2-Biomimétisme des interactions entre la membrane endosomale et

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FORMULAIRE STAGE Recherche-M2 BBSG
(période de stage : du 5 janvier 2017 au 3 juillet 2017)
Titre du stage :
Biomimétisme des interactions entre la membrane endosomale et le cytosquelette d’actine
Laboratoire (intitulé, adresse, site web) :
Centre Interdisciplinaire de Nanoscience de Marseille (CINaM), CNRS UMR 7325
Campus de Luminy, Case 913 – 13288 Marseille Cedex 09
http://www.cinam.univ-mrs.fr/cinam/index.php
Equipe :
Physique et micro-nano Ingénierie pour le Vivant, Département Science et
Technologie des Nano-Objets (STNO)
Maitre de stage :
Emmanuèle HELFER
E-mail : [email protected]
Téléphone : 06 60 30 28 91
Descriptif du stage :
Contexte :
La cellule contient des réseaux de filaments d'actine qui jouent un rôle essentiel dans
le remodelage des membranes cellulaires, par exemple dans les structures de
migration comme le lamellipode. Dans ce projet, nous étudions le complexe protéique
WASH (WASH) qui génère des réseaux branchés d’actine à la surface des endosomes
intracellulaires. WASH permet la fission de petites vésicules de transport à partir des
endosomes, vésicules qui assurent le transport de molécules entre différentes régions de
la cellule. Pour cela, WASH forme des nano-domaines à la surface des endosomes
(figure, A), et ces domaines sont précurseurs des vésicules de transport.
A
Projet :
Nous avons caractérisé l’interaction entre WASH et son
récepteur membranaire, le CSC (Cargo Selective Complex), qui
permet de recruter WASH à la surface des endosomes. WASH et
CSC forment des domaines protéo-lipidiques avec des lipides
spécifiques de la membrane endosomale. Nous avons montré
que le réseau branché d’actine contribue à l’organisation de
WASH en nano-domaines sur les endosomes (figure, B). Le but
du stage est de comprendre les paramètres physiques et
biochimiques qui contrôlent la répartition de WASH à la
membrane, en utilisant une approche in vitro. Nous allons
reconstituer le système WASH-actine sur des vésicules géantes
B
(A) Reconstruction 3D des domaines WASH (en vert) sur les endosomes (en rouge). (B) Le réseau
branché d’actine (en orange)
participe à la répartition de WASH
en nano-domaines à la surface
des endosomes.
(GUVs) qui miment les endosomes mais sont beaucoup plus grandes (quelques 10µm de
diamètre), ce qui facilite l’observation en microscopie.
1) WASH et CSC, purifiés en cellules mammifères, sont fluorescents, ce qui permet
de les observer par microscopie de fluorescence. La première étape consistera à
optimiser l’ancrage des complexes sur les GUVs. Cela permettra d’observer en
temps réel le recrutement de WASH par CSC à la membrane.
2) Nous étudierons ensuite la répartition spontanée des complexes à la surface des
GUVs : formeront-ils des domaines, avec des lipides spécifiques, ou seront-ils
répartis de façon homogène ? Nous mesurerons l’effet de la densité relative des
complexes : comment la densité de CSC affecte l’organisation de WASH, et viceversa.
3) L’étape suivante consistera à augmenter le degré de biomimétisme en ajoutant
le réseau d’actine, pour voir comment il modifie la répartition des complexes. Si
WASH est distribué de façon homogène, l’actine va-t-elle induire la formation de
domaines ? Si au contraire, les domaines sont déjà existants, vont-ils diminuer ou
augmenter en présence d’actine ?
Toutes ces observations permettront d’améliorer la compréhension du mécanisme de
formation des nano-domaines protéo-lipidiques à l’origine du transport vésiculaire
intracellulaire.
Techniques utilisées :
Fabrication de membranes lipidiques
Microscopie optique, fluorescence, analyse d’images
Mots Clés : actine, WASH, domaine protéo-lipidique, biophysique, vidéomicroscopie,
analyse d’images