Génétique

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Kits
Réf :
117 029
Français – p 1
Kit précipitation d’ADN (x10 kits)
Version : 3109
Génétique
Précipitation de l’ADN
Réf :
117 029
1 Composition
- 10 ampoules d’ADN (de saumon) à 1mg/mL (tampon Tris-HCI 0,010 M, pH
8,0 en présence d’EDTA 0,001M).
- 10 ampoules d’acétate de Sodium (3 M pH 5,2).
- 10 ampoules de vert de méthyle acétique
- 10 ampoules d’isopropanol
2 Précautions d’utilisation et de stockage
Le kit se conserve au congélateur.
Le kit se conserve 4 mois après réception.
3 Matériel complémentaire à prévoir
- Tubes à essais
- Agitateurs en verre
- Boîtes de pétri ou verre de montre
4 Introduction
L’acide désoxyribonucléique, appelé communément ADN, est une longue
molécule en double hélice qui contient l’information génétique. L’ADN se
trouve principalement dans les chromosomes du noyau des cellules ou sous
forme de brin enroulé dans les bactéries sans noyau. Si vous déroulez tout
l’ADN d’une seule cellule humaine, le filament qui sera invisible à l’œil nu
mesurera environ 1 mètre 50.
Une molécule d’ADN n’existe pas chez l’humain comme une « corde
détendue » mais la molécule est serrée et enroulée comme le serait un cordon
de téléphone très long qui n’aurait pas été déroulé depuis plusieurs années.
Les agrégats épais d’ADN que sont les chromosomes peuvent être observés
avec un microscope très puissant.
L’ADN est une molécule en double brin. Chaque brin d’ADN est composé
d’une combinaison des quatre nucléotides, chaque nucléotide comporte une
base purique ou pyrimidique (adénine, guanine, cytosine ou thymidine)
associée avec un sucre désoxyribose et un groupement phosphate. Chacune
des bases d’un des brins peut former une liaison faible de type « hydrogène »
avec la base complémentaire de l’autre brin (ou même éventuellement avec
une base complémentaire du même brin). L’ensemble des associations par
« paires de bases » complémentaires confère la structure en double hélice de
la molécule d’ADN. Sa forme enroulée est si complexe et sensible que si elle
était altérée ou déroulée, elle ne fonctionnerait plus normalement dans les
cellules.
L’enchaînement des bases dans une molécule d’ADN de tout organisme est
un code pour la synthèse d’une des molécules de l’organisme, chacune de
l’ensemble de ces molécules ayant son code. Ainsi, plus l’organisme est
complexe, plus l’ADN sera long car il devra coder pour de nombreuses
molécules. Par exemple, la longueur d’un ADN de virus pourra être de 3000
paires de bases, celui d’une bactérie : 3 millions de paires de bases, alors
qu’un ADN de cellule humaine mesurera de 3 à 5 milliards de paires de bases.
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5 Présentation
Extraire l’ADN des cellules n’est jamais facile. Les parois des cellules et
membranes de noyaux peuvent être lysées et l’ADN dissous dans un solvant.
L’ADN doit ensuite être séparé des débris cellulaires, substructures ou autres
molécules. Les cellules contiennent également une grande variété d’enzymes
appelées nucléases qui peuvent attaquer ou détruire les acides nucléiques.
L’ADN doit donc être protégé de ces nucléases au cours de sa purification.
Ce processus d’isolation est long pour la durée habituelle de travaux
pratiques. Ce kit vous permet de mettre en évidence la dernière étape
d’isolation de l’ADN et d’observer avec succès une macromolécule sans la
frustration des difficultés des étapes antérieures. L’addition d’alcool à une
solution d’ADN va la précipiter et vous permettre d’en retirer les brins avec une
baguette en verre. Une seule molécule d’ADN n’est pas visible en elle-même
mais vous aurez la possibilité d’en observer les brins agrégés.
La manipulation de condensation et de mise en évidence d’une coloration de
l’ADN pur pourra être complétée par une extraction et coloration d’ADN
végétal (kiwi, chou-fleur…)
La comparaison des résultats obtenus et l’affirmation de la spécificité de la
coloration au vert de méthyl, permettront de définir la nature du composant
extrait.
6 Protocole expérimental
6.1 Précipitation de l’ADN
- Equilibrer les ampoules d’ADN et d’Acétate de Sodium à une température de
25 °C.
- Mettre le contenu de l’ampoule d’ADN dans un tube à essai.
- Ajouter lentement en laissant couler le long de la paroi, l’ampoule d’acétate
de Sodium à l’ADN en agitant légèrement. Mélanger doucement à l’agitateur.
- Ajouter l’ampoule d’Isopropanol et observer la formation d’une couche.
- Avec une baguette de verre ou une pipette, mélanger doucement les phases
aqueuses et organiques. L’ADN va commencer à précipiter. Enrouler
doucement l’ADN autour de la baguette de verre.
- Retirer doucement l’ADN et le placer dans une boîte de pétri ou tout autre
surface plane. Le laisser sécher. L’ADN isolé est ainsi prêt pour être, soit
coloré, soit observé sous un microscope.
6.2 Coloration au vert de méthyl acétique
- Placer la méduse d’ADN récupérée dans un verre de montre,
- L’immerger délicatement à l’aide d’une pipette dans le vert de méthyl
acétique.
- Laisser colorer 5 à 10 minutes.
- Aspirer le colorant et rincer très délicatement à l’eau distillée en évitant les
jets violents.
- Observer au microscope ou remettre délicatement en suspension.
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