rt_pcr

Représentation d’une méthode de chimie analytique
pour le module de méthodes de séparations analytiques
Hubert Girault
Présentée par : Mouhoub Amar étudiant en post-grade à l’IPS.
École des Sciences Criminelles
1015 Lausanne - Dorigny.
Le plan.
1- Définitions.
2- La PCR un procédé d’amplification.
3- La PCR en temps réel.
4- Champ d’application.
5- Conclusion.
6- Références.
1- Définitions.
>1- 1- RT-PCR :
> Real Time Polymerase chain reaction, appelée aussi qr-PCR
(Quantitative real time PCR) : Est une méthode quantitative en temps
réel des amplifiats de la PCR.
> Mais la RT-PCR est aussi la Reverse transcription –PCR.
> 1- 2- La Transcription.
> La transcription est la synthèse de l’ARN sous la direction de l’ADN. Les
deux acides nucléiques utilisent le même langage (dans l’ARN la base T
est remplacé par U). la molécule d’ARN qui en résulte représente une
transcription des instructions fournies par le gène pour la construction
d’une protéine. Ce type de molécule d’ARN est appelé ARN messager
(ARNm), qui se fait transcrit par des enzymes appelées ARN polymérase.
1- Définitions.
1- 2- La transcription
ADN
1- Définitions.
1- 2- La transcription
ADN
La transcription
ARNm
1- Définitions.
1- 2- La transcription
ADN
La transcription
ARNm
Protéines
1- Définitions.
> 1- 3- Reverse Transcription : (La reverse transcription)
> Certains virus à ARN appelés rétrovirus présente un sens à ``l’envers`` de
la circulation de l’information génétique, grâce à une enzyme spécifique
nommé reverse transcriptase, qui transcrit de l’ADN à partir d’une matrice
d’ARN. L’ADN nouvellement formé s’intègre alors sous forme de provirus
dans le génome de la cellule infectée par ce virus. Cette enzyme est
exploitée en biologie moléculaire dans les réactions de reverse transcription
suivie de PCR (RT-PCR).
1- Définitions.
1- 3- La RT (reverse transcription)
ARN
1- Définitions.
1- 3- La RT (reverse transcription)
ARN
Reverse transcription
ADN
1- Définitions.
1- 3- La RT (reverse transcription)
ARN
Reverse transcription
ADN
Intégration
2- La PCR un procédé d’amplification.
> 2- 1- La PCR.
> La PCR est l’amplification enzymatique ``In vitro´´. Appellée en
anglais Polymerase chain reaction cette réaction enzymatique
conduit à une amplification spécifique d’une séquence nucléotidique
donnée (amplifiats).
> 2- 2- La découverte de PCR.
> Le concept technologique a été découvert par Kary Mullis en 1983.
aujourd’hui, la méthode est devenue l’une des techniques de bases
pour ne pas dire l’une des techniques de référence, pour un large
spectre d’application en biologie moléculaire.
2- La PCR un procédé d’amplification.
> 2- 3- Principe de la PCR : La réaction enzymatique PCR
nécessite.
> _ Un extrait d’ADN.
> _ l’enzyme : ADN polymérase (Ampli Taq de la bactérie
Thermus aquaticus).
> _ Deux amorces (Primers).
> _ dNTP : les différentes nucléotides (A, T, C & G).
> _ Tampon (Buffer) qui assure un PH optimale (8-9) ainsi que la
présence d’ions Mg²+ .
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 3- Principe de la PCR : La réaction enzymatique
PCR nécessite.
_ Un extrait d’ADN.
_ l’enzyme : ADN polymérase (Ampli Taq de la bactérie
Thermus aquaticus).
_ Deux amorces (Primers).
_ dNTP : les différentes nucléotides (A, T, C & G).
_ Tampon (Buffer) qui assure un PH optimale (8-9)
ainsi que la présence d’ions Mg²+ .
PCR Mix
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 4- La Reverse Transcription – PCR.
Voici une animation de la réaction enzymatique
Reverse Transcription suivie d’une PCR (RT – PCR) ``In vitro´´.
AAAAA
RT TTTTT
AAAAA
RT
TTTTT
AAAAA RT
TTTTT
Une Amorce
d’Oligo dT
s’hybride avec
l’ARNm
La Reverse
Transcriptase
(RT) copie le 1er
brin d’ADNc
La Reverse
Transcriptase
digère et
remplace l’ARNm
et copie le
second brin
d’ADNc
L’ADNc
Double brin
Conversion de l’ARNm en ADNc par la Reverse Transcription
50º
A. ADN
double
brin.
96º
B. Dénatur-ation
50º
72º
C. Hybrida-tion des
amorces
Taq
D. Liaison de
la Polymerase
Taq
72º
Taq
Taq
Taq
E. Copiage
des brins
Taq
1
96º
1er cycle de
synthèse
d’ADNc (2
double
brains)
2
3
4
F.Dénatu-ration
1
2
G.Hybridation
des amorces
50º
3
4
1
Taq
72º
Taq
2
3
Taq
Taq
4
H. Liaison
de la
Polymerase
1
Taq
72º
2
Taq
I. Copiage
des brins
2ème
cycle
de
synthèse
de ADNc (4
doubles
brins)
3
Taq
Taq
4
1
J.
Dénaturation
à 96º
2
3
4
Hybridation
des amorces
à 50º
1
72º
2
3ème cycle
de
synthèse
d’ADNc
(8
doubles
brins)
3
4
K.
Liaison de la
polymerase
(non montré)
et copiage des
brins
1
L.
Dénaturation
à 96º
2
3
4
Hybridation
des amorces
à 50º
1
72º
M.
Copiage des
brins à 72º
2
3
4ème cycle
de
synthèse
(16
doubles
brins)
4
1
Les doubles
brins
d’ADNc (16)
sont
représentés
sous forme
de lignes
2
3
4
1
Après 5ème cycle
ces 32 doubles
brins dont 24
(75%) ont la
même taille
2
3
4
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 5- Représentation de la quantité d’ADN double brin à différents
cycles d’amplification.
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 5- Représentation de la quantité d’ADN double brin à différents
cycles d’amplification.
•2- 6- Représentation graphique.
2- 7- Échelle logarithmique
2- La PCR un procédé d’amplification.
2- 6- La PCR traditionnel est
seulement semi quantitative.
La PCR conventionnel ne peut
Pas être considéré une analyse
quantitative et les résultats sont
habituellement exprimés en termes
de positivité / négativité.
Une évaluation sémi-quantitative est
possible sur la base de l'aspect de
positivité (faible/forte) de bande
électrophorétique, mais cette
approche est fortement subjective et
la sensibilité est très basse.
3- La PCR en temps réel
> 3- 1- Principe.
> Higuchi & al, 1992, ont été les pionniers de l'analyse de la cinétique
de la PCR en concevant un système qui détecte les produits de PCR.
Ce système « en temps réel » a utilisé le bromure d'éthidium qui se
lie aux quantités croissantes d'ADN bicaténaire amplifiée, ayant pour
résultat une augmentation de la fluorescence.
3- La PCR en temps réel
3- 1- les méthodes de détections.
a- SYBER Green.
Le SYBER Green est un colorant luminescent qui se lie à l’ADN
double brin mais pas à l’ADN simple brin où la florescence devient
plus forte et plus sensible que le bromure d’éthidium. Utilisé pour
contrôler la synthèse d’ADN durant la réaction PCR en temps réel (RT-PCR).
•3- La PCR en temps réel
• 3- 1- les méthodes de détections.
• a- SYBER Green.
>
b- TaqMan.
> La méthode de TaqMan est basée sur l’activité 5’-3’ exonucléase la
de l’ADN polymérase (AmpliTaq) qui clive une sonde doublement
marquée hybridé à la séquence cible pendant l'amplification de la
PCR. Cette méthode à l’avantage d’être spécifique de l’ADN
amplifié comparé au SYBER Green qui peut se lie aussi aux produits
non spécifique de la PCR.
•3- La PCR en temps réel
•3- La PCR en temps réel
• b- TaqMan.
• b- 1- Principe de la méthode TaqMan.
> Après extraction d’ADN, l’extrait d’ADN est ajouté à un mélange de la
réaction PCR (PCR Mix ) contenant les composants standard de PCR plus
une sonde qui s’hybride à la matrice entre les deux amorces (cf schéma).
Cette sonde contient un colorant fluorescent de signal à l’extrémité 5 ' (6carboxyfluorescein, 6-FAM ; émission λ max = 518 nm) et un colorant
``Quencher´´ (extincteur) à l’extrémité 3‘, 6carboxytetramethylrhodamine, TAMRA ; émission λ max = 582 nm)
L'extincteur peut seulement éteindre la signal de fluorescence quand les
deux colorants sont près l'un de l'autre. C'est seulement dans le cas d'une
sonde intacte. Une fois que l'amplification se produit, la sonde est dégradée
par l'activité 5 '- 3 ' exonuclease de l’ADN polymérase (AmpliTaq), et la
fluorescence sera détecté à l'aide d'un laser intégré dans le détecteur de
séquence.
•3- La PCR en temps réel
• 3- 2- Description d’un appareil.
> Il y a beaucoup d’appareil de PCR en temps réel disponibles et celui
montré ci dessous est l'ICycler® de BioRad. Le couvercle glisse pour
placer la plaque des échantillons de 96 puits. Ce qui permet d’analyser
plusieurs échantillons simultanément.
•3- La PCR en temps réel
• 3- 2- Description d’un appareil.
L’appareil est doté d’un détecteur sensible qui surveille la florescence dans
chaque puit de la plaque à chaque cycle d’amplification.
•3- La PCR en temps réel
•3- 3- les résultats obtenus à l’aide d’un appareil de
``Bio-Rad ICycler΄΄ de RT-PCR.
> La courbe obtenus (grand carré) est identique à la courbe théorique (petit
carré) ; de même pour la courbe en échelle logarithmique.
•3- La PCR en temps réel
3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?
>
Ce graphe montre une série de dilution de
10 X d’un échantillon d’ADN.
>
Plus l’échantillon est dilué il faut plus de
cycle pour que l’amplification soit
discernable.
>
Ainsi, la quantification de la quantité
d’ADN dans l'échantillon initial doit être
faite où l'amplification est logarithmique,
nous mesurons le nombre de cycle auquel
l'augmentation de la fluorescence (et donc
d’ADN) est logarithmique. Ceci est
montré par le trait horizontal orange dans
la figure (le seuil) et est placé par
l'utilisateur. Le point auquel la
fluorescence croise le seuil s'appelle la Ct
>
Le même graphe précédent mais sur une
échelle logarithmique
.
•3- La PCR en temps réel
3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?
> On peut maintenant tracer les valeurs de Ct en fonction de la concentration d’ADN.
La courbe est une droite (R = 0,990).
•3- La PCR en temps réel
3- 4- comment on va mesurer la concentration d’ADN initial?
> On peut déduire la quantité d’ADN qu’on a amplifié par PCR d’un
échantillon en extrapolant sa valeur Ct sur cette droite. Pour une valeur Ct =
25 cycle on a log q = 4 donc q = 10000 copies d’ADN.
•3- La PCR en temps réel
3- 5- L’effet de l’efficacité sur la PCR.
> Voici une série de calcul du taux d’ADN qui sera théoriquement amplifié à
différentes efficacités. Une petite différence dans l’efficacité de 10% induit
une grande perte de 80% d’ADN amplifié après 30 cycles.
4- Champ d’application.
> 1- La Real Time - PCR a été utilisé chez l'homme pour mesurer la charge
virale pour le diagnostic des différentes maladies provoquées par des virus à
ADN tels que : CMV, HIV, HCV et HBV.
> la surveillance des patients présentant l'infection du CMV a démontré que
le nombre de copie d'ADN de CMV a changé proportionnellement avec la
thérapie anti-CMV, confirmant que cette technique est tout à fait utile pour
diagnostiquer le début des maladies liées au CMV et surveiller la
réactivation de virus chez les patients présentant les infections CMV
latentes.
> 2- la Real Time - PCR peut être utile pour l’étude des phénomènes
immunologiques se produisant pendant la l'immunothérapie basé sur les
peptides HLA de classe I, par la mesure du niveau de transcription de
l'interféron-gamma (IFN-γ).
4- Champ d’application.
>
>
1:
3- Travail personnel en science forensique.
La Reverse Transcriptase - PCR peut être utilisé pour la détection des
ARNm exprimés dans un type de cellules donnés notamment la salive qui
exprime de manière spécifique 5 gènes rapportés dans la littérature1, qui
peut s’avérer très utile dans l’identification des fluides biologiques
contenus dans les traces biologiques.
l’aspect quantitatif de la Real Time - PCR peut permettre l’évaluation des
taux d’ARNm dans une quantité donnée de salive (volume ou nombre de
cellule) a fin de remplacer les tests biochimiques conventionnels qui on
une sensibilité de : 1/10µl de salive.
J. Juusolaa, J. Ballantyne. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid
identification. Forensic Sci. Int. 135 (2003) 85–96.
5- Conclusion.
> La Réél time PCR ou PCR quantitative en
temps réel permet une quantification
extrêmement sensible des niveaux de
transcription d’un gène cible en quelques
heurs avec une manipulation minimale
d’échantillon qui diminue par conséquence
les risques de contaminations.
5- Références.
1- D. Larzul, La PCR un procédé d’amplification ``In
vitro´´, 1993 Technique et documentation – Lavoisier.
Paris.
2- M. Provenzano et al, The Usefulness of Quantitative
Real Time PCR in Immunogenetics. ASHI Quarterly,
Third Quarterly, 2001.
3- www. med. SC. edu85 / pcr / real time-home.htm.
> Et merci pour votre attention.