dans les lignées cellulaires canc - Avemar - Cancer

Introduction
La composition chimique exacte du FWGE qui est actuellement
utilisé comme complément alimentaire pour des patients atteints
de cancer n'est pas complètement connue [1]. Le FWGE contient
deux quinones: la 2-méthoxy benzoquinone et la 2,6-dimethoxy
benzoquinone auxquelles beaucoup de ses propriétés biologiques
sont dues [2]. Des données précliniques in vitro et in vivo ont
attribué au FWGE des effets antiprolifératifs, antimétastatiques
et immunologiques [1-7]. Dans les études de lignées cellulaires,
le FWGE a déclenché la mort cellulaire programmée via les
caspases - PARP [7,8]. Il faut noter que le mécanisme exact par
lequel cette composition multi-moléculaire déclenche l'apoptose
est encore obscure. Dans des études antérieures, plusieurs
groupes ont démontré que le FWGE interfère avec les enzymes
de la glycolyse anaérobie et le cycle des pentoses [2, 9, 10].
Les cibles connues sont la transcétolase, la glucose-6-phosphate
déshydrogénase, la lactate déshydrogénase et l'hexokinase qui
sont nécessaires à l'affectation des précurseurs de la synthèse
d'ADN [9]. La ribonucléotide réductase est aussi impliquée dans
la synthèse d'ADN [6]. Cette enzyme est régulée positivement
dans divers types de cancer et elle est une cible attrayante en
chimiothérapie anticancéreuse. Plusieurs produits anticancéreux
utilisés depuis longtemps, comme la fludarabine, la cytarabine
et la gemcitabine, exercent, au moins en partie, leur activité
cytotoxique en inhibant la ribonucléotide réductase [11].
L'activité inhibitrice du FWGE sur la ribonucléotide réductase a
été montrée, ce qui lui permet d'interférer avec la synthèse
d'acide nucléique par différents moyens [1, 8, 11].
RECHERCHE Accès Libre
Mueller et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2011, 30:42
http://www.jeccr.com/content/30/1/42
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Journal of Experimental &
Clinical Cancer Research
Profil d'activité cytotoxique prometteuse de
l'extrait fermenté de germe de blé (Avemar®)
dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines
Thomas Mueller, Karin Jordan and Wieland Voigt*
Résumé
L'extrait fermenté de germe de blé (FWGE - Fermented wheat germ extract) est couramment utilisé comme complément
alimentaire. Des données récentes limitées suggèrent des effets antiprolifératifs, métastatiques et immunologiques, exercés,
au moins en partie, par deux quinones: la 2-méthoxy benzoquinone et la 2,6-dimethoxybenzoquinone en tant qu'éléments
du FWGE. Ces données d'activité nous ont incité à examiner davantage l'activité antiproliférative in vitro du FWGE
employé seul ou en combinaison avec des médicaments, comme le 5-FU, l'oxaliplatine ou bien l'irinotécan couramment
utilisés sur un large spectre de lignées cellulaires tumorales humaines. Nous avons utilisé le test à la sulforhodamine B pour
déterminer la relation dose-réponse. Les valeurs CI50 ont été calculées à l'aide de l'équation de Hill. L'interaction médica-
menteuse de l'exposition simultanée et séquentielle au médicament a été estimée en utilisant le modèle de Drewinko et
l'activité clinique potentielle a été évaluée au moyen du modèle de l'activité relative antitumorale (RAA - relative antitumor
activity). L'apoptose a été détectée par l'électrophorèse d'ADN sur gel.
Le FWGE a induit l'apoptose et exercé une activité antitumorale significative sur un large spectre de 32 lignées cellulaires
cancéreuses humaines. L'activité la plus élevée a été trouvée dans les lignées cellulaires de neuroblastome avec une CI50
moyenne de 0.042mg/ml. De plus, la fourchette des valeurs CI50 a été très étroite allant de 0,3 mg/ml à 0,54 mg/ml dans
8 lignées cellulaires cancéreuses du co
^lon. En expérimentation combinée, sur les lignées cellulaires cancéreuses du co ^lon,
lorsque le FWGE a été utilisé avec soit le 5-FU, soit l'oxaliplatine ou l'irinotécan, nous avons observé une synergie addi-
tive, en particulier pour le 5-FU. Pour une exposition alternée entre le 5-FU et le FWGE, la synergie observée disparaît.
Pris ensemble, le FWGE exerce une activité antitumorale significative dans notre modèle de tumeur. L'exposition médica-
menteuse simultanée du FWGE et avec le 5-FU, ou l'oxaliplatine ou l'irinotécan a donné une interaction médicamenteuse
additive. Toutefois, l'exposition médicamenteuse séquentielle du 5-FU et du FWGE dans les lignées cellulaires du cancer
du co
^lon semble être dépendante de la programmation (5-FU peut précéder FWGE).
Il semble que le FWGE est un sérieux candidat en tant qu'additif au régime clinique.
*Correspondance: [email protected]
University of Halle, Department Internal Medicine, Oncology/Hematology
and Hemostaseology, Ernst-Grube Str. 40, 06120 Halle/Saale, Germany
©2011 Mueller et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution licence (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use,
distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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Le FWGE exerce non seulement une activité antitumorale en
monothérapie sur des lignées cellulaires tumorales humaines et
les xénogreffes de tumeurs humaines mais certaines données
suggèrent une interaction synergique avec le 5-FU ou la dacar-
bazin (DTIC) dans un nombre limité de lignées cellulaires [2, 6].
En plus des données précliniques, il existe déjà quelques
études cliniques publiées qui confirment les effets bénéfiques du
FWGE dans la thérapie du cancer humain. Les données les plus
impressionnantes ont été générées dans un essai aléatoire de
phase II réalisé par Demidov et al. Ils ont trouvé, lors de la com-
binaison de la DTIC et du FWGE, un gain significatif de survie
sans progression et survie globale par rapport à l'application de
la DTIC seule chez les patients atteints de mélanome [12]. Une
étude menée par Jakab et al. chez des patients atteints de cancer
colorectal a permis d'observer un meilleur taux de survie et une
réduction de la formation de métastases lors de la combinaison
de la chimiothérapie et du FWGE en comparaison avec l'emploi
du groupe chimiothérapie seul. Dans une analyse multivariée de
cette étude, seuls le stade de la tumeur et le traitement du FWGE
étaient des prédicteurs importants de la survie [13].
Toutefois, ces données doivent être interprétées avec prudence
car l'étude avait une conception non aléatoire et les groupes de
patients n'étaient pas équilibrés [1, 13]. De même importance,
plusieurs études, notamment celles mentionnées ci-dessus, ont
suggéré une amélioration de la qualité de vie grâce à un traite-
ment associé avec le FWGE [14].
Dans l'ensemble, les données précliniques restreintes ainsi
que les données cliniques disponibles attribuent au FWGE, en
tant qu'aliment pour des patients cancéreux, non seulement des
profils d'activité prometteurs, mais aussi les propriétés d'un
agent anticancéreux potentiel.
Dans cette vaste étude in vitro, nous avions pour but
d'analyser l'activité d'agent unique du FWGE ainsi que son
interaction avec les médicaments comme le 5-FU, l'oxaliplatine
ou bien l'irinotécan couramment utilisés sur un large panel des
lignées cellulaires tumorales des différentes entités tumorales.
Ces données ont une valeur potentielle pour diriger plus en avant
le développement du FWGE vers différents types de cancer et pour
aider à sélectionner des partenaires de médicament potentiels
pour le futur développement des combinaisons de chimiothérapie
avec le FWGE.
Matériels et méthodes
Médicaments et produits chimiques
Le FWGE a été un don généreux de Biropharma Kft,
Kunfehértó, H-6413, Hongrie. Le FWGE a été conservé à 4 °C
sous forme de poudre sèche jusqu'à son utilisation. Pour l'expéri-
mentation, le FWGE a été préparé frais dans de l'eau stérile
à une concentration finale de 100 mg/ml. Ensuite, la solution
a été centrifugée à 150 g pour éliminer les éléments insolubles.
Le 5-FU, l'irinotécan, l'oxaliplatine et le test à la sulforhodamine
B ont été achetés chez Sigma Chemical Company, en
Allemagne. Le RPMI 1640 et la pénicilline/streptomycine ont
été obtenus de PAA, Pasching, Autriche. SVF a été acheté chez
Biochrom AG, Berlin, Allemagne.
Lignées cellulaires et culture
Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été utilisées
pour l'expérimentation: cancer du testicule (H12.1, 2102EP,
1411HP, 1777NRpmet), cancer du co
^lon (HCT-8, HCT-15,
HCT-116, HT-29, DLD-1, SW480, COLO205, COLO320DM),
CPNPC (A549, A427, H322, H358), cancer de la tête et du cou
(FADU, A253), carcinome épidermoïde du col de l'utérus
(A431), adénocarcinome mammaire (MCF-7, BT474), adéno-
carcinome ovarien (A2780), cancer de l'estomac (M2), cancer
anaplasique de la thyroïde (8505C, SW1736), cancer papillaire
de la thyroïde (BCPAP), cancer folliculaire de la thyroïde
(FTC133), mélanome (518A2), hépatome (HepG2), glioblas-
tome (U87MG), neuroblastome (SHSY5Y, la SIMA). Toutes les
lignées de cellules ont été cultivées en monocouches d'un max-
imum de 80% de confluence dans un milieu de RPMI 1640
complété avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine
à 37 °C, 5% de CO2et de l'air humidifié.
Expériences d'inhibition de croissance
Pour évaluer les effets antiprolifératifs, le test à la sulforho-
damine B (SRB) a été utilisé comme décrit précédemment [15].
En bref, les cellules ont été ensemencées dans les plaques 96
puits à une densité spécifique pour garantir la croissance expo-
nentielle pendant toute la durée de l'essai. Les nombres des
cellules ont été préalablement déterminés par la cinétique de
croissance cellulaire. Après 24 h, les cellules à croissance expo-
nentielle ont été exposées en série à des dilutions de chaque
médicament pris soit individuellement, soit en association de
façon continue pour les temps indiqués. Pour étudier l'influence
de l'ajout des médicaments, le médicament A a été administré 24
h après l'ensemencement et suivi par le médicament B 24 h plus
tard ou inversement. Les plaques de contro
^le traitées avec un
seul médicament à la fois ont été manipulées en parallèle. Après
120 h, la durée totale de l'essai, les milieux ont été retirés et les
cellules ont été fixées à l'aide du TCA à 10% et traitées confor-
mément au protocole du test SRB publié [15]. L'absorbance a
été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de plaque 96 puits.
(Rainbow, SLT, Allemagne).
Électrophorèse d'ADN sur gel
Les cellules flottantes après un traitement médicamenteux avec
une CI90 de FWGE pendant 48 h ont été utilisées pour détecter
l'apoptose par électrophorèse d'ADN sur gel. Après avoir lavé
les cellules deux fois avec du PBS, elles ont été lysées dans un
tampon de lyse (100 mM TRIS-HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA,
SDS 0,8%). Suivant le traitement par RNaseA pendant 2 h à 37 °C
et par protéinase K (Roche Molecular Biochemicals) pendant
une nuit à 50 °C, les lysats ont été mélangés avec le tampon de
chargement d'ADN. La séparation des fragments d'ADN s'est
faite sur un gel d'agarose 1,5% suivi par une coloration au
bromure d'éthidium puis un rinçage à l'eau distillée. Les échelles
d'ADN ont été visualisées sous lumière UV et documentées sur
un Instrument BioDocAnalyse (Biometra).

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L'analyse des données
Les courbes dose-réponse ont été générées par Sigma Plot
(Jandel Scientific, San Rafael, CA) et les valeurs CI50 ont été
calculées au moyen de l'équation de Hill. L'interaction médica-
menteuse a été estimée en utilisant le modèle de Drewinko [16].
En bref, une courbe hypothétique a été calculée en multipliant le
ratio du traité et non traité de contro
^le par les données de la courbe
dose-réponse d'un médicament administré seul. La synergie
peut être supposée si la courbe hypothétique passe au-dessus de
la courbe de combinaison. Par contre, si la courbe hypothétique
passe au-dessous de la courbe de combinaison, cela prouve
l'antagonisme. En cas d'additivité, les deux courbes se superposent.
L'étude statistique s'est basée sur le test de Student non apparié
bilatéral. L'étude statistique a abouti à une valeur p <0,05.
L'activité clinique potentielle a été évaluée par le modèle de
l'activité antitumorale relative (RAA), ce qui a été défini comme
le rapport entre les pics des concentrations plasmatiques et la
valeur de CI50 in vitro [17]. Une valeur RAA> 1 indique une
activité clinique potentielle.
Résultats
Activité antiproliférative du FWGE administré seul dans des
lignées de cellules cancéreuses
L'activité antiproliférative d'une exposition continue de 96
heures au FWGE a été évaluée sur un large panel de lignées
cellulaires tumorales humaines en utilisant le test SRB. Les
valeurs de la CI50 ont été calculées au moyen de l'équation de
Hill et les données obtenues à partir d'au moins trois expériences
indépendantes ont été résumées sous forme de graphique
(Figure 1). La CI50 du FWGE variaient de 0,038 mg/ml à
0,7 mg / ml avec une CI50 médiane de 0,33 mg/ml.
Après l'administration orale du FWGE à une dose normale de
9 g/jour chez les patients, le pic de la concentration plasmatique
est de 0,5-1 mg / ml [7]. Compte tenu de ce pic de la concentra-
tion plasmatique et de la CI50 observées dans le panel de lignée
cellulaire, la RAA calculée est au moins 1 ou plus, ce qui
pourrait indiquer une activité clinique potentielle. La plus forte
activité du FWGE a été trouvée dans des lignées cellulaires de
neuroblastome avec une CI50 moyenne de 0,042 mg/ml
(RAA ..12 - 24). Il est intéressant de noter que les 8 lignées
cellulaires du cancer du co
^lon inclues dans ce panel ont une
CI50 très étroite variant de 0,3 mg / ml à 0,54 mg/ml donnant une
RAA de 1,7 à 3,3 (Figure 1).
Détection du mode de la mort cellulaire induite par le FWGE dans
un panel de lignées cellulaires
Afin de distinguer le mode de mort cellulaire induite par le FWGE,
nous avons traité un panel représentatif de lignées cellulaires
cancéreuses humaines avec une CI90 de FWGE pendant 48 h.
Après le traitement, les cellules flottantes ont été récoltées et
une électrophorèse d'ADN sur gel a été réalisée. Dans toutes les
lignées cellulaires traitées, des fragments d'ADN de 180 bp,
indicatifs de la dégradation de l'ADN durant le processus
d'apoptose, pouvaient être détectés (Figure 2).
Combinaison du FWGE avec le 5-FU, l'oxaliplatine et l'irinotécan
dans les lignées cellulaires du cancer du co
^lon humain
L'effet médicamenteux combiné d'une exposition parallèle au
FWGE et soit au 5-FU, soit à l'irinotécan ou à l'oxaliplatine a été
évalué sur un panel de 8 lignées cellulaires du cancer du co
^lon.
Le mode de l'interaction médicamenteuse a été analysé par la
méthode de Drewinko et les données ont été résumées dans le
Tableau 1.
Dans l'ensemble, une synergie significative a été observée
pour les combinaisons du FWGE et du 5-FU (6 sur 8 lignées
cellulaires) et moins pour l'irinotécan et l'oxaliplatine (2 sur 8
lignées cellulaires). L'interaction médicamenteuse des lignées
cellulaires restantes était additive. De plus, aucun antagonisme
significatif a été trouvé lors de l'exposition médicamenteuse
simultanée. Un tableau représentatif de l'interaction médica-
menteuse synergique est présenté dans la Figure 3.
Application médicamenteuse séquentielle du FWGE et du 5-FU
dans les lignes cellulaires du cancer du co
^lon humain HT29 et
HCT-8
Pour évaluer l'influence de la programmation des médicaments,
24 h après l'ensemencement, les cellules à croissance exponen-
tielle ont été exposées à une CI30 de FWGE puis à une série de
dilutions de 5-FU, 24 h plus tard ou inversement. Les cellules
ont été fixées après 120 h, durée totale de l'essai, et ont été
traitées selon le protocole de SRB. Les valeurs de CI50 ont été
calculées au moyen de l'équation de Hill en utilisant la courbe
Sigma et les données ont été résumées dans le Tableau 2. Dans
les deux lignées cellulaires, lorsque l'application du 5-FU a été
suivie par le FWGE, nous avons observé une interaction
médicamenteuse additive. En revanche, si la prise du FWGE
précède de 24 heures celle du 5-FU, nous avons observé une
tendance à l'antagonisme dans les deux lignées cellulaires.
Cependant, cet antagonisme n'a pas atteint une signification
statistique. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que
les interactions entre le 5-FU et le FWGE dépendent de leur
programmation. Il faut éviter que l'administration du FWGE
précède celle du 5-FU.
Discussion
Le FWGE appartient au groupe des nutraceutiques qui sont
approuvés comme aliments diététiques destinés à des fins médi-
cales spéciales pour les patients atteints de cancer. Il est bien
toléré à la dose recommandée et possède une large fenêtre
thérapeutique [2]. Outre son utilisation en tant que complément
alimentaire pour améliorer les sympto
^mes du cancer chez les
patients, il existe de plus en plus de preuves montrant que le
FWGE peut également avoir des propriétés anticancéreuses
[1-3]. Cependant, jusqu'à présent, cet effet antitumoral a été peu
étudié.
Ainsi, nous avons examiné l'activité cytotoxique préclinique
du FWGE employé seul ou en association avec les médica-
ments, comme le 5-FU, l'oxaliplatine ou bien l'irinotécan,
couramment utilisés sur un large spectre de lignées cellulaires
tumorales humaines pour évaluer ses propriétés antitumorales
potentielles.

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Figure 1 Illustration de la CI50 du FWGE sous forme de graphique.
Pour une meilleure comparaison des différentes activités, la moyenne des CI50 des résultats d'au moins 3 expériences indépendantes par
lignée cellulaire est présenté sous forme de graphe moyen. La moyenne de CI50 est de 0,33 mg/ml. La plus forte activité du FWGE a été trou-
vée dans des lignées cellulaires cancéreuses de neuroblastome et de l'ovaire. Il est intéressant de noter que la valeur de CI50 de 8 lignées cellu-
laires du cancer du co
^lon humain inclues dans ce panel est proche de la valeur moyenne de CI50.

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Les lignées cellulaires tumorales humaines ou les xénogreffes
de tumeurs humaines servent souvent de modèles pour des
études médicamenteuses précliniques. Il faut être prudent lors
de l'interprétation des résultats puisque leur valeur prédictive
positive est limitée à environ 60-70% [18, 19]. La valeur prédic-
tive des données cytotoxiques précliniques peut être renforcée
par le modèle de l'activité antitumorale relative (RAA). Ce
dernier permet d'estimer l'activité potentielle d'un médicament
dans un certain type de tumeur en prenant en considération la
valeur préclinique de CI50 aussi bien que le pic des concentra-
tions plasmatiques pouvant être atteint cliniquement [20]. Il est
possible de supposer l'activité clinique potentielle uniquement
dans le cas où la valeur préclinique de la CI50 est clairement en
dessous de la concentration plasmatique qui peut être atteinte
chez un patient.
Dans la présente étude, nous avons observé une activité
antiproliférative importante du FWGE évaluée par les concen-
trations de la CI50 qui se trouvaient dans un même ordre de
Figure 2 L'induction de l'apoptose par le FWGE
Un panel représentatif de lignées cellulaires tumorales humaines
a été traité avec une CI90 de FWGE pendant 48 h et les cellules
flottantes ont été récoltées par centrifugation pour l'extraction
d'ADN. L'ADN a été séparé par électrophorèse sur gel et coloré
par la suite avec du bromure d'éthidium qui permet de visualiser
les fragments d'ADN sous lumière UV.
Figure 3 La synergie entre le FWGE et le 5-FU dans les
lignées cellulaires du cancer du co
^lon humain HCT15.
Le graphique représente la moyenne de 3 expériences indépen-
dantes. La courbe hypothétique a été calculée comme décrite par
Drewinko et al. [16]. La synergie est indiquée par la courbe
hypothétique qui passe au-dessus de la courbe des combinaisons.
Tableau 1 Sommaire de la combinaison des médicaments
CI50 (FFM)
Lignées cellulaire Oxaliplatin ± FWGE valeur p 5-FU ± FWGE valeur p CPT-11 ± FWGE valeur p
-+ - + -+
HCT-8 0,43 ± 0,03 0,45 ± 0,03 0,52 2,65 ± 0,35 1,2 ± 0,6 0,023* 2,0 ± 0,46 1,8 ± 0,32 0,63
HCT-15 0,95 ± 0,19 0,57 ± 0,25 0,05 4,45 ± 0,72 1,45 ± 0,61 0,0001* 4,5 ± 0,3 3,4 ± 0,31 0,001*
HCT116 0,39 ± 0,06 0,19 ± 0,09 0,01* 4,6 ± 0,38 2,9 ± 0,9 0,01* 1,2 ± 0,1 0,96 ± 0,11 0,01*
HT29 0,32 ± 0,09 0,35 ± 0,05 0,53 0,99 ± 0,31 1,3 ± 0,6 0,39 3,5 ± 0,3 4,1 ± 0,23 0,05
DLD-1 2,47 ± 0,17 2,2 ± 0,8 0,61 3,2 ± 0,21 1,6 ± 0,7 0,02* 6,6 ± 0,6 6,1 ± 0,85 0,43
Colo205 0,45 ± 0,05 0,24 ± 0,05 0,001* 0,54 ± 0,12 0,44 ± 0,1 0,26 1,2 ± 0,19 1,1 ± 0,19 0,24
Colo320 1,1 ± 0,34 0,84 ± 0,13 0,33 1,35 ± 0,133 0,57 ± 0,03 0,001* 8,5 ± 3,4 8,7 ± 3,1 0,92
SW48 0,13 ± 0,02 0,1 ± 0,02 0,09 3,4 ± 0,2 2,2 ± 0,2 0,002* 2,4 ± 0,35 2,1 ± 0,29 0,18
SW480 0,57 ± 0,11 0,37 ± 0,12 0,06 2,7 ± 0,17 2,9 ± 1,5 0,83 6,4 ± 1,2 6,9 ± 2,3 0,72
n $$3, l'astérisque indique une interaction médicamenteuse synergique significative