LE BAYON Jean-Christophe Master de sciences, technologie et santé, mention génétique et biologie cellulaire (GBC), spécialité génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire (recherche) de l’université Claude Bernard – Lyon I – Numéro d’immatriculation du ministère : 20070447 Mail : jc.le.bayon AT gmail POINT com Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines d’enveloppe F et HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée cellulaire des virus parainfluenza humains et animaux. Année 2009-2010 : première année de thèse Résumé L’entrée des paramyxovirus dans la cellule hôte nécessite, en général, l’implication coopérative de deux glycoprotéines (GP) virales de surface. Chez les virus parainfluenza et les avulavirus, ce rôle est joué par la GP d’ancrage hémagglutinine-neuraminidase (HN) et la GP de fusion (F). L’activation de la GP F par la GP HN est nécessaire au processus de fusion membranaire, mais son mécanisme moléculaire reste encore mal connu. Mon projet de recherche consistera en l’évaluation de caractéristiques fonctionnelles des GP, du virus parainfluenza humain de type 2 (hPIV-2) et du virus de la maladie de Newcastle affectant les poulets (NDV), mutées sur la base de mutations déjà caractérisées au sein du laboratoire sur le virus parainfluenza de type 5 (PIV-5), et de mutation observée sur les GP de souches variantes de hPIV-2. La synthèse de mutants des GP F et de HN de hPIV-2 et NDV jouant un rôle sur la fusion membranaire devra être abordée dans un premier temps. Les ADNc des gènes viraux codant pour ces GP ont déjà été extraits et placés dans un plasmide d’expression eucaryote. Un ensemble de mutations sont aujourd’hui à effectuer, en utilisant la technique de mutagénèse dirigée. Les mutations seront choisies en fonction de mutation déjà observée sur la GP F de souches variantes ayant des capacité à former des syncytia en culture cellulaire importante ou alors déterminées par rapport à des mutations connues pour jouer un rôle dans l’autonomie de F de PIV-5 (souche W3A) et par ailleurs déjà caractérisées au laboratoire (article soumis pour publication, brevets FR 08/06547 et FR 08/06548). 1 La caractérisation fonctionnelle de ces GP lors de leur expression transitoire par des cellules devra ensuite être effectuée. La quantification du potentiel fusogène des GP F ou de la combinaison F/HN se fera grâce à des tests de fusion cellule-cellule. La quantification de l’expression en surface de ces glycoprotéines se fera grâce à l’observation de ces cellules immuno-marquées en cytométrie en flux et par Western-blot. La fusion intercellulaire et l’expression des GP pourront être observés par observation de cellules immuno-marquées par un fluorophore au microscope confocal. L’expression puis étude de ces mutants sur des particules pseudo-virales (VLP). Ce système permettra d’analyser plus finement le comportement de glycoprotéines et d’utiliser des méthodes plus sensibles pour caractériser la fusion inter-membranaire comme le “lipidmixing”. L’incorporation des glycoprotéines sera observée et analysée grâce à des techniques de microscopie électronique à transmission et de microscopie cryo-électronique. De plus le laboratoire devrait acquérir un système de génétique inverse de NDV, qui sera utilisé afin d’étudier le comportement des différents mutants dans le cadre d’une infection. Ce système pourra être adapté à hPIV-2 et PIV-5 et aura l’avantage de confirmer le rôle des GP mutées dans un contexte viral. Pour certains mutants présentant des caractéristiques impliquant la coopération entre F et HN, des études d’interactions entre F et HN seront menées, afin de déterminer les domaines de la GP impliqués dans l’interaction. Ceci sera possible notamment grâce à des techniques de co-immunoprécipitation. Nous pensons ainsi, grâce à ces études, pouvoir comprendre plus finement le mécanisme d’entrée de ces virus dans la cellule, plus particulièrement la relation entre les GP d’attachement et de fusion. Cette connaissance pourrait permettre le développement de nouveaux antiviraux, inhibiteurs d’entrée, comme le Fuzéon® contre HIV-1, mais ciblant l’interaction entre F et HN. Ces drogues pourraient ainsi 1) empêcher l’activation de la GP F par HN 2) bloquer les interactions entre HN et F et rendre ainsi cette dernière nonfonctionnelle ou 3) activer précocement la GP F, en mimant l’action de HN, et inactiver ainsi celle-ci. 2 UMR : CNRS FRE 3011 Équipe : Pathogénèse des virus respiratoires Responsable de l'équipe : Pr Bruno Lina Directeur de thèse : Dr Manuel Rosa-Calatrava 3