Developpement et validation de la detection de mycoplasma
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DEVELOPPEMENT ET VALIDATION DE LA DETECTION DE MYCOPLASMA, UREAPLASMA ET CANDIDA PAR PCR EN TEMPS REEL. Claude‐Nathanaël Sciboz ESanté, 48ième volée Avril – Aout 2009, Laboratoire MCL Niederwangen Responsable : Dr. P.‐A. Menoud Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Sommaire Nous avons développé une méthode d’analyse quantitative de PCR en temps réel pour trois bactéries et un champignon qui sont responsables des infections de la sphère urogénitale. Ceux‐ci peuvent provoquer de nombreuses infections urinaires et à terme, une infertilité voire des lésions cancéreuses. Cette méthode a été développée pour les Mycoplasma hominis, les Mycoplasma génitalium, les Ureaplasma parvum/urealiticum et le Candida albicans. Ces micro‐organismes sont des parasites de notre corps et de nos cellules. Ils peuvent rester longtemps en latence, sans que le patient montre le moindre symptôme. Le but de mon travail est de développer une PCR en temps réel afin de détecter de faibles quantités des ADN bactériens en multiplexe, afin de diminuer les risques de contamination et de réduire le temps entrepris pour la réalisation de ces analyses. Nos résultats démontrent que la PCR en temps réel est une très bonne alternative aux méthodes traditionnelles de cultures bactériologiques et des PCR conventionnelles avec détection sur gel. Celle‐ ci est non seulement spécifique mais très sensible pour la détection des micro‐organismes recherchés. Mots clés : Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum/urealiticum, Candida albicans, PCR en temps réel, spécificité, sensibilité. Abstract We developed a quantitative method for analysis of three bacteria and one fungus by real‐time PCR. These organisms are responsible for infections of the urogenital sphere. These can lead to numerous urinary infections which eventually may end to infertility or even cancerous lesions. This PCR method was developed for Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum/urealiticum and Candida albicans. These microorganisms are parasites of our body and our cells. They can stay latent for a long period of time without symptom. The goal of my work is to develop a multiplex real‐time PCR to detect small amount of bacterial DNA, decreasing thus the risk of contamination and reducing the hands‐on time for carrying out the analysis. Our results demonstrate that a real‐time PCR is a very good alternative to the traditional method of bacteriological cultures and to the conventional PCR with agarose gel detection. Our method is not only specific but very sensitive for the detection of microorganisms we are looking for. Keywords: Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum/ urealiticum, Candida albicans, real‐time PCR, specificity, sensitivity. 2 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Remerciements Je remercie le Docteur Pierre‐Alain Menoud, ainsi que le Laboratoire MCL pour m’avoir offert la possibilité d’effectuer mon travail de diplôme, ainsi que l’aide qu’il m’a apporté pour la réalisation du projet. 3 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Table des matières 1 INTRODUCTION......................................................................................................................... 5 1.1 Les mollicutes ...................................................................................................................................6 1.1.1 Les Mycoplasmas................................................................................................................................... 6 1.1.2 Le Mycoplasma genitalium.................................................................................................................... 6 1.1.3 Le Mycoplasma hominis ........................................................................................................................ 6 1.1.4 L’Ureaplasma parvum/urealyticum....................................................................................................... 7 1.2 Le Candida albicans ...........................................................................................................................7 1.3 PCR en temps réel .............................................................................................................................7 1.4 Sonde TAQman .................................................................................................................................8 1.5 RNAse P ............................................................................................................................................8 2 BUT ................................................................................................................................................ 9 3 MATÉRIEL.................................................................................................................................... 9 3.1 Réactifs.............................................................................................................................................9 3.1.1 LightCycler 480 II ................................................................................................................................... 9 3.1.1.1 4 Programme ................................................................................................................................. 10 SÉQUENCES DES PRIMERS ET SONDES ........................................................................... 11 4.1 Protocoles.......................................................................................................................................11 4.1.1 Extraction............................................................................................................................................. 11 4.1.2 Préparation Master‐mix ...................................................................................................................... 11 4.1.3 Mise sur LightCycler............................................................................................................................. 13 5 RÉSULTATS .............................................................................................................................. 14 5.1 Détection sur LC480 ........................................................................................................................15 5.2 Spécificité .......................................................................................................................................16 5.3 Sensibilité .......................................................................................................................................17 6 DISCUSSION ............................................................................................................................. 18 7 CONCLUSION............................................................................................................................ 19 8 BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................... 20 9 ANNEXES ................................................................................................................................... 21 9.1 Protocole Puro ................................................................................................................................21 4 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 1 Introduction De nombreuses bactéries sont des agents d’infections génitales. Leur responsabilité est souvent difficile à confirmer car certaines se trouvent être des organismes commensaux de notre flore bactérienne. Afin de pouvoir les analyser, le laboratoire a mis en place le profil urogénital regroupant de nombreuses espèces pathogènes parmi les plus courantes. Ce profil regroupe entre autres les Mycoplasma, les Ureaplasma, les Candida albicans, les Gardnerella et les Trichomonas. Généralement, ces analyses commencent au laboratoire de microbiologie afin d’identifier ces bactéries par mise en culture et déterminer l’espèce par galerie biochimique. Puis, il y a vérification par biologie moléculaire par méthode standard de PCR et migration sur gel d’agarose. Le but de mon travail est de mettre au point et valider une analyse par PCR multiplexe en temps réel sur un LightCycler 480 (Roche Diagnostics), abrégé LC480, regroupant Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum/parvum et Candida albicans. Pour cela nous avons dû nous soumettre à plusieurs restrictions afin de mettre en place cette méthode. Nous avons dû trouver des primers (amorces) et des sondes qui soient compatibles avec la température utilisée par la méthode de détection du kit commercialisé par Roche pour la détection de Chlamydiae trachomatis et Neisseria gonorrhoeae. La température définie étant de 60°C pour l’hybridation des primers et de 65°C pour celle des sondes. Il fallait aussi que les amorces, ainsi que les sondes soient spécifiques aux bactéries recherchées. De plus, la réalisation du mélange « réactif » appelé « Mix » ou « MasterMix » doit contenir les réactifs contenus dans le kit de base de Roche, et l’utilisation de sondes appelées « sonde TAQman » est de rigueur. Par la suite, il nous a fallu vérifier la sensibilité de notre méthode, par différentes dilutions d’ADN bactérien et la spécificité de nos sondes et amorces pour une soixantaine d’échantillons. L’intérêt pour le laboratoire est l’exécution rapide et un résultat fiable afin de garantir un traitement adéquat pour le patient. De plus, cette analyse réalisée en multiplexe permet d’éviter les contaminations. Enfin, sa réalisation manuelle est simple et pratique. Le projet s’est donc orienté de la façon suivante : En premier lieu, nous avons recherché des primers et des sondes dont les séquences étaient spécifiques aux différentes bactéries, en recherchant dans différentes littératures. Puis, il fallait concevoir un mélange réactionnel capable d’utiliser celui de Roche, ainsi que des sondes TAQman. Nos sondes et nos primers devaient s’hybrider à une température dite d’annealing de 60°C pour les primers et de 65°C pour les sondes. Ensuite, l’essai pilote a permis de définir si nos mélanges fonctionnaient. Puis est venu l’intégration d’un contrôle interne d’extraction et d’amplification. A suivi, un affinage de l’analyse, qui comprend entre autres les divers changements au niveau des concentrations du mélange réactionnel, la sensibilité et la spécificité de la méthode par la validation technique de soixante échantillons en comparant nos résultats avec ceux d’une méthode de PCR avec détection sur gel. 5 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 1.1 Les mollicutes Les mollicutes sont des bactéries regroupant les Mycoplasmas et les Ureaplasmas. Par étymologie « mollis cutis » veut dire : peau molle. Ce qui veut dire qu’elles sont dépourvues de parois. Elles sont donc insensibles aux antibiotiques agissant sur la paroi des bactéries, comme les Beta‐lactamine. Ces bactéries ubiquitaires sont difficiles à cultiver et à séparer des autres bactéries de la flore commensale. On distingue deux genres : ‐ Les Mycoplasma sont divisés en plusieurs espèces : M. pneumoniae, M. hominis, M. salivarium. M. genitalium, M. fermentans, M. orale. ‐ Les Ureaplasma sont exigeants en urée. Deux espèces, bien que commensales, sont pathogènes pour l’homme : U. urealyticum et U. parvum lorsque leur présence est dominante par rapport aux autres bactéries de la flore normale. 1.1.1 Les Mycoplasmas Ce sont des bactéries parasites de l’homme, des végétaux et des animaux. Dépourvues de parois rigides (mucopeptides), elles peuvent prendre des formes variables (polymorphes) : allongées, amiboïdes, pseudo‐mycéliens ou coccoïdes. Ce sont de très petites bactéries, de 125 à 200 nanomètres qui sont difficilement visibles au microscope optique. Elles sont non colorables par la méthode de Gram. Les mycoplasmes sont capables de se multiplier en dehors des cellules vivantes. Elles peuvent se développer en plusieurs jours sur des milieux artificiels solides ou liquides et prennent alors un aspect d’« œuf au plat ». Le Mycoplasma genitalium est plus effilé que le Mycoplasma hominis. Le M. hominis est capable d’hydrolyser l’arginine alors que le M. genitalium fermente le glucose. 1.1.2 Le Mycoplasma genitalium Il est très difficile à isoler et doit donc à faire croître sur des milieux complexes enrichis en sérum et rendus sélectifs par la présence de pénicilline. Sinon il ne peut être étudié que par des méthodes de biologie moléculaire. Il possède le plus petit génome bactérien connu (580 kb). Son pouvoir pathogène peut provoquer des urétrites non gonococciques ou chroniques chez l’homme. L’urétrite est une inflammation de l’urètre. Il provoque aussi l’endométrite qui est une inflammation du revêtement interne de l’utérus. En de rares cas, il peut être trouvé dans les liquides articulaires au cours du syndrome de Reiter qui est une arthrite réactionnelle causée par des bactéries. 1.1.3 Le Mycoplasma hominis Ce Mycoplasma est une bactérie commensale du tractus urogénital. Près de la moitié des adultes les possèdent dans leur flore. En général il n’est pas considéré comme infectieux, mais peut provoquer occasionnellement plusieurs infections du tractus uro‐génital ainsi que des infections extra génitales. Son pouvoir pathogène peut provoquer des bartholinites qui sont une infection des glandes de Bartholin situées de chaque côté de la partie postérieure de l’orifice du vagin ou encore des pyosalphinx qui sont des kystes sur les trompes de Fallope. Il peut provoquer aussi divers symptômes 6 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée sur le corps comme des endocardites qui sont une inflammation de l’enveloppe interne du cœur, des péritonites, qui sont une perforation du tube digestif ou encore, dans de rares cas, des abcès au cerveau. 1.1.4 L’Ureaplasma parvum/urealyticum C’est un hôte normal des voies génitales masculines et féminines. Sa fréquence d’isolement est directement liée à l’activité sexuelle. Il devient pathogène lorsque sa concentration passe le seuil des 10E4 CFU/ml. On sait aussi que l’Ureaplasma est capable d’hydrolyser l’urée. Son pouvoir pathogène est capable de provoquer des urétrites non gonococciques, des vaginites, des cervicites qui sont une inflammation du col de l’utérus, des lithiases urinaires qui sont des calculs urinaires. Il peut provoquer aussi de la fièvre et à terme une stérilité. 1.2 Le Candida albicans Le Candida albicans est une levure de forme allongée à ronde, qui se reproduit par bourgeonnement. Elle vit de façon commensale dans le tube digestif de l’homme, des mammifères et des oiseaux. C’est un opportuniste lors de déséquilibre digestif, de mauvaise hygiène corporelle, lors de prise de médicaments provoquant un déséquilibre hormonal ou de personne en immunodéficience. Son pouvoir pathogène peut provoquer des lésions cutanées, des septicémies lors de gestes chirurgicaux. 1.3 PCR en temps réel Notre méthode utilise le principe de la PCR en temps réel qui est une amélioration de la PCR classique (Polymerase Chain Reaction). La PCR classique se compose de plusieurs éléments : de l’ADN qui est notre produit à amplifier, il est généralement sous forme double brin, d’amorces (primers) qui sont des petits bouts d’ADN dont on connaît exactement le nombre et l’ordre des nucléotides se trouvant à l’intérieur. Il y a en général deux amorces. Une se fixe sur le brin négatif, dit antisens et l’autre se fixe sur le brin positif (brin sens). Grâce à la complémentarité des bases, celles‐ci vont se fixer sur notre ADN cible. Celles‐ci sont en général sélectionnées afin d’encadrer le bout d’ADN que l’on désire amplifier. Afin d’amplifier notre ADN, c'est‐à‐dire de le multiplier, il nous faut ajouter des nucléotides ; ceux‐ci sont au nombre de quatre : Guanine, Adénine, Thymine, Cytosine. Ils se regroupent par paire, c’est‐à‐dire la Thymine avec l’Adénine et la Cytosine avec la Guanine. Il nous faut aussi une enzyme qui en ajoutant les nucléotides allonge le brin d’ADN amorcé par les primers, c’est la Taq ADN polymérase. J’ai donc tous les éléments pour faire une PCR, je peux donc expliquer les trois étapes de la PCR. La première s’appelle la dénaturation. Elle consiste à chauffer l’ADN, afin que les deux brins d’ADN se séparent. L’ADN devenu simple brin, chacun des nucléotides sont découverts. Ce qui permet de passer à l’étape suivante. 7 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée L’hybridation. Durant cette étape, les amorces vont se fixer sur les brins d’ADN cible grâce à la complémentarité des bases. La Taq polymérase va se fixer sur l’ADN et commencer à allonger la partie de l’ADN que l’on désir amplifier. Cette dernière partie s’appelle l’élongation. C’est en succédant plusieurs fois à ces trois étapes que la PCR fonctionne. Le nombre de cycles dépend de la longueur de l’ADN cible à amplifier. Pour une PCR classique, la détection se fait à la fin de la PCR sur un gel d’agarose. Mais pour la PCR en temps réel, la détection se fait lors de l’hybridation ou de l’élongation, d’où l’utilisation de sonde. Car en effet, la sonde se trouve sur notre ADN cible, entre nos amorces. Il existe différentes sondes : des sondes FRET, des sondes Beacon et des Sondes TAQman. Je décrirai de la sonde TAQman. 1.4 Sonde TAQman Le principe de cette sonde est d’utiliser l’activité 5’‐3’ de la Taq polymérase qui hydrolyser la sonde qui vient de s’hybrider sur l’ADN cible. Comme l’enzyme (Taq polymérase) va toujours du sens 5 ‘‐ 3’. La sonde est constituée d’un fluorochrome et d’un « quencher ». Le quencher absorbe la fluorescence émise par le fluorochrome. Au moment où la polymérase hydrolyse le nucléotide auquel est attaché le fluorochrome, ce dernier se retrouvera loin du quencher et pourra émettre sa fluorescence et le détecteur pourra la calculer. Figure 1 Principe Sonde TAQman (http://ipj.quintessenz.de/content/poster295/abb5.jpg) 1.5 RNAse P La RNAse P est une ribonucléoprotéine composée d’un ARN et d’une protéine. Elle se trouve chez tous les êtres vivants. Elle est chargée de la maturation du pré‐ARNt. Comme elle se trouve chez tous les humains, son gène est un excellent contrôle interne d’extraction et d’amplification. 8 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 2 But Rappel du but de mon travail: Détection de Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum/urealiticum et Candida albicans par PCR en temps réel. 3 Matériel ‐ LightCycler 480 II ‐ Pipettes automatiques ‐ Tubes PCR ‐ Portoir ‐ Plaque multi‐puits 96 ROCHE 3.1 Réactifs ‐ Roche Diagnotics : LightCycler® 480 Probes Master ‐ Sondes TAQman ‐ Primers ‐ H2O PCR ROCHE 3.1.1 LightCycler 480 II Le système du LightCycler 480 (LC480) est conçu pour la réalisation de PCR en temps réel sur un format de 96 échantillons. La PCR se fait dans des plaques à 96 puits. Dans chacun des puits se déroule une PCR en temps réel pour chaque échantillon. La plaque vient se placer sur un bloc chauffant, qui assure un échange thermique rapide et homogène pour toute la plaque. Il est possible, grâce à ce système qui émet et lit la fluorescence à plusieurs longueurs d’ondes, d’élaborer des PCR multiplexes. C'est‐à‐dire de réaliser plusieurs PCR dans un même puits grâce à son système optique et une source lumineuse à haute énergie et large spectre. Le LC480 est capable d’émettre en 5 longueurs d’onde d’excitation et de les séparer en 6 canaux de lecture indépendante. Ce qui nous permet de réaliser des PCR multiplexes. 9 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Voici les longueurs d’onde utilisées pour notre test : Tableau 1 Fluorochrome excitation/émission CN. Sciboz (2008) ANALYSE Fluorochrome (couleur) EXCITATION EMISSION URE + CAN FAM (vert) 465 510 MHO+ MGE Yakima yellow (jaune) 533 580 Contrôle interne CY5 (rouge) 618 660 URE : Ureaplasma parvum/urealitica CAN : Candida albicans MHO : Mycoplasma hominis MGE : Mycoplasma genitalium Comme on peut le voir dans le tableau 1, il y a deux fois deux analyses sur les mêmes fluorochromes, c'est‐à‐dire : les Candida albicans ainsi que les Ureaplasma qui utilisent le fluorochrome FAM et qui ne pourront pas être détectés dans le même puits. Il serait en effet impossible de distinguer si c’est un Candida ou un Ureaplasma que l’on détectera ou les deux. Il en est de même pour les Mycoplasma hominis et genitalium qui utilisent le fluorochrome Yakima Yellow. Nous avons donc décidé de mettre en PCR multiplexe, les Candida et les Mycoplasma hominis ensemble et les Ureaplasma ainsi que les Mycoplasma genitalium ensemble. Comme cela, en deux puits, nous avons la possibilité de détecter quantitativement, quatre sortes de bactéries, avec une très grande spécificité et sensibilité plus un contrôle interne d’amplification. 3.1.1.1 Programme 1 : dénaturation : dénaturation de l’ADN et activation de l’enzyme 2 : cycling : Amplification par PCR de l’ADN cible 3 : cooling : refroidissement de l’instrument Tableau 2 Programme LC480 C.‐N. Sciboz (2008) Paramètre Dénaturation Cycling Cooling Analyse Mode None Quantification mode None Cycles 1 45 1 Segment 1 1 2 1 Target [C°] 95 95 58 40 Hold[hh :mm :ss] 00 :10 :00 00 :00 :10 00 :00 :30 00 :00 :30 Acquisition Mode none none single none 10 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 4 Séquences des primers et Sondes Tableau 3 Tableau Séquences : CN., Sciboz (2008) 4.1 Protocoles 4.1.1 Extraction L’extraction des acides nucléiques est faite dans la routine du laboratoire MCL sur un extracteur automatique : le EasyMag de bioMérieux (France). Le protocole d’extraction est standard et fourni par la société. 4.1.2 Préparation Master‐mix En premier lieu, nous effectuons des « aliquots » de mélange primers et sondes. Il faut savoir que les primers et les sondes arrivent sous forme lyophilisée. Il faut donc les reconstituer à une concentration de 100µM avec de l’eau ultra pure, d’après les indications données sur la feuille fournie par le fabricant. Les sondes sont en général reconstituées à une concentration de 20µM. Puis nous pipetons à volume égal les primers F et R correspondant à chaque analyse, ce qui nous donne une concentration de 50µM. (exemple 100µl de primer Can‐F et 100µl de primer Can‐R à une concentration de 100µM chacun). L’ajout d’ADN extrait (5 µl) se fait en dernier. 11 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Mélange Primer et sonde pour CAN/MHO : Réactifs Concentration Sonde MHO Primers MHO‐R/MHO‐F Sonde CAN Primers CAN‐R/CAN‐F Sonde ctrl interne Primers ctrl interne * Dépend du nombre d’échantillons 20 µM 50 µM 20 µM 50 µM 20 µM 20 µM Concentration Finale 0.2 µM 0.4 µM 0.2 µM 0.4 µM 0.1 µM 0.03 µM Volume 1 ech. 0.21 µl 0.17 µl 0.21 µl 0.17 µl 0.11 µl 0.03 µl Concentration Finale 0.2 µM 0.4 µM 0.2 µM 0.5 µM 0.1 µM 0.03 µM Volume 1 ech. 0.21µl 0.17 µl 0.21 µl 0.21 µl 0.11 µl 0.03 µl Mix * * * * * * Mélange Primer et sonde pour MGE/URE : Réactifs Concentration Sonde MGE Primers MGE‐R/MGE‐F Sonde URE Primers URE‐R/URE‐F Sonde ctrl interne Primers ctrl interne * Dépend du nombre d’échantillons 20 µM 50 µM 20 µM 50 µM 20 µM 20 µM Mix * * * * * * Voici les conditions de réaction pour la PCR en temps réel : volume final de 25 µl/ réaction pour CAN/MHO Réactifs Volume 1 éch. Mélange Sonde/Primers 0.9µl MIX Roche (contient MgCl2) 10µl H2O pure 4.1µl * Dépend du nombre d’échantillons Le MasterMix de Roche contient déjà du MgCl2 à une concentration idéale pour l’utilisation de sondes TAQman. Le magnésium est un cofacteur indispensable pour l’enzyme. Le mélange est ensuite distribué par 15µl de réaction et 5µl d’ADN sont ajoutés par puits. (volume final 20µl) Recouvrir la plaque d’une fine couche de plastique (fournit avec les plaques), afin d’éviter toute évaporation lors de la mise sur LC480 et d’évité les contaminations. C’est une étape importante où il faut à tout pris éviter les contaminations, puisque les puits sont les uns à côté des autres. Aussi faut‐il ne pas se tromper de sens de la plaque et faire un protocole de mise sur plaque afin d’assurer des résultats correspondant aux échantillons/patients. 12 Claude‐Natahaël Sciboz 4.1.3 Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Mise sur LightCycler La plaque est secouée de haut en bas en gardant la plaque horizontalement afin que le mix ainsi que l’ADN soient mélangés au fond des puits. Le film transparent que l’on a posé au‐dessus de la plaque sert à éviter l’évaporation lors du chauffage à haute température dans le LightCylcer. Ensuite, il convient de placer la plaque dans le compartiment du LC480 et de lancer le programme. 13 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 5 Résultats Tableau 4 Data base échantillons : CN., Sciboz (2008) Les résultats positifs sont colorés en vert, alors qu’un résultat négatif en orange. Tous les échantillons ont été testés par méthode manuelle sur gel et sur un LightCycler 480. Comme on peut le voir, de nombreux résultats sortis positifs sur gel (surtout pour Candida), sont devenus négatifs en PCR en temps réel. Cela est dû à la spécificité des primers et à la sensibilité de la 14 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée méthode. Auparavant, sur gel, on se basait sur les yeux du laborant, afin de définir si oui ou non la bande du Candida se trouvait à la même hauteur que son contrôle, alors qu’en PCR en temps réel, c’est une sonde qui le fait en étant beaucoup plus précise. De plus certain Mycoplasma et Ureaplasma qui étaient négatifs sur gel, sont devenus positifs. Comme le LightCycler a une meilleure sensibilité grâce au choix des amorces et des sondes, il peut détecter de plus faibles concentrations d’ADN bactérien. 5.1 Détection sur LC480 La détection sur LightCycler se fait graphiquement. Le détecteur enregistre la fluorescence émise dans chaque puits de la plaque. L’intensité de la fluorescence de base s’appelle « Background ». C'est‐à‐dire le seuil minimal de détection. Comme à chaque nouveau cycle il y a une lecture de la fluorescence. S’il y a présence d’ADN, et donc une augmentation de la fluorescence, le capteur enregistrera la valeur et la reproduira graphiquement. Quand cette fluorescence devient supérieure à celle du « Background », le détecteur déterminera un « crossing point (CP) », c’est à partir le point précis auquel la valeur de la fluorescence augmente exponentiellement. Si la valeur de la fluorescence ne dépasse pas la celle du background, l’échantillon est considéré comme négatif. Nous avons aussi conclu, que la détection d’échantillon positif à partir de 40 cycles, resterait négative, car au bout de plusieurs cycles, les sondes TAQman peuvent s’hydrolysées et donc donner une légère augmentation de la fluorescence sur LC480. Figure 2 Détection LC 480 Les courbes montantes indiquent un échantillon positif. Les courbes restées plates, un échantillon négatif J’ai décidé d’ajouter une « color compensation ». Un fluorophore peut émettre une fluorescence avec un maximum à une longueur d’onde précise mais qui « déborde » cependant dans plusieurs canaux. Donc grâce au procédé de « color compensation », j’ai pu soustraire les émissions de fluorescence dans les canaux de lecture adjacents. 15 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 5.2 Spécificité La spécificité de la méthode, c’est sa capacité à distinguer les résultats négatifs d’un résultat positifs. En d’autres termes, la capacité d’obtenir de vrais positifs et de vrais négatifs. Comme nous avons choisi des sondes et des primers spécifiques à telles bactéries ou champignons nous pouvons donc estimer a priori que nos résultats sont corrects. De plus lors de chaque analyse, un contrôle positif de souche pure est utilisé comme échantillon supplémentaire, afin de valider nos résultats. Un contrôle négatif, en général de l’eau, est aussi utilisé afin de démontrér qu’il n’y a pas eu de contamination lors de la réalisation du test. D’après les résultats obtenus dans notre tableau et la comparaison entre les deux méthodes sont concordants à plus de 95%. Comme tous nos résultats ont été accompagnés de contrôles positifs et négatifs, je peux donc valider mes résultats et valider par la même occasion la spécificité de la méthode. En regardant le tableau, je m’aperçois qu’il y a une plus grosse différence entre les résultats obtenus pour les Candidas albicans sur gel et ceux obtenus sur le LC480. C’est pourquoi, j’ai effectué un test utilisant plusieurs souches de Candida, dont un C. kefyr, un Candida sans particularité et un C. guillermondil. Aucune des souches utilisées n’a été détectée par nos sondes et primers, on peut donc dire qu’elles sont spécifiques à C. albicans. Je peux aussi faire la remarque que plusieurs résultats notés positifs sur gel et négatifs par PCR en temps réel sont sûrement dus à l’utilisation de primers moins spécifiques et aussi dû à la capacité de jugement de l’œil de la personne. Figure 3 Résultat souches CAN 16 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 5.3 Sensibilité La sensibilité d’une méthode, c’est sa capacité à détecter une quantité définie d’ADN. Plus son seuil est bas, meilleurs est sa détection. La sensibilité « clinique » peut différer de la sensibilité analytique. Mais pour ce travail nous ne nous occupons que de la sensibilité analytique. La détermination de la sensibilité a été réalisée par courbe de calibration. La courbe de calibration est une courbe linaire qui se construit grâce aux résultats de plusieurs dilutions du même échantillon pour la même analyse. Pour chaque analyse j’ai réalisé une courbe. En premier lieux j’ai effectué une courbe pour le contrôle interne, car j’étais sûr d’avoir un signal d’amplification dans les prélèvements. Pour cela j’ai utilisé un appareil qui calcule la concentration d’ADN humain, par rapport à sa fluorescence émise en présence de SYBR green. Puis j’ai effectué des dilutions. Après amplification par PCR en temps réel, chaque dilution m’a donné un CP différent. Chaque CP correspondant donc à une concentration connue. J’ai pu donc dessiner une courbe de calibration pour mon contrôle interne. Puisque mon CP de contrôle interne correspond à une concentration d’ADN donnée, je peux donc dire que j’ai une quantité d’ADN équivalent donc à un nombre de copies/µl. Ce qui vient donc à faire une règle de trois, car connaissant le nombre de paires de bases de l’ADN humain et le nombre de paires de bases de mes bactéries et de mon champignon, je peux effectuer un rapport. Figure 4 Rapport ADN humain/bact En utilisant donc les CP, j’ai pu effectuer des standards pour chacune de mes bactéries et du Candida albicans. Grâce à ces Standards, j’ai réalisé des dilutions pour faire une courbe de calibration pour chaque analyse. 17 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Figure 5 Exemple CP utilisés Au final la sensibilité calculée de ma méthode est de : Candida albicans : 20 copies par réaction (4 copies génomiques/µl) Mycoplasma hominis et genitalium: 2 443 621 copies/µl Ureaplasma parvum/urealyticum : 74 216 096 copies/µl 6 Discussion Le tableau des résultats présente ceux de la PCR classique et ceux de la PCR en temps réel. Comme on peut le constater 70% des résultats obtenu sont en parfaite correspondance. Bien que des résultats soient différents, tous sont acceptés, car il s’agit de valider une nouvelle méthode bien plus spécifique et sensible que la précédant. De plus, lors de que chaque test, l’utilisation de contrôles positifs et de contrôles négatifs ont été validés, tout comme l’utilisation d’un contrôle interne d’amplification, me permet d’affirmer qu’un résultat négatif n’est pas dû à une inhibition de la réaction. Plusieurs essais ont été nécessaires pour arriver à l’aboutissement de ce travail. C’est grâce à ces essais que j’ai pu affiner ma méthode, contrôler la concentration de la sonde des Ureaplasma qui était un peu faible, j’ai pu contrôler que les primers des Candidas étaient bien spécifiques. C’est grâce aussi à plusieurs essais et de nombreux calculs que je suis arrivé à une valeur minimale de détection pour chaque analyse. J’ai eu pas mal de difficulté à trouver des échantillons de souches pures afin de réaliser les standards qui me permettraient de réaliser les courbes de calibration. Il a été très difficile d’arriver à des concentrations minimales lors de la réalisation des dilutions des standards. La longueur des génomes bactériens n’est pas précise et les mesures de concentration d’ADN dans les prélèvements pour les Ureaplasma et les Mycoplasma inclues l’ADN humain prélevé lors du frottis. Par conséquent, en réalité, la sensibilité minimale calculée est très probablement bien inférieure à celle indiquée et devrait être de l’ordre de 5‐10 copies génomiques par réaction. 18 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée Pour mon travail de diplôme il était nécessaire d’arriver à une valeur pour estimer la sensibilité, mais pour la validité du test en lui‐même, cela n’était pas nécessaire. Car cette analyse est qualitative. Mais d’avoir un seuil de détection peut permettre de quantifier relativement et de voir l’importance de l’infection. 7 Conclusion Le développement et la validation de l’analyse sur le LightCycler 480 pour les Mycoplasma hominis et genitalium, Ureaplasma urealyticum/parvum et Candida albicans a été réalisée et atteinte. Ceci donne une nouvelle perspective au développement des analyses de laboratoire par PCR en temps réel. Il serait intéressant d’utiliser cette méthode pour la détection d’autres bactéries comme le Trichomonas et la Gardnerella., qui se font aussi par PCR classique. Pour terminer, j’ai eu beaucoup de plaisir à élaborer cette méthode d’analyse. La PCR en temps réel est un avantage considérable au point de vue technologique. Plus précise et plus rapide que la PCR classique, elle permet d’être plus spécifique et plus sensible tout en simplifiant le processus de l’analyse, sans avoir de manipulation supplémentaire 19 Claude‐Natahaël Sciboz Travail de diplôme Développement et validation de la détection de Mycoplasma, Ureaplasma et Candida par PCR en temps réel ESanté 48 ième volée 8 Bibliographie • Berche, P. & al. (1988). Bactériologie : Les bactéries des infections humaines, éditeur : Medecine‐Sciences Flammarion • Bienvenüe, A. (2003). ENSEIGNEMENT A DISTANCE DE "BIOLOGIE PHYSICO‐CHIMIQUE ET STRUCTURALE, Structure de l’ARN. [Page Web]. Accès : http://www.biochimie.univ‐ montp2.fr/licence/interact_adn/arn/page11.htm • Campus de Microbiologie médicale (2009). Cours de bactériologie générale. [Page web]. Accès : http://www.microbes‐edu.org/etudiant/etudiants.html • Einsele, H. & al. (1997). Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes. 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