénotypique (2)
 Etude antigénique:
 étude des antigènes de groupe ou de type.
 portés par la bactérie à l’aide de sérums spécifiques
connus.
 par des réactions immunologiques d’agglutination ou de
précipitation de l’antigène bactérien par l’antisérum
spécifique connu.
Biologie moléculaire
 Détection directe à partir de prélèvements par amplification
génique (PCR) :
-Amplification de l’ARN 16S sur valves cardiaques
-Détection des agents de méningites communautaires (N. meningitidis,
L.monocytogenes, S. pneumoniae, H. influenzae) sur LCR
-Détection de Chlamydia trachomatis (sur urines, prél. génitaux)
-Détection de M. tuberculosis (sur prél. pulmonaires et autres)
 Identification de bactéries à partir de colonies :
-Amplification et séquençage de gènes cibles (ex. ARN 16S)
 Détermination de la sensibilité aux ATB :
ex : Méthicilline chez S. aureus (S. aureus résistant à la Méthicilline - SARM)
 Épidémiologie moléculaire :
ex: électrophorèse en champ pulsé
INTERPRETATION
 Lecture et interprétation des résultats: tenir compte
 Du type de prélèvement ( mono ou poly microbien)
 Du malade et de l’histoire clinique
 Du contexte épidémiologique
 Le diagnostic de certitude: bactériologie
 Une diarrhée aigüe= Typhoïde si isolement de S. typhi
 Pneumopathie = Tuberculose si isolement de M.tuberculosis
 Méningite cérébro-spinale (isolement de N. meningitidis )
EXEMPLE 1:diagnostic d’une
septicémie
 Prélèvements
 Urgence
 Sang complet ( 10 ml) stérilité absolue
 Pics thermiques
 Répéter
 Avant tout antibiothérapie
 Examen bactériologique
 Incubation
 (Examen microscopique et) isolement
 Identification
 antibiogramme
EXEMPLE 2: diagnostic d ’une
méningite
 Prélèvements
 Urgence
 LCR ( 2-3ml enfant, 5ml adulte) stérilité absolue
 Avant antibiothérapie
 Diagnostic biologique
 Etude cytologique quantitative et qualitative (polynucléaires ou
lymphocytes)
 Etude biochimique ( glucose, chlorures, protéines)
 Etude bactériologique ( microscopie directe, culture, identification
biochimique et antigénique, antibiogramme)
Exemple 3:diagnostic d’une
tuberculose
 Prélèvements
 Expectoration: crachats, aspiration bronchique, tubage gastrique…
 Stérilité surtout pour les prélèvements monomicrobiens
 Conservation et transport
 Diagnostic bactériologique
 Examen microscopique après coloration spécifique ( BAAR)
 Mise en culture après décontamination et centrifugation (poly microbiens)
 Ensemencement sur milieu de culture spécifique
 Incubation pendant 3 semaines à plus selon le milieu de culture
 Lecture des résultats et interprétation, rendu au clinicien
 Antibiogramme +ou -
DIAGNOSTIC INDIRECT(1)
Objectif
Établir le diagnostic étiologique d’une infection par la recherche
d’anticorps circulants synthétisés en réponse à la multiplication
bactérienne:
 lorsque la mise en évidence de l’agent causal est techniquement
difficile par les méthodes traditionnelles (ex. T. pallidum)
 lorsque la mise en évidence de l’agent causal est impossible
(diagnostic rétrospectif d’une infection guérie)
 lorsque la mise en évidence de l’agent causal nécessite des
prélèvements trop invasifs (ex. l’encéphalite listérienne)
DIAGNOSTIC INDIRECT(2)
Différentes méthodes utilisées
. Réactions d’agglutination ou d’hémagglutination (HA)
. Réactions d’immunofluorescence (IF)
. Réactions immuno-enzymatiques (EIA) type ELISA
. Techniques d’Immuno-Blots (IB) ou Western-Blots (WB)
EXEMPLES
 Brucellose (zoonose due à B. abortus ou B. melitensis)
3 phases :
. I aiguë septicémique avec fièvre ondulante sudoro-algique
. II subaiguë avec localisations ostéo-articulaires
. III chronique
 Par séro-agglutination lente de Wright (SAW) = méthode de
réf. OMS +++
 Par épreuve à l’Ag tamponné (EAT ou rose Bengale)
EXEMPLES(1)
Chlamydioses
Pneumopathie atypique communautaire à C. pneumoniae, C.
psittaci (oiseaux)
Diagnostic par IFI, EIA
 Légionellose (due à L. pneumophila)
sérodiagnostic (IFI, ELISA)
 Mycoplasmoses respiratoires (due à M. pneumoniae)
Diagnostic par IFI, Aggl sur lame ou EIA

EXEMPLES(2)
 Salmonelloses typhiques et paratyphiques (dues à S.Typhi et S.
Paratyphi A, B, C)
Par le sérodiagnostic de Widal et Félix (présomption et investigation
rétrospective)
Recherche dans le sérum d’Ac anti-O et anti-H des 4 sérotypes
 Complications post-streptococciques ( Dc rétrospectif)
Comme rhumatisme articulaire aigu (RAA), glomérulonéphrite aiguë
(GNA)
détermination du titre en anticorps spécifiques (ASLO)
 Syphilis (ISTà T. pallidum subsp. pallidum)
Spirochète = bactérie hélicoïdale, mobile non colorable au Gram
observable en microscopie à fond noir :non cultivable in vitro
EXEMPLES
. Tests utilisés
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)TNT
. TPHA (Treponema pallidum Haemaglutination Assay)
TT
.ELISA (TT)
. Autres Tests :
. WB / IB
. (Test de Nelson d’immobilisation des tréponèmes (TPI))
CONCLUSION
 Qualité du prélèvement
 Qualité de l’analyse bactériologique
 Détection des « traces » laissées par la multiplication
bactériennes si besoin
 Rigueur dans l’interprétation et la validation des résultats
 Rapidité de l’envoi des résultats
Coopération entre clinicien et bactériologiste