Developpement et validation de la detection de mycoplasma

Claude‐NathanaëlSciboz
ESanté,48ièmevolée
Avril–Aout2009,LaboratoireMCLNiederwangen
Responsable:Dr.P.‐A.Menoud
DEVELOPPEMENTETVALIDATIONDELADETECTIONDE
MYCOPLASMA,UREAPLASMAETCANDIDA
PARPCRENTEMPSREEL.

Claude‐NatahaëlScibozTravaildediplômeESanté48ièmevolée
DéveloppementetvalidationdeladétectiondeMycoplasma,
UreaplasmaetCandidaparPCRentempsréel
2
Sommaire
Nousavonsdéveloppéuneméthoded’analysequantitativedePCRentempsréelpourtroisbactéries
etunchampignonquisontresponsablesdesinfectionsdelasphèreurogénitale.Ceux‐cipeuvent
provoquerdenombreusesinfectionsurinairesetàterme,uneinfertilitévoiredeslésions
cancéreuses.
CetteméthodeaétédéveloppéepourlesMycoplasmahominis,lesMycoplasmagénitalium,les
Ureaplasmaparvum/urealiticumetleCandidaalbicans.
Cesmicro‐organismessontdesparasitesdenotrecorpsetdenoscellules.Ilspeuventrester
longtempsenlatence,sansquelepatientmontrelemoindresymptôme.
LebutdemontravailestdedévelopperunePCRentempsréelafindedétecterdefaiblesquantités
desADNbactériensenmultiplexe,afindediminuerlesrisquesdecontaminationetderéduirele
tempsentreprispourlaréalisationdecesanalyses.
NosrésultatsdémontrentquelaPCRentempsréelestunetrèsbonnealternativeauxméthodes
traditionnellesdeculturesbactériologiquesetdesPCRconventionnellesavecdétectionsurgel.Celle‐
ciestnonseulementspécifiquemaistrèssensiblepourladétectiondesmicro‐organismes
recherchés.
Motsclés:Mycoplasmahominis,Mycoplasmagenitalium,Ureaplasmaparvum/urealiticum,Candida
albicans,PCRentempsréel,spécificité,sensibilité.
Abstract
Wedevelopedaquantitativemethodforanalysisofthreebacteriaandonefungusbyreal‐timePCR.
Theseorganismsareresponsibleforinfectionsoftheurogenitalsphere.Thesecanleadtonumerous
urinaryinfectionswhicheventuallymayendtoinfertilityorevencancerouslesions.
ThisPCRmethodwasdevelopedforMycoplasmahominis,Mycoplasmagenitalium,Ureaplasma
parvum/urealiticumandCandidaalbicans.
Thesemicroorganismsareparasitesofourbodyandourcells.Theycanstaylatentforalongperiod
oftimewithoutsymptom.
Thegoalofmyworkistodevelopamultiplexreal‐timePCRtodetectsmallamountofbacterialDNA,
decreasingthustheriskofcontaminationandreducingthehands‐ontimeforcarryingoutthe
analysis.
Ourresultsdemonstratethatareal‐timePCRisaverygoodalternativetothetraditionalmethodof
bacteriologicalculturesandtotheconventionalPCRwithagarosegeldetection.Ourmethodisnot
onlyspecificbutverysensitiveforthedetectionofmicroorganismswearelookingfor.
Keywords:Mycoplasmahominis,Mycoplasmagenitalium,Ureaplasmaparvum/urealiticum,Candida
albicans,real‐timePCR,specificity,sensitivity.

Claude‐NatahaëlScibozTravaildediplômeESanté48ièmevolée
DéveloppementetvalidationdeladétectiondeMycoplasma,
UreaplasmaetCandidaparPCRentempsréel
3
Remerciements
JeremercieleDocteurPierre‐AlainMenoud,ainsiqueleLaboratoireMCLpourm’avoiroffertla
possibilitéd’effectuermontravaildediplôme,ainsiquel’aidequ’ilm’aapportépourlaréalisationdu
projet.

Claude‐NatahaëlScibozTravaildediplômeESanté48ièmevolée
DéveloppementetvalidationdeladétectiondeMycoplasma,
UreaplasmaetCandidaparPCRentempsréel
4
Tabledesmatières
1INTRODUCTION.........................................................................................................................5
1.1Lesmollicutes ...................................................................................................................................6
1.1.1LesMycoplasmas................................................................................................................................... 6
1.1.2LeMycoplasmagenitalium.................................................................................................................... 6
1.1.3LeMycoplasmahominis ........................................................................................................................ 6
1.1.4L’Ureaplasmaparvum/urealyticum....................................................................................................... 7
1.2LeCandidaalbicans ...........................................................................................................................7
1.3PCRentempsréel .............................................................................................................................7
1.4SondeTAQman .................................................................................................................................8
1.5RNAseP ............................................................................................................................................8
2BUT ................................................................................................................................................9
3MATÉRIEL....................................................................................................................................9
3.1Réactifs.............................................................................................................................................9
3.1.1LightCycler480II ................................................................................................................................... 9
3.1.1.1Programme ................................................................................................................................. 10
4SÉQUENCESDESPRIMERSETSONDES........................................................................... 11
4.1Protocoles.......................................................................................................................................11
4.1.1Extraction............................................................................................................................................. 11
4.1.2PréparationMaster‐mix ...................................................................................................................... 11
4.1.3MisesurLightCycler............................................................................................................................. 13
5RÉSULTATS .............................................................................................................................. 14
5.1DétectionsurLC480 ........................................................................................................................15
5.2Spécificité .......................................................................................................................................16
5.3Sensibilité .......................................................................................................................................17
6DISCUSSION ............................................................................................................................. 18
7CONCLUSION............................................................................................................................ 19
8BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................... 20
9ANNEXES................................................................................................................................... 21
9.1ProtocolePuro ................................................................................................................................21

Claude‐NatahaëlScibozTravaildediplômeESanté48ièmevolée
DéveloppementetvalidationdeladétectiondeMycoplasma,
UreaplasmaetCandidaparPCRentempsréel
5
1 Introduction
Denombreusesbactériessontdesagentsd’infectionsgénitales.Leurresponsabilitéestsouvent
difficileàconfirmercarcertainessetrouventêtredesorganismescommensauxdenotreflore
bactérienne.Afindepouvoirlesanalyser,lelaboratoireamisenplaceleprofilurogénitalregroupant
denombreusesespècespathogènesparmilespluscourantes.Ceprofilregroupeentreautresles
Mycoplasma,lesUreaplasma,lesCandidaalbicans,lesGardnerellaetlesTrichomonas.
Généralement,cesanalysescommencentaulaboratoiredemicrobiologieafind’identifierces
bactériesparmiseencultureetdéterminerl’espècepargaleriebiochimique.Puis,ilyavérification
parbiologiemoléculaireparméthodestandarddePCRetmigrationsurgeld’agarose.
LebutdemontravailestdemettreaupointetvalideruneanalyseparPCRmultiplexeentempsréel
surunLightCycler480(RocheDiagnostics),abrégéLC480,regroupantMycoplasmahominis,
Mycoplasmagenitalium,Ureaplasmaurealyticum/parvumetCandidaalbicans.
Pourcelanousavonsdûnoussoumettreàplusieursrestrictionsafindemettreenplacecette
méthode.Nousavonsdûtrouverdesprimers(amorces)etdessondesquisoientcompatiblesavecla
températureutiliséeparlaméthodededétectiondukitcommercialiséparRochepourladétection
deChlamydiaetrachomatisetNeisseriagonorrhoeae.Latempératuredéfinieétantde60°Cpour
l’hybridationdesprimersetde65°Cpourcelledessondes.Ilfallaitaussiquelesamorces,ainsique
lessondessoientspécifiquesauxbactériesrecherchées.
Deplus,laréalisationdumélange«réactif»appelé«Mix»ou«MasterMix»doitcontenirles
réactifscontenusdanslekitdebasedeRoche,etl’utilisationdesondesappelées«sondeTAQman»
estderigueur.Parlasuite,ilnousafalluvérifierlasensibilitédenotreméthode,pardifférentes
dilutionsd’ADNbactérienetlaspécificitédenossondesetamorcespourunesoixantaine
d’échantillons.
L’intérêtpourlelaboratoireestl’exécutionrapideetunrésultatfiableafindegarantiruntraitement
adéquatpourlepatient.Deplus,cetteanalyseréaliséeenmultiplexepermetd’éviterles
contaminations.Enfin,saréalisationmanuelleestsimpleetpratique.
Leprojets’estdoncorientédelafaçonsuivante:
Enpremierlieu,nousavonsrecherchédesprimersetdessondesdontlesséquencesétaient
spécifiquesauxdifférentesbactéries,enrecherchantdansdifférenteslittératures.
Puis,ilfallaitconcevoirunmélangeréactionnelcapabled’utiliserceluideRoche,ainsiquedes
sondesTAQman.Nossondesetnosprimersdevaients’hybrideràunetempératuredited’annealing
de60°Cpourlesprimersetde65°Cpourlessondes.Ensuite,l’essaipiloteapermisdedéfinirsinos
mélangesfonctionnaient.Puisestvenul’intégrationd’uncontrôleinterned’extractionet
d’amplification.Asuivi,unaffinagedel’analyse,quicomprendentreautreslesdiverschangements
auniveaudesconcentrationsdumélangeréactionnel,lasensibilitéetlaspécificitédelaméthodepar
lavalidationtechniquedesoixanteéchantillonsencomparantnosrésultatsavecceuxd’une
méthodedePCRavecdétectionsurgel.