LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES
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LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES EN CANCEROLOGIE HUMAINE Dr Donatien MOUKASSA Département d’histo-embryologie et d’anatomie pathologique, FSS, UMNG EPU, Fondation Congolaise en Recherche Médicale, 5 Mars 2011 PLAN DE L’EXPOSE • Introduction I. II. III. IV. Rappels historiques Bases fondamentales Outils méthodologiques Applications en pathologie tumorale maligne 1. 2. Intérêt Types de description V. V- Contraintes et difficultés VI. VI- Perspectives d’avenir • Conclusion INTRODUCTION (1) • Maladie cancéreuse (a) – Démarche médicale • Prévention primaire / secondaire • Dépistage • Diagnostic de certitude • Stade évolutif – Pronostic • Adaptation thérapeutique INTRODUCTION (2) • Maladie cancéreuse (b) – Outils scientifiques • Cliniques (observation) • Para-cliniques (techniques complémentaires) –Morphologiques –Biologiques +++ –Radiologiques INTRODUCTION (3) • Maladie cancéreuse (c) – Outils scientifiques • Techniques de biologie moléculaire – 20 dernières années – Approches » Prévention adaptation thérapeutique – Place importante: démarche médicale – Exemples: » 90%: diagnostic des LMNH » 80-90%: adaptation thérapeutique, cancers du sein » 60-75%: prévention primaire, dépistage CCU RAPPELS HISTORIQUES (1) MÉDECINE DANS L’ANTIQUITÉ • Hippocrate – Ve siècle av. J.-C.. – Notion de « CANCER », « TUMEUR » – «doigts en baguette de tambour » • = hippocratisme digital • Cancer du poumon RAPPELS HISTORIQUES (2) MÉDECINE EN ÉGYPTE ANTIQUE • Papyrus Ebers – XVIe siècle av. J.-C. – 1er document – Description des tumeurs RAPPELS HISTORIQUES (4) • 1676 – Antoni van Leeuwenhoek • Découverte microscope • 1865 – Gregor Mendel (1822-1884) • Transmission des caractères génétiques, • Lois de Mendel. – Claude Bernard (1813-1878) • Introduction à l'étude de la médecine expérimentale (ouvrage) RAPPELS HISTORIQUES (5) • +++ XXe siècle – Médecine fondée sur les preuves, – Avancées technologiques • Immunologie – Immunohistochimie +++ • Génétique – Génétique moléculaire+++ • Cancérologie – Expérimentale +++ • Biologie moléculaire. RAPPELS HISTORIQUES (6) DECOUVERTES SCIENTIFIQUES • 1949 – Enders • Techniques de cultures cellulaires • 1953 – Crick et Watson • Découverte, structure de l’ADN • Bases+++ – Biologie moléculaire, – Génétique moderne ADN: Structure RAPPELS HISTORIQUES (7) • 1960 – Méthodes d'immunomarquage – Anticorps monoclonaux • 1985 – Saïki RK • Techniques d'amplification génomique – Science 1985; 230 : 1350-4. • Méthodes de biologie moléculaire +++ – Diagnostic viral, – Diagnostic des cancers. BASES FONDAMENTALES (1) • Génomes humains – Cellules humaines: • Acides nucléiques : support , information génétique – Acide Désoxyribo-Nucléique (ADN) – Acide Ribo-Nucléique (ARN) • Génomes tumoraux – Cellules tumorales • Acides nucléiques: altérations moléculaires – – – – Différenciation cellulaire Maturation cellulaire Division cellulaire (apoptose) Patrimoine génétique: fonction physiologique+++ BASES FONDAMENTALES (2) ADN • Bicaténaire • Structure: – Double hélice – Brin = enchaînement de désoxyribonucléotides: • Une base purique (Adénine: A, Guanine: G) • Une base pyrimidique (Cytosine: C, Thymine: T) • Les brins – Dissociables par dénaturation (par la chaleur) – Réassocient par hybridation – = 2 phases majeures utilisées en biologie moléculaire. STRUCTURE BASES FONDAMENTALES (3) • ARN – Monocaténaire – Structure des brins • Analogue à celle de l'ADN • Uracile à la place de la Thymine – Peut être copié en ADN monobrin • Une enzyme – = Transcriptase inverse (reverse transcriptase ou RT) OUTILS METHODOLOGIQUES (1) « Process » technique (a) • Étapes: – Étape 1: • • • • Extraction des ADN et ARN, Découpage, Séparation et analyse fragmentaire, Séquençage – Étape 2: • Mise en évidence qualitative ou quantitative de fragments soigneusement choisis OUTILS METHODOLOGIQUES (2) « Process » technique (b) • L'extraction – Moyens: • Biochimique: – Mini-colonnes chargées négativement » Fixation-élution ADN (Quiagen, HC2). – Suspension de poudre de verre – Phénol + chloroforme ou éther + alcool concentré. • Lyse enzymatique • Chauffage OUTILS METHODOLOGIQUES (3) « Process » technique (c) • Le découpage – Les enzymes-outils • = Enzymes de restriction – Endonucléases d'origine bactérienne: » Dnases, » Et, RNases – Coupure au niveau de séquences spécifiques. • Fragments obtenus: – Petite taille, – Analyse facile. OUTILS METHODOLOGIQUES (4) « Process » technique (d) • La séparation et analyse fragmentaire – Mises en œuvre par électrophorèse : • En gel de polyacrylamide de 3,5 à 15 % – Fragments de 20 à 2 000 pb • En gel d'agarose de 0,6 à 1,5 % – Fragments de 0,2 à 20 kb. – Variante: électrophorèse en champ pulsé • Fragments d'ADN supérieurs à 50 kb. OUTILS METHODOLOGIQUES (5) « Process » technique (e) • Les sondes spécifiques ou amorces – Oligonucléotides de synthèse • = Fragments d'ADN de moins de 100 bases • Marquage: repérage et sa quantification. –Marquage au 32P –Marquage à la biotine OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Les différentes techniques • L'hybridation moléculaire – Hybridation in situ • L’amplification génique ou enzymatique – PCR in situ, nichée ou multiplex • La quantification des acides nucléiques – PCR, RT-PCR quantitative • Le génotypage OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Prétraitements techniques (a) • Types d’échantillons biologiques – Prélèvements cellulaires • • • • Suspensions cellulaires Frottis (cytobrosse cervico-utérine) Cytoponction l’aiguille fine Écoulement mammaire… – Prélèvements tissulaires • Biopsies • Pièces opératoires • Pièces autopsiques OUTILS METHODOLOGIQUES (6) Prétraitements techniques (b) • Conditionnement des échantillons biologiques – Mode de fixation • • • • • • État frais +++ Cryoconservation (-20°C, -80°C) Azote liquide Formol tamponné à 10% + inclusion en paraffine Glutaraldéhyde Milieu de transport: STM, EasyPrep… – Choix des sondes, des amorces et/ou de la technique CASSETTE D’INCLUSION, FIXATION, F10% CANCER DU SEIN: CRYOCONSERVATION, CRYOSTAT OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • L'hybridation moléculaire – Complémentarité des bases nucléotidiques ADN / ARN – Techniques : • Hybridation sur tâche ou dot-blot – Directement sur l'échantillon déposé sur un filtre • Southern-blot (ADN) • Northern-blot (ARN) • L'hybridation en milieu liquide • FISH (fluorescence +++) OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • L'hybridation moléculaire – L'hybridation in situ +++ • Sur coupes tissulaires ou sur cellules fixées+++ • Morphologie + localisation, • Sonde de 50 bases environ. OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • L'amplification enzymatique ou génique – La Polymerase Chain Reaction (PCR) • Technique la plus utilisée • Types: – Nested-PCR (PCR nichée) – Semi-nested PCR, – PCR multiplex – Autres… OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • L'amplification enzymatique ou génique – La technique de l'ADN branché • Concept différent : – Au lieu d'amplifier la cible, c'est le signal qui est amplifié OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • La quantification des acides nucléiques – PCR quantitative • Compétition avec standard interne pour les ARN consiste à amplifier simultanément avec les mêmes amorces. OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • Le génotypage – Fragment génomique isolé par PCR ou RT-PCR. – Protocoles utilisables : • PCR spécifique de type – Une région choisie + amorce universelle + amorce typespécifique • PCR universelle – Amplification avec des amorces universelles OUTILS METHODOLOGIQUES Les différentes techniques • Les techniques des biopuces à ADN (microarrays) – Technique nouvelle +++ – Déterminer les profils d’expression de groupes tumoraux homogènes / tissus contrôles – Indication: • Tumeurs malignes+++ – But: • Classification tumorale / profils d’expression APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (1) • Schématiquement: – – – – – La pathogénie tumorale ou oncogenèse Les marqueurs génétiques de susceptibilité et de clonalité Les classifications moléculaires Le pronostic clinique La prédiction thérapeutique APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (2) • La pathogénie tumorale ou oncogenèse – Utilisation de la technique de microarray • Identification de gènes – Tissus tumoraux/tissus normaux – Processus tumoral (bases) • Intégration virale – HPV – CCU – LNH à GC B – VIH – CHC – VHB (P Wattré et al., 1997) • Altérations génomiques – Oncogènes / anti-oncogènes – Évaluation de la progression tumorale. APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (3) • Marqueurs génétiques de susceptibilité et de clonalité – Exemples: • Cancer du sein – 2 gènes majeurs de susceptibilité au cancer : » BRCA1, » BRCA2 – Syndromes Prédisposition Héréditaire » 20-25 %: • Lymphome folliculaire – Translocation (14;18) = marqueur de clonalité (PCR) APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (4) • Les classifications moléculaires – Utilisation des biopuces (microarrays) – Les cancers du sein : • 4 classes tumorales statut RH, Her2, grade histologique – Tumeurs du sein basal-like, – Tumeurs amplifiées pour le gène ERBB2 (HER2), – Tumeurs luminales A, – Tumeurs luminales B. – Les lymphomes non hodgkiniens • Lymphomes folliculaires • LMH EBV induits: Burkitt +++ HER2 +, HIS CARCINOME CANALAIRE INVASIF: RO+, RP+, Her2+ CANCER DU SEIN, FISH: DOUBLE MARQUAGE, RP, RO APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (4) • Les classifications moléculaires – Sarcomes (JM Coindre et al., 2010) • Hétérogènes • Classification complexe et peu reproductible. – Classification moléculaire: • Sarcomes avec translocation spécifique • Sarcomes avec un profil génomique simple – Liposarcomes bien différenciés, – Liposarcomes dédifférenciés – Sarcomes intimaux (gènes MDM2 , CDK4) • Sarcomes avec une mutation activatrice – Environ 90 %: GIST, » Mutation d'un gène codant pour un récepteur à activité tyrosinekinase (c-KIT, CD117). Sarcome synovial Cubitus Sarcome d’Ewing Humérus Deux sarcomes à morphologie similaire Lequel est le Sarcome d’Ewing? JM Coindre et al. Sarcome de Ewing translocation (11,22) (q24;q12) Sarcome synovial peu différencié translocation (X;18) (p11;q11) APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (5) • Le pronostic clinique – Biopuces d’expression+++ – HIS, PCR – Signatures moléculaires • Évolution clinique précise – Parfois > critères habituellement utilisés • Lymphomes non hodgkiniens – Détection de la maladie résiduelle / PCR » Lymphomes folliculaires (G Delsol et al., 1998) – Réarrangement du gène TCR: lymphomes T APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (6) • Le pronostic clinique – Utilisation des techniques d’hybridation • Signatures moléculaires: expression protéique (IHC) • Cancer du col de l’utérus – HPV HR 16 et/ou 33 et/ou 45 (D Moukassa et al., 2010, en cours) » Hybrid Capture 2 • Cancer colorectal – Gène MUC4/MUC2 (D Moukassa et al., 2011) CARCINOME DU COL UTÉRIN, HIS, HPV 16 + APPLICATIONS EN PATHOLOGIE TUMORALE MALIGNE Intérêt (7) • La prédiction thérapeutique – Signature d’expression génique de prédiction • Exemple: Réponse à la chimiothérapie – Cancer du sein (hormono-sensibles) – Cancer de la prostate (hormono-sensibles) – Restrictif • Environnement tumoral – Cellulaire (stroma entourant la tumeur) , – Organique (caractéristiques de la cellule hôte) • Études de la sensibilité des tumeurs – Chimiothérapie préopératoire (néo-adjuvante) CONTRAINTES ET DIFFICULTES • Compétence technique – Réactualisation des connaissances – Appropriation du procédé technique • Plateau technique – Lourd – Cher – Maintenance • Approvisionnement – Réactifs – Fournisseurs PERSPECTIVES D’AVENIR • Intégration des techniques de biologie moléculaire dans la pratique quotidienne en milieu hospitalier – Diagnostic de certitude des cancers, – Pronostic et suivi de la maladie cancéreuse, – Adaptation et orientation thérapeutiques • Intégration dans les curricula universitaires – Formation traditionnelle (CM, ED, TP) – Diplôme complémentaire (DU, CU…) CONCLUSION • Avancées technologiques: – PEC globale de la maladie cancéreuse • Biologie moléculaire+++ • Caractérisation du profil moléculaire – Techniques adaptées • Hybridation, amplification génomique, génotypage… – Coûts élevés • = frein modernisation des plateaux techniques, PEV – Réactualisation des connaissances
