Analyse des mutations des gènes cibles de l`instabilité microsatellite

RÉSUME
Un certain nombre de tumeurs urothéliales du
haut appareil urinaire (UUC pour urothelial cell
carcinoma), sporadiques ou qui se développent
dans le cadre du syndrome du cancer colorectal
héréditaire sans polypose (HNPCC pour heredita-
ry non polyposis colorectal cancer), présentent
une instabilité des microsatellites (MSI pour
microsatellite instability). Cette instabilité des
microsatellites est le reflet d’un défaut du système
de réparation des mésappariements de bases de
l’ADN (MMR pour mismatch repair). Ainsi, les
tumeurs MSI accumulent des mutations dans de
nombreux gènes qui comportent dans leurs
séquences codantes des séquences répétées ;
ces mutations conduisent à un décalage du cadre
de lecture et sont responsables de la synthèse
d’une protéine tronquée. Après avoir évalué l’inci-
dence du phénotype MSI dans 58 UUC à l’aide
des deux panels de marqueurs recommandés par
le National Cancer Institute, nous avons étudié la
distribution intra-tumorale des mutations secon-
daires de la mutagenèse MSI dans 13 gènes
cibles potentielles.
Parmi les 58 UUC évaluées, 4 (7%) présentaient
un phénotype MSI. Deux patients étaient atteints
d’un syndrome HNPCC. Trois des 4 tumeurs com-
portaient des mutations de MSH3, BAX, MRE11 et
RAD50. Des mutations d’autres gènes, impliqués
dans des voies cellulaires clés (ATR, DNA-PKcs,
MBD4, TCF-4, MSH6 et BLM), ont été aussi
détectées. Les mutations de BAX et de MRE11
étaient présentes de façon homogène au sein des
3tumeurs. Une analyse immunohistochimique a
confirmé la perte d’expression d’une des protéi-
nes du système MMR dans chaque tumeur
(MLH1, MSH2 et MSH6). Elle a aussi montré qu’u-
ne mutation de MRE11 ou de RAD50 induit la
perte d’expression conjointe des deux protéines,
qui font partie d’un même complexe protéique
(MRE11/RAD50/NBS1).
Les UUC avec un phénotype MSI sont rares et les
mutations de RAD50 et de MRE11 y sont fré-
quentes et probablement précoces, suggérant
leurs rôles clés dans la genèse de ces tumeurs.
MOTS CLES
Tumeur urothéliale, haut appareil urinaire, syndro-
me HNPCC, instabilité des microsatellites, gènes
cibles.
I. INTRODUCTION
Les tumeurs urothéliales sont un des cancers les
plus fréquents, responsables de 10% de la morta-
lité par cancer. La majorité de ces tumeurs se
développe dans la vessie, mais 5% apparaissent
dans le haut appareil urinaire, calices, bassinet et
uretère. Actuellement, le diagnostic de tumeur
Analyse des mutations des gènes cibles de l’instabilité
microsatellite dans les tumeurs urothéliales du
haut appareil urinaire
Pierre Mongiat-Artus1,Catherine Miquel2,Madelon van der Aa3,Olivier Buhard4,
Richard Hamelin4,Hany Soliman5,Chris Bangma6,Anne Janin7,Pierre Teillac1,
Theodorus van der Kwast 3,Françoise Praz4
1Service d’Urologie, Université Paris VII, Hôpital Saint-Louis, Paris, France.
2Service d’anatomopathologie, INSERM, U752; Université Paris V, Hôpital Sainte-Anne, Paris, France.
3Department of Pathology, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands.
4INSERM, U762 ; Université Paris VI, Paris, France
5Service de Biochimie, CNRS UPR 9051, Hôpital Saint-Louis, Paris, France
6Department of Urology, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands.
7Service d’anatomopathologie, INSERM U728, Hôpital Saint-Louis, Paris, France
1286
Progrès en Urologie (2005), 15, Supp. N°1, 1286-1292
INMEMORIAM PRD. CHOPIN

urothéliale du haut appareil urinaire (UUC) est
généralement porté à l’occasion du suivi d’une
tumeur urothéliale de vessie. Les UUC apparais-
sent de façon sporadique, mais des facteurs héré-
ditaires peuvent aussi présider à leur développe-
ment, certains cas survenant dans le cadre du
syndrome du cancer colorectal héréditaire sans
polypose ou syndrome HNPCC [3]. Le syndrome
HNPCC est une maladie héréditaire de transmis-
sion autosomique dominante due à une mutation
germinale dans un des gènes du système MMR,
généralement MLH1 ou MSH2 et plus rarement
MSH6 ou PMS2 [25]. Ce syndrome est caractéri-
sé par un risque élevé de cancer colorectal (82%),
de cancer de l’endomètre (60%), ainsi que de can-
cer de l’estomac (13%), ovarien (12%), urothélial
du haut appareil urinaire (4%), cérébral (3,7%) et
hépato-biliaire (2%) [1, 30, 33, 34].
L’instabilité des microsatellites (MSI) est un phé-
notype tumoral révélateur d’un défaut du système
MMR, caractéristique des tumeurs HNPCC et de
15% des cancers colorectaux sporadiques. Les
mutations germinales des gènes du système
MMR sont la cause principale du syndrome
HNPCC, alors que la méthylation du promoteur de
MLH1 est le mécanisme dominant de l’inactivation
du système MMR dans les tumeurs sporadiques
[18, 20]. Les microsatellites sont de courtes
séquences répétées de l’ADN, dispersées dans
tout le génome, particulièrement sujettes aux
mutations de type insertion ou délétion qui sur-
viennent durant la réplication. De nombreux mar-
queurs microsatellites et critères diagnostiques
ont été utilisés pour déterminer le phénotype MSI
des tumeurs, conduisant à des résultats extrême-
ment variables et contradictoires. Le consensus
de Bethesda a été un point de repère important
pour standardiser l’analyse du phénotype MSI
dans les tumeurs colorectales ; il a recommandé
l’utilisation d’un panel de 5 marqueurs (2 mononu-
cléotidiques et 3 dinucléotidiques) dans la tumeur
et l’ADN normal pour classer les tumeurs en MSI-
High (MSI-H, MSI sur 2 loci ou plus), MSI-Low
(MSI-L, MSI sur 1 locus) ou MSS (MS stable, sans
instabilité) [6]. Seul le phénotype MSI-H caractéri-
se les tumeurs HNPCC ou sporadiques qui com-
portent un défaut du système MMR. Cependant,
l’utilisation du panel original de Bethesda n’est
pas exempte de difficultés techniques en particu-
lier, l’utilisation d’un trop grand nombre de mar-
queurs dinucléotidiques a conduit à classer des
tumeurs de façon erronée en MSI-High. Ainsi, la
dernière réunion de consensus a récemment
recommandé, comme une alternative au panel
original de Bethesda, l’utilisation de 5 marqueurs
mononucléotidiques quasi-monomorphes couplés
dans une seule PCR dite « pentaplex » [7, 31, 32].
Cette PCR permet un dépistage rapide d’un grand
nombre d’échantillons tumoraux avec une grande
spécificité et une grande sensibilité et une inter-
prétation univoque des résultats sans avoir
recours à l’ADN normal des patients.
Les études portant sur le statut MSI des tumeurs
urothéliales du haut appareil urinaire sont rares et
l’incidence du phénotype MSI déterminé en utili-
sant le panel de Bethesda classique dans ces
tumeurs varie de 4 à 31% [5, 8, 12, 17, 29]. Ces
variations peuvent résulter de problèmes d’inter-
prétation des marqueurs dinucléotidiques, de l’uti-
lisation de critères moins stringents que ceux exi-
gés par la conférence de consensus et de popu-
lations d’étude différentes. Les UUC MSI-H ont
été décrits comme survenant plus volontiers dans
l’uretère, présentant une croissance inversée et
un taux d’envahissement musculaire plus faible
par rapport aux UUC MSI-L et MSS [8, 16, 17].
Les cancers colorectaux MSI possèdent aussi des
caractéristiques cliniques et pathologiques spéci-
fiques : un risque métastatique moindre, une
meilleure survie et une réponse spécifique à la
chimiothérapie [13, 27]. Il paraît ainsi important de
pouvoir identifier avec certitude les UCC MSI.
La carcinogénèse des tumeurs MSI est un pro-
cessus évolutif dans lequel l’instabilité des micro-
satellites provoque l’accumulation et la sélection
d’un grand nombre de mutations secondaires
inactivatrices dans des régions codantes de
gènes, dits cibles, qui peuvent promouvoir la car-
cinogenèse [9, 36]. La plupart des études réali-
sées sur les gènes cibles ont été effectuées dans
des cancers du côlon, de l’endomètre et de l’esto-
mac ; elles suggère une spécificité tissulaire, la
fréquence de mutation d’une gène cible donné
étant variable selon l’organe où les tumeurs se
développent [9, 22, 26]. Aucune étude exhaustive
des mutations des gènes cibles dans les UUC
MSI n’a été réalisée.
Après avoir établi avec précision l’incidence du
phénotype MSI dans les tumeurs urothéliales du
haut appareil urinaire sur une série de 58 patients,
nous avons recherché dans les tumeurs MSI la
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présence de mutations dans un grand nombre de
gènes cibles candidats (n=13) impliqués dans des
voies cellulaires clés. Afin d’identifier les gènes
cibles de la carcinogenèse MSI dans les tumeurs
urothéliales, de multiples sites tumoraux ont été
analysés simultanément pour chaque tumeur afin
d’évaluer l’hétérogénéité des mutations des
gènes cibles dans les tumeurs.
II. MATERIEL ET METHODES
Patients.
Les patients ont été sélectionnés à partir d’une
cohorte de 58 patients présentant une tumeur uro-
théliale primitive du haut appareil urinaire prise en
charge entre 1988 et 2004 soit à l’Erasmus Medi-
cal Center de Rotterdam, soit à l’hôpital Saint-
Louis de Paris. Le statut MSI a été établi en utili-
sant la PCR pentaplex de 5 marqueurs mononu-
cléotidiques quasi-monomorphes récemment
recommandée par le NCI du fait de sa fiabilité
prouvée dans l’évaluation des cancers colorec-
taux MSI (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 et NR-
27) [6,31,32]. Le phénotype MSI était retenu en
cas d’instabilité de 3 marqueurs ou plus. Les
résultats ont été confirmés à l’aide du panel origi-
nal de Bethesda (BAT-25, BAT-26, D5S346,
D2S123 et D17S250) [23]. Afin d’identifier, les
gènes cibles de la carcinogenèse MSI dans les
tumeurs urothéliales, nous avons recherché la
présence de mutations des gènes cibles dans les
tumeurs provenant de 7 patients : quatre tumeur
MSI et trois tumeurs qui comportaient des variants
dans 1 des 5 marqueurs microsatellites utilisés
pour détecter le phénotype MSI.
Les données cliniques et anatomopathologiques
ont été collectées dans le Tableau 1. La classifi-
cation des tumeurs a été réalisée selon les critè-
res de l’OMS et l’IUAC de 1998 [11].
Sélection des tumeurs et extraction de l’ADN.
L’ADN tumoral et normal a été extrait à partir de
blocs tissulaires inclus en paraffine à l’aide du kit
DNeasy™Tissue Kit (Qiagen, Germany). Le
parenchyme rénal ou la couche musculaire urété-
rale ont été sélectionnés pour l’extraction d’ADN
normal. Les zones tumorales comprenant plus de
80% de cellules cancéreuses ont été sélection-
nées pour être microdisséquées sous un micro-
scope inversé (x40). De 2 à 5 zones tumorales ont
pu être microdisséquées pour chaque tumeur. La
tumeur primitive d’une patiente (#4) était fixée au
Bouin, ainsi seules les 2 récidives ont pu être ana-
lysées (#4-R1, #4-R2).
Détection des mutations dans les gènes
cibles.
Treize gènes ont été sélectionnés en raison de
leur implication dans des voies cellulaires clés. A
l’exception de MRE11, la séquence répétée
microsatellite de tous ces gènes est située dans
leur séquence codante (Tableau 2). Seul MRE11
comporte une répétition microsatellite qui se situe
dans une séquence intronique. La technique de
détection des mutations dans les répétitions
mononucléotidiques de ces 13 gènes a déjà été
détaillée [23]. Chaque PCR avec des profils anor-
maux a été réalisée au moins 2 fois de façon indé-
pendante pour confirmer la présence de muta-
tions.
III. RESULTATS
Caractéristiques cliniques et pathologiques
des tumeurs MSI (Tableau 1).
Deux des 4 patients ayant une tumeur MSI étaient
atteints d’un syndrome HNPCC (#1 et #4). Leur
tumeur présentait une perte d’expression immu-
nohistochimique conjointe de MSH2 et MSH6. Les
deux autres tumeurs présentaient une perte d’ex-
pression de MLH1. L’âge au moment du diagnos-
tic des tumeurs MSI était significativement plus
jeune que celui des tumeurs MSS (42 versus 65
ans). Contrairement aux patients dont les tumeurs
étaient de phénotype MSS, aucun des patients
avec des tumeurs MSI n’avait présenté de tumeur
vésicale avant la tumeur du haut appareil urinaire,
mais cette différence n’était pas significative. Les
tumeurs MSI, de répartition hétérogène en grade
et stade, étaient localisées dans le bassinet chez
1patient, l’uretère chez 2 patients et le bassinet et
l’uretère chez 1 patient. Le suivi des patients por-
teurs de tumeurs MSI variait de 18,2 à 142,1 mois.
Un patient était décédé lors de l’étude.
Altérations des gènes cibles (Tableau 2).
La majorité des 13 gènes analysés ont déjà été
décrits comme des cibles fréquentes de mutations
secondaires de la mutagenèse MSI [9, 36]. A l’ex-
ception de MRE11, les mutations sont situées
dans la séquence codante de ces gènes et
conduisent à la synthèse d’une protéine tronquée
non fonctionnelle. Les mutations de MRE11
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Tableau 1. Caractéristiques clinico-pathologiques des patients porteurs d’une tumeur urothéliale du haut
appareil urinaire avec un phénotype MSI.
Tableau 2. Analyse multi-site des mutations des gènes cibles. Pour chaque gène, les mutations sont pré-
sentes (case noire), absente (case grise) ou non déterminée (case blanche). La fréquence de mutation de
chaque gène correspond au pourcentage de tumeurs présentant une mutation dans au moins un site sur
le nombre total de tumeurs. La fréquence de mutation de chaque tumeur correspond au pourcentage de
mutations des gènes étudiés après exclusion de BRCA1 et de BRCA2.
(a) Nombre de sites analysés pour le statut MSI
(b) M : masculin ; F : féminin
(c) B : bassinet ; U : uretère

entraîne un défaut d’épissage conduisant à la syn-
thèse d’une protéine tronquée rapidement dégra-
dée responsable d’une diminution importante de
l’expression protéique [15]. Les 4 tumeurs MSI de
notre étude présentaient 2 à 7 gènes mutés parmi
les 13 gènes analysés (18% à 63% de gènes
mutés). Aucune des trois tumeurs avec des
variants dans un des cinq marqueurs utilisés pour
le type MSI (classées MSI-L) ne présentait de
mutations dans les gènes cibles. Quatre tumeurs
MSI avaient une mutation de MSH3, 3 une muta-
tion de BAX, RAD50 et MRE11, suggérant que
ces gènes sont des gènes cibles fréquents dans
les UUC MSI. De plus, deux tumeurs MSI avaient
des mutations de TGFb-RII, TCF-4, MSH6, MBD4
et ATR. Nous n’avons trouvé qu’une seule tumeur
porteuse de mutation de DNA-PKcs ou BLM.
Parmi les 13 gènes étudiés, seuls BRCA1 et
BRCA2 n’étaient pas l’objet de mutation et ont
donc été exclus des calculs de taux de mutation.
Nous avons voulu évaluer la distribution intra-
tumorale de ces mutations en analysant plusieurs
sites tumoraux pour chaque tumeur. Parmi les
mutations les plus fréquentes, les mutations de
BAX et de MRE11 étaient présentes dans de mul-
tiples sites étudiés, contrairement aux autres
mutations, dont les distributions étaient beaucoup
moins uniformes. La comparaison du profil des
mutations survenues dans les deux récidives
tumorales successives du patient #4 a permis de
mettre en évidence une accumulation des muta-
tions dans les gènes cibles au cours du temps,
BAX et MRE11 étant les plus précoces.
Afin d’évaluer la signification biologique des muta-
tions observées dans les gènes MRE11 et de
RAD50, nous avons étudié l’expression immuno-
histochimique de deux protéines MRE11 et
RAD50. Dans le tissu normal, leur expression était
ubiquitaire, de localisation nucléaire et de forte
intensité. Dans les tumeurs, les mutations de
MRE11 ou de RAD50 s’accompagnaient d’une
extinction concomitante de l’expression immuno-
histochimique des deux protéines.
IV. DISCUSSION
L’objectif de cette étude était de caractériser dans
des UUC MSI les mutations de 13 gènes cibles
potentielles de l’instabilité des microsatellites .
L’incidence du phénotype MSI que nous avons
trouvée dans les UUC (7%) est plus faible que
celle rapportée dans la majorité des publications
antérieures, en dehors d’une d’entre elle, fixant
cette incidence à 4% après utilisation d’une
méthodologie identique à la nôtre [12].
Les tumeurs avec un défaut du système de répa-
ration des mésappariements de bases, accumu-
lent des mutations dans des répétitions mononu-
cléotidiques situées de régions codantes de
gènes dits cibles [9, 36]. Ces mutations peuvent
être sélectionnées et contribuent à l’initiation ou la
progression des tumeurs par l’intermédiaire d’une
perte de la régulation de la croissance cellulaire,
d’un échappement à l’apoptose ou d’un défaut de
réparation de l’ADN. Il est intéressant de noter
que la sélection des mutations des gènes cibles
dans les tumeurs MSI semble spécifique du tissu
dans lequel les tumeurs se développent, avec des
profils de mutations des gènes cibles distincts
dans les cancers de l’endomètre et cancers colo-
rectaux [9, 36]. L’examen de 13 gènes cibles
potentiels de l’instabilité des microsatellites dans
les UUC MSI avait pour but d’obtenir des informa-
tions supplémentaires sur l’impact potentiel de
leur inactivation. A notre connaissance, l’analyse
de gènes cibles dans les UUC MSI n’a été réali-
sée qu’une fois sur 15 tumeurs et sur 5 gènes
[16]. Des altérations de MSH6 (38%), TGFb-RII
(23%), BAX (23%) et MSH3 (15%) ont ainsi été
rapportées. Nous avons observé des altérations
fréquentes de MSH3, MRE11, RAD50 et BAX et
décrit des mutations dans d’autres gènes impli-
qués dans le maintien de l’intégrité du génome
comme ATR, DNA-PKcs, MBD4 et BLM. Notre
étude souligne l’intérêt de pratiquer une recherche
mutationnelle sur de multiples sites tumoraux, plu-
tôt que sur un seul site. Premièrement, une telle
approche nous a permis de détecter des muta-
tions ne survenant que dans une seule partie de
la tumeur. Deuxièmement, cette procédure identi-
fie les mutations survenant de façon homogène
au sein de la tumeur, ce qui reste un argument en
faveur de leur survenue précoce au cours de la
carcinogenèse. Plusieurs études se sont intéres-
sées dans les cancers colorectaux MSI à l’homo-
généité et la précocité des mutations de TGFb-
RII, et dans une moindre mesure de celles de
BAX [2, 4]. La faible fréquence et l’hétérogénéité
des mutations de TGFb-RII observées dans notre
étude plaident contre une implication précoce de
ce gène dans la transformation initiale dans les
UUC MSI [16, 35]. A l’opposé, les mutations de
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