Salmonella Listeria monocytogenes Bactéries pathogènes du tube digestif Thomas Hindré Escherichia coli Laboratoire Adaptation et Pathogénie des micro organismes [email protected] Plan du cours I- Les bactéries du genre Listeria a- Le genre Listeria b- Listeria monocytogenes 1- Généralités 2- Cycle infectieux 3- Invasion cellulaire 4- Spécificité d'hôte 5- Evasion du phagosome 6- Réplication intra cellulaire 7- Motilité intra cellulaire 8- Régulation de la virulence III- L'espèce Escherichia coli a- Généralités b- Les pathovars E. coli c- Les E. coli entérohémorragiques (EHEC) 1- Généralités 2- Physiopathologie 3- Système de sécrétion de type III (LEE) 4- Lésion attachement/effacement 5- Régulation du LEE 6- Shiga-toxine 7- Régulation de la production de Shiga-toxine II- Les bactéries du genre Salmonella a- Le genre Salmonella b- Les sérovars Salmonella c- Salmonella enterica ssp enterica 1- Agent de la salmonellose 2- Cycle infectieux 3- Système de sécrétion de type III (SSTT) 4- Invasion des cellules non-phagocytaires 5- Réplication intra cellulaire 6- Régulation de SSTT SPI-1 Plan du cours I- Les bactéries du genre Listeria a- Le genre Listeria b- Listeria monocytogenes 1- Généralités 2- Cycle infectieux 3- Invasion cellulaire 4- Spécificité d'hôte 5- Evasion du phagosome 6- Réplication intra cellulaire 7- Motilité intra cellulaire 8- Régulation de la virulence III- L'espèce Escherichia coli a- Généralités b- Les pathovars E. coli c- Les E. coli entérohémorragiques (EHEC) 1- Généralités 2- Physiopathologie 3- Système de sécrétion de type III (LEE) 4- Lésion attachement/effacement 5- Régulation du LEE 6- Shiga-toxine 7- Régulation de la production de Shiga-toxine II- Les bactéries du genre Salmonella a- Le genre Salmonella b- Les sérovars Salmonella c- Salmonella enterica ssp enterica 1- Agent de la salmonellose 2- Cycle infectieux 3- Système de sécrétion de type III (SSTT) 4- Invasion des cellules non-phagocytaires 5- Réplication intra cellulaire 6- Régulation de SSTT SPI-1 Le genre Listeria Phylum Firmicute Gram-positif Morphologie bâtonnet, mobile à 20°C Anaérobie facultative Cossart, PNAS, 2011 8 espèces : Listeria monocytogenes : les seules listeria pathogènes pour les humains Listeria innocua listeria pathogènes pour les ruminants Listeria ivanovii subsp. ivanovii Listeria ivanovii subsp. londoniensis et moutons Listeria grayi Listeria seeligeri Listeria welshimeri Listeria marthii Listeria rocourtiae Listeria monocytogenes Bactérie ubiquiste (eau, sol) Bactérie pathogène chez l'homme (tube digestif) Pathologie associée : Listériose - gastro-entérites à fièvre - septicémie - méningites - avortement Personnes immunodéprimées Femmes enceintes Incidence : - En France, 4 cas / millions d'habitants - Mortalité 20 à 30% des cas Cycle infectieux : - Contamination par ingestion - Franchissement de la barrière épithéliale intestinale : dissémination - Franchissement des barrières hémato-encéphalique : méningites placentaire : avortement, infection néo-natal Listeria monocytogenes : cycle infectieux Invasion : - Endocytose induite par la bactérie - Protéines de surface = internaline A et B (InlA-B) Evasion du phagosome : - Lyse de la vacuole phagocytaire induite par la bactérie - Protéines sécrétées = listeriolysine (LLO) phospholipase (PLC) Réplication intra-cellulaire : - Détournement des nutriments de l'hôte - Transporteur d'hexose phosphorylé (Hpt) Mobilité intra ou inter-cellulaire : - Détournement du cytosquelette de l'hôte - Protéine de surface inductrice de polymérisation de l'actine (ActA) Listeria monocytogenes : invasion cellulaire Du côté de la bactérie - Internalin A (InlA) - Protéine liée au peptidoglycane = adhésine InlA E-cadherin Du coté de la cellule hôte - E-Cadherine = récepteur - Protéine transmembranaire impliquée dans les interactions cellules/cellules - Extrémité cytoplasmique liée au cytosquelette via catenin et - Liguand naturel = E-cadherine Hamon, Nat rev Microbiol, 2006 La fixation InlA /E-cadherin modifie le cytosquelette d'actine via les catenines et induit l'endocytose de la bactérie Listeria monocytogenes : invasion cellulaire InlB Met Du côté de la bactérie - Internalin B (InlB) = adhésine - Protéine insérée dans la membrane Du coté de la cellule hôte - Met = récepteur Hamon, Nat rev Microbiol, 2006 - Protéine transmembranaire à activité tyrosine kinase - Voix de signalisation induisant des modifications du cytosquelette - Ligand naturel = Facteur de croissance des hépatocytes (HGF) La fixation de InlB /Met induit une voix de signalisation conduisant à l'endocytose de la bactérie Met Listeria monocytogenes : spécificité d'hôte Du côté de la bactérie - Adhésine = Internalin A et B (InlA, InlB) - Séquence et structure protéique conservée Du côté de la cellule hôte - Récepteur = Met et E-cadherine - Variabilité de séquence et de structure entre les espèces Hamon, Nat rev Microbiol, 2006 L'induction de l'endocytose par la bactérie n'est possible que si la clé (adhésine bactérienne) est adaptée à la serrure (récepteur cellulaire) Listeria monocytogenes : évasion du phagosome Lysteriolysine (LLO) - cytolysine - A pH acide des monomères de LLO s'oligomérisent pour former un complexe - Le complexe s'insère dans le membrane du phagosome - Formation d'un pore dans la membrane - Destruction du phagosome Hamon, Nat rev Microbiol, 2006 Phospholipase C (PLC) - Hydrolyse des phospholipides membranaires - Destruction du phagosome Listeria monocytogenes : réplication Extracellulaire Intracellulaire intracellulaire Milieu extracellulaire - Listeria consomme des sucres qui sont phosphorylés lors de l'importation (Phosphotransfer system: PTS) - Les sucres phosphorylés sont dégradés par la voie de la glycolyse - Séquestration de PrfA Freitag, Nat rev Microbiol, 2009 Milieu intracellulaire - Listeria détourne les sucres du catabolisme de l'hôte grâce au transporteur d'hexosephosphate (Hpt) - Les sucres internalisés sont dégradés par la voie des pentoses phosphate - PrfA libre Listeria monocytogenes : motilité intra-cellulaire WASP Arp2/3 Du côté de la cellule hôte Polymérisation de l'actine - Actine + Arp2/3 = Polymérisation de l'actine - Protéine WASP = Activation et recrutement de la machinerie de polymérisation de l'actine Du côté de la bactérie - ActA = Protéine similaire à WASP - Protéine de surface présente à un seul pôle de la bactérie Motilité par polymérisation de l'actine ActA recrute la machinerie de polymérisation de l'actine ce qui permet la motilité intra et inter-cellulaire de la bactérie Listeria monocytogenes : régulation de la virulence - Transcription monocistronique de prfA (faible) Temp <30°C - Structure secondaire de l’ARNm codant PrfA - Inhibition de la traduction PrfA faiblement actif PrfA fortement actif - Déstabilisation de la structure IIaire de l’ARNm prfA = traduction Temp >30°C - Activation de PrfA (si transport de sucre par PTS inactif) - Transcription polycistronique de prfA (forte) - Activation des gènes de virulence par PrfA Gènes de virulence Plan du cours I- Les bactéries du genre Listeria a- Le genre Listeria b- Listeria monocytogenes 1- Généralités 2- Cycle infectieux 3- Invasion cellulaire 4- Spécificité d'hôte 5- Evasion du phagosome 6- Réplication intra cellulaire 7- Motilité intra cellulaire 8- Régulation de la virulence III- L'espèce Escherichia coli a- Généralités b- Les pathovars E. coli c- Les E. coli entérohémorragiques (EHEC) 1- Généralités 2- Physiopathologie 3- Système de sécrétion de type III (LEE) 4- Lésion attachement/effacement 5- Régulation du LEE 6- Shiga-toxine 7- Régulation de la production de Shiga-toxine II- Les bactéries du genre Salmonella a- Le genre Salmonella b- Les sérovars Salmonella c- Salmonella enterica ssp enterica 1- Agent de la salmonellose 2- Cycle infectieux 3- Système de sécrétion de type III (SSTT) 4- Invasion des cellules non-phagocytaires 5- Réplication intra cellulaire 6- Régulation de SSTT SPI-1 Le genre Salmonella espèce sous- espèce enterica enterica indica salamae diarizonae houtenae Phylum Proteobacteria 99.7% 0.3% arizonae bongori Gram-négatif Morphologie bâtonnet, flagelé Anaérobie facultative Deux espèces : Salmonella enterica (6 sous espèces, ~2500 sérovars) = PREDOMINANTE Salmonella bongori (pas de sous espèces, 8 sérovars) = RARE Nomenclature : Salmonella enterica subsp. enterica ser Typhimurium = S. Typhimurium Les sérovars Salmonella Les sous-espèce de Salmonella sont divisées en sérovars caractérisés par des marqueurs antigéniques de surface : Antigène H - Antigène O = Extrémité du Lipopolysaccharide (LPS) - Antigène H = Filament du flagelle La variabilité antigénique des sousespèce de Salmonella contribue à sa capacité d'évasion du système immunitaire de l'hôte. Antigène O La variabilité de phase de l'antigène H chez Salmonella Certains sérovars de Salmonella possèdent deux types d'antigène H (= flagelline) codés par deux gènes distincts, fljB et fliC FljB L'expression de fljB et fliC est contrôlée par un mécanisme de variation de phase : FliC - Seul un des 2 gènes est exprimé dans une cellule donnée (figure) - La fréquence d'inversion de la région promotrice de fljB est de 10-4 à 10-5 par générations Bonifield, J. bact, 2003 Salmonella enterica ssp enterica : agent des salmonelloses Parasite intestinal des animaux vertébrés et des oiseaux (Salmonella Typhimurium) Pathogène spécifique à l'homme (Salmonella Typhi) Pathologie associée : Salmonellose - gastro-entérites - fièvre - fièvre Typhoïde - septicémie S. Typhimurium S. Typhi Incidence : - En France, 17000 cas humain en 2008 - Mortalité en absence de traitement : 1% (S. Typhimurium) à 10% (S. Typhi) des cas Salmonella enterica: cycle infectieux Haraga et al., Nat rev Microbiol, 2008 - Ingestion d'aliments contaminés - Survie dans l'estomac (pH acide) - Invasion des entérocytes non phagocytaires (cellules M) induite par la bactérie - Migration à travers l'épithélium intestinal jusqu'aux cellules lymhoïdes - Induction d'une réponse inflammatoire et recrutement des polynucléaire neutrophile (PMN) = gastro-entérite S. Typhimurium OU - Invasion des macrophages intestinaux et dissémination dans le S. Typhi système lymphatique = fièvre typhoïde Salmonella enterica: système de sécrétion de type III (SSTT) SPI-1 Système de sécrétion = injectisome - complexe protéique (~20 protéines) - codé par un ilôt de pathogénicité = Salmonella Pathogenicity Island (SPI) - Transport actif (hydrolyse de l'ATP) d'effecteurs bactériens directement dans le cytoplasme de la cellule hôte Translocon Aiguille Anneau transmembranaire - Seringue moléculaire : Anneau transmembranaire = pore dans les membranes bactériennes Aiguille = tube creux (Ø 6-12 nm) Translocon = pore dans la membrane de la cellule hôte Salmonella enterica: invasion des cellules non-phagocytaires • Activation du SSTT SPI-1 au contact des cellules hôtes 1 • Translocation d'effecteurs bactériens dans la cellule hôte : - Inducteur de l'endocytose : SopE, SopE2, SopB, SipC, SipA 2 3 - Activateur de la réponse inflammatoire : SopE, SopE2, SopB - Inhibiteurs : StpP, SspH1 Haraga et al., Nat rev Microbiol, 2008 La bactérie induit 1- son internalisation par endocytose (modulation du cytosquelette de l'hôte) 2- la réponse inflammatoire (activation de voies de signalisation) 3- le retour à un état cellulaire "normal" après internalisation (inhibition de voies de signalisation) Salmonella enterica: réplication intra cellulaire • Après endocytose, les bactéries sont contenues dans le phagosome • Le phagosome se transforme rapidement en vacuole (SCV) dont le pH est acide • Adaptation de la bactérie à l'environnement SCV • Activation du SSTT SPI-2 et sécrétion d'éffecteurs bactériens à travers la membrane du SCV : - Modification du cytosquelette : SspH2, SpvB, SseI, SseF, SseG, ... - Formation de filaments (Sif): SifA, PipB2 • Augmentation de la taille du SCV et réplication de la bactérie Haraga et al., Nat rev Microbiol, 2008 Le SST SPI-2 est impliqué dans la survie et la réplication de la bactérie dans la vacuole (SCV) Salmonella enterica: régulation de la virulence (SSTT SPI-1) • Le régulateur HilA codé par l'ilôt de pathogénicité SPI-1 est le régulateur central • L'expression de hilA est contrôlée par 3 activateurs (HilD, HilC, RtsA) et 1 inhibiteur (HilE). • HilD joue un rôle central dans l'intégration des signaux environementaux affectant l'expression de SPI-1 Plan du cours I- Les bactéries du genre Listeria a- Le genre Listeria b- Listeria monocytogenes 1- Généralités 2- Cycle infectieux 3- Invasion cellulaire 4- Spécificité d'hôte 5- Evasion du phagosome 6- Réplication intra cellulaire 7- Motilité intra cellulaire 8- Régulation de la virulence III- L'espèce Escherichia coli a- Généralités b- Les pathovars E. coli c- Les E. coli entérohémorragiques (EHEC) 1- Généralités 2- Physiopathologie 3- Système de sécrétion de type III (LEE) 4- Lésion attachement/effacement 5- Régulation du LEE 6- Shiga-toxine 7- Régulation de la production de Shiga-toxine II- Les bactéries du genre Salmonella a- Le genre Salmonella b- Les sérovars Salmonella c- Salmonella enterica ssp enterica 1- Agent de la salmonellose 2- Cycle infectieux 3- Système de sécrétion de type III (SSTT) 4- Invasion des cellules non-phagocytaires 5- Réplication intra cellulaire 6- Régulation de SSTT SPI-1 L'espèce Escherichia coli Phylum Proteobacteria Gram-négatif Morphologie bâtonnet Aérobie, Anaérobie facultative Tenaillon et al., Nat rev Microbiol, 2010 Espèce aérobie majoritaire dans l'intestin (flore commensale) Très grande diversité génétique (seulement ≈40% du génome commun à toutes les souches) 6 groupes phylogénétiques distincts (A, B1, B2, D, E, F) Certaines souches présentent un caractère pathogène pour l'homme ( ) Les pathovars Escherichia coli Les souches E. coli pathogènes sont classées en pathovars selon les pathologies qu'elles provoquent : Pathologies intestinales ETEC: diarrhées infantines (toxine) Entérotoxigénique Entéroaggrégative Entéroinvasive EAggEC: diarrhées persistantes (adhésion+ toxine) EIEC: syndromes dysentériques (invasion) EPEC : diarrhées infantines (attachement) EHEC: colite hémorragique, syndrome hémolytique et urémique (attachement + toxine) DAEC: diarrhées aqueuses (adhésion diffuse) Pathologies extra-intestinales UPEC: cystites, pyélonéphrites (Uropathogénique) MNEC: méningite néonatale Entéropathogénique Entérohémorragique Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) Apparus en 1982, responsable de toxi-infections alimentaires = Maladie du hamburger - Colites hémorragiques - Syndrome Hémolytique-Urémique (SHU) - Purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) Epidémiologie - ~ 100 cas/an en France, <1/105 enfant de moins de 15 ans - >50% dus à souches O157: H7 - Le tube digestif des ruminants constitue le principal réservoir des EHEC → Contamination via l’ingestion d’eau ou d’aliments contaminés (viande hachée) Spécificités du pathovar EHEC - Production de Shiga-toxine (Stx) - Formation de lésion attachement/effacement sur les cellules épithéliales intestinales E. coli entérohémorragiques : Physiopathologie - Contamination suite à ingestion aliments contaminés - Colonisation au niveau de l'intestin par adhésion intime aux cellules épithéliales intestinales Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) Colonisation Adhésion Mort cellulaire Inhibition synthèse protéique Production Stx Liaison Stx / récepteur - Induction de la réponse inflammatoire de l'hôte = Diarrhées - Production de la Shiga-toxine - Passage de la Shiga-toxine dans le système de circulation sanguine - Fixation de la toxine sur les récepteurs au niveau des cellules endothéliales du rein = SHU Induction réponse inflammatoire → Diarrhées Transcytose Stx ? E. coli entérohémorragiques : système de sécrétion de type III - Injectisome codé par un ilôt de pathogénicité = Locus of Enterocyte Effacement (LEE; 35kpb) - Transport actif d'effecteurs directement vers le cytoplasme de la cellule hôte - ≈ 40 effecteurs codés par le LEE ou par d'autres loci du chromosome bactérien Garmendia et al., Infection immunity, 2005 E. coli entérohémorragiques : lésion attachement/effacement - Attachement à la surface de la cellule hôte induite par la bactérie (interaction Intimin/Tir) : Tir = Protéine sécrétée par le SSTT qui s'insert dans la membrane de la cellule hôte Intimin = Protéine bactérienne de surface - Formation d'un piédestal induite par la bactérie : Tir et TccP = Protéines sécrétées par le SSTT qui activent la polymérisation de l'actine (N-WASP et Arp 2/3) EspB = Protéine sécrétée qui affecte le cytosquelette de l'hôte Torres et al., 2005 E. coli entérohémorragiques : Régulation du LEE ?? Walters and Sperandio, Infect Immun, 2006 - La régulation de l'expression du LEE implique des régulateurs non spécifiques (en gris) et des régulateurs spécifiques des EHEC (en noir) - Le régulateur clé est Ler codé par le LEE et qui lève la répression des opérons du LEE par le régulateur non spécifique HNS - L'expression du gène ler est elle-même soumise à régulation par : • des régulateurs spécifiques du LEE (GrlA, GrlR, Pch, EtrA, EivF) • des régulateurs non spécifiques : QseA=régulateur dépendant du quorum-sensing ??= senseur de Epinéphrine/Adrénaline….. E. coli entérohémorragiques : Shigatoxine (Stx) - Toxine codée par un phage (stxA et stxB) - Deux familles (Stx1 et Stx2) présentent seule ou en combinaison dans une souche EHEC donnée - Stx = hétéropolymère de type A1B5 - Activité dirigée contre les cellules endothéliales présentant le récepteur Gb3 (cerveau, rein) : Libération de la toxine dans la lumière intestinale Passage de Stx dans le système sanguin Fixation au récepteur Gb3 et internalisation Transport Rétrograde Clivage de la sous unité A : A→A1 + A2 Translocation de A1 vers le noyau Activité N-glycosidase de A1 inhibe la synthèse protéique (inactivation ribosome) Induction de l'apoptose et de la mort cellulaire Pradel N., 2001 E. coli entérohémorragiques : Shigatoxine - Régulation - stxAB sous la dépendance du promoteur tardif du phage Lysogène - Le phage peut être à l'état lysogène ou lytique : Lytique Lysogène : La répression par C1 empêche la transcription des gènes phagiques tardifs (dépendant de Pr') Lytique : La levée de répression par C1 permet l'expression des gènes précoces qui enclenchent la transcription des gènes tardifs y compris stxAB Waldor and Friedman, Curr. Opin. Microbiol., 2005 Le signal ( )qui entraine la dérépression est l'altération de l'ADN La libération de Stx est associée à la lyse des bactéries par le phage