contribution à l`étude du pouvoir immunomodulateur des

TAHAR AMROUCHE
CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DU POUVOIR IMMUNOMODULATEUR
DES BIFIDOBACTÉRIES : ANALYSE IN VITRO ET ÉTUDE EX VIVO
DES MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Sciences et Technologie des aliments
pour l’obtention du grade de Philosophiæ doctor (Ph.D.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION
FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2005
© Tahar Amrouche, 2005
Résumé
Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets
bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes
fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont
rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches
probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes
impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce
projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries
isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels
ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois
souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides (B.
thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis
Bb12 et des souches ATCC (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B.
pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire
induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée
d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une
stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu
cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les
exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus
approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité
immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou
protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs,
le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des
anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre
Bifidobacterium. Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ
58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés,
ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant
la détection spécifique et sensible des bifidobactéries.
ii
Résumé long
Les bifidobactéries sont des bactéries candidates potentielles aux probiotiques à
cause de leurs effets bénéfiques sur la santé de l’homme incluant la prévention et/ou
traitement des gastro-entérites, intolérance au lactose, cancer, hypercholestérolémie, etc.
Une des propriétés intéressantes des bifidobactéries est leur capacité à moduler certaines
fonctions du système immunitaire et remédier à certaines pathologies immunologiques.
Cependant, les études rapportées démontrant les effets immunomodulateurs des
probiotiques sont basées sur des modèles utilisant des cellules bactériennes vivantes et
limités à certaines souches probiotiques. L’effet des composants issus de la lyse cellulaire
dans le tractus gastro-intestinal sur le système immunitaire demeure mal connu, d’où alors
la nécessité d’élucider les mécanismes d’immunostimulation induits par ces derniers. Le
but de ce projet est d’étudier le potentiel immunomodulateur de certaines souches de
bifidobactérie isolées d’humains et utilisées à l’état non viable et d’explorer les mécanismes
moléculaires impliqués dans cette action immunomodulatrice. Notre étude visait d’une part,
à évaluer les effets de certains composants cellulaires de bifidobactérie notamment le
contenu cytoplasmique brut, la paroi cellulaire, et les exopolysaccharides (EPS) sur la
réponse immunitaire, et d’autre part, caractériser à l’échelle moléculaire les composants à
pouvoir immunomodulateur et exploiter leur propriété pour produire des anticorps
monoclonaux permettant de détecter spécifiquement les bifidobactéries dans les aliments.
Trois souches locales de bifidobactéries, B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64
(fèces de bébés) productrices d’EPS ont été étudiées et comparées au Bifidobacterium lactis
Bb12 (souche de référence). Des souches ATCC de bifidobactéries ont également été
utilisées pour développer des anticorps monoclonaux.
Les résultats obtenus montrent des effets immunostimulants dépendant de la
souche/espèce, du composant cellulaire et de la dose utilisée. Une meilleure stimulation de
la prolifération cellulaire (Indice de stimulation =16) est obtenue avec la paroi cellulaire de
B. lactis Bb12 (40 µg/ml). Le contenu cytoplasmique stimule la réponse immunitaire à un
niveau moindre que la paroi, par contre, les EPS bruts ou fractionnés n’induisent aucun
effet. La stimulation de la prolifération à été confirmée par le dosage des cytokines révélant
iii
une forte production de IFN-γ (> 4 µg/ml) générée par la paroi cellulaire, et une stimulation
de la sécrétion de IL-10 dans le milieu (< 1 µg/ml). Par ailleurs, les résultats obtenus
démontrent que l’effet immunostimulant induit par le cytoplasme de B. lactis Bb12 est
associé aux fractions peptidiques et/ou protéiques intracytoplasmiques, notamment les
fractions acides. Les peptides et les protéines immunostimulants sont de poids moléculaire
très variable et de caractère moins hydrophobe. Toutefois, des études in vivo et cliniques
devraient être réalisées afin de valider ces résultats et laisser envisager une perspective
d’utilisation
des
bifidobactéries
à
l’état
de
lysats
cellulaires
comme
agents
immunomodulateurs commercialisables sous forme de nutraceutiques.
Il était prévu dans ce projet de mettre à profit les propriétés immuno-actives des
bifidobactéries pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries.
Par cette approche, nous voulions aborder une problématique liée à l’utilisation des
bifidobactéries comme probiotiques vivants dans les produits alimentaires et se résumant
en la difficulté de détecter les souches de bifidobactéries vivantes dans ces produits. Cette
partie du projet a pour objectif de produire et caractériser des anticorps monoclonaux
dirigés contre les protéines de paroi (antigène de surface) de bifidobactéries en vue de
mettre au point des tests immunologiques combinés à la culture bactérienne (en plaque)
permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries vivantes dans les aliments.
L’analyse du profil protéique des parois (SDS-PAGE) de six espèces différentes de
bifidobactérie (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B.
pseudolongum) a révélé des bandes différentes et des bandes similaires (PM: 34 à 58 kDa)
(protéines communes probables).
Testées pour leur immunogénicité chez des souris Balb/c, une forte production
d’anticorps polyclonaux a été mise en évidence (test ELISA) chez les souris immunisées
avec les protéines de B. bifidum et B. longum (titre en anticorps de 53333). Ces deux souris
ont alors été sélectionnées pour la fusion cellulaire et la production d’anticorps
monoclonaux. Les anticorps (IgG)
anti-B. longum produits ont montré une réactivité
croisée avec l’ensemble des espèces de bifidobactérie testées indiquant une antigénécité
iv
partagée entre les espèces de bifidobactéries. En effet, un épitope commun porté par une
protéine de 58 kDa (PM) a été révélé par une analyse de type "western-blot".
De plus, une analyse en ELISA directe a permis de confirmer la spécificité des
anticorps produits puisque le test s’est révélé négatif avec d’autres souches non apparentées
aux bifidobactéries. La fixation de l’anticorps sur les bifidobactéries a été observée au
microscope électronique après un traitement immunochimique. La sensibilité de l’anticorps
a été estimée par ELISA à 105 cfu/ml. La détection des cellules viables de bifidobactéries
par l’anticorps produit a été par ailleurs démontrée par le test d’immuno-culture. Toutefois,
les résultats de ce test devraient être validés sur des produits probiotiques (yogourt, lait
fermenté, etc) afin de rendre le test utilisable à l’échelle industrielle.
Mots clés : Nutraceutiques, probiotiques, Bifidobactéries, système immunitaire,
immunomodulation, prolifération cellulaire, Cytokines, Cytoplasme, Exopolysaccharides,
Paroi cellulaire, Anticorps.
v
Abstract
Probiotic bifidobacteria are known to have beneficial effects on host health. One of
the interesting properties of these bacteria is their capacity to modulate the host immune
function. However, the mechanisms by which the bifidobacteria influence the immune
response are not well known. This project aimed to evaluate the immunodulatory potential
of some bifidobacterial strains isolated from newborn feces. We tried to determine the
cellular and molecular mechanisms involved in immune response induced by cytoplasmic
content, cell wall and exopolysaccharides from bifidobacteria. Three exopolysaccharideproducing fecal strains of bifidobacteria (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82, and
RBL64) and a commercial available strain (Bifidobacterium lactis Bb12) were tested using
mouse splenocytes. The results demonstrate that a high stimulation of cell proliferation and
interferon-gamma (IFN-γ) production were induced by cell wall. In addition, a concomitant
stimulation of interleukin-10 (IL-10) secretion was observed. The cytoplasmic content was
also shown to be immunostimulating, but less than cell wall. However, the effects observed
were dose or strain-species-dependent. B. lactis Bb12 was found to be significantly more
immunostimulating than other bifidobacterial strains used. Partially fractionated peptides
and acidic fraction from B. lactis Bb12 showed a low hydrophobicity and appeared heat
stable and mitogenic. In contrast, no immunostimulating effects were induced by
exopolysaccharides. The mitogenic properties of cell wall protein were then explored to
develop specific monoclonal antibodies (Mab) able to detect bifidobacteria species in food.
Common proteins were revealed in cell wall extracts from bifidobacteria (B. animalis, B.
breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum). The proteins obtained were
found to be immunonogenic in Balb/c mouse. Monoclonal antibodies (IgG) -anti-B.
longum- produced cross-reacted with all bifidobacteria tested. The shared antigenicity
shown by bifidobacteria was revealed by an epitope supported by a common protein of 58
kDa. This was confirmed by immune-transmission electron microscopy observation, which
showed the specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins.
The Mab produced was also shown to be sensitive (105 cfu/ml) and specific to members of
the bifidobacterial genus. The Mab developed allowed detection of viable cells of
bifidobacteria using immuno-culture test.
vi
Key words: Antibodies, bifidobacteria, cell proliferation, cell wall, cytokines, cytoplasm,
exopolysaccharides, immunomodulation, immune system, nutraceutics.
Agzul (résumé en berbère)
Bifidubaktiri d iprubyuteken (probiotiques) i yetwassnen atas assagi, yeεni ţţibaktiryin mara twarnunt i tgulliyin ţţakent ayen yelhan i tdawsa. Tibaktiriyin agi zemrent
ad snernint kra n tsuγnin yeţhuddun γef tfekka mgal atanan n uεebbud d izerman n
bnadem. D acu kan, ar assa, ur nessin ara amek tibaktiriyin stanent tafekka. Iswi n usenfar
agi d anelmud n unezmar n usnerni n ustan n bifidubaktiri. Ayagi i wakken a d-naf
isemduyen n kra n tsegrin n tsiluliyin (cellules) am iferdisen (éléments) yellan daxel, sufella neγ i d-deggirent ar berra γef tririt n uhuddu. Krad (3) n ccetlat n bifidubaktiri idyekkan seg izerman llufan ţwalmendent ţwasdemrent ar yiwet n ccetla tamselγut
Bifidobacterium lactis Bb12. Agmuden i d-nessufeγ qqaren-d d akken asnerni yelhan n
ufadi n tsiluliyin n udihan (rate) n amumad, i d- yettabaε unerni amuqran n IFN-γ yakw d
usennerni n usufeγ (sécrétion) n IL-10, yefkaten-id ulesi n tsilulit (paroi cellulaire). Ayen
yellan daxel n tsilulit d tazunin-ines (ipeptidiyen yak tiprutiniyin) snernayent drus γef ulesi.
Ma d ayen yεenan EPS (exopolysaccharides) ulac asnnerni i d-yekkan segsen. Ma d
tiprutiniyin n ulesi n bifidubakiri (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum
et B. pseudolongum) banent-ed d timesnerniyin timuqranin n uhareb γef tfekka n umumad
(Balb/c) ssutuyent afares amuqran n tfekkamgalin. Tifekkamgalin i d-yeffγen d yiwet n
txellalt (IgG) mgal B. longum ţwafursent-ed s trennawet u sknent-ed tasedmirt tanmidagt
(réaction croisée) yakw d ccetlat nniden n bifidubakiri. Anecta yekka-d seg yiwet n
teprutint (protéine) tamsihart i yezzayen 58 kd. Tulmist n tfekkamgalin i d-yefursen
yeţwasentem-ed s usadez (test) ibaw i d- yelummzen mi ţ-nerεed yakkw d cctali nniden n
tbaktiriyin. Tufin n bifidubaktiri yeddren s tfekkamgalin i d-yedran yefursen yedra-d s
usadez n immuno-culture. Tifekkamgalin tulmisin i-d yekkan seg yiwet n txellayt idnessenfel zemrent ad ţwaqedcent i tifin n cctali n bfidobktiri di tgwellyin.
Awalen n tsurra : Nutraceutiques, iprubyutiken, bifidubaktiri, anagraw amhaddan, asnerni
uhuddu, afadi n tsiluliyin, cytokines, cytoplasme, exopolysaccharides, alessi n tsilulit,
tafekkamgalt.
Avant-Propos
La présente thèse est le fruit d’un travail de longue halène accompli en quatre
années. Elle porte sur un sujet d’actualité traitant principalement des probiotiques et de la
modulation de la fonction immunitaire. Ce sujet relève de l’interface entre la microbiologie
et l’immunologie et ouvre des perspectives prometteuses dans le domaine de la
bactériothérapie. La réalisation de ce projet de doctorat m’a permis de relever un défi en
découvrant cette nouvelle interface aussi passionnante que complexe. Cette thèse comporte
trois articles scientifiques, dont je suis l’auteur principal, rédigés en anglais et précédés
chacun par un résumé en français, et une revue de littérature écrite en français.
L’introduction et le Chapitre I, intitulé « Revue de littérature », présentent la
problématique de recherche et font état des connaissances actuelles sur les probiotiques, les
prébiotiques et les symbiotiques. L’effet des probiotiques sur la modulation de la fonction
immunitaire constitue l’essentiel de cette revue et est introduit comme une propriété
prometteuse pour l’utilisation des probiotiques, puisque cette propriété ne semble pas être
nécessairement liée à la viabilité des probiotiques. Les travaux rapportés dans la littérature
sont discutés et leur analyse m’a permis de cerner la problématique, de poser l’hypothèse et
de définir les objectifs de recherche à réaliser.
Le Chapitre II, intitulé « Effects of bifidobacterial cytoplasm, cell wall and
exopolysaccharides on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production”, constitue
la première étape de mes travaux. Dans ce chapitre, sont étudiées les propriétés
immunomodulatrices des composants cellulaires de bifidobactéries. J’avais effectué mes
travaux expérimentaux à l’Université Laval et, en partie, au CEGEP Lévis Lauzon (Qc)
sous la supervision du Dr Ismail Fliss et Dr Yvan Boutin respectivement. Guénolée Prioult
avait contribué aux tests de prolifération lymphocytaire et à l’analyse des cytokines. Ce
chapitre présente intégralement le contenu d’un article scientifique (en anglais) qui est sous
presse à : International Dairy Journal.
Le Chapitre III, portant le titre « Effects of bifidobacterial cytoplasm peptide and
protein fractions on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production », est
viii
consacré à l’étude de certains composants intra cytoplasmiques responsables de l’effet
immunomodulateur induit par une souche de bifidobactérie ayant montré des propriétés
immunostimulantes potentielles dans le chapitre II. Nous avions donc étudié l’effet des
fractions peptidiques et protéiques extraites du cytoplasme de B. lactis Bb12 sur la
prolifération des lymphocytes et la sécrétion de cytokines. J’ai accompli tous mes travaux
expérimentaux à l’Université Laval aux laboratoires du Dr Ismail Fliss, du Dr Sylvie
Gauthier et du Dr Julie Jean et au laboratoire d’analyse instrumentale. Dr Najat Attouri
avait contribué aux essais de prolifération lymphocytaire, alors que Alain Gaudreau a
apporté sa contribution dans l’analyse et le fractionnement des peptides et protéines. Le
présent chapitre fait objet d’un article à soumettre prochainement à International Dairy
Journal.
Quant au Chapitre IV, intitulé «Production and characterization of antibifidobacteria monoclonal antibodies and their application in the development of an
immuno-culture detection method» a été réalisé dans le but de développer des anticorps
monoclonaux spécifiques capables de détecter des espèces de bifidobactéries viables par un
test d’immuno-culture. La fusion cellulaire a été réalisée au laboratoire du Dr Yvan Boutin
au CEGEP Lévis Lauzon (Qc). J’ai réalisé la production et la caractérisation des anticorps
anti-bifidobactéries, ainsi que le test d’immuno-culture, au laboratoire du Dr Ismail Fliss à
l’Université Laval. Olivier Moroni avait contribué à l’extraction des protéines pariétales,
alors que Dr Ehab Kheadr et Richard Janvier ont apporté leur contribution dans la
réalisation des travaux de microscopie électronique. L’immunisation des souris et la
collecte de sang ont été effectuées par Julie Brassard, Mélanie Alain et Vincent Leclerc à
l’Université Laval. Le présent travail a eu le mérite du 3ème prix de meilleure présentationaffiche attribué par le comité d’évaluation lors du Symposium international de Montréal
(La santé par les probiotiques-Applications dans ce troisième millénaire, 28 et 29 octobre
2004). Ce chapitre est présenté sous forme d’un article scientifique rédigé en anglais et
accepté à la publication au Journal of Microbiological Methods.
Enfin, une Conclusion générale est présentée pour donner une vision globale de mes
travaux de thèse de doctorat tout en mentionnant les conclusions les plus importantes qui en
ressortent, et en soulignant leur impact et les perspectives d’avenir.
ix
Remerciements
Le mérite de ce travail revient à toutes les personnes qui ont participé à sa
réalisation et auxquelles d’ailleurs j’exprime ma profonde reconnaissance. La réussite de ce
travail ne saurait être possible sans le grand apport de mon directeur Dr Ismail Fliss et de
mon co-directeur Yvan Boutin. Je remercie Dr Ismail Fliss de m’avoir offert l’opportunité
de réaliser ce projet au sein de son équipe, pour ses conseils précieux, ses orientations
scientifiques, ainsi que son optimisme affiché malgré toutes les contraintes. Mes vifs
remerciements s’adressent également au Dr Yvan Boutin pour son encadrement tant
apprécié assuré pendant l’expérimentation et la rédaction de la thèse, sa rigueur
scientifique, ses encouragements et ses conseils judicieux.
Je tiens à remercier FCAR, NOVALAIT, MAPAQ, NSERC et la banque mondiale
pour leur support financier. Je voudrai remercier également Dr Sylvie Gauthier et Dr Julie
Jean pour l’accès accordé à certains équipements de leurs laboratoires respectifs, pour les
conversations scientifiques et leurs encouragements. J’adresse aussi mes remerciements au
directeur du CEGEP Levis Lauzon de m’avoir bien accueilli au sein de son établissement,
où une bonne partie de mes travaux expérimentaux a été réalisée. Je désire remercier Dr
Gisèle Lapointe pour la pré lecture du manuscrit, ainsi que les membres du jury pour avoir
examiné et jugé mon travail.
Mes remerciements vont aussi aux Dr Ehab Kheadr et Dr Nadjat Attouri pour leur
disponibilité et leur contribution appréciable à ce projet. J’aimerai remercier énormément
Julie Brassard, Mélanie Alain et Vincent Leclerc pour toute l’aide fournie au niveau de
l’animalerie. J’exprime ma profonde gratitude à toute l’équipe de l’ADVITECH Solution
pour l’esprit de coopération manifesté tout au long de ce projet. Je remercie tout
particulièrement Josée Fortier, Lynda Labarre, Nicolas. Le personnel de la clinique des
maladies d’allergie (Place de la Cité, Sainte-Foy, Québec) est également remercié pour les
échantillons de sang de donneurs fournis pour nos expériences préliminaires.
x
Ce projet n’aurait pu être une réussite sans la contribution de plusieurs personnes
parmi elles: Olivier Moroni, Guénolée Prioult, Alain Gaudreau, Richard Janvier, Claude
Gosselin, Céline Paquin, Edith Tousignant, Anne-Françoise Allain, Myriam Roy (CEGEP
Levis Lauzon), Arezki Djaout et Chem Chi. Que tout le personnel administratif du centre
STELA, de l’INAF, du département ALN et de la faculté FSAA (Université Laval) ayant
contribué directement ou indirectement à ce projet soit remercié.
Je n’oublierai évidemment pas de remercier toutes les personnes auxquelles revient
le mérite de ma formation au Québec et ailleurs. Je remercie également toute ma famille
pour son soutien moral à distance et tou(te)s mes ami(e)s avec lesquel(le)s j’ai partagé
durant mon séjour au Québec des moments de loisir et d’humour agréables et des soirées
inoubliables.
xi
A ceux et celles qui me sont cher(e)s.
A la mémoire des victimes du mouvement citoyen en Kabylie et ailleurs.
Table des matières
Résumé
Résumé long
Agzul (résumé en berbère)
Remerciements
Liste des tableaux
Liste des figures
Chapitre I. Revue de littérature
1.1 Écosystème gastro-intestinal : composition et évolution
1.1.1 Description générale
1.1.2 La microflore intestinale
1.1.3 Les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale
1.2 Les probiotiques et les prébiotiques
1.2.1 Définitions
1.2.2 Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé
1.2.3 Les principales souches microbiennes à potentiel probiotique
1.2.4 Propriétés et critères de sélection des probiotiques
1.3 Les probiotiques et le système immunitaire
1.3.1 Le système immunitaire de l’hôte
1.3.2 La modulation de la réponse immunitaire
1.3.3 Effets des probiotiques et de leurs composants sur le système immunitaire
1.3.4 Les probiotiques et l’immunomodulation : Études in vitro et in vivo
1.4 Problématique de recherche et objectifs
Chapitre II. Effets du contenu cytoplasmique, de la paroi cellulaire et des
exopolysaccharides de bifidobactéries sur la prolifération de lymphocytes de souris et la
production de cytokines. Effects of bifidobacterial cytoplasm, cell wall and
exopolysaccharides on mouse lymphocyte proliferation and cytokine production.
2.1 Résumé
2.2 Abstract
2.3 Introduction
2.4 Material and methods
xiii
2.4.1 Bacterial strains and culture conditions
2.4.2 EPS isolation, purification and fractionation
2.4.3 EPS molecular mass determination
2.4.4 Preparation of cytoplasm and cell wall extracts of bifidobacteria
2.4.5 Stimulation of mouse splenocytes by bifidobacterial extracts
2.4.6 Statistical analysis
2.5 Results and discussion
2.5.1 EPS production by bifidobacteria
2.5.2 Splenocyte proliferation induced by bifidobacterial extracts
2.5.3 Cytokine production
2.6 Conclusions
Chapitre III. Effets des fractions peptidiques et protéiques du cytoplasme de bifidobactéries
sur la prolifération des lymphocytes de souris et la production de cytokines. Effects of
bifidobacterial cytoplasm peptide and protein fractions on mouse lymphocyte proliferation
and cytokine production.
3.1 Résumé
3.2 Abstract
3.3 Introduction
3.4 Material and methods
3.4.1 Bacterial strains and culture conditions
3.4.2 Preparation of bifidobacterial cytoplasm extracts
3.4.3 Cytoplasm peptide and protein profile analysis
3.4.4 Separation of acidic and basic peptide and protein fractions
3.4.5 Characterization of cytoplasm peptide and protein fractions of bifidobacteria
3.4.6 Proliferation assay
3.4.7 Cytokine analysis
3.4.8 Statistical analysis
3.5 Results and discussion
3.5.1 Peptide and protein profile of bifidobacterial cytoplasm
3.5.2 Fractionation of cytoplasmic content into acidic and basic fractions
3.5.3 Characterization of cytoplasmic acidic and basic fractions
xiv
3.5.4 Cell proliferation and cytokine production induced by semi purified peptides and
proteins
3.5.4.2 Effect on cytokine production
3.6 Conclusion
Chapitre IV. Production et caractérisation d’anticorps monoclonaux anti-bifidobactéries et
leur application dans le développement d’une méthode de détection en immuno-culture.
Production and characterization of anti-bifidobacteria monoclonal antibodies and their
application in the development of an immuno-culture detection method
4.1 Résumé
4.2 Abstract
4.3 Introduction
4.4 Material and methods
4.4.1 Bacterial strains and culture conditions
4.4.2 Protein extraction and purification
4.4.3 Immunization of mice and evaluation of specific antibody production
4.4.4 Monoclonal antibody (Mab) production
4.4.5 Purification and isotyping of monoclonal antibody
4.4.6 Determination of cross reactivity by western blot
4.4.7 Antibody specificity test
4.4.8 Sensitivity test
4.4.9 Immune-Transmission electron microscopy (TEM)
4.4.10 Detection of bifidobacteria using an Immuno-culture (IC) method
4.5 Results and discussion
4.6 Conclusion
Conclusion générale
Liste des tableaux
Tableau 1.1. Les principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la
microflore intestinale. Adapté de Holzapfel et al. (1998).
Tableau 1.2. Les prébiotiques et les candidats aux prébiotiques (Blaut, 2002).
Tableau 1.3. Quelques souches probiotiques et leurs effets cliniques. Adapté de MattilaSandholm et al. (1999).
Tableau 1.4. Distribution des différentes espèces de Bifidobacterium dans le tractus digestif
de l’homme en fonction de l’âge (Ballongne, 1993).
Tableau 1.5. Réponses immunes vis-à-vis d’une denrée alimentaire au niveau de la
muqueuse intestinale. Adapté de Kaminogawa (1996).
Tableau 1.6. Études in vitro, in vivo et cliniques récentes sur les effets immunomodulateurs
des probiotiques.
Table 3.1. Average molecular weight of most abundant peptides or proteins detected in
each labelled peak from acidic and basic fractions.
Liste des figures
Figure 1.1. Schéma simplifié décrivant les compartiments de l’appareil digestif de l’homme
et leurs microflores. Adapté et modifié de Ouwehand & Vesterlund (2003).
Figure 1.2. Vue générale sur la microflore du colon humain. Adapté de
Roberfroid (1995).
Gibson &
Figure 1.3. Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté de
Mercenier et al. (2002).
Figure 1.4. Propriétés et critères de sélection des probiotiques. Adapté de Salminen et al.
(1998).
Figure 1.5. Organisation fonctionnelle tripolaire des cellules T helper et équilibre Th1/Th2.
Adapté et modifié de Bot et al. (2004).
Figure 1.6. Description schématique du fonctionnement de l’immunité induite par un
antigène détecté. ADCC, cellules cytotoxiques dépendant des anticorps; Tr : Lymphocyte T
régulateur; B, Lymphocyte B; Th, Lymphocyte T helper; CPA, cellules présentatrices de
l’antigène; Tc, Lymphocyte T cytotoxique; NK : cellules naturelles tueuses; K, cellules
tueuses. Schéma tiré de : Roitt I, Brostoff J, Male D. (1998), Immunology (Fifth Edition),
Philadelphia: Mosby, et modifié par Kidd (2003).
Figure 1.7. Les propriétés anti-allergiques potentielles de IL-10. Adapté de Till et al. (2004)
Figure 1.8. Les différents effets biologiques des anticorps. Adapté de Casadevall et al.
(2004).
Figure 1.9. Description schématique générale du système immunitaire associé à la
muqueuse intestinale. A, B et C : voies d’entrée de l’antigène: (A), les cellules épithéliales
intestinales ; (B) interaction des cellules dendritiques et cellules épithéliales; (C) cellules
M. Flèches : sens de drainage lymphatique des plaques de Peyer et de Lamina propria des
villosités (vers les nodules lymphatiques mésentériques). Adapté de Spahn & Kucharzik
(2004).
Figure 1.10. Les sources de variation de la fonction immunitaire. Adapter de Calder &
Samantha (2002).
Figure 1.11. Représentation schématique de la polarisation des cellules Th1 et Th2 et de la
sécrétion des cytokines. Ag, antigène; MHC II, Molécules du CMH de classe II; TCR,
Récepteur cellulaire des cellules T; LPs, lipoprotéines; CpG, motif de nucléotide non
méthylé; APC, cellules CPA; LPS, lipopolysaccharides; TLRs, Toll-like receptors; B7.1 et
B7.2, molécules de co-stimulation ; CD, Cluster déterminant ( Brandtzaeg, 2002).
xvii
Figure 1.12. Les thérapies possibles basées sur la manipulations des lymphocytes in vivo
proposées pour le traitement de certaines maladies immunologiques. (+), expansion; (-)
inhibition. Adapté de McGuirk & Mills (2002).
Figure 1.13. Action des probiotiques et des prébiotiques sur le système immunitaire de
l’intestin. Adapté de Ouwehand et al. (2002).
Figure 1.14. Représentation schématique de la paroi des bactéries Gram-positives (Delcour
et al., 1999).
Figure 1.15. Schéma illustrant l’interaction entre les composants bactériens (Lactobacillus
grasseri) et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor. Adapté de Saito (2004).
Figure 2.1. EPS content of polysaccharide fractions from three bifidobacterial strains
isolated from newborns feces (A), strain RBL81; (B), strain RBL82; (C), strain RBL64.
The fractions were separated by centricon based on their molecular weight: F1 > 100 000
Da; F2: 5 000 – 100 000 Da; F3: < 5 000 Da.
Figure 2.2. Gel permeation chromatography analysis of crude bacterial exopolysaccharides
: A1, 1600x103 Da; A2, 100x103 Da; B, L. rhamnosus RW-9595M; C, strain RBL 82.
Figure 2.3. Gel permeation chromatography analysis of fractioned EPS from bifidobacterial
strain RBL82 using pullulan standard: A1, 1600x103 Da; A2, 100x103 Da; D, F1 > 100,000
Da; E, F2: 5 000 – 100 000 Da; F, F3 < 5 000 Da.
Figure 2.4. Effect of (A) cytoplasmic content, (B) cell wall, and (C) EPS extracts from the
strains RBL64 and B. lactis Bb12 on splenocyte proliferation when the preparations were
normalized on the basis of their protein content. Columns with different letters are
significantly different.
Figure 2.5. Synergistic effect of PHA and cellular preparations (A) cytoplasmic content,
(B) cell wall, and (C) exopolysaccharides from bifidobacterial strain RBL64 and B. lactis
Bb12 on IFN-γ splenocyte production when cells were cultured in complete RPMI medium
added with mitogen agent (PHA) (10 µg mL-1). No IFN-γ was detected in PHA-free media
and there was no significant difference between treatments with exopolysaccharides. *,
higher than 4 µg mL-1.
Figure 2.6. Synergistic effect of PHA and cellular preparations (A) cytoplasmic content,
(B) cell wall, and (C) exopolysaccharides from bifidobacterial strain RBL64 and B. lactis
Bb12 on IL-10 splenocyte production when cells were cultured in complete RPMI medium
added with mitogen agent (PHA) (10 µg mL-1). No IL-10 was detected in PHA-free media
and there is no significant difference between treatments with cytoplasmic content. ND, not
detected.
Figure 3.1. Peptide and protein profile of cytoplasmic extracts from strains B.
thermoacidophilum RBL64, RBL82 and RBL84, and B. lactis Bb12 obtained by SDSPAGE using 10 % acrylamide gel.
xviii
Figure 3.2. Peptide and protein profile of acidic fraction (B. lactis Bb12) analysed by RPHPLC (C18 column). Labelled peaks are selected and collected using an appropriated
colum.
Figure 3.3. Peptide and protein profile of basic fraction (B. lactis Bb12) analysed by RPHPLC (C18 column). Labelled peaks are selected and collected using an appropriated
colum.
Figure 3.4. Effect of (A) acidic and basic fractions and crude cytoplasmic extract, and (B)
semi purified peptides and proteins from B. lactis Bb12 on splenocyte proliferation. The
cytoplasmic preparation was normalized on the basis of its protein content. Columns with
different letters are significantly different.
Figure 3.5. Effect of acidic fraction, basic fraction, and crude cytoplasmic extract from B.
lactis Bb12 on splenocyte IFN-γ production. The cytoplasmic preparation was normalized
on the basis of its protein content. Columns with different letters are significantly different.
Figure 3.6. Effect of acidic and basic fraction, and crude cytoplasmic extract from the
strains B. lactis Bb12 on splenocyte IL-4 production. The cytoplasmic preparation was
normalized on the basis of its protein content. Columns with different letters are
significantly different.
Figure 4.1. SDS-PAGE of cell wall proteins from six bifidobacteria strains carried out
with 10 % acrylamide gel.
Figure 4.2. Antibody level of mice immunized by cell wall proteins from six bifidobacterial
species. The averages presented were calculated from values corresponding to the three
mice receiving the same antigen.
Figure 4.3. Western blot carried out with protein solution from bifidobacteria using purified
monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 at concentration of 0.06 µg/ml. The
proteins were separated on acrylamide (10%) gel and transferred in PVDF membrane.
Figure 4.4. Bifidobacterium longum cells bounded by the monoclonal antibody produced
against B. longum ATCC 15708 shown by transmission electronic microscopy: (a) negative
control (treatment without antibody), (b) treatment with antibody. Bar indicate 200 nm.
Figure 4.5. Specificity of monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 tested against
cells (OD650 nm = 0.1) from (a) Bifidobacterium genera and (b) other species of bacteria at
concentration of 0.5 µg/ml. Control (+), supernatant from clone culture tested for anti-B.
longum production.
Figure 4.6. Variation of the reactivity of the monoclonal antibody produced against B.
longum ATCC 15708 tested at different concentration against bacterial cells (OD650 nm=
0.1). Supernatant from clone culture tested for anti-B. longum production was used as
positive control.
xix
Figure 4.7. Sensitivity test carried out with diluted cell suspension using purified
monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 at the optimal concentration of 0.5
µg/ml.
Figure 4.8. Immune-culture test carried out with anti-B. longum and fresh culture of B.
longum using 6-wells plate. Because of high size of wells in culture plate a maximal
concentration of anti-B. longum (1.5 µg/ml) was used for coating; mother- solution of B.
longum: 1.4x 109 cfu/ml; dilution A1: 10-7, B2: 10-6, and B1:10-5; A2: negative control
(non-coated well).
Introduction
L’Homme à l’instar des animaux vit continuellement en association avec la
population de microorganismes complexe habitant son tractus gastro-intestinal. L’un des
principaux effets bénéfiques émanant de leur alliance est la protection et l’amélioration de
la résistance aux maladies infectieuses de l’organisme-hôte (Fuller, 1989; Asahara et al.,
2001a,b; Saavedra & Tschernia, 2002; Tlaskalová-Hogenová et al., 2004; Sullivan & Nord
2005). Cependant, la composition de cette flore peut être altérée par divers facteurs
alimentaires et environnementaux, qui rendent l’organisme-hôte susceptible aux maladies
ou aux désordres digestifs.
Les travaux de Metchnikoff (1907) ont démontré que la consommation d’aliments
fermentés permet de rétablir la flore intestinale en générant des effets bénéfiques sur la
santé de l’homme et des animaux. Les investigations récentes ont mis en évidence le rôle
crucial que jouent la microflore intestinale dans le maintien et l’amélioration de la santé.
Certains de ces travaux ont montré que les animaux conventionnels pourvus d’une
microflore intestinale complète sont plus résistants aux infections que les animaux
axéniques (germ-free) dépourvus de microflore (Perdigon et al., 2001; Neumann et al.,
1998; Lima-Filho et al., 2004).
En effet, de nombreuses études scientifiques ont rapporté les propriétés
prophylactiques et thérapeutiques de certains microorganismes présents dans les aliments
fermentés (Parker, 1974; Gibson & Fuller, 2000; Varcoe et al., 2003; Marelli et al., 2004,
Lin et al., 2005). Ces microorganismes favorables pour la santé de l’homme et de l’animal
ont reçu le nom de « Probiotiques ». Ce concept a été développé tout particulièrement après
l’émergence, ces dernières décennies, des bactéries résistantes aux antibiotiques et l’intérêt
suscité par les agents naturelles d’inhibition pour le contrôle des germes pathogènes
(Ouewhand et al., 1999; Kailasapathy & Chin, 2000).
Des études récentes (Hirayamma & Rafter, 2000; Reid & Burton, 2002; Ibnou-Zekri
et al., 2003; Lodinova-Zadnikova et al., 2003; Rinkinena et al., 2003; Sgouras et al., 2004;
2
Asahara et al., 2004) ont montré que la consommation de produits alimentaires enrichis en
probiotiques produit plusieurs effets favorables sur l’organisme tels que l’amélioration des
mécanismes de la réponse immunitaire, le rétablissement de l’équilibre microbien dans le
colon, le traitement de certaines infections intestinales et uro-génitales, la réduction des
risques d’allergie, de cancer, d’ulcère, etc.
Les microorganismes probiotiques sélectionnés en alimentation humaine sont
représentés essentiellement par les bactéries lactiques, particulièrement celles appartenant
au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Sanders, 2000; Sullivan &
Nord, 2002;
Borriello et al., 2003; Saito et al., 2004). Aujourd’hui, ces deux genres bactériens sont
largement utilisés dans la fabrication de produits laitiers fermentés. A titre d’exemple, aux
États Unis, près de 60 % des yogourts réfrigérés contiennent des cultures probiotiques tels
que Lactobacillus acidophilus et / ou Bifidobacterium sp. La consommation de yogourt
dans ce pays est passée de 0.5 à 2 kg/ personne/an (Blum et al., 1999). En Europe, le
marché des probiotiques destinés à la consommation humaine a été évalué à près de 12.9
millions $ US en 2003, ce marché augmente actuellement d’environ de 14 % par an
(Anderson, 2004).
La perception des propriétés prophylactiques et thérapeutiques des probiotiques est
à l’origine de la consommation accrue des produits laitiers fermentés notamment le yogourt
(Mercenier et al., 2002; Chukeatirote, 2003). Cependant, l’effet probiotique des
bifidobactéries dépend de leur taux de survie non seulement dans les aliments mais
également dans le tractus gastro-intestinal (Shah, 2000; Marteau et al., 2003; Gagnon et al.,
2004). Pour cette raison, il devient nécessaire d’identifier et d’évaluer la population de
bifidobactéries dans les produits fermentés afin de s’assurer d’un apport en probiotiques
suffisant pour obtenir les effets bénéfiques escomptés. Ceci donc inciterait à développer de
nouvelles méthodes moléculaires fiables permettant de détecter spécifiquement les espèces
ou souches de bifidobactéries (Klein, 2003; Corsetti et al., 2003; Vitali et al., 2003).
Un des effets positifs sur la santé attribué aux probiotiques est leur action sur le
système immunitaire. La modulation de certains paramètres de la réponse immunitaire par
3
les probiotiques suscite actuellement de plus en plus d’intérêt compte tenu des problèmes
d’ordre immunologique observés chez l’homme (infections, allergies, déficiences
immunitaires, etc) (Cunningham-Rundles et al., 2000; Chiang et al., 2000; Fang et al.,
2000; Cano & Perdigon, 2003). Les études déjà rapportées ont montré que certaines
bifidobactéries sont capables de stimuler la fonction immunitaire en favorisant l’activité des
macrophages, la production d’anticorps, l’induction d’effets anti-tumoraux, la réduction
d’allergie et l’induction du phénomène de tolérance orale (Ducluzeau et al., 1984;
Yamazaki et al., 1985; Reddy & Rivenson, 1993; Calder & Samantha, 2002; Welman &
Maddox, 2003; Chukeatirote, 2003; Prioult et al., 2003; Mastrandrea et al., 2004).
Par ailleurs, certains travaux de recherche ont suggéré que la flore intestinale
pourrait être un facteur
indispensable pour rétablir l'équilibre entre les cellules
immunitaires Th1 et Th2 qui jouent un rôle pivot dans le processus d’immunomodulation. Il
semblerait que certaines souches intestinales peuvent jouer un rôle important dans la
suppression (greffes, maladies auto-immunes) ou la stimulation (défenses contre les
bactéries ou les virus) de la réponse immunitaire. Cependant, les mécanismes cellulaires et
moléculaires par lesquels les probiotiques exercent ces effets immunomodulateurs ne sont
pas encore bien élucidés (Isolauri et al., 2001; Kaur et al., 2002; Perdigon et al., 2003;
Kidd, 2003 ).
Les effets immunomodulateurs observés ont été souvent associés à la consommation
de souches probiotiques vivantes. Cependant, des études récentes ont montré que certains
probiotiques non viables sont également capables d’exercer des effets similaires sur le
système immunitaire En effet, il a été mentionné dans la littérature que des lysats cellulaires
de souches probiotiques (Lactobacillus casei, L. rhamnosus GG, L. acidophilus, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium lactis, et Streptococcus thermophilus) ont
des effets immunorégulateurs (Pessi et al., 1999; Bautista-Garfias et al., 2001; Kankaanpa
et al., 2003). Des études ont démontré que certains motifs d’acides nucléiques provenant du
génome des probiotiques présentent des propriétés immunomodulatrices (Lammers et al.,
2003; Klinman et al., 2004; Jijon et al., 2004). Il semblerait aussi que les
exopolysaccharides capsulaires ou excrétés dans le milieu par les souches bactériennes
4
stimulent également les composants du système immunitaire (Rangavajhyala et al., 1997;
Brubaker et al., 1999; Ruas-Madiedo et al., 2002). Une étude récente menée par Chabot et
al. (2001) a démontré que les exopolysaccharides produits par Lactobacillus rhamnosus
RW-9595M stimulent la réponse immunitaire. Cependant, l’effet des exopolysaccharides,
ainsi que celui des peptides et des protéines du cytoplasme, des bifidobactéries sur la
réponse immunitaire n’ont fait l’objet d’aucune étude.
Notre projet vise à évaluer le potentiel de certaines souches de bifidobactéries
d’origine humaine à moduler certaines fonctions immunitaires. Il vise également à
identifier, à l’aide d’essais in vitro et ex vivo, les constituants cellulaires responsables de
cette fonction immunomodulatrice et d’identifier ainsi les mécanismes impliqués.. De façon
plus spécifique, ce projet vise à i) évaluer le potentiel de certaines souches de
bifidobactéries isolées d’humain à moduler certaines fonctions immunitaires; ii) identifier
les composantes cellulaires (contenu cytoplasmique, paroi cellulaire et exopolysaccharides)
responsables de cet effet immunomodulateur; iii) caractériser, à l’aide de tests in vitro et ex
vivo cette activité immunomodulatrice; iv) caractériser à l’échelle moléculaire les fractions
identifiées et v) exploiter l’effet immunodulateur de certains constituants cellulaires pour
produire et caractériser des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries et de les
utiliser pour la détection de bifidobactéries vivantes dans les aliments.
Chapitre I: Revue de littérature
1.1 Écosystème gastro-intestinal : composition et évolution
1.1.1 Description générale
Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux
microorganismes exogènes. De par sa surface totale (muqueuse) estimée à 200-300 m2, il
représente la plus grande surface du corps en contact avec l’environnement (Holzapfel et
al., 1998). L’écosystème gastro-intestinal est généré par une alliance stable entre
l’épithélium gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne.
Ces trois composants sont continuellement liés entre eux et évoluent ensemble en assurant
une fonction et une activité normales de l’écosystème. Si l’un des trois composants de
l’écosystème est défaillant, l’alliance est altérée et par conséquent diverses pathologies s’y
installent (McCracken & Lorenz, 2001). La Figure 1.1 montre les principaux
compartiments constituant le tractus gastro-intestinal de l’homme. Les interactions entre les
microorganismes
et l’hôte peuvent être de trois types: symbiose, commensalisme et
pathogénicité (Hooper & Gordon, 2001). L’hôte est protégé contre la microflore intestinale
pathogène par les barrières chimiques et physiques formées par l’épithélium gastrointestinal (Kagnoff & Eckmann, 1997).
1.1.2 La microflore intestinale
Selon la définition de Isolauri et al. (2002), la flore intestinale normale est une
collection complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus
gastro-intestinal et remplissant un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du
système immunitaire de l’hôte. Après une colonisation complète, la microflore intestinale
est considérée comme un organe acquis après la naissance. Il est constitué d’une grande
diversité d’espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l’hôte. La microflore
du tractus gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014 cellules microbiennes
représentant 400 à 500 espèces et sous espèces. Cette microflore représente environ 10 fois
le nombre total de cellules du corps humain (Moore et Holdeman, 1974; Bjorksten, 2004).
6
Œsophage : mucus, péristaltisme.
Seuls les microorganismes provenant
des aliments ou de la cavité orale sont
présents
Duodénum: Secrétions
pancréatiques et biliaires,
mucus, faible O2.
Microflore: 103-104 cfu/g
Bacteroides
Candida albicans
Lactobacillus
Streptococcus
Colon: Anaérobiose,
motricité, enzymes
bactériennes, acides gras
volatiles, ammoniaque…
Microflore: 1010-1011 cfu/g
Bacteroides
Bacillus
Bifidobacterium
Clostridium
Enterococcus
Eubacterium
Fusobacterium
Peptostreptococcus
Ruminococcus
Streptococcus
Estomac: pH acide (HCl), O2,
enzymes (pepsines, lipases…),
mucus.
Microflore: 104 cfu/g
Candida albicans
Helicobacter pylori
Lactobacillus
Streptococcus
Jéjunum: Secrétions pancréatiques
et biliaires, mucus, péristaltisme.
Microflore: 105-107 cfu/g
Bacteroides
Candida albicans
Lactobacillus
Streptococcus
Iléon : Anaérobiose, sels
biliaires, enzymes.
Microflore : 107-108 cfu/g
Bacteroides
Clostridium
Enterobacteriacea
Enterococcus
Lactobacillus
Veillonella
Figure 1.1. Schéma simplifié décrivant les compartiments de l’appareil digestif de
l’homme et leurs microflores. Adapté et modifié de Ouwehand & Vesterlund (2003).
La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des conditions
régnant dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont été identifiées :
les bactéries autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches particulières, et les
bactéries allochtones ou transitoires rencontrées dans d’autres habitats du tractus. La
majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent normalement en harmonie avec
l’hôte, excepté lorsque l’équilibre du système est rompu (Hao & Lee, 2004).
7
Du point de vue microbiologique, comme le montre la Figure 1.1, l’environnement
gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent des conditions très
différentes pour la survie des différents microorganismes. Dans le premier compartiment,
l’estomac, la prolifération microbienne est fortement réduite par la présence d’oxygène
apporté par la déglutition et d’une forte acidité. De ce fait, l’estomac héberge sélectivement
les microorganismes acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles,
streptocoques, levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit intestin, la
microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives tels que les
lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies strictes notamment les
bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies. Dans le dernier compartiment qui est le
colon (dépourvu d’oxygène), le transit digestif est plus lent et la flore microbienne est plus
abondante, représentant 35 à 50 % du volume du contenu du colon humain (Cummings et
al., 1989; Gounier-Château,1994).
La microflore du colon est très complexe et dominée par les bactéries anaérobies
strictes (Bacteroides spp., Clostridium spp, Bifidobacterium spp., Atopobium spp…).
Tandis que les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par
les lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae. Les levures
(ex. Candida albicans) sont relativement faiblement représentées. La charge microbienne
dans les différents compartiments a été estimée à environ : 104, 103-4, 105-7, 107-8 et 1010-11
colonies formant unité (cfu)/g dans l’estomac, le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le colon
respectivement (Ouwehand & Vesterlund, 2003; Isolauri et al., 2004). Les bifidobactéries
et les lactobacilles, ainsi que certains entérocoques, E. coli, streptocoques et bactéroides, se
distinguent par leurs effets bénéfiques sur la santé de l’hôte, comme l’amélioration de la
maturation et de l’intégrité de l’intestin, l’antagonisme contre les pathogènes et la
modulation de la fonction immunitaire (Gibson & Roberfroid, 1995; Schiffrin & Blum,
2002; Rastall, 2004). Les principaux composants de la flore du colon ainsi que leurs effets
sur l’hôte sont présentés dans la Figure 1.2.
Toutefois, il faut noter qu’une partie de la flore gastro-intestinale (fraction
minoritaire) demeure non cultivable et moins explorée, et ce pour diverses raisons:
8
méconnaissance des besoins de croissance de certaines bactéries, la sélectivité des milieux
utilisés, le stress dû aux conditions de culture, la nécessité d’anaérobiose stricte et la
difficulté de stimuler les interactions entre les bactéries et les autres microorganismes ou les
cellules de l’hôte (Zoetendal et al., 2004).
Organismes négatifs pour la santé
Organismes positifs pour la santé
1
Putréfaction
intestinale
Ps. aeruginosa
Proteus sp.
Production de
carcinogènes
Staphylocoques
Clostridies
Veillonellae
Diarrhées, constipation,
infections, atteinte du foie,
Cancer, toxigénèse,
encéphalopathie
Inhibition de la croissance
de bactéries exogènes et
pathogènes
Entérocoques
E. coli
Lactobacilles
Digestion/absorption
d’ingrédients alimentaires
et minéraux
Stimulation de
la fonction immunitaire
Streptocoques
Bifidobactéries
Bactéroides
2
Synthèse de vitamines
No./g fèces (log10)
Figure 1.2. Vue générale sur la microflore du colon humain. Adapté de Gibson &
Roberfroid (1995).
1.1.3 Les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale
La composition et les fonctions de la microflore du tractus gastro-intestinal sont
influencées par divers facteurs liés au changement des conditions physiologiques de l’hôte
9
( âge, état de santé,…), de la composition du régime alimentaire et des circonstances
environnementales (contamination par les pathogènes, antibiothérapie, chimiothérapie,
climat, stress, hygiène …) (Mitsuoka, 1989; Hopkins et al., 2002). Selon, Holzapfel et al.
(1998), les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale sont résumés dans
le Tableau 1.1.
Tableau 1.1. Les principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la
microflore intestinale. Adapté de Holzapfel et al. (1998).
Facteurs médiés par l’hôte
Facteurs microbiens
- pH, secrétions (immunoblogulines,
- Adhésion
bile, sels, enzymes),
- Motilité
- Motilité (péristaltisme),
- Flexibilité nutritionnelle
- Physiologie (variable selon les
- Spores, capsules, enzymes,
composants antimicrobiens
compartiments),
- Cellules détachées, mucines, exsudats
- Temps de génération.
de tissus.
Interactions microbiennes
Synergie
Antagonisme/ stimulation
- Coopération métabolique
- Acides gras de courte chaîne, amines.
- Excrétion de vitamines et facteurs
- Changement de Eh, pH et tension d’O2
- Composants antimicrobiens,
de croissance
siderophores,
- Changement de Eh (potentiel d’oxydoréduction), pH et tension d’O2 .
- Besoins nutritionnels, etc.
Régime alimentaire
Composition, fibres non digestibles, drogues, etc.
Les divers facteurs mentionnés dans le Tableau 1.1 peuvent perturber l’équilibre de
l’écosystème intestinal en favorisant des espèces particulières par rapport à d’autres. Dans
certains cas, ce déséquilibre peut être très favorable à la prolifération de microorganismes
10
opportunistes pathogènes pouvant compromettre la santé et le bien-être de l’hôte. Il serait
donc impératif de rechercher des solutions alternatives permettant la restauration de
l’équilibre de la microflore intestinale de l’hôte. L’utilisation des probiotiques et/ou des
prébiotiques (préparations microbiennes ou à base de certaines substances) s’est avérée une
alternative prometteuse. Ces nouveaux concepts sont décrits dans la section suivante.
1.2 Les probiotiques et les prébiotiques
1.2.1 Définitions
1.2.1.1 Les probiotiques
La notion de '' probiotiques'' a été développée grâce aux travaux de Metchnikoff
(1907) qui avait constaté que les paysans bulgares, grands consommateurs de laits
fermentés, vivaient très vieux et en bonne santé. Ainsi, Metchnikoff avait proposé
l’ingestion de bactéries vivantes, particulièrement des bactéries lactiques, pour réduire les
désordres intestinaux et améliorer l’hygiène digestive, et donc augmenter l’espérance de vie
(Gournier-Château et al., 1994).
Le terme probiotique dérive des deux mots grecs '' pros'' et '' bios'' qui signifient
littéralement ''pour la vie'' contrairement au terme antibiotique signifiant ''contre la vie''. Ce
terme a été introduit pour la première fois par Lilly et Stillwell (1965) pour décrire des
substances produites par un microorganisme et stimulant la croissance d’autres
microorganismes. Depuis, plusieurs définitions ont été données aux probiotiques
dépendamment de leurs effets sur la santé. Selon Parker (1974), « probiotiques » désigne
les microorganismes et les substances qui contribuent au maintien de l’équilibre de la flore
intestinale. Cette définition englobant les microorganismes et les métabolites microbiens
produits (les antibiotiques), a été modifiée par Fuller (1989) qui redéfinit les probiotiques
comme étant : ''des préparations microbiennes vivantes utilisées comme additif alimentaire
et qui ont une action bénéfique sur l'animal hôte en améliorant la digestion et l'hygiène
intestinale''. Enfin, selon la définition adoptée par le groupe de travail mixte formé par
l’Organisation des Nations Unies (ONU) pour l’agriculture et l’alimentation et
l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) (Report of FAO/WHO, 2002), les
11
probiotiques sont « des microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui
sont bénéfiques pour la santé de l’hôte ».
De façon plus spécifique, pour qu’un organisme soit considéré comme étant
potentiellement probiotique il doit présenter les caractéristiques suivantes:
- être un habitant naturel de l’intestin,
- être capable de coloniser le milieu intestinal, persister et se multiplier
- adhérer aux cellules intestinales et exclue ou réduit l’adhérence des pathogènes
- avoir un métabolisme actif et produire des substances inhibant les pathogènes
(acides, H2O2, bactériocines…)
- non invasif, non carcinogène et non pathogène
- être capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée
- survivre aux différents procédés technologiques de production
-
garder sa viabilité dans l'aliment et durant le transit intestinal (Salminen et al.,
1996, Tannock, 1999a,b; Stanton et al., 2001).
Dans toutes les définitions prononcées, la notion de viabilité apparaît comme un
critère de sélection important. Cependant, cette notion demeure très controversée puisque
des études récentes, ont clairement démontré que même les souches non viables de
probiotiques sont capables d’exercer certains effets positifs sur la santé entre autres la
stimulation de certaines fonctions immunitaires, l’inhibition de l’adhésion et l’invasion de
certains pathogènes (Coconier et al., 1993; Ouwehand et al., 1999). Ceci laisserait donc
envisager une éventuelle redéfinition des probiotiques où la notion de viabilité sera à
reconsidérer.
1.2.1.2 Les prébiotiques
Certains
composants
de
la
microflore
intestinale,
particulièrement
les
bifidobactéries, sont capables de fermenter des substances essentiellement non digestibles
(hydrates de carbone) dans le colon grâce à son pouvoir saccharolytique important (Kaplan
et al., 2000). Cette propriété permet d’augmenter la croissance ou l’activité des
microorganismes spécifiques du tractus gastro-intestinal en influençant positivement la
12
santé de l’hôte. Les effets bénéfiques générés par ces interactions ont permis le
développement du nouveau concept « prébiotiques » (Berg, 1998; Kaialaspathy & Chin,
2000).
Le concept de prébiotique a été développé suite aux travaux de Gibson et al. (1995)
qui ont mis en évidence une stimulation sélective de la croissance de bifidobactéries dans le
colon de sujets ayant ingérés de l’oligofructose et de l’inuline. Ainsi, les prébiotiques ont
été définis comme étant des ingrédients alimentaires non digestibles exerçant des effets
bénéfiques sur l’hôte en stimulant sélectivement dans le colon la croissance et/ou l’activité
d’une ou d’un nombre limité de bactéries capables d’améliorer la santé de l’hôte.
Les prébiotiques doivent être non digestibles pour servir de substrat aux bactéries
spécifiques, principalement les bifidobactéries et les lactobacilles, qui sont actives et
améliore la santé de l’hôte. Les fibres alimentaires comme les polysaccharides tels que
l’amidon, l’inuline, la pectine, la gomme guar, et les oligosaccharides non digestibles sont
ainsi fermentées par les bactéries intestinales en produisant des acides gras à courte chaîne
notamment les acides acétique, propionique et butyrique…qui sont alors utilisés par les
différents tissus de l’hôte comme substrats énergétiques, ou comme facteurs de régulation
cellulaire (Blaut, 2002). Par exemple, le butyrate est non seulement utilisé par les cellule
épithéliales du colon à des fins énergétiques, mais aussi joue un rôle majeur dans la
régulation de leur processus de prolifération et différenciation cellulaires (Mortensen et al.,
1996; Litvak et al., 1998).
Pour être considéré comme prébiotique, un ingrédient alimentaire doit:
a- être ni hydrolysé ni absorbé dans le tractus gastro-intestinal,
b- être sélectif pour un nombre limité de bactéries endogènes,
c- modifier la microflore intestinale en améliorant sa composition,
d- induire des effets intestinaux ou systémiques bénéfiques pour la santé de l’hôte
(Gibson et al., 1995)
Le Tableau 1.2 rapporte les principaux ingrédients alimentaires considérés comme
prébiotiques.
13
Tableau 1.2. Les prébiotiques et les candidats aux prébiotiques (Blaut, 2002).
Composant
prébiotique
Xylo-oligosaccharides
Composition
Oligosaccharides de soja
Raffinose(F-Gal-G)+stachyose(F-Gal-Gal) 3–4
Oligosaccharides
transgalactosylés
6’ Galactosyllactose
β (1→4) liés aux unités de xylose
Degré de
polymérisation
2–4
2–8
Condensats de Palatinose Molecules de sucrose réarrangées par voie 2–7
enzymatique
Isomaltooligosaccharides Transgalactosylation de maltose
2–8
Inuline
β (2→1) Fructans
2–65
Oligofructose
β (2→1) Fructans
2–8
Lactulose (Bifiteral®)
Galactosyl-β (4→1) fructose
3–5
1.2.1.3 Les symbiotiques
Un symbiotique est un mélange de probiotiques et de prébiotiques qui affecte
positivement l’hôte en
améliorant la survie et l’implantation d’espèces microbiennes
vivantes apportées sous forme de suppléments alimentaires dans le tractus gastro-intestinal,
et, par conséquent, la santé et le bien-être de l’hôte (Isolauri et al., 2002).
Le terme symbiotique évoque la propriété de synergie et est réservé uniquement aux
produits contenant les probiotiques et les prébiotiques au même temps. Dans ces produits,
les prébiotiques stimulent sélectivement la croissance des probiotiques. Par exemple, un
produit contenant l’oligofructose et une bifidobactérie probiotique est considéré comme un
symbiotique. Cependant, lorsque un Lactobacillus probiotique est associé à l’oligofructose,
la combinaison ne forme pas un symbiotique (Schrezenmeir & Vrese,
2001). Cette
différence serait due au fait que les bifidobactéries produisent une grande quantité de
14
ß-fructosidases, enzymes capables de dégrader sélectivement la liaison entre les fructoses
présents dans l’oligofructose.
Une étude récente de Bartosch et al. (2005) réalisée sur un groupe de volontaires
âgés (> 62 ans) dont le contenu intestinal en bifidobactéries est fortement réduit par l’âge, a
démontré que l’ingestion d’un symbiotique à base de Bifidobacterium bifidum BB-02 et
Bifidobacterium lactis BL-01 (probiotiques) et de l’inuline (prébiotique) a augmenté
significativement la taille et la diversité des populations de bifidobactéries dans les matières
fécales par rapport au groupe contrôle et groupe placebo.
1.2.2 Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé
Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des
probiotiques. La Figure 1.3 illustre la diversité des effets bénéfiques sur la santé
documentés et rapportés dans la littérature.
Amélioration de la
digestion du lactose
(sécrétion de lactase)
Influence positive sur la
flore intestinale
Bonne croissance et le
bien-être
Régulation de la
motilité intestinale
(constipation, syndrome
d’irritation intestinale)
Réduction des produits
du catabolisme éliminés
par le foie et le rein
Probiotiques
Prévention de : ostéoporose,
cancer, hypertension et
athérosclérose (réduction du
taux de cholestérol)
Augmentation de la valeur
nutritionnelle (bonne
digestion et absorption des
minéraux et vitamines
Prévention des infections
intestinales (virus,
i et
Helicobacter pylor…)
urogénitales
Modulation du système
immunitaire
Réduction de l’inflammation
ou des réactions allergiques
Figure 1.3. Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté de
Mercenier et al. (2002).
15
Il est à noter que la validité scientifique de ces effets bénéfiques est très variable.
Pour certains effets, des preuves scientifiques irréfutables appuyées par des études cliniques
existent et permettent d’attribuer certaines allégations-santé aux produits probiotiques. Pour
d’autres, les allégations demeurent encore à un stade hypothétique et des études plus
approfondies demeurent nécessaires pour apporter des preuves scientifiques convaincantes
à ces allégations.
a) Les probiotiques et les infections gastro-intestinales: des études cliniques ont
démontré que des infections gastrointestinales causées par Helicobacter pylori, la diarrhée
du voyageur, diarrhée due aux rotavirus, diarrhée-associée aux antibiotiques comme celle
causée par Clostridium difficile, peuvent être contrecarrées avec succès par l’utilisation de
probiotiques (Mercenier et al., 2002, Turchet et al., 2003; Wang et al., 2004; Tursi et al.,
2004, Plummer et al. 2004). A titre d’exemple Wang et al. (2004) ont rapporté que la
consommation régulière de yogourt additionné de Lactobacillus acidophilus La5 ou de
Bifidobacterium lactis Bb12 induit une suppression effective de l’infection due à H. pylori.
Tandis que Rosenfeldt et al. (2002) ont mentionné que des souches de L. rhamnosus et L.
reuteri ont permis de traiter des gastro-entérites à rotavirus chez des enfants hospitalisés.
b) Les probiotiques et l’intolérance au lactose : il a été rapporté que la
consommation de lait ou de yogourt enrichis en probiotiques améliore l’absorption de
lactose chez les patients déficients en lactase et réduit les symptômes digestifs dus à
l’intolérance au lactose. Jiang et al., 1996 ont démontré que la consommation de lait
contenant des souches de Bifidobacterium longum
réduit les symptômes de la
malabsorption de lactose chez des sujets humains suite à une élévation de la sécrétion de βgalactosidase.
c) les probiotiques et le cholestérol: des études préliminaires ont révélé que la
consommation de yogourt ou de lait fermenté contenant des probiotiques entraînent une
diminution du taux de cholestérol dans le sang, et par conséquent la réduction les risques
d’hypercholestérolémie responsable des maladies coronariennes. Par exemple, Bukowska et
16
al. (1998) ont mis en évidence une diminution du taux de cholestérol sanguin chez des
sujets soumis à un régime supplémenté avec Lactobacillus plantarum 299 v.
d) Les probiotiques et la prévention du cancer du colon: selon certaines études, les
bactéries probiotiques ont la propriété d’inhiber les processus conduisant à la formation du
cancer du colon chez l’homme. En effet, Matsumoto et Benno (2004) ont mentionné que la
consommation
de
yogourt
contenant
Bifidobacterium
lactis
LKM512
réduit
significativement la mutagénécité dans l’intestin de volontaires par comparaison à un
placebo.
e) Les probiotiques et les maladies inflammatoires de l’intestin: selon la littérature,
les processus inflammatoires impliqués dans les pathologies de l’intestin de l’homme
comme la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse et la pouchite sont contrôlés par les
probiotiques. Une étude de Guandalini (2002) a montré que l’ingestion de Lactobacillus
GG entraîne une amélioration notable de l’état clinique chez des enfants souffrant de la
maladie de Crohn. De même Gosselink et al. (2004) ont observé des effets cliniques
bénéfiques chez des patients affectés par une colite ulcéreuse après ingestion de produits
fermentés contenant Lactobacillus GG (1-2x1010 bactéries/jour).
f) Les probiotiques et la perméabilité intestinale : l’altération de la perméabilité
intestinale (fonction-barrière) causée par une infection, toxines ou autre facteur favorise un
transfert aberrant d’antigènes (y compris la microflore locale) à travers l’intestin en
engendrant des réponses immunitaires inappropriées (réactions inflammatoires ou autoimmunes) (Baumgart & Dignass, 2002 ; Gill, 2003). Des études récentes ont montré que la
consommation de probiotiques stabilise la fonction barrière de l’épithélium intestinal. Par
exemple, Isolauri et al. (1993) ont démontré que Lactobacillus GG normalise le processus
de perméabilité intestinale chez le rat. En outre, une étude récente de Rosenfeldt et al.
(2004) a démontré qu’une administration de probiotiques (Lactobacillus rhamnosus et
Lactobacillus reuteri) permet de stabiliser la fonction-barrière de l’intestin et de diminuer
les symptômes gastro-intestinaux chez des enfants souffrant d’une dermatite atopique.
17
Cependant les mécanismes impliqués dans cette normalisation ne sont pas encore bien
connus.
g) Les probiotiques et la motilité de l’intestin : la motilité intestinale joue un rôle
important dans la réduction de la croissance des microorganismes pathogènes dans
l’intestin. Les probiotiques pourraient avoir des effets positifs sur la motilité de l’intestin en
réduisant le temps de transit des microorganismes pathogènes (Takiguchi et al.,1998). Une
étude de Grimaud et al. (1993) a montré que l’ingestion de lait fermenté avec
Bifidobacterium animalis entraîne une réduction significative du temps du transit du
contenu gastro-intestinal chez des volontaires. Tandis que Verdu et al. (2004) ont rapporté
que l’effet de Lactobacillus paracasei (probiotique) sur la motilité de l’intestin se traduit
par une atténuation de l’hyper contractilité post-infection du muscle. Ils suggèrent que les
probiotiques peuvent être utilisés dans le traitement du syndrome de l’intestin irritable.
Dans d’autres cas, les allégations-santé revendiquées demeurent purement
hypothétiques et des études scientifiques plus approfondies sont nécessaires pour confirmer
ou infirmer ces allégations. Cette situation est particulièrement vraie pour les effets des
probiotiques sur le système immunitaire et pour lesquels très peu de preuves scientifiques et
d’études cliniques ont été apportées pour valider ces allégations. Néanmoins, la stimulation
du système immunitaire de l’hôte demeure un aspect très important dans le développement
du concept « probiotiques », d’autant plus que certains travaux rapportés dans la littérature
(voir section 1.3.4) suggèrent que certaines souches à fort potentiel probiotique sont
capables de stimuler certaines fonctions immunitaires notamment lors d’infections
bactériennes ou virales.
1.2.3 Les principales souches microbiennes à potentiel probiotique
1.2.3.1 Les souches probiotiques utilisées en alimentation humaine et animale
Les souches ou espèces probiotiques sont des composants normaux de la flore
intestinale (Dunne et al., 2001). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus
utilisés comme probiotiques sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Goldin
18
et Gorbach, 1992; Berg, 1998). Par contre, en alimentation animale de nombreux genres
bactériens et fongiques sont utilisés, comme Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus,
Streptococcus,
Pediococcus,
Enterococcus,
Propionibacterium,
Saccharomyces,
Aspergillus et Torulopsis (Tannock, 1997; Pirkka et al., 1999; Huang et al., 2003).
En général, les souches probiotiques sont sélectionnées prioritairement pour leurs
effets bénéfiques et leur sécurité d’utilisation (innocuité). Le Tableau 1.3 rapporte
quelques souches probiotiques pour les quelles des effets bénéfiques sur la santé sont bien
documentés. Cependant, l’aptitude des souches bactériennes à stimuler la fonction
immunitaire est très variable, seulement certaines souches sont reconnues capables
d’exercer des effets immunomodulateurs sur l’organisme-hôte (Gill et al., 2000).
Il faut noter que les bactéries du genre Bifidobacterium sont de plus en plus utilisées
dans les produits probiotiques à causes des nombreux effets bénéfiques sur la santé associés
à leur consommation. (Kimura et al., 1998). Pour obtenir certains effets positifs sur la santé
(réduction des infections intestinales, digestion du lactose, réduction du cholestérol…), une
souche probiotique doit atteindre le gros intestin à une concentration d’environ 1x107
cellules viables/gramme (Stanton et al., 2001). De ce fait, la concentration d’un probiotique
dans un aliment doit tenir compte de cette contrainte pour permettre d’atteindre les
concentrations ciblées dans le colon. Cette concentration dépend évidemment de la nature
de l’aliment utilisé et de la quantité journalière consommée.
19
Tableau 1.3. Quelques souches probiotiques et leurs effets cliniques. Adapté de
Mattila-Sandholm et al. (1999).
Souche probiotique
Effets cliniques sur l’Homme
Adhésion aux cellules intestinales humaines,
réduction de l’activité des enzymes fécales,
Lactobacillus GG ATCC 53103
prévention des diarrhées associées aux
antibiotiques, prévention et traitement des
diarrhées à rotavirus et autres diarrhées,
modulation de la réponse immunitaire
Prévention de la diarrhée du voyageur, modulation
Lactobacillus jonhsonii Lj-1(LA-1) de la flore intestinale, réduction des symptômes de
l’intolérance au lactose, traitement de la
constipation, amélioration de l’immunité, adjuvant
dans le traitement de Helicobacter pylori
Prévention de la diarrhée du voyageur, traitement
Bifidobacterium lactis (bifidum) Bb- des diarrhées virales (rotavirus), modulation de la
flore intestinale, traitement de la constipation,
12
modulation de la réponse immunitaire.
Lactobacillus reuteri ATCC 55730 Colonisation du tractus intestinal, réduction de la
durée des diarrhées aux rotavirus, traitement des
diarrhées virales
Modulation de la flore intestinale, réduction de
Lactobacillus casei Shirota
l’activité des enzymes fécales, effets positifs sur le
cancer superficiel.
Lactobacillus plantarum DSM 9843 Adhésion aux cellules intestinales humaines,
modulation de la flore intestinale
Prévention et traitement des diarrhées associées
Saccharomyces boulardii
aux antibiotiques (ex. Clostridium difficile colitis)
1.2.3.1 Les bifidobactéries
Les bactéries appartenant au genre Bifidobacterium, ont été décrites pour la première
fois par Tessier (1900) qui a isolé à partir de fèces d’un enfant allaité au sein, une bactérie
anaérobie de morphologie bifide qu’il appela Bacillus bifidus. En général, les
bifidobactéries montrent un polymorphisme cellulaire (bifide ou ramifié) dépendant des
conditions de culture comme teneur du milieu en N-acetylglucosamine, alanine, acide
glutamique ou ions Ca2+ (Scardovi, 1984). Diverses espèces et souches de bifidobactéries
de propriétés fonctionnelles différentes peuvent coloniser simultanément l’intestin de
homme (Matto et al., 2004).
20
Les bifidobactéries sont des bactéries Gram-positives, immobiles, non sporulées, non
productrices de gaz, anaérobies (sauf quelques espèces pouvant tolérer l’oxygène), catalasenégatives (excepté B. indicum et B. asteroides) et saccharolytiques. Leurs niches
écologiques sont: l’intestin de l’homme, la cavité buccale, le tractus gastro-intestinal de
l’animal,
l’intestin de l’insecte et les eaux résiduaires (Ventura et al., 2004). La
température de croissance des bifidobactéries isolées de l’humain ou des animaux varie
respectivement de 36° à 38 °C et de 41° C à 43 °C (Dong et al., 2000).
Les souches de bifidobactérie identifiées chez l’humain sont entre autres : B.
catenulatum, B. adolescentis, B. longum, B. infantis, B. breve…(Scardovi 1984; Lauer &
Kandler, 1983). Tandis que le groupe de bifidobactéries d’origine animale comprend
principalement: B. suis, B. thermophilum, B. animalis, B. pseudolongum… (Matteuzzi et
al., 1971; Mitsuoka,1969; Scardovi & Trovatelli, 1974; Simpson et al., 2003). La variation
de la distribution des bifidobactéries dans le tractus gastro-intestinal de l’homme selon
l’âge est indiquée dans le Tableau 1.4.
Tableau 1.4. Distribution des différentes espèces de Bifidobacterium dans le tractus
digestif de l’homme en fonction de l’âge (Ballongne, 1993).
Population
Jeunes enfants nourris
au sein
Espèces mineures
Jeunes enfants nourris
au biberon
Enfants et adolescents
B. bifidum biovar.b
Adultes
Personnes âgées
B. bifidum biovar.a
Espèces majeures
B. longum
B. infantis
B. breve
B. adolescentis
B. infantis
B. breve
B. bifidum biovar.b
B. longum
B. adolescentis biovar.a et b
B. adolescentis biovar.b
B. longum
Du point de vue physiologique, les bifidobactéries se caractérisent par leur activité
enzymatique leur permettant d’utiliser de nombreux sucres, comme le lactose, le galactose,
21
le raffinose, le sucrose, l’amylopectine, l’amylose, le xylan, etc (Scardovi, 1984) et de
produire de l’acide lactique et de l’acide acétique (Gibson & Wang 1994; Yildirim &
Johnson 1998). Les bifidobactéries se distinguent des lactobacilles principalement par la
production d’une enzyme caractéristique: fructose 6-phosphate phosphocétolase impliquée
dans la voie métabolique de D-fructose-6-phosphate (DeVries et Stouthamer, 1967). Cette
enzyme caractérise essentiellement les bifidobactéries provenant de l’humain, alors que les
bifidobactéries isolées des animaux se distinguent par le duo de substrat : xylulose-5phospate/fructose-6-phosphate phosphocétolase (Meile et al. 2001). Une autre enzyme clé
intervenant dans la fermentation des sucres a été identifiée chez les bifidobactéries, il s’agit
de la β-galactosidase qui catalyse les réactions d’hydrolyse et de transgalactosylation
(Zarate et al., 1990; Hughes & Hoover, 1995; Tannock et al., 2004).
Les méthodes classiques d’identification des bifidobactéries basées sur les propriétés
phénotypiques et biochimiques (morphologie cellulaire, fermentation des sucres…) n’ont
pas permis d’établir une classification définitive de ces bactéries, à cause des ambiguïtés
observées dans les résultats d’analyse. La mise au point de nouvelles techniques basées sur
la biologie moléculaire a permis de déterminer une unité phylogénétique cohérente au sein
des membres du genre Bifidobacterium. Par exemple, le séquençage du gène de l’ARN
ribosomal (rRNA), principalement le gène de 16S rRNA, permet une identification précise
de nombreuses espèces appartenant au genre Bifidobacterium. Ce séquençage indique une
similitude (identité) de plus 93 % pour les séquences de 16S rDNA (Miyake et al. 1998;
Ventura et al., 2004, Masco et al., 2004).
Cependant, en comparant le genre Bifidobacterium avec les autres genres bactériens
sur la base de pourcentage de G+C (Guanine+Cytosine) indiquant le contenu en base de
l’ADN bactérien, il est difficile de distinguer entre les genres Gardnerella et
Bifidobacterium (Scardovi, 1984).
1.2.4 Propriétés et critères de sélection des probiotiques
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la
souche microbienne. Le choix des probiotiques dépend de ces propriétés et du type
22
d’utilisation. Selon le rapport de la FAO/WHO (2002), pour qu’un produit soit reconnu
comme étant probiotique, une évaluation du produit basée sur plusieurs critères doit être
effectuée suivant les recommandations suivantes :
a) Désignation du Genre/Espèce/Souche : il est nécessaire de connaître le genre et
l’espèce de la souche utilisée, car les effets probiotiques sont spécifiques à la souche
microbienne. Le probiotique doit porter un nom reconnu scientifiquement et son
identification doit être effectuée à l’aide de méthodes récentes et valides combinant les tests
phénotypiques et génotypiques.
b) Dépistage des probiotiques potentiels par des tests in vitro : les tests in vitro sont
réalisés afin de déterminer les mécanismes par lesquels les microorganismes probiotiques
exercent leurs effets bénéfiques. Il est recommandé d’utiliser des tests spécifiques à la cible
et appropriés pouvant corréler avec les résultats des essais in vivo. Les principaux tests in
vitro réalisés pour étudier les probiotiques sont :
-
Résistance à l’acidité gastrique
-
Résistance aux acides biliaires
-
Adhérence au mucus et/ou cellules épithéliales humaines
-
Activité antimicrobienne contre les bactéries potentiellement pathogènes
-
Capacité de réduire l’adhésion des pathogènes aux surfaces
-
Activité de l’hydrolase sur les sels biliaires (dissociation des sels biliaires)
-
Résistance aux spermicides ( application vaginale des probiotiques)
c) Innocuité de souches probiotiques : les probiotiques utilisés dans les produits
alimentaires sont des microorganismes appartenant à la flore normale intestinale.
Cependant, l’innocuité de la souche microbienne doit être prouvée avant toute utilisation du
probiotique dans l’aliment. Les bifidobactéries ne présentent aucun risque d’infection chez
l’homme. En théorie, des effets secondaires peuvent être associés à la consommation de
produits contenant certaines souches probiotiques. Ces effets secondaires se résument-en :
-
Infections systémiques
-
Activités métaboliques délétères
23
-
Stimulation immunitaire excessive chez des personnes sensibles
-
Transfert de gènes entre les espèces bactériennes probiotiques et celles de la
flore intestinale.
d) Études in vivo sur des animaux et humains : afin de confirmer ou valider les
résultats des tests in vitro, il serait nécessaire de réaliser des essais in vivo sur des animaux
de laboratoire ou, de préférence, sur des sujets humains dans des conditions expérimentales
appropriées. En général, une méthode standard d’évaluation clinique des probiotiques
comprend les phases suivantes:
-
Phase 1 : consistant à évaluer l’innocuité de la souche probiotique.
-
Phase 2 : permet d’étudier l’efficacité d’un probiotique par comparaison à un
placebo.
-
Phase 3 : permet de comparer des probiotiques avec un traitement standard
(condition spécifique).
-
Phase 4 : consisterait à surveiller l’utilisation du probiotique (effets produits).
e) Allégations-santé et marque du produit : la mention d’allégations-santé générales
est actuellement autorisée sur les produits contenant des probiotiques dans certains pays
comme les Etats-Unis, Angleterre, etc. Il est cependant recommandé de mentionner sur les
produits les allégations spécifiques lorsque des données scientifiques sont disponibles. Par
exemple, mentionner « réduit l’incidence et la sévérité des diarrhées à rotavirus chez les
enfants » au lieu de «améliore la santé de l’intestin ». La marque (étiquette) doit porter :
Genre/espèce/souche, nombre minimal de cellules viables, allégation santé, conditions de
stockage, etc.
En plus de l’innocuité et des propriétés fonctionnelles, des critères technologiques
sont également pris en considération dans la sélection des souches probiotiques. Selon
Saarela et al. (2000), ces critères sont :
-
Bonnes propriétés sensorielles
-
Résistance aux phages
-
Viabilité durant le traitement technologique
24
-
Stabilité dans le produit et durant le stockage.
L’ensemble des propriétés et critères de sélection des probiotiques est présenté
dans la Figure 1.4.
Origine
humaine
Effets sur la santé;
maintien de la viabilité;
applicabilité aux aliments
Stabilité (acides, bile)
Survie dans l’intestin
Adhésion à l’intestin humain
Exclusion compétitive des pathogènes,
stimulation des cellules immunitaires
Colonisation de l’humain
Multiplication dans le tractus intestinal au moins
temporairement, modulation immunitaire
Production de substances antimicrobiennes
Inactivation des pathogènes dans l’intestin, normalisation
de la flore intestinale
Antagonisme contre les bactéries pathogènes
Prévention de: adhésion de pathogènes et affaiblissement
dentaire
Absence de risques dans les aliments et aspect clinique
documenté
Identification précise des souches (genre, espèce et souche)
Effets sur la santé documentés et cliniquement validés
Données sur la dose effective minimale dans différents produits
Traitement, durée de conservation, stabilité
Toutes les propriétés ci-dessus (adhésion, effets antimicrobiens…) devraient être maintenues
durant le traitement et le stockage
Figure 1.4. Propriétés et critères de sélection des probiotiques. Adapté de Salminen et
al. (1998).
25
Toutefois, le critère de viabilité ou de survie demeure essentiel dans la sélection des
probiotiques. La capacité de survie des probiotiques dans l’hôte après leur ingestion,
dépend de leur résistance intrinsèque, des facteurs de l’hôte et du véhicule par lequel ont été
ingérés (Marteau et al., 2003). Parmi les facteurs de l’hôte qui réduisent la survie des
probiotiques, on cite principalement l’acide gastrique, l’oxygène, le potentiel redox, les
sels biliaires, les autres secrétions digestives (mucus, défensines) et l’interaction avec la
flore endogène (Blehaut et al., 1989 ; Marteau & Vesa, 1998; Godward et al., 2000 ).
Compte tenu des tous ces facteurs, il est donc recommandé de consommer les probiotiques
à des doses appropriées pour obtenir les effets bénéfiques escomptés.
Contrairement au Lactobacillus acidophilus, les souches de Bifidobacterium
utilisées commercialement ne survivent pas au pH gastrique ni à l’acidité de l’aliment
durant le stockage (Trindade, 2000). Pour augmenter leur taux de survie, les probiotiques
doivent être ingérés pendant le repas, ou bien protégés dans des capsules ou par
microencapsulation (Kailasapathy, 2002). Le choix des vecteurs dans lesquels ou par
lesquels sont ingérés les probiotiques est aussi important. Par exemple, Saxelin et al. (1995)
ont rapporté que le taux de survie de Lactobacillus strain GG est variable lorsqu’il est
ingéré dans les tablettes, les capsules de gélatine, les laits fermentés ou les boissons à base
de lactosérum.
1.3 Les probiotiques et le système immunitaire
Parmi les allégations-santé attribuées aux probiotiques, la modulation de la fonction
immunitaire suscite actuellement une attention particulière à cause du lien établi entre
l’altération de la flore microbienne de l’hôte et les maladies auto-immunes et l’émergence
des maladies atopiques et des allergies dans les sociétés occidentales. Il semblerait que les
probiotiques jouent un rôle crucial dans la prévention et la thérapie de ces maladies en
assurant la maturation du système immunitaire chez l’enfant et la modulation de la réponse
immunitaire à l’âge adulte.
26
1.3.1 Le système immunitaire de l’hôte
1.3.1.1 Description générale
L’organisme humain ou animal met en œuvre divers mécanismes de défense pour se
protéger contre l’invasion massive des microorganismes ou matières étrangères. La nature
de la réponse de l’organisme dépend du type de particules étrangères (virus, bactéries,
parasites, champignons, pollen…) et de la voie d'entrée (peau, poumons, épithélium…).
Le système immunitaire répond par deux types de mécanismes : l’immunité non
spécifique (ou naturelle ou innée) et l’immunité spécifique (ou acquise ou adaptative)
impliquant des facteurs cellulaires et humoraux qui régulent la réponse à l’antigène. Les
cellules du système immunitaire inné permettent l’initiation de la réponse immunitaire de
l’hôte et l’orientation du système immunitaire adaptatif.
Les cellules qui méditent l’immunité sont représentées par les lymphocytes et les
cellules accessoires tels que les macrophages, les cellules présentatrices d’antigène, et dans
certains cas les cellules épithéliales. Les lymphocytes se trouvent dans le système
lymphoïde constitué d’organes primaires (le thymus et la moelle osseuse) et secondaires
(rate, les ganglions lymphoïdes…). La rate produit une réponse contre les antigènes venant
du sang, alors que les nodules lymphoïdes agissent contre les antigènes provenant de la
lymphe. Les antigènes sont principalement absorbés via la peau ou les muqueuses. Le tissu
lymphoïde associé à la muqueuse (ex. : les plaques de Peyer, le tissu lymphoïde urogénital),
répond aux antigènes franchissant la barrière mucosale (Erickson & Hubbard, 2001).
La réponse du système immunitaire implique trois processus: reconnaissance de la
particule étrangère, sa destruction et enfin la régulation de la réponse immunitaire à l’aide
de cellules spécialisées et médiateurs (cytokines). La réponse immunitaire non spécifique
est réalisée par les phagocytes (monocytes/ macrophages et les neutrophiles) qui
reconnaissent, neutralisent et détruisent les microorganismes pathogènes. Alors que la
réponse spécifique est produite par les lymphocytes B sécrétant des anticorps et les
lymphocytes T produisant des cytokines.
27
1.3.1.2 Les cellules du système immunitaire : les lymphocytes T et B
Les lymphocytes T et B sont des cellules immunitaires dont la maturation se produit
dans le thymus et la moelle osseuse respectivement. Ils représentent les cellules effectrices
de l'immunité spécifique, leur immunocompétence dépend de leur capacité à synthétiser un
récepteur membranaire reconnaissant spécifiquement un antigène. Ils sont impliqués dans
la réponse à médiation cellulaire et la réponse humorale (production d’anticorps)
respectivement.
Les lymphocytes T se différencient en lymphocytes T auxiliaires (CD4+) ou Th qui
jouent un rôle pivot dans l’immunomodulation, ou en lymphocytes T cytotoxiques (CD8+)
ou Tc détruisant les cellules infectées. Les cellules Th se subdivisent en duex groupes, les
Th1 et les Th2. Les cellules Th1 dirigent l’immunité cellulaire qui permet d’éliminer les
pathogènes intracellulaires (ex.: virus) et les cellules cancéreuses, et de prévenir les
réactions d’hypersensibilité de la peau (Pulendran, 2004). Tandis que les cellules Th2
dirigent l’immunité humorale permettant la destruction des organismes extracellulaires
grâce aux anticorps sécrétés. L’équilibre entre les deux sous populations de lymphocytes T
permet de maintenir une homéostasie fonctionnelle générant une réponse immunitaire
appropriée (Kidd, 2003).
D’autres sous populations de lymphocytes T, appelées cellules T régulatrices
(CD4+CD25+), comme Tr et Th3, ont été récemment décrites (Allez & Mayer, 2004; van
Amelsfort et al., 2004; Rook & Brunet, 2005). Les Tr se distinguent des cellules Th1 et Th2
par leur phénotype, leur fonction immunosuppressive et leurs profils en cytokines. Elles
jouent un rôle dans le maintien de la tolérance et peuvent être induites contre les antigènes
bactériens, viraux et parasitaires. Elles peuvent également prévenir les immunopathologies
induites par les infections ou l’effet de la persistance prolongée du pathogène par
suppression de la réponse de type Th1 (McGuirk & Mills, 2002). La Figure 1.5 illustre
l’organisation fonctionnelle tripolaire des cellules Th1, Th2 et Tr. Les cellues Th1 sont
impliquées dans l’immunité à médiation cellulaire, alors que les cellules Th2 assurent
l’immunité à médiation humorale. La réponse immunitaire produite par les deux types de
28
cellules est régulée par les cellules Tr qui maintiennent une homéostasie immunitaire. Si
l’équilibre entre les cellules Th1 et Th2 est rompu, ces cellules produiront selon leur
dominance des réponses immunitaires anormales se traduisant par des maladies autoimmunes ( type Th1) ou allergies (type Th2).
Tr
Immunité à
médiation cellulaire
Th1
Th2
Immunité à
médiation humorale
Homéostasie immunitaire
Th2
Th1
Th1
Th2
Auto-immunité
Réponses anormales
Allergie
Figure 1.5. Organisation fonctionnelle tripolaire des cellules T helper et équilibre
Th1/Th2. Adapté et modifié de Bot et al. (2004).
Les lymphocytes T et B montrent une parfaite collaboration dans leur fonction. Les
lymphocytes T sont activés grâce aux cellules présentatrices de l’antigène ou CPA (les
29
cellules dendritiques, les cellules B et les monocytes/macrophages). Les lymphocytes B
sont ensuite activés à leur tour par les lymphocytes T pour se différencier en plasmocytes et
produire des anticorps (Hodgkin et al., 1998).
Les lymphocytes T reconnaissent des antigènes sous forme de peptides liés au
complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) des CPA. Les cellules Th reconnaissent
seulement les peptides (ex. peptides d’origine bactérienne) liés aux molécules du CMH
classe II alors que les lymphocytes T cytotoxiques identifient uniquement les peptides (ex.
peptides d’origine virale) liés aux molécules du CMH classe I (Chamberlain, 2002).
Par contre, les lymphocytes B reconnaissent différents types d’antigènes comme les
protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides, certains lipides et des haptènes (petites
molécules organiques)
grâce à des récepteurs liés à la surface cellulaire. Après la
destruction de l’antigène, la réponse immunitaire diminue alors que les lymphocytes B
mémoires persistent pour répondre rapidement au même antigène lors d’une éventuelle
réintroduction dans l’organisme (McHeyzer-Williams & McHeyzer-Williams, 2005).
Lors d’une infection, des molécules dérivant des pathogènes se fixent aux cellules
présentatrices de l’antigène (ex. cellules dendritiques) en stimulant leur maturation et
dirigeant la différentiation des lymphocytes T en Th1 et Th2. D’autres molécules activent
les CPA dirigeant l’induction des lymphocytes régulateurs (Tr). Le rôle des lymphocytes
Th dans la réponse immunitaire est illustré dans la Figure 1.6. Lorsque le lymphocyte Th
est stimulé, il secrète dans le milieu des cytokines (médiateurs) qui vont activer d’autres
cellules comme les lymphocytes B impliqués dans réponse de type humorale, et les
lymphocytes cytotoxiques, les macrophages, les cellules tueuses, etc qui interviennent dans
la réponse de type cellulaire. Les macrophages activés sont également capables de produire
des cytokines interagissant avec d’autres cellules immunitaires (les cellules tueuses et
granulocytes).
Notons toutefois que le développement ou la polarisation des cellules Th1 et Th 2 est
influencé par plusieurs facteurs comme le type de CPA (cellules dendritiques, macrophages
30
ou cellules B), l’avidité de l’interaction de TcR (récepteur de Tc) avec l’antigène et des
cytokines induites par les cellules Th1 et Th2 (Mosmann & Coffman, 1989; Macatonia et
al., 1993). Les cytokines jouent un rôle majeur dans la différentiation des cellules Th et la
régulation des réponses immunitaires produites (Swain, 1993; Spellberg & Edwards, 2001).
antigène
Tr
CPAn
Th
B
anticorps
cytokines
Tc
K
NK
macrophage
ADCC
granulocyte
cytokines
Figure 1.6. Description schématique du fonctionnement de l’immunité induite par un
antigène détecté. ADCC, cellules cytotoxiques dépendant des anticorps; Tr :
Lymphocyte T régulateur; B, Lymphocyte B; Th, Lymphocyte T helper; CPA, cellules
présentatrices de l’antigène; Tc, Lymphocyte T cytotoxique; NK : cellules naturelles
tueuses; K, cellules tueuses. Schéma tiré de : Roitt I, Brostoff J, Male D. (1998),
Immunology (Fifth Edition), Philadelphia: Mosby, et modifié par Kidd (2003).
1.3.1.3 Les cytokines : propriétés et activités
Les cytokines sont des médiateurs chimiques assurant la communication entre les
cellules et pouvant affecter plusieurs éléments du système immunitaire. Ce sont des
molécules de nature glycoprotéique sécrétées en cascade par les cellules immunitaires en
31
réponse à un stimulus, elles méditent et régulent l’immunité, l’inflammation et
l’hématopoïèse. Les cytokines agissent rapidement et à de très faibles concentrations sur les
cellules cibles en se liant spécifiquement à un récepteur membranaire par lequel un signal
(activation de tyrosine kinase) est transmis à la cellule pour induire l’expression d’un gène
(Townsend & McKenzie, 2000; Ollier, 2004).
Les
cytokines
comprennent
les
lymphokines
(lymphocytes),
monokines
(monocytes), chémokine (substances chimiotactiques), interleukine (produite par un
leucocyte et agit sur un autre). Une cytokine peut agir sur la cellule la sécrétant (action
autocrine), les cellules avoisinantes (action paracrine), ou les cellules distantes (action
endocrine). Le type de cytokine produite est variable selon la sous-population de
lymphocytes Th stimulée. Les cellules effectrices (Th1 ou Th2) produisent des cytokines
soit « pro-inflammatoires » (ex. IFN-γ), soit « anti-inflmmatoires » (ex. IL-10). Par contre,
les cellules régulatrices (Th3 ou Tr1) secètent des cytokines (ex. TGF-β) qui inhibent l’une
ou l’autre des réponses générées par les cellules effectrices (Monteleone et al., 2002).
Les effets exercés par les cytokines peuvent être synergiques ou antagonistes. En
général, les
cytokines stimulent la prolifération et la différentiation des cellules
immunitaires. Parmi elles, on cite l’IL-1 qui active les cellules T; l’IL-2 qui stimule la
prolifération des cellules T et B; l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-6 stimulant la prolifération et la
différentiation des cellules B; l’IL-3, l’IL-7 et le GM-CSF (Granulocyte Monocyte ColonyStimulating Factor) qui stimulent l’hématopoïèse (Townsend & McKenzie, 2000; Pyo et
al., 2003). Le profil de cytokines des populations de lymphocytes T impliquées dans la
réponse immunitaire induite par une denrée alimentaire au niveau de la muqueuse
intestinale est indiqué dans le Tableau 1.5. Selon ce tableau, Th1 produit IFN-γ mais pas
de IL-4 et IL-10. Par contre, Th2 secrète IL-4 mais pas de L’IFN-γ. Cependant, IL-10 est
produite par les cellules Th2 et Tr, tandis que TGF-β est secreté essentiellement par les
cellules régulatrices.
32
Tableau 1.5. Réponses immunes vis-à-vis d’une denrée alimentaire au niveau de la
muqueuse intestinale. Adapté de Kaminogawa (1996).
Sous-classes de lymphocytes TCD4+
Profils de cytokines
Th1
Th2
Th3
Tr1
IFN-γ
IL-4
TGF-β
IL-10
Facteurs de différentiation
++++
+/IL-2
++++
+/++
IL-4
+/+/++++
+/TGF-β
+
++
++++
IL-10
Commutation isotopique
IgG2a
IgG1/ Ig E
IgA
IgG4?
Suppression
Th2
Th1
Th1/ Th2
Th1/ Th2
L’IFN-γ joue un rôle multiple, il induit la production de CMH de classe I et II;
augmente l’activité antimicrobienne et antitumorale des monocytes/macrophages,
neutrophiles et cellules NK; stimule la synthèse et l’adhésion de facteurs sur les cellules
endothéliales et les leucocytes pour la diapédèse; augmente ou inhibe l’activité d’autres
cytokines; inhibe la production et l’activité de cellules Th2; exerce une faible activité
antivirale (Kawai et al., 1999; Hokeness et al., 2005).
L’IL-10, produite par les lymphocytes T et B, est une cytokine multifonctionnelle
qui régule la fonction de plusieurs cellules immunocompétentes, telles que les lymphocytes
T, lymphocytes B, les cellules NK, les monocytes/macrophages et les neutrophiles. L’IL-10
exerce un effet antagoniste sur l’IFN-γ. En outre, comme le montre la Figure 1.7, l’IL-10
joue un rôle important dans l’inhibition des réactions allergiques en diminuant l’activation
des mastocytes dépendant de IgE, la survie et l’activation des éosinophiles, etc (Till et al.,
2004).
33
Mastocytes
Eosinophile
↓ Expression de FcεRI
↓ Activation des mastocytes
dépendant de IgE
↓ Survie et activation
des éosinophiles
CD4+CD25+
Tr
B
IgG4
↓ Présentation d’antigène
dépendant de IgE
IL-10
Th2
(et contact cellulaire?)
↓ Cytokines et prolifération
Figure 1.7. Les propriétés anti-allergiques potentielles de IL-10. Adapté de Till et al.
(2004)
Le TGF-β, produite par les lymphocytes Th3 ou Tr, a une fonction
immunomodulatrice, elle est impliquée dans le mécanisme moléculaire de suppression de
l’action cytotoxique des lymphocytes Tc (CD8+) (Chen et al., 2004). Cette cytokine joue
aussi un rôle dans la régulation de l’immunité dans les muqueuses et la stimulation des la
sécrétion de IgA par les lymphocytes B (Spellberg & Edwards, 2001).
1.3.1.4 Les anticorps: propriétés, production et activités
Les anticorps ou immunoglobulines (IgG), sont des glycoprotéines qui sont
produites par les lymphocytes B en réponse à une substance immunogène. Chaque
anticorps se lie spécifiquement à un déterminant antigénique (fragment d’antigène ou
épitope). Les immunoglobulines, en forme de Y, sont constituées de deux chaînes légères et
deux chaînes lourdes, présentant des ponts di-sulfure inter et intra-chaînes. Elles montrent
une région variable (Fab, fragment antibody) portant le site de fixation à l’antigène et lui
34
conférant
sa spécificité, et une autre région dite région constante qui détermine le
mécanisme utilisé par l’anticorps pour détruire l’antigène (Carlisle et al., 1991).
Selon la séquence en acides aminés de la région constante des chaînes lourdes et la
fonction immunitaire, on distingue plusieurs classes (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) et sousclasses (IG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) d’anticorps. Par contre, la différence entre les
séquences en acides aminés de la région constante des chaînes courtes permet de distinguer
deux types d’Ig (Ig à chaîne légère Kappa ou Lamda) et des sous-types (Lamda1, Lamda2,
Lamda3, Lamda4). La région hyper variable des IgG permet la reconnaissance de
l’antigène, alors que leur partie commune permet de fixer le complément (protéines du
sérum) qui est activé pour lyser l’antigène, de lier l’anticorps aux cellules (phagocytes et
tueuses), et de traverser l’épithélium. La production des anticorps par les cellules B dépend
des cytokines sécrétées par les lymphocytes T. La biosynthèse des IgG2a est favorisée par
les cytokines sécrétées par les cellules de type Th1, tandis que la production de IgE et IgA
est induite par les cytokines issues des cellules de type Th2 (Kaminogawa, 1996).
Les anticorps IgG ont une grande demi-vie et sont plus abondants dans le sérum
humain où ils représentent plus de 85 % des anticorps totaux (Bienvenu et al., 1996). IgA
est sécrété principalement au niveau des muqueuses, alors que sa production dans le sang
est réduite (7 % - 15 % des anticorps totaux). Par contre, IgM, IgD et IgE sont faiblement
synthétisés (Kerr, 1990; Metzger, 1970). Il faut rappeler qu’une forte synthèse de IgE
engendre des réactions allergiques par sensibilisation et activation des mastocytes qui
libèrent des médiateurs inflammatoires (histamine et sérotonine…).
Lors d’une réponse humorale divers types d’anticorps peuvent être sécrétés et
exercer différentes activités biologiques dans l’organisme telles qu’illustrées dans la Figure
1.8. Toutefois, il faut mentionner que certaines effets comme la neutralisation des virus et
toxines et la génération d’oxydants sont indépendants des autres composants du système
immunitaire, alors que d’autres activités comme la cytotoxicité cellulaire dépendant des
anticorps et l’opsonization dépendant des cellules et des médiateurs de l’hôte (Casadevall et
al., 2004).
35
Génération d’oxydants
Réduction des dommages de
l’hôte dus à la réponse
inflammatoire
Immunomodulation
Régions
variables
Chaîne
courte
Chaîne
lourde
Opsonization
Régions
constantes
Activation
du complément
Activité antimicrobienne
directe
Cytotoxicité cellulaire
dépendant des anticorps
Neutralisation des
virus et toxines
Figure 1.8. Les différents effets biologiques des anticorps. Adapté de Casadevall et al.
(2004).
1.3.1.5 Le système immunitaire de la muqueuse intestinale
La muqueuse intestinale est le centre immunologique du corps, elle héberge 80 %
de la population des leucocytes du corps. Ces leucocytes sont indispensables pour
l’homéostasie du corps avec l’immense population bactérienne de l’intestin. La
dérégulation de cette homéostasie entraîne de nombreux désordres, notamment les
maladies de l’inflammation de l’intestin comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn
(Schiffrin & Blum, 2002 ; Velazquez et al., 2004).
En effet, le maintien de l’intégrité de l’intestin et de sa fonction digestive dépend en
partie de la capacité du système immunitaire de sa muqueuse à faire la distinction entre les
antigènes offensifs et inoffensifs et de produire une réponse appropriée: une immunité
36
active ou une tolérance (Brandzaeg, 1996). Le système immunitaire de la muqueuse
intestinale, à l’instar des autres muqueuses, est doté de deux armes de défense contre les
antigènes ou agents pathogènes (Brandzaeg, 2002):
a) exclusion de l’antigène à l’aide d’anticorps sécrétoires IgA et IgM en modulant ou
inhibant la colonisation de l’hôte par les microorganismes et la pénétration d’antigènes
solubles dangereux;
b) mécanismes de suppression de la réponse afin d’éviter une réaction locale ou
périphérique excessive (hypersensibilité) contre des substances inoffensives atteignant
la surface de la muqueuse. La suppression de la réponse induite par des antigènes
alimentaires via l’intestin est désignée sous le nom de ‘’tolérance orale’’.
Du point de vue anatomique, le système lymphoide de l’intestin comprend les
plaques de Peyer ou des follicules isolés, le Lamina propria enrichi en cellules plasmatiques
(cellules dendritiques…), les ganglions lymphatiques mésentériques et les plaques
cryptiques. Ces compartiments constituent les sites d’induction et effecteurs de l’immunité
intestinale. La Figure 1.9 montre une description schématique générale du système
immunitaire de l’intestin. Les voies d’entrée de l’antigène au niveau intestinal sont: les
cellules épithéliales intestinales (jonctions); via interaction des cellules dendritiques de
Lamina propria et cellules épithéliales; les cellules M (Spahn & Kucharzik, 2004).
Selon Monteleone et al. (2002), la distribution phénotypique des cellules T CD4+ et
CD8+ est similaire à celle des lymphocytes du sang périphérique avec la prédominance des
cellules CD4+ et αβTcR+. Les lymphocytes B sont très abondants dans la muqueuse
intestinale, particulièrement dans les follicules isolés et les plaques de Peyer, et médient la
première réponse immunitaire de type humorale protégeant l’organisme des pathogènes
entériques ou autres organisme infectieux. Une des propriétés remarquables des
lymphocytes B est la maturation des cellules B productrices d’IgM en cellules productrices
de IgA.
37
A
Cellules épithéliales
intestinales
Cellules
dendritiques
Lymphocytes
intraépithéliaux
Lymphocytes de
Lamina propria
B
Plaques
cryptiques
Lumière
intestinale
Cellules M
Plaques de Payer
C
Dogme
Vaisseau
lymphatiques
Aire des
cellules T
Lamina propria
Follicules
lymphoïdes isolés
Follicules de
cellules B
Nodules
lymphatiques
mésentériques
Plaques
cryptiques
Figure 1.9. Description schématique générale du système immunitaire associé à la
muqueuse intestinale. A, B et C : voies d’entrée de l’antigène: (A), les cellules
épithéliales intestinales ; (B) interaction des cellules dendritiques et cellules
épithéliales; (C) cellules M. Flèches : sens de drainage lymphatique des plaques de
Peyer et de Lamina propria des villosités (vers les nodules lymphatiques
mésentériques). Adapté de Spahn & Kucharzik (2004).
En outre, une hypothèse récente suggère que les lymphocytes B jouent un role clé
dans la régulation de l’homéostasie immunitaire intestinale et la prévention des maladies de
l’inflammation de l’intestin. Leur rôle immunorégulateur consisterait à activer les cellules
tueuses (NK) et favoriser la migration des cellules régulatrices CD4+CD8+ au site effecteur.
Cependant, le rôle des cellules NK ou CD4+CD8+ dans la production de IL-10 demeure
moins clair (Velazquez et al., 2004).
38
1.3.1.6 Les sources de variation de la fonction immunitaire
La fonction immunitaire varie d’un individu à un autre et elle est influencée par
plusieurs facteurs comme les infections, l’alimentation, le stress, l’âge, facteur génétique,
etc. L’un des facteurs majeurs est le polymorphisme génétique qui régule l’expression des
cytokines et de leurs récepteurs, des molécules d’adhésion, etc. L’influence de ces facteurs
sur le fonctionnement du système immunitaire pourrait entraîner une perte d’homéostasie et
par conséquent des pathologies immunologiques chez l’homme, d`où alors la nécessité de
rechercher des alternatives adéquates pour son rétablissement et sa régulation (Calder &
Samantha, 2002). La Figure 1.10 indique les facteurs responsables de la variation de la
fonction immunitaire.
Événements
antérieurs (la vie)
État nutritionnel
Facteur
génétique
Genre
Fonction immunitaire
Age
Statut hormonal
Historique de
Exposition aux
vaccination
pathogènes
(infection)
- Présence; Histoire
Obésité ?
Consommation
d’alcool
Tabagisme
Exercices
- Aigu
- Chronique
Stress
- Environnemental
- Physiologique
- Psychologique
Figure 1.10. Les sources de variation de la fonction immunitaire. Adapté de Calder &
Samantha (2002).
39
1.3.2 La modulation de la réponse immunitaire
1.3.2.1 Principe de l’immunomodulation
Une réponse immunitaire est caractérisée par (a) sa magnitude déterminée par
l’équilibre entre l’activation des lymphocytes et la tolérance induite par un antigène, (b) sa
nature déterminée par la spécificité et la fonction des lymphocytes activés par l’antigène et
(c) les mécanismes de régulation (reconnaissance, activation et phase effective).
En théorie, la régulation immunitaire se traduit par une homéostasie entre l’activité
des cellules Th1 et celle des cellules Th2 qui jouent un rôle central dans le mécanisme de
régulation immunitaire. Elle représente un processus complexe et dynamique impliquant
des facteurs cellulaires et moléculaires permettant d’éviter les réponses indésirables ou
excessives du système immunitaire à des substances à caractère immunogène. Une
substance immunogène est capable de stimuler la réponse immunitaire humorale, à
médiation cellulaire, ou les deux à la fois (Chamberlain, 2002).
La population de Th1 produit des IFN-γ et confère une protection contre les
pathogènes intracellulaires (virus et certaines bactéries) par recrutement et activation des
macrophages (la phagocytose) (Kawakami, 2003). Tandis que les cellules Th2 sécrètent IL4, IL-5 et sont plus impliquées dans l’immunité humorale par activation et différenciation
des cellules B, et particulièrement dans la production des anticorps IgE et IgA. Elles
participent aussi au recrutement des éosinophiles, des mastocytes et confèrent une
protection contre une infection parasitaire. Une inhibition croisée entre les cellules Th1 et
Th2 induite par IFN-γ et IL-10 respectivement permet de maintenir un équilibre entre les
Th1 et Th2 (Kidd, 2003).
1.3.2.2 Polarisation Th1/Th2
Lorsque les cellules T naïves entrent en contact direct avec les CPA, elles sont
activées et se différencient en cellules matures de type Th1 ou Th2. Ce processus de
différenciation cellulaire, réalisé grâce aux cytokines principalement, est appelé
« Polarisation Th1/Th2 ». Selon Romagnani (2004), les cellules Th1 et Th2 ne sont pas deux
40
sous-populations de cellules T CD4+ distinctes, mais elles représentent tout simplement les
formes polarisées de la réponse immunitaire très hétérogène médiée par les cellules T CD4+.
Le phénomène de polarisation des cellules Th est régulé par plusieurs facteurs comme le
répertoire lymphocytaire (diversité des lymphocytes), les cytokines du milieu, la dose et la
voie d’administration de l’antigène, le type de cellules présentatrices de l’antigène, etc. Les
cytokines du milieu et leurs récepteurs cellulaires jouent un rôle essentiel dans l’induction
de la polarisation des cellules T actives (Comerford & Nibbs, 2005). En effet, les cellules T
actives migrent vers le site d’infection et se polarisent selon le type de cytokines produites
dans le milieu, soit en Th1 en présence de l’IL-12, soit en Th2 en présence de l’IL-4
(Spellberg & Edwards, 2001, Brandtzaeg, 2002, Sun et al., 2005). La polarisation des
réponses Th1/Th2 est décrite schématiquement dans la
Figure 1.11.
Immunité à médiation
cellulaire
Production d’anticorps
Facteurs microbiens
Production d’anticorps
Hyperproduction d’IgE
Activation d’éosinophiles
Figure 1.11. Représentation schématique de la polarisation des cellules Th1 et Th2 et
de la sécrétion des cytokines. Ag, antigène; MHC II, Molécules du CMH de classe II;
TCR, Récepteur cellulaire des cellules T; LPs, lipoprotéines; CpG, motif de nucléotide
non méthylé; APC, cellules CPA; LPS, lipopolysaccharides; TLRs, Toll-like
receptors; B7.1 et B7.2, molécules de co-stimulation ; CD, Cluster déterminant
( Brandtzaeg, 2002).
41
Récemment, Bote et ses collaborateurs (2004) ont mentionné que l’organisation
fonctionnelle de l’immunité médiée par les cellules Th1 (productrices de IFN-γ) et Th2
(productrices de l’IL-4), est plutôt tripolaire que bipolaire, puisqu’une autre souspopulation de cellules Th, les cellules Tr (productrices de l’IL-10 ou TGF-β), sont
impliquées dans l’immunité et exercent un contrôle négatif sur les cellules Th1 et Th2.
La polarisation Th1/Th2 est nécessaire pour le maintien ou l’altération de l’équilibre
entre la réponse à un antigène et la tolérance à un antigène au niveau de la muqueuse
intestinale (Markus et al., 2002). Selon Perdigon et al. (2002), l’effet des probiotiques sur
l’équilibre Th1/Th2 est dépendant de la souche probiotique utilisée. Les effets induits par
les probiotiques sur l’équilibre Th1/Th2 peuvent être déterminés par la réponse systémique
après une injection parentérale d’ovalbumine. Par exemple, L. casei, L. delbrueckii ssp.
bulgaricus et L. acidophilus augmente la production de IgG1 en modifiant la balance en
faveur de Th2, alors que L. acidophilus favorise aussi la production de IgG2a en variant la
balance en faveur de Th1. Par contre, S. thermophilus ne montre aucune influence sur
l’équilibre Th1/Th2.
Toutefois, une polarisation inappropriée des réponses Th1/Th2 se caractérisant par la
forte dominance de la réponse de type pro-Th1/anti-Th2 ou de type anti-Th1/pro-Th2, peut
conduire respectivement à une auto-immunité (inflammation chronique, arthrite…) ou des
allergies (Robinson, 2004). Dans ce cas de figure, des cellules T régulatrices (Tr ou Th3)
interviennent pour inhiber les effecteurs cellulaires en produisant des cytokines de type IL10 ou TGF-β qui bloquent Th2 ou Th1 (Kidd, 2003).
1.3.2.3 Les pathologies immunitaires et les stratégies thérapeutiques
Chez un individu en santé normale, les lymphocytes Tr maintiennent l’homéostasie
et préviennent les réponses immunitaires anormales notamment au niveau intestinal et
pulmonaire. Cependant, un déséquilibre entre les lymphocytes régulateurs et les
lymphocytes effecteurs apparaissent dans certains cas de maladies. En effet, une expansion
des lymphocytes Tr supprime les réponses de type Th1 dans le cas de l’inflammation
chronique et du cancer. Par contre, une hyperactivité des lymphocytes Th1 entraîne des
42
pathologies comme les maladies auto-immunes, l’inflammation induite par l’infection et le
rejet des greffes. Une réponse anormale de type Th2 peut causer des allergies.
Selon Kemp (2000), il existe une corrélation entre l’effet clinique de l’infection et le
profil en cytokine de la réponse immunitaire induite par Leishmania, un parasite affectant
aussi bien l’homme que la souris. Chez la souris, l’infection engendre une polarisation des
cellules Th en cellules Th1 ou Th2 spécifique à l’antigène de Leishmania. Par contre, chez
l’homme, en présence de L. donovani, les cellules Th sont polarisées en cellules Th1 et Th2.
De même, Ogawara et al.(2005) ont mentionné que le rapport Th1/Th2 a une signification
clinique, il varie sensiblement avec l’état de la maladie de myélome. En évaluant l’IFN-γ
et de IL-4, ils ont constaté que le rapport Th1/Th2 augmente significativement chez les
patients par comparaison au groupe contrôle.
Pour remédier à certaines immunopathologies, des stratégies thérapeutiques basées
sur la manipulation in vivo des lymphocytes Tr ont été suggérées (McGuirk & Mills, 2002).
Ces thérapies sont présentées dans la Figure 1.12.
Les approches basées sur l’utilisation des probiotiques ou prébiotiques pourraient
constituer une alternative d’immunothérapie possible et sécuritaire ouvrant de nouveaux
horizons dans le domaine de la prévention et le traitement des anomalies ou pathologies
immunologiques chez les enfants, les personnes âgées, etc (Fooks & Gibson, 2002; Kaur et
al., 2002; Calder et al., 2002; Ouwehand et al., 2002; Noverr et al., 2004).
43
Inflammation,
rejet de greffe
Maladie
Th1
Tr
Th1
TrTr
Tr
IFN-γ
et TGF-β
TGF-β
IFN-γ ——
—— IL-10
IL-10 et
IFN-γ
Allergie
Cancer, infection
chronique
(-)
Tr
IL-4
(+)
Résolution
Thérapie
(+)
Th2
IFN-γ —— IL-10 et TGF-β
IFN-γ
IL-4 —— IL-10 et TGF-β
Figure 1.12. Les thérapies possibles basées sur la manipulations des lymphocytes in
vivo proposées pour le traitement de certaines maladies immunologiques. (+),
expansion; (-) inhibition. Adapté de McGuirk & Mills (2002).
1.3.3 Effets des
probiotiques et de leurs composants sur le système
immunitaire
Selon la littérature, les probiotiques, grâce à leurs composants intra ou
extracellulaires actifs, sont capables d’influencer le système immunitaire par contact avec
les cellules immunocompétentes, en transmettant des signaux qui modifient la réponse
immunitaire de l'organisme-hôte.
De nombreuses études ont en effet rapporté que la prolifération des lymphocytes et
la production de cytokines par les cellules du système immunitaire peuvent être
sensiblement modifiées par l’ingestion de probiotiques. Selon la nature de leurs
constituants cellulaires, les probiotiques influencent sélectivement la fonction immunitaire
en induisant la réponse humorale, cellulaire ou non spécifique. Les probiotiques ont aussi la
propriété de réduire ou supprimer la réponse immunitaire induites par les ingrédients
44
alimentaires en induisant la tolérance orale et prévenant les allergies (Prioult et al., 2003;
Tanaka & Ishikawa, 2004).
Au niveau de la muqueuse intestinale, les probiotiques et les prébiotiques, comme le
montre la Figure 1.13, peuvent influencer directement ou indirectement le système
immunitaire via les cellules M actives qui permettent le transfert de l’antigène aux CPA.
Leur action peut conduire à la modification de l’équilibre Th1/Th2 en faveur d’une
augmentation de lymphocytes B produisant des IgA et d’une réduction concomitante de
lymphocytes B sécrétant des IgE responsables des allergies (Ouwehand et al., 2002).
Prébiotiques
Probiotiques
Microflore intestinale
CPA
Th
Th0
IL-2
IL-12
IL-18
IgA
Th1
Th2
IL-2
IFN-α
IFN-β
B
Virus
IL-4
IL-10
TGF-β
B
IgE
Tumeur
Figure 1.13. Action des probiotiques et des prébiotiques sur le système immunitaire de
l’intestin. Adapté de Ouwehand et al. (2002).
45
1.3.3.1 Pouvoir immunomodulateur des cellules procaryotes
Certaines structures ou composants endo et exocellulaires issus des bactéries
lactiques possèdent des propriétés immunogènes. En effet, il a été rapporté que la paroi des
bactéries lactiques a un effet adjuvant sur la réponse immunitaire chez la souris et l’homme
(Tomasî icâ et al., 2000; Halassy et al., 2003; Wang et al., 2004). La paroi des bactéries
lactiques a une structure typique des bactéries Gram-positives caractérisée par une épaisse
multicouche de peptidoglycane, décorée avec des protéines, des acides teichoïques, des
polysaccharides et entourée, chez certaines espèces, par une couche para cristalline de
protéines de la couche S (Delcour et al., 1999). Une description schématique de la paroi des
bactéries lactiques est rapportée dans la Figure 1.14.
Acide
lipoteichoique
Polysaccharides
neutres
Acide
teichoique
Membrane
plasmique
Peptidoglycane
Couche S
(protéines)
Figure 1.14. Représentation schématique de la paroi des bactéries Gram-positives
(Delcour et al., 1999).
Le peptidoglycane, élément majeur de la paroi bactérienne, est un glycopeptide
sensible à l’action du lysozyme, enzyme secrétée dans l’intestin par les cellules de Paneth
(Peeters et al., 1975). Ce composant est constitué de : glucosamine, acide muramique, Lalanine, acide D-glutamique, lysine, acide D-aspartique et D-alanine (Wallinder et al.,
1971). Par ailleurs, des études ont montré que le peptidoglycane, l’acide teichoïque et le
46
contenu cytoplasmique de bactéries lactiques stimulent la production de certaines cytokines
(IL-1, IFN-γ, IL-6, TNF-α…), l’activité du macrophage et la prolifération des cellules de
plaques de Peyer (Iribe et al., 1981; Yamamoto et al., 1985; Meydani & Ha, 2000;
Kankaanpa et al., 2003).
L’effet immunomodulateur peut être également induit par les protéines de la couche
S de la paroi et d’autres composants intracellulaires (acides nucléiques, peptides, protéines)
ou extracellulaires (exopolysaccharides). Selon Grogono-Thomas et al. (2003), les
protéines de la couche S de la paroi bactérienne sont de taille variable et hautement
antigénique. Elles génèrent une forte production d’anticorps (IgG) chez l’hôte. Des études
ont rapporté que des peptides dérivant du processus de biosynthèse des protéines chez la
flore normale du colon ont la propriété de générer in vivo une inflammation des muqueuses.
Ces peptides sont formylés et à effet chémotactique, ils induisent la migration des cellules
inflammatoires dirigées vers leur cible et stimulent leurs fonctions biologiques comme la
dégranulation, la production de radicaux d’oxygène, la phagocytose, et la synthèse
d’eicosaenoides (ex. leukotriene B4) stimulant la réponse des leucocytes (Chadwick et al.,
1988; Nast & LeDuc,1988; Hobson et al., 1990).
Selon certaines études, l’ADN bactérien et des oligodeoxynucléotides exprimant des
motifs de CpG (deoxycytidylatephosphate-deoxyguanylate) non méthylés induisent la
maturation, la différentiation et la prolifération des cellules immunitaires : cellules B, T et
NK, les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (Roman et al., 1997; Sun
et al., 1998; Klinman et al., 2004). Jijon et al. (2004) ont souligné que l’ADN produit par
les probiotiques ont la propriété d’améliorer la fonction immunitaire et épithéliale chez la
souris et l’homme en réduisant les réponses pro-inflammatoires. Une étude similaire menée
par Lammers et al. (2003) a démontré que l’ADN génomique de bifidobactéries induit une
sécrétion d’une cytokine anti-inflammatoire IL-10 par les cellules mononuclées du sang
périphérique humain.
Des composants bactériens extracellulaires ont également la propriété de stimuler
la réponse immunitaire. Ruiz-Bravo et al. (2001) ont indiqué que des exopolysaccharides
47
produits par le bacille Paenibacillus jamilae CP-7, administré par voie intra péritonéale
aux souris Balb/c ont
permis de mettre en évidence des effets immunomodulateurs
intéressants en améliorant la résistance à Listeria monocytogenes. En outre, ils ont observé
une augmentation in vitro de la prolifération lymphocytaire. Tandis que Gonzalez et al.
(2003) ont démontré que des polysaccharides capsulaires extraits et purifiés de
Porphyromonas gingivalis, utilisés comme antigène pour immuniser des souris, augmentent
la production des IgM et IgG dans le sérum par rapport aux souris traitées avec les cellules
bactériennes entières.
Chabot et al. (2001) ont récemment étudié in vitro les propriétés immunostimulantes
des EPS produits par Lactobacillus rhamnosus RW- 9595M en utilisant des splénocytes de
souris C57Bl/6 et BALB/c, la lignée macrophagique murine RAW.264.7 et les cellules
mononuclées du sang humain. Les indices de stimulation de la prolifération cellulaire
obtenus dans cette étude se sont avérés faibles, estimés à moins de 155 % par rapport au
contrôle (100%). Néanmoins, la détection de certaines cytokines dans le milieu de culture
indique un certain effet mitogène des EPS synthétisés par L. rhamnosus.
En résumé, de nombreuses études s’accordent
à affirmer que les cellules
microbiennes inactivées (non viables), ainsi que leurs composants cellulaires ou produits de
sécrétion (métabolites), sont capables de stimuler certains composants du système
immunitaire de la même façon que les cellules viables. Cependant, les composants endo et
exocellulaires de bifidobactéries impliqués dans l’induction de l’effet immunomodulateur
sont très peu documentés. Seuls les effets immunomodulateurs des EPS de L. rhamnosus
ont été étudiés. Par contre, les EPS produits par les bifidobactéries pourtant candidates aux
probiotiques ne sont pas encore explorés. L’identification des composants cellulaires à
pouvoir immunomodulateur issus des bifidobactéries serait donc d’un grand intérêt.
48
1.3.3.2 Mécanismes d’interaction entre les probiotiques (ou procaryotes )
et les cellules immunitaires
Le processus de modulation immunitaire est amorcé grâce à l’interaction entre le
composé bactérien actif et des récepteurs cellulaires de signal bactérien se trouvant sur les
cellules immunitaires. Ces récepteurs sont appelés Toll like receptors (TLR)s. Comme le
montre la Figure 1.15, cette interaction génère un signal qui est transmis au noyau de la
cellule immunitaire en induisant la transcription du gène codant pour la synthèse des
cytokines. Selon Mastrandrea et al. (2004), les bactéries et leurs produits sont capables de
stimuler le processus de sécrétion des cytokines par activation des récepteurs cellulaires
spécifiques et par conséquent la translocation nucléaire des facteurs de transcription. Les
TLRs influencent le développement de la réponse immunitaire adaptative par activation des
cellules CPA et jouent un rôle crucial dans l’induction des réponses de type Th1 et Th2
(Dabbagh & Lewis, 2003).
Probiotiques (Bactéries lactiques)
ADN de L. gasseri
Peptidoglycane Ac. teichoique Oligo ADN
Membrane cellulaire
Signal de transduction
Cellule
dendritique
Production
de cytokines
Immunostimulation
Figure 1.15. Schéma illustrant l’interaction entre les composants bactériens
(Lactobacillus grasseri) et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor. Adapté de
Saito (2004).
49
Environ dix récepteurs de signaux bactériens de nature protéique, ont été
répertoriés chez les cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles, macrophages)
(Medzhitov et al., 1997; Chaudhary et al., 1998; Wang et al., 2003). Par exemple, le TLR2,
TLR4 et TLR9 reconnaissent les signaux provenant des composants de la paroi et du
cytoplasme de bactéries Gram-positive (Saito, 2004). Cependant, TLR4 reconnaît aussi le
signal induit par le composant de la paroi de bactéries Gram-négative (LPS), alors que
TLR2 et TLR6 agissent ensemble contre les particules de paroi de bactéries Gram-positives
et celles des levures (Takeuchi et al., 2000; Echchannaoui et al., 2002). Ishii et al. (2004)
ont rapporté que l’ADN des bactéries contient des motifs CpG interagissant avec le TLR9
des cellules immunitaires en induisant la production de cytokines, de chémokines et
d’immunoglobulines. Chez l’humain, l’expression de la protéine TLR2 est prédominante
sur les monocytes et neutrophiles, et non sur les cellules T, les cellules B ou cellules NK
(Flo et al., 2001).
En effet, Hosono et al. (1997) ont démontré qu’un composant polysaccharidique
isolé de la membrane cellulaire de Bifidobacterium adolescentis induit une forte
prolifération
des lymphocytes. De même, Kitazawa et al. (2000) ont souligné qu’un
phosphopolysaccharide extracellulaire neutre produit par Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus OLL 1073R-1 stimule la fonction phagocytaire des macrophages in vivo et in
vitro.
1.3.4 Les probiotiques et l’immunomodulation : Études in vitro et in vivo
Pour mettre en évidence les effets immunomodulateurs des probiotiques tant
recherchés dans le cas de la tolérance orale, des allergies et des infections, les études
réalisées de nos jours font appel à des méthodes in vitro ou ex vivo (ex. : lignées cellulaires
en culture) et / ou in vivo chez l’animal (animaux conventionnels ou axéniques) et rarement
chez l’Homme.
1.3.4.1 Probiotiques et tolérance orale
Les travaux récents de Prioult et al. (2003) ont mis en évidence l’effet des
probiotiques sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la β-lactoglobuline bovine
50
chez la souris conventionnelle. L’effet observé au niveau humoral et cellulaire dépendait de
la souche probiotique utilisée. Lactobacillus
paracasei s’est avéré plus efficace que
Bifidobacterium lactis et L. johnsonii. Kankaanpa et al. (2003) ont mentionné que
Lactobacillus GG, Bifidobacterium Bb-12 et L. acidophilus inhibent la prolifération des
cellules mononuclées du sang périphérique humain, l’expression des marqueurs cellulaires
CD25, CD69 et de HLA-DR (système CMH-Antigène humain) sur les lymphocytes T
stimulées avec phytohémagglutinine et la production de IL2 et IL4. Par ailleurs, Ulisse et
al. (2001) et Morita et al. (2002) ont démontré que des souches probiotiques appartenant au
genre Lactobacillus induisent in vitro et in vivo une production significative de cytokines
anti-inflammatoires notamment IL-10.
De même, Jijon et ses collaborateurs (2004) ont démontré que l’ADN des bactéries
probiotiques réduisent in vitro et in vivo les réponses inflammatoires au niveau de
l’épithélium intestinal. Ils ont étudié l’effet de l’ADN issu d’un mélange de 8 souches
probiotiques (L. acidophilus MB 443, L. delbrueckii subsp. bulgaricus MB 453, L. casei
MB 451, L. plantarum MB 452, B. longum Y10, B. infantis Y1, B. breve Y8 et S. salivarius
subsp. thermophilus MB 455), sur des mono couches de cellules épithéliales HT-29, des
segments de colon, des splénocytes murins, et des souris déficientes en IL-10 en présence
de stimulus pro-inflammatoire. Ils ont observé une réduction de la sécrétion de IL-8 par
HT-29, une inhibition des mécanismes pro-inflammatoires (protéine kinase, facteur kappa
B) et la sécrétion de IFN-γ dans le colon et par les splénocytes. Une diminution de la
production de TNF-α et IFN-γ au niveau de la muqueuse et une amélioration de l’état
histologique des souris ont été également constatées
1.3.4.2 Probiotiques et allergies
De nombreux travaux de recherches sont actuellement focalisés sur les maladies
allergiques à cause de l’augmentation de la prévalence des allergies observée
particulièrement dans les pays occidentaux. L’émergence de ces maladies s’explique en
partie par l’hypothèse d’hygiène, selon laquelle la présence d’hygiène diminue l’exposition
du corps aux agents infectieux en réduisant l’activité du système immunitaire et
augmentant les risques d’apparition des désordres allergiques atopiques (Sheikh &
51
Strachan, 2004). Les études rapportées ont démontré l’effet anti-prolifération des souches
probiotiques sur les cellules immunitaires impliquées dans les réactions allergiques
(dermatite et allergies alimentaires), l’expression des récepteurs et la production de
cytokines.
En effet, une étude clinique de Mastrandrea et al. (2004) effectuée sur des sujets
humains (6 à 48 ans) présentant des symptômes cliniques d’asthme et/ou conjonctivite,
rhinite, urticaire, dermatite atopique, allergie alimentaire et le syndrome de l’intestin irrité,
a montré les effets positifs des probiotiques dans le traitement des maladies allergiques.
Selon cette étude, une administration quotidienne d’un mélange (1 x 109 bactéries vivantes)
de Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii et Streptococcus thermophilus permet de
réduire significativement le taux de précurseurs circulants de lymphocytes CD34+ impliqués
dans l’inflammation allergique systémique.
Wang et al (2004) ont rapporté que l’ingestion de lait fermenté contenant
Lactobacillus paracasei-33 ( 2 x 109 cfu/pot) pendant 30 jours, permet d’améliorer la
qualité de vie chez des patients souffrant d’une rhinite allergique.
1.3.4.3 Probiotiques et infections
Des souris Balb/C et des rats Wistar et Brown infectés par Listeria monocytogenes
ont montré, après une administration orale de cellules (109 cfu ) de Lactobacillus casei
Shirota, une réduction significative de l’infection et une amélioration de la mémoire
immunologique de la réponse à médiation cellulaire induite. Les effets observés
dépendaient de la dose, de la viabilité et de la durée de supplémentation, mais pas de
l’espèce ou de la caractéristique génétique de l’hôte (de Waard et al., 2003).
Récemment, Lee et al. (2004) ont étudié in vitro l’activité anti-prolifération des
fractions cytoplasmiques de
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei et
Bifidobacterium longum sur les lignées de cellules tumorales SNUC2A, SNU1, NIH/3T3
et Jurkat. Ils ont constaté que toutes les fractions cytoplasmiques, particulièrement celles de
L. casei et B. longum, inhibent la prolifération des cellules tumorales. Ils ont mentionné que
52
les mêmes souches bactériennes administrées à des souris induisent un effet
immunomodulateur se traduisant par une augmentation du nombre de cellules T, cellules
NK, cellules CMH classe II+ et cellules T CD4−CD8+.
Une forte activité antimicrobienne des bifidobactéries contre la souche bactérienne
pathogène E. coli O157:H7 a été révélée par une étude Gagnon et al.(2004). Cette étude a
démontré que deux souches de bifidobactéries isolées à partir de fecès de nourrissons, B.
bifidum RBL 71 et B. bifidum RBL 460, ont une forte capacité d’adhésion aux cellules
Caco-2 et permettent de réduire significativement l’adhésion des E. coli à cette lignée
cellulaire de colon humain, laissant suggérer une possible protection contre l’infection
causée par ce pathogène.
Valeur et al. (2004) ont tenté d’établir cliniquement un lien entre la colonisation due
aux bactéries probiotiques et la fonction immunitaire au niveau de la muqueuse intestinale.
En supplémentant la ration alimentaire de 19 volontaires avec Lactobacillus reuteri ATCC
55730, à raison de 4 x 108 cfu/jour pendant 28 jours, une forte colonisation du tractus
gastro-intestinal suivie d’une diminution du nombre d’histiocytes dans la muqueuse
gastrique et d’une augmentation significative du nombre de lymphocytes B dans le
duodénum et de lymphocytes T CD4+ dans l’épithélium de l’iléon a été observée.
Une étude de Shu et al. (2000) a montré que l’administration par voie orale de la
souche probiotique Bifidobacterium lactis (HN019) à des souris Balb/c confère une
meilleure protection contre l’infection due à Salmonella typhimurium par comparaison aux
souris contrôles n’ayant pas ingéré de B. lactis. Selon cette étude, l’ingestion de B. lactis
entraîne chez les souris infectées une réduction de la translocation du pathogène aux tissus
viscéraux (rate et foie) et une amélioration significative des paramètres immunologiques
comme la prolifération des lymphocytes, l’activité macrophagique sanguine et péritonéale,
la production des anticorps anti-S. typhimurium.
De même, Jain et al. (2004) ont observé chez des patients souffrant d’une
septicémie une réduction significatifve de l’incidence des bactéries potentiellement
53
pathogènes suite à l’ingestion pendant une semaine d’un mélange symbiotique contenant
Lactobacillus acidophilus La5, Bifidobacterium lactis Bb 12, Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus bulgaricus et oligofructose.
Dans le Tableau 1.6 sont résumées certaines autres études in vitro, ex vivo, in vivo
et cliniques rapportées dans la littérature. Les études in-vitro rapportées dans ce tableau
démontrent que certaines souches de probiotiques du genre Lactobacillus et
Bifidobacterium stimulent l’activité des macrophages et des cellules mononuclées en
induisant la sécretion de plusieurs cytokines (TNF-α, IFN-γ, Il-10, etc). Les effets observés
mettent donc en évidence l’influenece des probiotiques sur certains composants du sytème
immunitaire. Les études ex vivo et in vivo démontrent que l’ingestion de probiotiques
(Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium) réduit la colonisation du tube digestif par
les bactéries pathogènes (ex. Helicobacter pylori) et stimule la réponse immunitaire
spécifique en activant les cellules CD4+. Selon les études cliniques rapportées, l’ingestion
de probiotiques augmente les capacités de défense de l’hôte en activant les lymphocytes
T CD4+, stimulant l’activité anti- tumorale et réduisant les infections comme la colonisation
vaginale aux coliformes et levures. Toutefois, les effets observés dans ces études sont
variables selon la souche probiotique utilisée.
54
Tableau 1.6. Études in vitro, in vivo et cliniques récentes sur les effets
immunomodulateurs des probiotiques.
Méthodologie
Effets observés
Références
Etudes in vitro
Induction de la sécrétion de cytokines proinflammatoires : IL-12 et TNF-α
He et al.,
2002
Activation de NF-κB et production de TNF-α:
protoplaste > paroi cellulaire >> complexe Matsuguchi
peptidoglycane – polysaccharide. Activation de l c- et al., 2003
Jun N-terminal kinase par l’acide lipotéichoique.
Lactobacillus plantarum 299 Augmentation de IL-1β, TNF-α et IFN-γ (en Pathmakan
testé
sur
les
cellules présence de E. coli pathogène). Augmentation
than et al.,
mononuclées du colon
de IL-10 produite par les cellules de colon en 2004
inflammation.
Études ex vivo et in vivo
Co-culture :
macrophages
(J774.1) + bifidobactéries :
B. adolescentis et B. longum
Cellules de Lactobacillus casei
testées sur les macrophages
RAW264.7
Ingestion (14 jours) par les
souris B6C3F1 de :
Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus bulgaricus, L.
acidophilus et Bifidobacterium
Co-culture: Muqueuse (iléon
humain: maladie de Crohn ) +
L. casei et L. bulgaricus
Absence d’effet sur CD8+ (cellules Tc), B220+
+
(cellules B), IgA, ni IgM dans la rate et
les plaques de Peyer.
Augmentation significative du nombre de cellules
CD4+ (Th)
Réduction du nombre de cellules CD4+.
Inhibition de l’expression de TNF-α par les
lymphocytes intra épithéliaux
Pestka et al.,
2001
Borruel et
al., 2002
Co-culture : Cellules de colon Activation de
la protéine anti-apoptotique
(humain et murin)
+ Akt/protéine kinase. Inhibition de la protéine pro- Yan & Polk,
Lactobacillus rhamnosus GG
apoptotique p38/protéine kinase
2002
Ingestion par des souris de
Réduction significative du taux de colonisation de
L. casei shirota après infection H. pylori dans la muqueuse et diminution de Sgouras et
à Helicobacter pylori.
l’inflammation de la muqueuse gastrique.
al., 2004
Études cliniques
Ingestion de L. rhamnosus
Augmentation de lymphocytes CD56+ dans le
HN001 ou B. lactis HN019. sang. Elévation ex vivo de l’activité anti- Gill et al.,
2001
Volontaires âgés (70 ans)
tumorale.
Administration orale de
Lactobacillus rhamnosus
subspecies GG à des
volontaires sains (5 semaines)
Ingestion de L. rhamnosus GR1 et L. fermentum RC-14 par
des femmes (60 jours)
Activation des lymphocytes T CD4+
Diminution significative de TNF-α , IL-6 et IFN-γ Schultz et
al., 2003
Augmentation de IL-10 et IL-4.
Réduction de la colonisation vaginale due aux
coliformes et levures.
Reid et al.,
2003
55
1.4 Problématique de recherche et objectifs
Selon la littérature, les aliments probiotiques présentent incontestablement un fort
potentiel pour prévenir certaines maladies infectieuses et ont des effets positifs sur
l'homéostasie du système immunitaire sans induction d'effets négatifs, comme l'allergie ou
les réponses auto-immunes. En effet, une amélioration de la protection de l’organisme
contre les maladies observée suite à la consommation de produits fermentés laisse suggérer
qu’il existe une relation directe entre les probiotiques et les systèmes immunitaires inné et
adaptatif qui réagissent d’une manière simultanée et coordonnée.
Il apparaît que des composants, des activités enzymatiques ou des produits
métaboliques/fermentions issus de bactéries probiotiques peuvent contribuer ou méditer des
effets bénéfiques spécifiques sur la fonction immunitaire. Il semblerait que les
exopolysacharides produits par certaines bactéries lactiques (probiotiques) exercent un effet
stimulant sur la réponse immunitaire. Cependant, les preuves apportées pour soutenir cette
affirmation demeurent très fragmentaires et plusieurs questions demeurent encore sans
réponse telles que :
- Quelles sont, parmi les espèces probiotiques connues, celles capables d’exercer un
effet immunomodulateur significatif?
- Quels sont les facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans l’interaction
entre les probiotiques et les composants du système immunitaire?
- Quels sont les mécanismes impliqués dans cet effet immunomodulateur?
En outre, l’implantation d’une souche probiotique dans la flore intestinale d’un
individu peut se confronter au problème de résistance à la colonisation manifestée par la
flore locale, et les conditions gastro-intestinales hostiles (acidité, bile, enzymes…) affectant
la survie du probiotique. Ainsi, l’ingestion de probiotiques doit être massive et continue ou
semi-continue pour qu’ils puissent avoir une action efficace et mimer l’effet d’une flore
implantée dans l’organisme.
56
Les études peu nombreuses consacrées à l’effet immunomodulateur des
probiotiques ont majoritairement été basées sur des modèles expérimentaux permettant de
déterminer l’effet des souches ou espèces du genre Lactobacillus sur les réponses
immunitaires de l’hôte. Cependant, le potentiel immunomodulateur des bifidobactéries est
très peu étudié. De plus, le rôle des EPS produits par les bifidobactéries dans l’effet
immunomodulateur n’est pas encore déterminé. Par ailleurs, les mécanismes cellulaires et
moléculaires impliqués dans l’immunomodulation induite par les bifidobactéries ne sont
pas encore bien élucidés. La connaissance de ces mécanismes permettrait certainement une
meilleure sélection des souches en fonction de l’activité recherchée et par conséquent une
utilisation plus efficace et plus ciblée.
L’étude du pouvoir immunomodulateur des composants endo et exocellulaires de
souches de bifidobactéries s’avère nécessaire compte tenu de la lyse cellulaire des
probiotiques après leur ingestion et de la susceptibilité du système immunitaire à répondre
aux signaux bactériens.
L’hypothèse que nous nous sommes proposée de vérifier par ce travail se résume
comme suit :
Certaines bactéries appartenant au genre Bifidobacterium seraient capables de
moduler certaines fonctions du système immunitaire à travers les organes immunitaires du
tube digestif. Cette fonction immunomodulatrice n’est pas nécessairement associée à la
viabilité des souches et des composantes cellulaires issues de la lyse des bifidobactéries lors
de leur passage dans le tractus gastro-intestinal seraient également capables d’exercer cette
fonction sur le système immunitaire. Parmi les composantes cellulaires impliquées, les
polysaccharides seraient la composante ayant les effets les plus marqués sur les différentes
fonctions immunitaires.
Afin de vérifier l’hypothèse ci-dessus, nous avions visé l’objectif général suivant :
Étudier à travers des modèles in vitro et ex vivo, le potentiel immunostimulant
des
composants intra-cellulaire et extra-cellulaire de certaines souches probiotiques appartenant
57
au genre Bifidobacterium et productrices d’exopolysaccharides, et élucider les mécanismes
moléculaires qui y sont impliqués.
Les objectifs spécifiques assignés à notre étude sont les suivants:
Objectif 1. Produire et caractériser les EPS biosynthétisés par certaines souches de
bifidobactéries;
Objectif 2. Évaluer ex vivo l’effet du contenu cytoplasmique, de la paroi cellulaire
et des EPS de bifidobactéries sur la prolifération des lymphocytes et la production de
cytokines;
Objectif
3.
Identifier,
caractériser
et
valider
à
l’échelle
biochimique,
immunologique et moléculaire les fractions bactériennes responsables de l’activité
immunomodulatrice observée;
Objectif 4. Exploiter les résultats obtenus dans les objectifs précédents pour
produire et caractériser des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries en vue
de développer une méthode d’immuno-culture permettant la détection de souches de
bifidobactéries viables dans les aliments.
Chapitre II: Effets du contenu cytoplasmique, de la paroi
cellulaire et des exopolysaccharides de bifidobactéries sur
la prolifération de lymphocytes de souris et la production
de cytokines. Effects of bifidobacterial cytoplasm, cell
wall and exopolysaccharides on mouse lymphocyte
proliferation and cytokine production.
T. Amrouche a,b,c, Y. Boutin b,d, G. Prioult a, and I. Fliss a,b*
a
Dairy Research Center STELA, Pavillon Paul-Comtois, Université Laval, Québec (Qc)
G1K 7P4
b
Institute of Nutraceutical and Functional Foods INAF, Université Laval, Québec (Qc)
G1K 7P4
c
Department of Food Technology, Faculty of Agronomy and Biological Sciences,
University of Tizi-Wezzu, Algeria
d
TransBiotech, CEGEP Lévis Lauzon, Lévis (Qc) G6V 9V6
International Dairy Journal : sous presse
59
2.1 Résumé
Les bifidobactéries, candidates aux probiotiques, sont des bactéries exerçant des
effets bénéfiques sur la santé de l’être humain comme le rétablissement de l’équilibre de la
flore colique, l’amélioration de l’immunité, le traitement des diarrhées, etc. Des études
récentes ont rapporté que les bactéries probiotiques ont la capacité de stimuler certaines
fonctions immunitaires et offrent ainsi des possibilités d’augmenter les capacités de défense
de l’organisme hôte contre les infections gastro-intestinales. Cependant, les mécanismes
impliqués dans cet effet immunomodulateur demeurent mal connus. Le but de ce projet est
d’étudier les effets de certains constituants des cellules de bifidobactérie notamment le
contenu cytoplasmique, la paroi bactérienne et les exopolysaccharides (EPS) sur la réponse
immunitaire. L’effet immunomodulateur a été étudié par une mesure de la prolifération
lymphocytaire ainsi que par le dosage de certaines cytokines notamment IFN-γ et IL-10.
Trois souches de bifidobactéries, B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64, isolées
à partir de féces de bébés et sélectionnées pour leur capacité à produire des EPS, ont été
étudiées. Une souche commerciale, Bifidobacterium lactis Bb12 a été utilisée comme
souche de référence. Les résultats obtenus montrent qu’une meilleure stimulation de la
prolifération cellulaire est obtenue avec la paroi cellulaire. Un effet immunostimulant
important a été également obtenu avec le contenu cytoplasmique de B. lactis Bb12.
Cependant, l’effet observé est dépendant de la souche microbienne et de la dose utilisée.
Par contre, les EPS bruts ou fractionnés n’induisent aucun effet. La paroi cellulaire de B.
lactis Bb12 s’est avérée plus immunostimulante (Indice de stimulation =16) que celle des
autres souches testées. Le dosage des cytokines a confirmé les résultats de la prolifération
cellulaire et a montré une forte production de IFN-γ (> 4 µg/ml) générée par la paroi
cellulaire, et une augmentation de la sécrétion de IL-10 dans le milieu ( < 1 µg/ml ). Les
résultats obtenus démontrent que les extraits cellulaires de bifidobactéries, notamment les
parois, stimulent la prolifération des lymphocytes et laissent suggérer la possibilité
d’utilisation de ces derniers dans le contrôle de certaines pathologies immunitaires.
Mots clés: Bifidobactéries, Cytokines, Cytoplasme, Exopolysaccharides, Paroi cellulaire,
Prolifération cellulaire.
60
2.2 Abstract
Probiotic bifidobacteria have been reported to stimulate the immune system and
thus offer the possibility of improving host immune defence against pathogens. The aim of
this work was to study the effects of bifidobacterial cytoplasm, cell wall, and
exopolysaccharide (EPS) on splenocyte proliferation and production of IFN-γ and IL-10.
Three bifidobacteria, RBL64, RBL81, and RBL82 isolated from newborn infant feces were
used in our study. Commercial strain Bifidobacterium lactis Bb12 was used as a positive
control. Among different cell extracts, the cell wall components showed the most profound
effects on cell proliferation and cytokine production. EPS neither stimulate lymphocyte
proliferation nor induced cytokine secretion. B. lactis Bb12 exhibited a significant
immunostimulating effect (stimulation index = 16) compared to other bifidobacteria
studied. More IFN-γ (> 4 ng mL-1) was produced in response to cell wall and about 0.8 ng
mL-1 of IL-10 was detected in the cell culture supernatant. The results demonstrate that
bifidobacterial extracts, mainly the cell walls, stimulate the proliferation of lymphocytes
and suggest that such extracts could be used in controlling certain immune pathologies.
Keywords: Bifidobacteria, Cell wall, Cytokines, Cell proliferation, Cytoplasm,
Exopolysaccharides.
2.3 Introduction
Recent studies on human and animal infections suggest that the natural intestinal
microflora plays a major role in resisting both viral infections and colonization of the
gastrointestinal tract by pathogenic bacteria (Sherwood & Gorbach, 2000; Ibnou-Zekri,
Blum, Schiffrin, & von der Weid, 2003; Asahara, Shimizu, Nomoto, Hamabata, Ozawa &
Takeda, 2004). It has been shown that protection by microflora can be improved by
ingesting probiotics, which are microorganisms that favourably influence host physiology
by modifying the intestinal flora (Kirjavainen, Arvola, Salminen & Isolauri, 2002; Hattori
et al., 2003). Bifidobacteria, discovered in 1899 by Tessier, are a major component of the
gastrointestinal tract microflora (Mitsuoka, 1990) and a constituent of the gut mucosal
barrier (Mullie et al., 2002). Like many other bacteria, bifidobacteria are known to produce
61
capsular and extracellular polysaccharides (EPS) (Roberts, Fett, Osman, Wijey, O’Connor
& Hoover, 1995), which have a role in cell recognition, adhesion to surfaces, and formation
of biofilms to facilitate colonization of various ecosystems. They also have a protective
function in the natural environment, for example against phagocytosis, phages, and osmotic
stress (Whitfield & Valvano, 1993; Looijesteijn, Trapet, De Vries, Abee & Hugenholtz,
2001).
Probiotic bifidobacteria, especially B. longum, B. infantis and B. breve, have been
shown to stimulate the immune system and thus may increase the capacity of the host to
fight against gastrointestinal infections (Mullie et al., 2004) and help to reduce allergic
inflammation (Von der Weid, Ibnou-Zekri, & Pfeifer, 2002). Some evidence suggests that
the effects of probiotic bacteria on the immune system may be utilized to treat
immunologically exacerbated pathologies in humans (Matsuzaki & Chin, 2000; Perdigon,
Fuller & Raya, 2001; Cross, Stevenson & Gill, 2001; Prioult, Fliss & Pecquet, 2003).
Probiotic modulation of humoral, cellular and non-specific immunity has been studied in
disease models (Yasui, Shida, Matsuzaki & Yokokura, 1999; Qiao et al. 2002; Hart et al.,
2004), and new species and strains of probiotic bacteria are continually being identified and
evaluated for their capacity to modulate immune functions.
The mode of action of bifidobacteria and lactic acid bacteria in the gastrointestinal
tract appears to be non-specific, increasing immune responsiveness to a wide variety of
antigens (De Roos & Katan, 2000). Ouwehand, Kirjavainen, Gronlund, Isolauri and
Salminen (1999) reported that probiotics exert effects through interactions between
lymphoid tissue and intact microorganisms, fragments thereof or metabolites produced in
situ. Bacterial cell wall breakdown products may play an important role in a number of
homeostatic mechanisms as well as non- specific immunity (Erickson & Hubbard, 2000;
Kankaanpa, Sutasb, Salminena & Isolaurib, 2003). It has also been reported that probiotic
bacteria can preferentially promote Th1-type responses (IFN-γ secretion) (He et al., 2002;
Morita et al., 2002). Regular ingestion of several Lactobacillus species has been shown to
enhance the capacity of murine splenic leukocytes to produce IFN-γ following mitogenic
62
stimulation, while IL-4 or IL-5 production is unaffected (Gill, 1998; Gill, Rutherfurd,
Prasad & Gopal, 2000).
Preliminary results reported for lactic acid bacteria suggest that EPS may be useful
not only for their rheological properties but also for health-promoting properties, which
may include anti-tumor and immunostimulatory actions (Ricciardi & Clementi, 2000;
Chabot et al., 2001). Van Calsteren, Pau-Roblot, Begin and Roy (2002), and RuasMadiedo, Hugenholtz and Zoon (2002) reported that EPS from lactic acid bacteria may
influence the immune system by enhancing lymphocyte proliferation, macrophage
activation and cytokine production.
At the present time, there is no clear understanding of the molecular or cellular basis
for immunostimulation by bifidobacteria. To address the lack of data that convincingly
show immunomodulatory effects of bifidobacteria, we have attempted to elucidate a
mechanism by studying the action of four bifidobacteria. Three isolates of Bifidobacterium
acidophilum from newborn infant feces were compared to the commercial strain
Bifidobacterium lactis Bb12. The abilities of cytoplasm, cell wall and EPS from
bifidobacteria to stimulate mouse splenocyte proliferation and production of cytokines IFNγ and IL-10 were measured.
2.4 Material and methods
2.4.1 Bacterial strains and culture conditions
Isolates from newborn infant faeces were identified as bifidobacteria by fructose-6phosphate phosphoketolase assay and by the PCR method (Touré, Kheadr, Lacroix, Moroni
and Fliss, 2003). Isolates RBL81, RBL82, and RBL64 were selected on their basis of
exopolysaccharide production. Bifidobacterium lactis Bb12 (Chr. Hansen, Moersolm,
Denmark) was used as positive control. Bacteria were first cultured for 18 hours at 37°C in
De Man-Rogosa-Sharpe broth (MRS) (Rosell Institute Inc., Montreal, Canada)
supplemented with 1% Tween 80 and 0.05% cysteine-HCl (v/v) to lower the oxidationreduction potential of the medium (Screekumar & Hosono, 1998). After incubation, 100
63
mL of this pre-culture was transferred into 900 mL MRS broth and incubated under
anaerobic conditions for 24 h at 37 oC. All incubations were stationary.
2.4.2 EPS isolation, purification and fractionation
EPS was isolated and purified by the method of Cerning et al. (1994). After
incubation, cultures were heated at 100°C for 15 min to inactivate potential EPS hydrolases
and to improve detachment of EPS from the microbial cell walls (Tuinier, Van Casteren,
Looijesteijn, Schols, Voragen & Zoon, 2001). The cultures were then centrifuged at 10,000
rpm for 20 min at 4°C to separate bacteria and cell debris. EPS were precipitated with three
volumes of chilled 95% ethanol and standing overnight at 4°C. The precipitate, collected by
centrifugation at 9,000 rpm for 20 min at 4°C, was re-suspended in 25 mL of deionised
water and then freeze-dried. The resulting powder was dissolved in 15 mL of 10 %
trichloroacetic acid (TCA) and the solution was centrifuged at 9,000 rpm for 15 min at 4°C
to remove proteins. The protein content of the supernatant was determined by the Lowry
method using bovine serum albumin (BSA) as standard. As required, TCA extraction was
repeated to remove the remaining proteins. EPS solutions were dialysed (1000 Da MW-cut
off) at 4 °C for 2 days against deionised water. After dialysis, EPS solutions were
fractionated by successive filtrations through Centricon (Millipore) 5,000 and 100,000
MW-cut off filters. Three fractions were obtained: F1: > 100,000 Da; F2: 5,000 to 100,000
Da; and F3: < 5 000 Da. The total sugar content of the EPS suspensions was estimated by
the phenol/sulfuric method (Dubois, Gilles, Hamilton & Roberts, 1956). All samples were
aliquoted and kept at –20 °C until use. EPS solutions were passed through a 0.22 µm filter
prior to addition to cell cultures.
2.4.3 EPS molecular mass determination
EPS molecular weights were determined by gel permeation chromatography (GPC)
on a Waters HPLC system (Milford, MA, U.S.A.). Two columns, TOSOHAS G 4000
PWXL (30 cm x 7.8 mm) and BECKMAN TSK 4 000 SW (60 cm x 7.5 mm) were
connected in series. The mobile phase was 0.1 M ammonium acetate (pH 7.2) at a flow rate
of 0.5 mL min-1. Pullulan standards (Shodex Standards, Japan) of 100,000 Da and 1.6 x 106
Da and purified EPS were adjusted to 1 mg L-1 and 50 µL volumes were injected. A light-
64
scattering detector (SEDX Scientific Products & Equipment, Concord, Canada) was used at
45°C to detect the presence of exopolysaccharides resulting in variation of scattered light
intensity.
2.4.4 Preparation of cytoplasm and cell wall extracts of bifidobacteria
Fourteen-hour MRS broth cultures were centrifuged at 5,000 x g for 10 min at 4 °C
and washed with 0.01 M potassium phosphate buffer (PBS) at pH 7.0. Pelleted cells were
disrupted manually for 30 min at 4 °C with three or four volumes of alumina micro-beads
(Sigma Co., Saint Louis, Mo, USA) in a mortar laid in ice. PBS (1 mL) was added to the
mixture to facilitate extraction. The alumina beads were separated from the suspension by
centrifugation at 1,000 x g for 15 min at 4 °C. The homogenate was re-centrifuged at
30,000 x g for 30 min at 4 °C in order to pellet cell walls and obtain cytoplasmic extract in
the supernatant fraction. Cell walls were resuspended in 2 mL of bi-distilled water. The
protein content of the cytoplasmic and cell wall extracts was determined by the Lowry
method. The extracts were diluted in RPMI 1640 medium to a final protein concentration of
2 mg mL-1 and passed through a 0.22 µm-filter.
2.4.5 Stimulation of mouse splenocytes by bifidobacterial extracts
Spleens were removed aseptically from euthanized Balb/C mice and single cell
suspensions were prepared by mechanically disrupting the tissues through a cell strainer
into RPMI 1640 medium (Gibco BRL Inc., Paisley, Scotland). Red blood cells were
removed from the cell suspension by lysis with 0.87 % NH4Cl solution. Cells were then
washed, suspended in RPMI 1640 complete medium (with 10 % fetal calf serum (FSC), 0.1
mL mL-1 50 mM mercaptoethanol, 100 U mL-1 penicillin, and 100 µg mL-1 streptomycin,
all from Gibco). Cells were transferred to 96-well round bottom plates at a concentration of
5x105 cells mL-1. Various concentrations of bifidobacterial extracts were added alone or
with phytohemagglutinin (PHA) (10 µg mL-1) to the cells. They were incubated for 48 h in
a humidified 5 % CO2 atmosphere at 37 °C.
65
2.4.5.1 Cell proliferation
After incubation, the plates were centrifuged and the supernatants were kept for
cytokine analysis while the cells were used to measure proliferation. Cell proliferation was
measured by adding 20 µL of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) for the last 24 h of culture
and determining BrdU incorporation using a cell proliferation ELISA kit (Roche
Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany). Proliferation responses were expressed as a
stimulation index calculated as the ratio of mean OD (450 nm) obtained for stimulated
culture to the mean OD (450nm) obtained for un-stimulated control cell cultures.
2.4.5.2 Measurement of IFN-γ and IL-10
Interferon gamma (IFN-γ) and interleukin 10 (IL-10), in supernatants of splenocyte
cultures, were determined by cytokine-specific sandwich ELISAs. Antibodies R 4-6A2 and
biotinylated XMG1.2 were used for IFN-γ while MM-011 and biotinylated MM-16E3 were
used for IL-10 (all from Endogen, Woburn, MA, USA). Coating antibodies were diluted to
2 µg mL-1 and conjugate antibodies were diluted to 0.5 µg mL-1. Streptavidin-horseradish
peroxydase (Endogen, Woburn, MA, USA) and 3, 3, 5,,5-tetramethylebenzidine (KPL,
Maryland, USA) were used in these assays. The reaction was stopped with 1 M H2SO4 and
optical densities at 450 nm was determined using an ELISA plate reader (Molecular
Device, Sunnyvale, USA). Cytokine concentrations were derived from linear dose-response
standard curves obtained using dilutions of recombinant mouse IFN-γ (BD Pharmigen, San
Diego, CA, USA) or recombinant mouse IL-10 (Endogen). Fresh cell-free complete RPMI
1640 was used as negative control.
2.4.6 Statistical analysis
Splenocyte proliferation assay and cytokines evaluation were carried out in
triplicate for each bacterial extract, and all analysis was done in duplicate. Statistical
analyses were carried out with STATGRAPHICS plus 4.1 (Manugistics Inc., Rockville,
MD, USA). Significant differences between treatments were tested by analysis of variance
(ANOVA) followed by a comparison between treatments performed by Fisher’s least
significant difference (LSD) method, with a level of significance of P < 0.05.
66
2.5 Results and discussion
Few studies suggest that EPS produced by certain lactic acid bacteria may have
immunostimulatory (Hosono, Amenati, Natsume, Hirayama, Adachi & Kaminogawa,
1997), antitumoral (Oda, Hasegawa, Komatsu, Kambe & Tsuchiya, 1983; Ebina, Ogata &
Murata, 1995) activities. Induction of cytokine (IFN-γ and IL-1α) production has been
reported (Kitazawa, Itoh, Tomioka, Mizugaki & Yamaguchi, 1996) and phosphate groups
in these polysaccharides are believed to play an important role in macrophage and
lymphocyte activation (Kitazawa, Harata, Uemura, Saito, Kaneko & Itoh, 1998; Kitazawa
et al., 2000; Nishimura-Uemura, Kitazawa, Kawai, Itoh, Oda & Saito, 2003). We therefore
sought to evaluate the effect of crude and fractioned bifidobacterial EPS as well as
cytoplasm and cell wall extracts on splenocyte proliferation and production of IFN-γ and
IL-10. Since similar results were obtained with all fractions of the three isolates RBL64,
RBL81, and RBL82, we present herein only the comparison of RBL64 and B. lactis Bb12.
2.5.1 EPS production by bifidobacteria
The average yields of crude (total) EPS obtained from 24-hour cultures of isolates
RBL81, RBL82, RBL64, and B. lactis Bb12 were respectively 0.53, 0.42, 0.32, and 0.33
mg mL-1 of supernatant. Concentrations of EPS were in the same range as those obtained
by Roberts et al. (1995) from Bifidobacterium longum BB-79 (0.47 g L-1). EPS yield has
been reported to vary widely depending on species and culture conditions. For example,
Streptococcus thermophilus has been shown to produce 20 to 100 mg EPS L-1 in fermented
milk medium (Vaningelgem et al., 2004), while Lactobacillus rhamnosus RW-9595M
yielded 2350 mg L-1 of purified EPS when grown on supplemented whey permeate at 37 °C
(Bergmaier, Champagne, & Lacroix, 2003). Lactococcus lactis subsp. cremoris SBT 0495
has been reported to produce 600 mg L-1 in lactose-containing medium (Higashimura,
Mulder-Bosman, Reich, Iwasaki & Robin, 2000).
Bifidobacterial EPS were fractionated into F1 (> 100,000 Da), F2 (5,000 to 100,000
Da) or F3 (< 5,000 Da) portions. Proportions of each fraction of the isolate are shown in
67
Figure 2.1. Fraction F1 of all isolates was found to have a higher EPS content (ranging
from 63.5 to 79.3%) than fraction F2 (18.1 to 30.9%) or F3 (1.6 to 5.6%).
Aa
100
% Total EPS
76,1
50
22,5
2,1
0
F1
F2
F3
EPS fraction
b
B
100
% Total EPS
79,3
50
18,1
1,6
0
F1
F2
F3
EPS fraction
% Total EPS
Cc
100
63,5
50
30,9
5,6
0
F1
F2
F3
EPS fraction
Figure 2.1. EPS content of polysaccharide fractions from three bifidobacterial strains
isolated from newborns feces (A), strain RBL81; (B), strain RBL82; (C), strain
RBL64. The fractions were separated by centricon based on their molecular weight:
F1 > 100 000 Da; F2: 5 000 – 100 000 Da; F3: < 5 000 Da.
68
Isolate RBL82 produced more EPS in the molecular weight range > 100,000 Da
than did RBL64 or RBL81. The comparison of the EPS molecular weight profiles of isolate
RBL82 and Lactobacillus rhamnosus RW-9595M (Bergmaier et al., 2001) is shown in
Figure 2.2. With the aid of Figure 2.3, which shows three peaks corresponding
respectively to the EPS of fractions F1, F2, and F3, it can be seen that most of the EPS
produced by bifidobacteria appears to be of lower molecular weight. Fraction F1 appears to
contain some of fraction F2, which may have been retained by the 105 Da cut-off filter or
may be an artefact of fractionation. Tone-Shimokawa, Toida and Kawashima (1996), who
analysed cell wall polysaccharides of Bifidobacterium infantis Reuter ATCC 15697 by gel
filtration chromatography using pullulan standards, reported that polysaccharides were
affected by the ionic strength of the eluting solution and may interact with the column
matrix. The weight range of F1 appears consistent with the findings of Roberts et al.
(1995), who estimated by chromatography the average weight EPS from Bifidobacterum
longum BB-79 to be greater than 200,000 Da.
A2
Light scattering (eV)
A1
C
Elution time (min)
Figure 2.2. Gel permeation chromatography analysis of crude bacterial
exopolysaccharides : A1, 1600x103 Da; A2, 100x103 Da; B, L. rhamnosus RW-9595M;
C, strain RBL 82.
69
Light scattering (eV)
A1
A2
D
E
F
Elution time (min)
Figure 2.3. Gel permeation chromatography analysis of fractioned EPS from
bifidobacterial strain RBL82 using pullulan standard: A1, 1600x103 Da; A2, 100x103
Da; D, F1 > 100,000 Da; E, F2: 5 000 – 100 000 Da; F, F3 < 5 000 Da.
2.5.2 Splenocyte proliferation induced by bifidobacterial extracts
The crude EPS preparation had only a weak stimulating effect on cell proliferation
(Figure 2.4). Tzianabos, Wang and Kaspera (2003) reported that different bacterial
capsular polysaccharides with molecular weights greater than 17 kDa stimulated CD4+ cell
proliferation in vitro. Our results suggest that molecular weight does not likely influence
any possible stimulatory effect of bifidobacterial EPS on the proliferation of mouse
splenocytes.
70
18
16
Strain RBL64
a)A
B. lactis Bb12
Stimulation index
14
d
12
Cells+PHA (10 µg/ml)
d
10
8
b
6
4
2
c
a
a
a
a b
a
0
2
20
40
PHA alone
200
Cytoplasmic
(µgProtein
protein
mL-1)
Cytoplasmic content
content (µg
mL-1)
18
16
d
d
b)B
c
Stimulation index
14
c
12
10
8
b
6
4
2
b
b
a
a
0
2
20
40
200
PHA alone
Cell
wall
proteinmL-1)
mL-1 )
Cell
wall(µg
(µg Protein
18
Stimulation index
16
c)C
14
12
10
8
d
6
4
2
0
a
b
0,1
a b
b c
abc abc
10
100
b
1
PHA alone
-1
Exopolysaccharides (µg
Exopolysaccharides
(µgmL-1)
mL )
Figure 2.4. Effect of (A) cytoplasmic content, (B) cell wall, and (C) EPS extracts from
the strains RBL64 and B. lactis Bb12 on splenocyte proliferation when the
preparations were normalized on the basis of their protein content. Columns with
different letters are significantly different.
71
Several factors influencing the effects of EPS on lymphocyte proliferation have
been reported. Kitazawa et al. (1998), who fractionated EPS from Lactobacillus delbrueckii
ssp. bulgaricus 1073R-1 into neutral and acidic fractions, demonstrated that the acidic
polysaccharide stimulated mitogenic responses of murine splenocytes and Peyer’s patches
but not thymocytes. They also reported that de-phosphorylation of EPS reduced their
mitogenic activity in lymphocytes. Obviously, polysaccharide structure may be modified
during extraction and purification procedures (structural alteration induced by heat or
trichloroacetic acid treatment), causing losses of their properties to stimulate the cell
proliferation.
Recent studies suggest that the cell proliferation stimulation induced by bacterial
EPS are indeed structure-dependent and that the active structures are in turn charge
dependent. Kalka-Moll, Tzianabos, Bryant, Niemeyer, Ploegh, and Kasper (2002)
emphasized that bacterial polysaccharides with a zwitterionic charge spatial motif, such as
capsular polysaccharides, elicit potent CD4 T-cell responses both in vivo and in vitro.
Recently, Stingele, Corthesy, Kusy, Porcelli, Kasper and Tzianabos (2004) demonstrated
that
zwitterionic
polysaccharides
interact
directly
with
T
cells
with
rapid
association/dissociation kinetics. The proliferative response of T cells depends on free
amino (positively charged) and carboxyl or phosphate groups (negatively charged) that are
part of the repeating unit structure. Chemical neutralization of either charged group results
in loss of the ability of the polysaccharide to activate T cells (Tzianabos et al., 2000;
Tzianabos, Wang & Kasper, 2001). Using gas-liquid chromatography and GLC-mass
spectrometry, Roberts et al. (1995) found that EPS from Bifibobacterium longum BB-79
appear to be composed of galactose and an unidentified hexose (possibly glucose) with a
lactic acid substituent.
Splenocyte proliferation stimulated by bifidobacterial cytoplasm and cell wall from
strains RBL64 and B. lactis Bb12 can be clearly observed after 48 h of incubation. Figure
2.4 shows that splenocyte proliferation is dose dependent and the SI is significantly
increased at protein concentrations ranging from 20 to 40 µg mL-1. For both strains, cell
wall extract was a more efficient stimulator of splenocyte proliferation than the cytoplasm
72
fraction. However, B. lactis Bb12 extracts were more effective than those from RBL64.
Prioult et al. (2003) reported that Bifidobacterium lactis Bb12 (NCC 362) was more
effective than Lactobacillus paracasei (NCC 2461) or Lactobacillus johnsonii (NCC 533)
at inducing and maintaining oral tolerance to bovine β-lactoglobulin in mice. Other studies
have reported that Gram-positive bacteria, which do not contain lipopolysaccharide (LPS)
but carry surface teichoic acids, lipoteichoic acids and peptidoglycan, can stimulate
immune cells. However, whole peptidoglycan is much less active than LPS on a dry weight
basis (Weintraub, 2003; Moreillon & Majcherczyk, 2003). The mechanisms by which
Gram-positive bacteria stimulate cellular response thus require further study.
The stimulation of cell proliferation by cytoplasm may be due to DNA and bioactive
peptides. Indeed, Hemmi et al. (2000) reported that bacterial DNA has stimulatory effects
on mammalian immune cells, which depend on the presence of unmethylated CpG
(deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate) dinucleotides in the bacterial DNA. They
postulated that cellular response to CpG DNA is mediated by a Toll-like receptor (TLR9),
which consists of phylogenetically conserved transmembrane proteins recognizing bacteriaderived ligands. They demonstrated that TLR9-deficient mice express a non-responsive
phenotype to CpG-DNA, suggesting that murine TLR9 is a CpG-DNA receptor. Bacterial
DNA and synthetic oligodeoxynucleotides expressing unmethylated CpG motifs stimulate
the immune system, inducing maturation, differentiation, and proliferation of multiple
immune cells, including B and T lymphocytes, NK cells, monocytes, macrophages, and
dendritic cells (Roman et al., 1997; Sun, Zhang, Tough, & Sprent, 1998; Klinman, Currie,
Gursel & Verthelyi, 2004). Other sources of immunomodulators from bifidobacteria may
include peptidases, which could generate bioactive peptides with mitogenic effects on
splenocytes (Gobbetti, Corsetti, Smacchi, Zocchetti, and De Angelis, 1998; Samartsev,
Astapovich and Novik, 2000).
Differences in the level of stimulation may arise from the proportions of immunoactive components in specific probiotics. While our results demonstrate that cell extracts,
mainly cell wall extract, stimulate splenocyte proliferation and suggest that such extracts
could be used to enhance host immune responses or in controlling certain
73
immunopathologies. Pessi, Sutas, Saxelin, Kalliooinen and Isolauri (1999) reported that
extracts from probiotics such as L. rhamnosus GG, B. lactis, L. acidophilus, L. delbrueckii
subsp. bulgaricus, and S. thermophilus suppress immune response in vitro. Dijkstra, Alber
and Keck (1997) have suggested that bacterial surface constituents, being readily accessible
to detection, have been biologically selected by the immune system as indicators of
bacterial presence and are thus potent inducers of host responses. Since peptidoglycan is
the major constituent of the Gram-positive bacterial cell wall and is located at the cell
surface, this glycoprotein is a suitable target for such immune responses. Moreover, the
basic architecture of peptidoglycan appears to be highly conserved among bacteria, with
minor variations in exact chemical composition while an additional layer of S-proteins may
provide additional variation (Beveridge & Graham, 1991; Labischinski & Maidhof, 1994).
2.5.3 Cytokine production
IFN-γ is secreted by T-cell helper type 1 cells (Th1), which are associated with
antibody responses (Knopf, 2000). Although it has antiviral and antiparasitic activities in
mice, the main biological activity of IFN-γ appears to be immunomodulatory. IL-10
produced by T-cell helper type 2 cells (Th2) inhibits the synthesis of a number of cytokines,
including IFN-γ. IL-10 is also produced by regulatory T cells and lead to both suppression
of Th2 responses and a switch from IgE to IgG4 antibody production preventing allergic
disease (Robinson, Larche & Durham,
2004). Induction or enhancement of cytokine
production could be major mechanisms by which bifidobacteria exert immunomodulatory
activities (Marin, Lee, Murtha, Ustunol & Pestika, 1997). Since no cytokines were detected
after adding bifidobacterial extracts alone, we checked for synergistic effects with PHA.
Levels of IFN-γ and IL-10 produced by splenocytes in the presence of bifidobacterial
extracts with PHA are shown in Figure 2.5 and Figure 2.6. A significant increase in IFN-γ
production was obtained in splenocyte cultures with bacterial cell wall at concentrations of
20 to 40 µg mL-1. More than 4 ng mL-1 of IFN-γ was obtained by adding cell wall from B.
lactis Bb12 while little or none was produced by adding EPS (Figure 2.5c). IL-10 was not
detected (Figure 2.6c) in response to EPS. These results are consistent with those obtained
in the proliferation assay. In addition to the proliferation immune cells also react to
74
conserved bacterial molecules such as peptidoglycan by secreting cytokines (Moreillon &
Majcherczyk, 2003).
Increased IL-10 production by splenocytes (0.8 ng mL-1) was obtained in response
to isolate RBL64 cell wall and PHA. These results suggest a strain or species dependent
effect of bifidobacterial cell wall extracts on splenocytes, since they may induce pro- or
anti- inflammatory cytokines. Indeed, IFN-γ is known to be a major macrophage-activating
lymphokine and regulates the induction of other cytokines, particularly Th2 cytokines such
as IL-4, IL-5 and IL-10.
Because of its role in mediating macrophage and NK cell activation, IFN-γ is
important in host defence against intracellular pathogens such as Mycobacterium
tuberculosis and viruses and against tumours (Meydani & Ha, 2000). However, overexpression of cytokines may lead to inflammation in the intestine and is thus considered
undesirable, especially for allergic infants and the elderly. He et al. (2002), in finding that
bifidobacterial induction of cytokine secretion is strain and species dependant,
demonstrated that Bifidobacterium adolescentis and B. longum, known as adult-type
bifidobacteria, induced significantly more pro-inflammatory cytokine secretion (IL-12 and
TNF-α) by a murine macrophage-like cell line than did the infant-type bifidobacteria B.
bifidum, B. breve and B. infantis. In contrast, B. adolescentis did not stimulate the
production of anti-inflammatory IL-10.
75
4
A
Strain RBL64
IFN-γ (ng mL-1)
B. lactis Bb12
3
Cells+PHA (10µg/ml)
d
2
cd
bcd bc
bcd
1
ab
a
a a
0
2
20
40
200
PHA alone
Cytoplasmic content (µg protein mL-1)
IFN-γ (ng mL-1)
4
*
B
*
e
e
cd
bcd
3
abc
2
ab
1
a bc
a
0
2
20
40
200
PHA alone
-1
Cell wall (µg protein mL )
IFN-γ (ng mL-1)
4
C
3
2
1
0
0,1
1
10
100
PHA alone
-1
Exopolysaccharides (µg mL )
Figure 2.5. Synergistic effect of PHA and cellular preparations (A) cytoplasmic
content, (B) cell wall, and (C) exopolysaccharides from bifidobacterial strain RBL64
and B. lactis Bb12 on IFN-γ splenocyte production when cells were cultured in
complete RPMI medium added with mitogen agent (PHA) (10 µg mL-1). No IFN-γ was
detected in PHA-free media and there was no significant difference between
treatments with exopolysaccharides. *, higher than 4 µg mL-1.
76
IL-10 (ng mL-1)
1
A
Strain
0,8
B. lactis Bb12
0,6
0,4
0,2
N.D
0
2
20
40
200
PHA alone
-1
Cytoplasmic content (µg protein mL )
1
B
c
IL-10 (ng mL-1)
0,8
b
0,6
b
0,4
b
b b
b
0,2
a
N.D
0
2
20
40
200
-1
1
PHA alone
Cell wall (µg protein mL )
C
IL-10 (ng mL-1)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
N.D
N.D
N.D
0,1
1
10
N.D
100
N.D
PHA alone
-1
Exopolysaccharides (µg mL )
Figure 2.6. Synergistic effect of PHA and cellular preparations (A) cytoplasmic
content, (B) cell wall, and (C) exopolysaccharides from bifidobacterial strain RBL64
and B. lactis Bb12 on IL-10 splenocyte production when cells were cultured in
complete RPMI medium added with mitogen agent (PHA) (10 µg mL-1). No IL-10
was detected in PHA-free media and there is no significant difference between
treatments with cytoplasmic content. ND, not detected.
77
Splenocyte proliferation and cytokine secretion in mice probably reflect stimulation
of lymphocyte-governed inherent immunity to bacterial immunogens. It thus appears that
the immunoregulatory action of bifidobacteria may be mediated primarily by enhancement
of interferon production by spleen cells. In theory, this mechanism could serve to regulate
over-expression of the Th2-type immune response and thus help to fight against allergic
response. Increased lymphocyte proliferation and IFN-γ production in response to lactic
acid bacteria in rat spleen has been previously reported (De Simone, Bianchi Salvadori,
Jirillo, Baldinelli, Bitonti & Vesely, 1989; De Simone, Bianchi Salvadori & Jirillo, 1993;
Attouri, Bouras, Tome, Marcos & Lemonnier, 2002). Decreased IL-10 secretion could in
effect stimulate pro-Th1-type responses, since IL-10 is a potent deactivating signal for
cytokine production and can suppress IFN-γ production and Th1 phenotype expression (De
Wall Malefyt, Abrams, Bennet, Figdor & De Vries, 1993; D’Andrea, Aste-Amezaga,
Valiante, Ma, Kubin, & Trinchieri, 1993). Establishment of a robust Th1-type immunity in
the site of infection is a prerequisite for effective defence against most viruses and
intracellular bacteria, whereas the coinduction of Th2-type immunity lead to the
maintenance of immune homeostasis during Th1-mediated responses (Bot, Smith &Von
Herrath, 2004). In addition, IL-10 detected in the culture media could be produced by
regulatory T cells, distinct in function and phenotype from the Th1 and Th2 populations
(McGuirk & Mills, 2002). CD4+CD25+ regulatory T-cell, secreting high levels of IL-10,
were recently shown to be re-directed against pathologic T-lymphocytes, facilitating the
treatment of autoimmune disease (Mekala & Geiger, 2004).
2.6 Conclusions
The results demonstrate overall that cell components from bifidobacteria promote in
vitro immune responses in mouse splenocytes. Cell wall and cytoplasm were found to
stimulate lymphocyte proliferation and increase IFN-γ, and IL-10 while bifidobacterial EPS
recovered from culture broth did not produce a significant response. It is therefore
suggested that live probiotic bacteria may not be required to influence the immune system.
Components such as cell wall from autolysed bifidobacteria may stimulate lymphatic cell
proliferation and cytokine production. The use of nonviable probiotics in foods should have
the advantage of allowing a longer product shelf life and easier storage. Since the
78
composition of bacterial cell wall and cytoplasm is very complex, additional research to
identify specific immunoregulatory agents, particularly the components favouring pro-Th1
activity, should provide valuable insight into probiotic immunostimulation. Understanding
of these modulatory functions could provide a unique opportunity to prevent or treat
intestinal disorders associated with food allergy, intestinal infections, inflammatory bowel
disease and autoimmunity. Probiotic bifidobacteria could be used as nutritional
supplements to improve the immune function of neonate or the elderly, for whom these
functions are diminished. The use of probiotic homogenates as components of functional
foods should also be studied clinically. Since bifidobacteria and lactic acid bacteria are
indigenous inhabitants of the healthy intestine and have been used safely for the production
of food all over the world since ancient times, they are particularly suited to use as
probiotics or immunomodulators for both the prevention and therapeutic treatment of
diseases mediated by immune responses.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from FCAR, NOVALAIT, MAPAQ and
NSERC. T. Amrouche was recipient of scholarships from the World Bank. Dr Stephen
Davids is thanked for reading the manuscript.
Chapitre III: Effets des fractions peptidiques et
protéiques du cytoplasme de bifidobactéries sur la
prolifération des lymphocytes de souris et la production
de cytokines. Effects of bifidobacterial cytoplasm peptide
and protein fractions on mouse lymphocyte proliferation
and cytokine production.
T. Amrouche a,b,c, Y. Boutin b,d, and I. Fliss a,b*
a
Dairy Research Center STELA, Pavillon Paul-Comtois, Université Laval, Québec (Qc)
G1K 7P4
b
Institute of Nutraceutical and Functional Foods INAF, Université Laval, Québec (Qc)
G1K 7P4
c
Department of Food Technology, Faculty of Agronomy and Biological Sciences,
University of Tizi-Ouzou, Algeria
d
TransBiotech, CEGEP Lévis Lauzon, Lévis (Qc) G6V 9V6
International Dairy Journal : à soumettre prochainement
80
Dans le premier chapitre, nous avions mentionné que le contenu cytoplasmique des
bifidobactéries, notamment celui de la B. lactis Bb12, exerce un effet stimulant sur la
prolifération des lymphocytes et la production de cytokines. A cet effet, nous avions
postulé que cet effet immunostimulant a été induit par les peptides et les protéines retrouvés
dans le cytoplasme des cellules de bifidobactéries. Afin de vérifier cette hypothèse, nous
avons réalisé les travaux rapportés dans ce chapitre. Nous avons fractionné et caractérisé
les peptides et les protéines cytoplasmiques de B. lactis Bb12. Les fractions peptidiques et
protéiques ont été ensuite étudiées pour leurs propriétés immunomodulatrices.
3.1 Résumé
Les bifidobactéries sont des bactéries très utilisées dans les produits fermentées
probiotiques. L’une des propriétés intéressantes des bifidobactéries est leur capacité à
rétablir ou améliorer la fonction immunitaire chez l’homme et l’animal. Dans une étude
antérieure, nous avions démontré que le contenu cytoplasmique de certaines souches de
bifidobactéries stimule la prolifération des splénocytes et la sécrétion de cytokines.
Cependant, les composants responsables de l’effet immunostumulant observé ne sont pas
encore identifiés. La présente étude a pour but de caractériser et d’étudier l’effet des
peptides et des protéines du cytoplasme de Bifidobacterium lacis Bb12 sur la prolifération
des splénocytes de souris et la production de cytokines. L'analyse par SDS-PAGE de
l’extrait cytoplasmique de B. lacis Bb12 cultivée sur le milieu MRS en anaérobiose a révélé
la présence d’un groupe hétérogène de peptide et de protéines.
Les peptides et les
protéines ont été fractionnés par électrofocalisation (pH isoélectrique ou pI) en fraction
acide (pI 2-5) et fraction basique (pI 5-12). Analysées par RP-HPLC, chacune des deux
fractions montre la prédominance de peptides et de protéines relativement moins
hydrophobes. Le poids moléculaire des peptides et des protéines des pics majeurs a été
estimé par spectrométrie de masse à environ 510.16 à 10048.03 Da et plus de 13142.83 Da
respectivement. Quatre pics majeurs ont été sélectionnés dans chaque fraction puis testés
pour leur activité mitogénique sur des splénocytes de souris. Le cytoplasme brut (avant
fractionnement) de la souche B. lactis Bb 12 s’est montré immunostimulant (indice de
stimulation (IS) = 2,96 ± 0,35) comparativement à la PHA (IS=1,66 ± 0,20) en confirmant
les effets immunostimulants observés dans notre étude antérieure. La fraction acide (100
81
µg/ml) stimule la prolifération des splénocytes (SI=1,61 ± 0,08) plus que la fraction
basique (SI=1,33± 0,02). Les deux cytokines IFN-γ et IL-4 ont été détectées dans le milieu
de culture à différentes concentrations indiquant la stimulation des cellules T helper. Une
forte sécrétion de IFN-γ (1199,57±127,60 pg/ml) a été induite par l’extrait cytoplasmique
brut (40 µg/ml) indiquant probablement une forte stimulation des cellules Th1. Une
augmentation notable de la production de IFN-γ (578,55±195,16 pg/ml) a été également
générée par la fraction basique (40 µg/ml). Une stimulation maximale de la sécrétion de IL4 (9,14±4,04 pg/ml) induite par le contenu cytoplasmique à une concentration de 40 µg/ml
indiquerait la stimulation des cellules Th2. Enfin, les effets immunostimulants ainsi
démontrés laissent suggérer une possibilité d’utilisation de l’extrait cytoplasmique de
bifidobactéries comme nutraceutique (agent immunomodulateur).
Key words: Bifidobactéries, prolifération cellulaire, cytokines, cytoplasme, peptides,
protéines.
3.2 Abstract
Bifidobacteria are probiotic bacteria shown to possess immunonodulatory properties
in human and animal. Cellular components such as cytoplasmic content from bifidobacteria
were demonstrated to elicit a mitogenic activity when tested in vitro with immune cells.
Based on previously reported immunostimulating effects of bifidobacterial cytoplasm, we
tested the potentiating effects of representative peptides and proteins from. B. lactis Bb12
cytoplasm on immune response measuring splenocyte proliferation and secreted cytokines.
SDS-PAGE analysis of cytoplasmic extract resulted in a profile indicating an
heterogeneous protein and peptide group in B. lactis Bb12. Cytoplasmic peptides and
proteins were fractionated into acidic and basic fractions by liquid-phase electrofocalisation
based on amino acid isoelectric pH. Both acidic and basic fractions were further
fractionated by RP-HPLC into different peptides and protein fraction based on their
hydrophobicity. The most abundant components in both fractions were eluted early
indicating their low hydrophobicity. Four majors peaks selected in each fraction were
analysed by mass spectrometry and showed individually an abundant peptide or protein
with contaminants. The molecular weight of the components ranged from 510.16 to
82
10048.03 Da (peptides) or higher than 13142.83 Da (proteins). Each fraction was tested for
its mitogenic activity on mouse splenocytes. The acidic fraction (100 µg/ml) was found to
stimulate cell proliferation more (stimulation index (SI)= 1,61 ± 0,08) than the basic
fraction (SI=1,33± 0,02), but less than the cytoplasmic content (2,96 ± 0,35). Secreted IFNγ and IL-4 were detected in culture media at different level indicating the stimulation of
helper T cells. The basic fraction was shown to induce more IFN-γ (578,55±195,16) than
the acidic fraction (191,08±7,50 pg/ml). The results demonstrate that several peptides and
proteins from B. lactis Bb12 exhibit an immunostimulating activity suggesting the
possibility of the use of cytoplasmic content as nutraceutical products to enhance immune
responses in children or elderly persons with reduced immune function.
Key words: Bifidobacteria, cell proliferation, cytokines, cytoplasm, peptides, proteins.
3.3 Introduction
Probiotics such as bifidobacteria have been recently reported to enhance the human
and animal immune system. Immunomodulatory effects of probiotic bacteria were shown
to be associated not only with live microorganisms but also with nonviable organisms
(Tejada-Simon and Pestka, 1999; Christensen et al., 2002; Kankaanpa et al., 2003;
McCarthy et al., 2003; Chukeatirote, 2003; Mastrandrea et al., 2004). In our previous work,
we demonstrated that cell wall and cytoplasm from bifidobacteria stimulated in vitro the
lymphocyte proliferation and cytokines production. In addition, Lee et al. (2004) mentioned
that cytoplasmic preparations of lactic acid bacteria were found to have antitumor effects in
vivo with the modulation of cellular immunity.
According to Reid et al. (2002), several novel peptides from Lactobacillus
fermentum RC-14 may prove to be significant with respect to its probiotic activity.
Recently, Nouaille et al.(2003) mentioned that a new application for lactic acid bacteria is
their use as live delivery vectors for antigenic or therapeutic protein or peptides in mucosal
surfaces enhancing both mucosal and systemic immune responses. Chadwick et al. (1988)
reported that peptides produced by intestinal bacteria could promote an inflammatory
response and should cross the 'mucosal barrier'. They mentioned that these peptides activate
83
in vitro and in vivo human neutrophils inducing chemotaxis and lysosomal enzyme.
Furthermore, a bacterial formylpeptide, N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP),
has been reported by Arbour et al. (1996) to induce and modulate various cellular responses
and secretion of pro-inflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells.
In addition, some prokaryotic proteins such as heat shock proteins were shown to be
a potential source of microbial peptides generated by digested bacteria and could enhance
presentation of peptides to CD8+ T cells (Castellino et al., 2000; Aaron et al., 2004, Tobian
et al., 2004). However, cytoplasm-derived peptides inducing the immunomodulatory effects
are few investigated in bifidobacteria. In this study, we aimed to characterize the peptides
or proteins fractions from bifidobacteria (Bifidobacterium lactis Bb12) cytoplasm
responsible for immunomodulation.
3.4 Material and methods
3.4.1 Bacterial strains and culture conditions
Isolates Bifidobacterium thermoacidophilum RBL81, RBL82 and RBL64 from
newborn infant faeces were identified by fructose-6-phosphate phosphoketolase assay and
by the PCR method of Touré et al. (2003). These isolates and Bifidobacterium lactis Bb12
(Chr. Hansen, Moersolm, Denmark) were individually subcultured anaerobically for 18
hours at 37 °C in 300 mL of De Man-Rogosa-Sharpe broth (MRS) (Rosell Institute Inc.,
Montreal, Canada) supplemented with 0.05 % cysteine-HCl (v/v) to lower the oxidationreduction potential of the medium and thereby improve anaerobic growth (Sreekumar &
Hosono, 1998). Tween 80 was added at a concentration of 1 % (v/v). Three hundred mL of
each pre-culture was transferred to 270 mL of broth in separate 1 L flasks (3 flasks for each
culture), which were incubated for 16 h at 37 °C in an anaerobic jar containing a carbon
dioxide generating sachet (AnaeroGen, OXOID Ltd., Basingstoke, England).
3.4.2 Preparation of bifidobacterial cytoplasm extracts
After incubation (16 h), bifidobacteria cultures were used to extract cytoplasmic
content according to method of Fernandez-Espla et al. (2000) with some modifications.
84
Briefly, cells were collected at the end of exponential growth phase (16 h) by centrifugation
at 5,000 x g for 10 min at 4 °C and washed three times with 0.01 M potassium phosphate
buffer (PBS) at pH 7.0. The contents of bacterial cells were released by disruption of
pelleted cells manually for 30 min at 4 °C with three or four volumes of alumina powder
(Sigma Co., Saint Louis, Mo, USA) in a mortar laid in ice. PBS (1 mL) was added to the
mixture to facilitate extraction. The alumina was separated from the suspension of
disrupted cells by centrifugation at 1,000 x g for 15 min at 4 °C. Finally, the preparations
were re-centrifuged at 30,000 x g for 30 min at 4 °C in order to pellet cell walls and obtain
cytoplasmic extract in the supernatant fraction. The protein content of the cytoplasmic
extract was determined by the Lowry method. All samples were stored at – 20 °C until they
were used.
3.4.3 Cytoplasm peptide and protein profile analysis
SDS-PAGE analysis was carried out to compare the peptide and protein profile of
cytoplasm from bifidobacterial strains used. The analysis was carried out using 10 %
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) performed in the presence of sodium dodecyl
sulfate (SDS) according to Laemmli (1970). Molecular markers Bio-Rad (Broad Range)
with molecular mass ranging from 21.5 to 97.5 kDa were used.
3.4.4 Separation of acidic and basic peptide and protein fractions
Cytoplasmic content was separated by ampholyte-free isoelectric focusing using the
method described by Groleau et al. (2002). Briefly, cytoplasmic extracts (0.1 g ) were
resuspended in 40 mL of deionized water and fractionated for 2 h at 4 oC by liquid-phase
isoelectric focusing in a preparative Rotofor cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) at
constant power (15 W). Twenty fractions were collected and the pH of each fraction was
measured to determine the isoelectric pH (pI). The fractions were then pooled to obtain the
acidic fraction (pI from 2 to 5) and basic fraction (pI from 5 to 12). Acidic and basic
fractions were dried by Speed Vac concentrator (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY)
and stored at 4 0C until use.
85
3.4.5 Characterization of cytoplasm peptide and protein fractions of
bifidobacteria
3.4.5.1 Characterization by Reverse Phase-HPLC
The acidic and basic fractions from B. lactis Bb12 cytoplasm were resuspended
separately in saline phosphate buffer and were analyzed by RP-HPLC for peptide and
protein content. Analysis were performed with a Luna C18 column (3.9 i.d. x 150 mm,
Phenomenex) using Waters HPLC system described above and following conditions: flow
rate, 1 mL/min; column temperature, 39 0C; solvent A, trifluoroacetic acid (TFA) 0.11%
(v/v) in HPLC-grade water; solvent B, acetonitrile/water/TFA 60%/40%/0.1% (v/v).
Elution was performed with a linear gradient of solvent B from 0 to 60% over 45 min
(Groleau et al., 2002). Major peaks corresponding to peptide or protein from B. lactis Bb12
were individually collected at different time (elution time), thoroughly dried by Speed Vac
concentrator (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY) and resuspended in water to be
assayed for their immunoactivity.
3.4.5.2 Characterization by mass spectrometry
Collected peaks from acidic and basic fraction were analyzed separately by mass
spectrometry using a MSD QUAD Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, Palo Alto,
CA), following the method described by Groleau et al. (2002). In order to reduce the effect
of TFA, collected fractions (individual peaks) were resuspended in 20 % (v/v) propionic
acid prior the infusion in the mass spectrometry interface. Signals were recorded in positive
mode using a 90-V fragmentation with a scan range of 300-3000 m/z. Nitrogen was used as
the drying gas at 13.0 L/min and 350oC, and nebulizer gas at 241 kPa. The capillary voltage
was set at 3000V. The instrument was calibrated using ES tuning mix (G2431A, Agilent).
3.4.6 Proliferation assay
A proliferation assay was carried out to evaluate the mononuclear cell response to
cytoplasm fractions from B. lactis Bb12. Spleens were removed aseptically from
euthanized Balb/C mice and single cell suspensions were prepared by mechanically
disrupting the tissues through a cell strainer into RPMI 1640 medium (Gibco BRL Inc.,
Paisley, Scotland). Erythrocytes were removed from cell suspension by osmotic shock with
86
2 mL of 0.87 % NH4Cl solution for 2 min at 37oC. Spleen cells were then washed three
times at 4°C, suspended in RPMI 1640 complete medium (with 10% fetal calf serum
(FSC), 0.1 mL mL-1 50 mM mercaptoethanol, 100 U mL-1 penicillin, and 100 µg mL-1
streptomycin, all from Gibco). The crude cytoplasmic extract and acidic and basic fractions
were diluted in supplemented RPMI to 0.8, 8, 80 and 200 μg/mL; whereas the fractionated
components (peaks) were diluted in supplemented RPMI at 0.8, 8 and 80 μg/mL. All the
samples were filtered (0.22 μm). Cells were plated at a final concentration of 5x105 cells
mL-1. A mitogenic agent, phytohemagglutinin (PHA) (10 µg mL-1) was used alone as
control for cell proliferation. Medium alone, PHA or above-mentioned concentrations of
bifidobacterial components were added to wells in duplicate. Finally, AlamarBlue indicator
(BioSource International, Inc., USA) was added to wells (20 µL/well) to measure cell
proliferation. AlamarBlue system incorporates an oxidation-reduction indicator that both
fluoresces and changes color in response to chemical reduction of culture media resulting
from cell growth (Lancaster, 1996). Cell cultures were incubated for 48 h in a humidified 5
% CO2 atmosphere at 37 °C. At the end of incubation, the microplates were centrifuged and
supernatants were transferred to a black opaque 96-well microplate (Fisher Scientific,
Pittsburgh, USA) to determine fluorescence values. Fluorescence measurements were made
by FLUOstar spectrofluorometric microtiter well plate reader (BMG Labtechnologies,
Offenburg, Germany) (excitation: 544 nm; emission: 610 nm; gain 026). Proliferation
responses were expressed as a stimulation index calculated as the ratio of mean
fluorescence value obtained for stimulated culture to the mean fluorescence value obtained
for nonstimulated control cell cultures.
3.4.7 Cytokine analysis
In order to evaluate cytokine production, a separate microplate was prepared
without adding AlamarBlue. Cytokine production was measured in splenocytes cultured in
conditions described above and added with bifidobacterial components and 10 μg/mL PHA,
at which concentration the stimulation index was not affected. Interferon gamma (IFN-γ)
and interleukin 4 (IL-4), in supernatants of splenocyte cultures, were evaluated by cytokinespecific sandwich ELISAs. Antibodies R 4-6A2 and biotinylated XMG1.2 were used for
IFN-γ while MM-011 and biotinylated MM-16E3 were used for IL-4 (all from Endogen,
87
Woburn, MA, USA). Coating antibodies were diluted to 2 µg mL-1 and conjugate
antibodies were diluted to 0.5 µg mL-1. Cytokine concentrations were derived from linear
dose-response standard curves obtained using dilutions of recombinant mouse IFN-γ (BD
Pharmigen, San Diego, CA, USA) or recombinant mouse IL- (Endogen). Optical densities
were measured at 450 nm after 15 min with TMB (tetramethylbenzidine) peroxidase
substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories) and H2O2 at room temperature. The reaction
was stopped by addition of 1 M H2SO4. Fresh cell-free complete RPMI 1640 was used as
negative control.
3.4.8 Statistical analysis
Splenocyte proliferation assay and cytokines evaluation were carried out in
triplicate for each bacterial extract, and all analysis was done in duplicate. Statistical
analyses were performed with STATGRAPHICS plus 4.1 (Manugistics Inc., Rockville,
MD, USA). Significant differences between treatments were tested by analysis of variance
(ANOVA). The treatments were compared using Fisher’s least
significant difference
(LSD) method, with a level of significance of P < 0.05.
3.5 Results and discussion
3.5.1 Peptide and protein profile of bifidobacterial cytoplasm
To compare the cytoplasmic peptide and protein profile of three isolates of
bifidobacteria and B. lactis Bb12 cytoplasm extracts were analysed by SDS-PAGE. The
results reported in Figure 3.1 showed difference and similarities in protein profile between
the strains tested.
The band corresponding to the molecular weight (MW) of 75 kDa was shown only
by B. lactis Bb12. While, a common band with MW of 34 kDa was found to be
characteristic to the isolates RBL81, RBL82, and RBL64. Bands with high MW (>45 kDa)
and weak MW (<31 kDa) allowing discrimination between B. lactis Bb12 and isolates
tested were also observed. More proteins and peptides appear to be biosynthesized by B.
lactis Bb12 compared to other bifidobacterial strains. However, as can be seen in the
88
Figure 3.1, peptides seem to be produced in quantities non detectable by blue coomassie
staining compared to proteins. Marasco et al. (1984) reported that bacteria elaborate in very
low concentrations numerous peptides of similar composition, which may differ markedly
in their specific biological activities. The differences observed in protein and peptides
profile of bifidobacteria should be attributed to the variability and diversity of strain
proteome. Champomier-Verges et al. (2002) mentioned that lactic acid bacteria strains
grown in the same rich synthetic MRS medium show some common (a dozen) proteins
which represent almost 20% of the total protein detected on the acidic proteomic map.
However, lactic acid bacteria indicating metabolic adaptation to media conditions show
some differences in protein content. Indeed, different stress treatments (e.g., heat, low pH,
osmotic shock, etc.) have been reported to induce transiently general and specific proteins
(e.g., heat shock proteins) by physiological changes enhancing bacterial ability to survive in
adverse environmental conditions (Ang et al., 1991; Prasad et al., 2003, De Angelis et al.,
lac
tis
B
B.
RB
L8
2
RB
L6
4
RB
L8
1
b1
2
2004).
M
kDa
97,5
66
45
31
21,5
Figure 3.1. Peptide and protein profile of cytoplasmic extracts from strains
B. thermoacidophilum RBL64, RBL82 and RBL84, and B. lactis Bb12 obtained by
SDS-PAGE using 10 % acrylamide gel.
The band corresponding to the molecular weight (MW) of 75 kDa was shown only
by B. lactis Bb12. While, a common band with MW of 34 kDa was found to be
characteristic to the isolates RBL81, RBL82, and RBL64. Bands with high MW (>45 kDa)
89
and weak MW (<31 kDa) allowing discrimination between B. lactis Bb12 and isolates
tested were also observed. More proteins and peptides appear to be biosynthesized by B.
lactis Bb12 compared to other bifidobacterial strains. However, as can be seen in the
Figure 3.1, peptides seem to be produced in quantities non detectable by blue coomassie
staining compared to proteins. Marasco et al. (1984) reported that bacteria elaborate in very
low concentrations numerous peptides of similar composition, which may differ markedly
in their specific biological activities. The differences observed in protein and peptides
profile of bifidobacteria should be attributed to the variability and diversity of strain
proteome. Champomier-Verges et al. (2002) mentioned that lactic acid bacteria strains
grown in the same rich synthetic MRS medium show some common (a dozen) proteins
which represent almost 20% of the total protein detected on the acidic proteomic map.
However, lactic acid bacteria indicating metabolic adaptation to media conditions show
some differences in protein content. Indeed, different stress treatments (e.g., heat, low pH,
osmotic shock, etc.) have been reported to induce transiently general and specific proteins
(e.g., heat shock proteins) by physiological changes enhancing bacterial ability to survive in
adverse environmental conditions (Ang et al., 1991; Prasad et al., 2003, De Angelis et al.,
2004).
3.5.2 Fractionation of cytoplasmic content into acidic and basic fractions
Peptides and proteins from B. lactis Bb12 were separated into different fractions by
liquid-phase isoelectric focusing. This preparative technique allowed separation of
amphoteric molecules such as proteins and peptides according to their isoelectric point (pI).
Charged molecules migrate through a pH gradient in an electric field and reach their
zwitterionic state at pH corresponding to their pI (Laas, 1998).
After isofocusing, the pH of the peptide and protein fractions was measured to
obtain the average pI for each fraction collected. The pH gradient generated by isofocusing
of the cytoplasmic peptides and proteins resulted in 20 fractions with average pI ranging
from 2 to 12. Bacterial peptides and proteins (i.e. Lactococcus lactis) have been reported to
be distributed in two groups, an acidic and a basic group (Champomier-Verges et al.,
2002). Because of the quantitative distribution of peptides fractions throughout the pH
90
gradient (Prioult et al., 2003), we pooled the peptide and protein fractions according to two
ranges of pH: pH 2-5 for acidic fraction (10 fractions) and pH 5-9 for basic fraction (10
fractions).
3.5.3 Characterization of cytoplasmic acidic and basic fractions
In order to separate several peptides and proteins with subtle differences in their
amino acid composition, the acidic and basic fractions were analysed individually by RPHPLC. The chromatogram of each fraction is shown in Figure 3.2 and Figure 3.3.
Chromatography system resulted in marked differences in retention time for several
peptides and proteins when applied to the column as a mixture. In both fractions, we
observed numerous peaks throughout the elution gradient indicating the presence of
heterogeneous group of peptides and proteins. However, most of materials that are eluted
earlier (5 to 10 mn) gave high absorbance (A210 > 1.0).
Relative absorbance (A214)
1,6
4
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
1
0,2
2
3
0
0
5
10
15
20
25
30
Retention tim e (m in)
Figure 3.2. Peptide and protein profile of acidic fraction (B. lactis Bb12) analysed by
RP-HPLC (C18 column). Labelled peaks are selected and collected using an
appropriated colum.
91
Relative absorbance (A214 )
1,6
1,4
23
1,2
1
4
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
5
10
15
20
25
30
Retention time (min)
Figure 3.3. Peptide and protein profile of basic fraction (B. lactis Bb12) analysed by
RP-HPLC (C18 column). Labelled peaks are selected and collected using an
appropriated colum.
The early peaks in the HPLC fractionation probably would correspond to the
peptides or proteins containing hydrophilic amino acids such as aspartic acid, serine,
glutamic acid, alanine, and glycine (Schiffmann et al., 1975). Furthermore, some peptides
or proteins could not easily be separated from others. Several minor peaks appear later (12
mn - 30 mn) in chromatogram indicating that more hydrophobic peptides and proteins
would be present in cytoplasm in minute concentration. These peptides could be formyl
methionyl peptides cleaved post-translationally from the NHs-terminal regions of newly
synthesized proteins.
The formyl methionine character of these peptides has been
suspected since a large number of bacteria were shown to elaborate similar substances
(Ward et al., 1968). It has been reported that both the biological activity of peptides and
their affinity for the peptide receptor increase as the hydrophobic character of the
constituent amino acids increases (Freer et al., 1982). However, complete characterization
of these peptides and proteins has been hampered by their weak concentrations.
Four peaks with high absorbance (major peaks) were selected in each fraction and
were collected individually by preparative HPLC to be analyzed by mass spectrometry and
92
tested for their bioactivity. Mass spectrometry analysis of labelled peaks in chromatograms
resulted in variable m/z corresponding to several components in each peak. Indeed, the
mass spectra (not shown) demonstrated more than one component when individual fraction
(labelled peak) was infused in spectrometry system. These results indicated partially
purified peptide or proteins. The extraneous peaks present in the total mass spectra of each
peptide or protein fraction (or labelled peak) are contaminants from other peaks due
presumably to the interaction of peptides and proteins with column or other factors.
Because of small quantities of HPLC-fractionated peptides and proteins selected, we were
not able to enhance purity of the materials by subsequent HPLC runs. Then, the data
analysis obtained for each labelled peak did not allow identification of peptide or protein
fractionated.
Moreover, the spectrometry data allow distinction between labelled peaks based on
the molecular weight of peptides or proteins previously fractionated. The average molecular
weight of the most abundant peptides or proteins fractionated are presented in Table 3.1.
The results indicated that peptides with molecular weigh ranging from 510.16 to 10048.03
Da are biosynthesized in B. lactis Bb12. These peptides were detected in both acidic and
basic fractions. Also, proteins with molecular weight higher than 13142.83 Da were shown
by mass spectra.
Table 3.1. Average molecular weight of most abundant peptides or proteins detected
in each labelled peak from acidic and basic fractions.
Peak 1
Peak 2
Peak 3
Peak 4
Acidic fraction
Average mass
S.D
510.16
00
10048.03
2.25
22450.60
4.63
13142.83
2.79
Basic fraction
Average mass
S.D
1187.24
0.08
13148.11
2.25
5.037.01
0.22
13556.74
3.58
In bacteria, most secreted proteins are synthesized as precursors containing the
mature protein and an N-terminal signal peptide that is an essential signature for protein
secretion. The signal peptide primary sequences are poorly conserved and show a common
tripartite structure including a positively charged N-terminus, a hydrophobic core and a
93
neutral or negatively charged C-terminus containing the signal peptide cleavage site (von
Heijne, 1990). Bacterial protein synthesis starts with a formylated methionine residue, and
this residue is sequentially cleaved away by a unique peptide deformylase and a methionine
aminopeptidase to generate mature proteins (Fu et al., 2003). Several bioactive formyl
oligopeptides were shown to be produced by different species of enteric bacteria (Hobson
et al., 1990).
3.5.4 Cell proliferation and cytokine production induced by semi purified
peptides and proteins
3.5.4.1 Effect on cell proliferation
The immunoactivity of semi-purified peptides and proteins from acidic and basic
fractions were assessed measuring splenocyte proliferation and hallmark Th1 and Th2
cytokines IFN-γ and IL-4 production in the presence of these peptides or proteins at
different concentrations in culture media. The cell proliferation was carried out with nonstimulated cells (in PHA-free media). Wells with PHA were used as positive control. The
stimulation index (SI) obtained by both acidic and basic are presented in Figure 3.4.
The results indicate that a cell proliferation stimulation was induced by cytoplasmic
peptides and proteins depending on fraction and concentration used. The acidic fraction is
shown to significantly stimulate (1,616 ± 0,08) splenocyte proliferation compared to the
nonstimulated cells (cells alone) when used at high concentration (100 µg/ml). The cell
proliferation induced by the acidic fraction was comparable with that obtained by PHA
(1,66 ± 0,20); the SI given by basic fraction was estimated at 1,3349 (± 0,02). High
stimulation of cell proliferation was obtained by cytoplasmic extract which showed a SI
increasing from 1,41 (± 0,15) to 2,96 ( ± 0,35) when the extract concentration in culture
media varied from 4 to 100 µg/ml respectively. Bacterial peptides and proteins (enzymes)
were reported to be immunomodulatory and to influence the specific and nonspecific
immune response (Houba et al., 1992; Dobrotina et al., 1992, Panaro and Mitolo, 1999).
94
3,5
d
A
Acidic fraction
Basic fraction
Cytoplasmic content
Cells+PHA(10 µg/ml)
Stimulation index
3
c
2,5
bc
2
1,5
ab ab
ab
a
ab
ab
a
ab
bc
a
1
0,5
0
0,4
4
40
PHAPH
100
Fraction (µg/ml)
3,5
B
Peak 1
Peak 2
Peak 3
Peak 4
Cells+PHA(10 µg/ml)
Stimulation index
3
2,5
c
2
1,5
c
bc
a
ab
a
1
a
a
ab
0,5
0
4
40
PHA
PHA
Peptides/Proteins (µg/ml)
Figure 3.4. Effect of (A) acidic and basic fractions and crude cytoplasmic extract, and
(B) semi purified peptides and proteins from B. lactis Bb12 on splenocyte
proliferation. The cytoplasmic preparation was normalized on the basis of its protein
content. Columns with different letters are significantly different.
These results are in accordance with those obtained in our previous study. Increased
cell proliferation induced by crude cytoplasmic extract could be explained by the presence
of synergistic components in cytoplasm of B. lactis Bb12. Indeed, Iliev et al. (2005)
demonstrated that chromosomal DNA motifs from Lactobacillus rhamnosus GG are active
95
in both murine and human immune cells. Nevermore, these results agree with those
recently reported by Lee et al. (2004) who mentioned that administration of cytoplasmic
fraction of Lactobacillus casei and Bifidobacterium longum to mice for 4 weeks enhanced
the number of total T cells, NK cells and MHC class II+ cells, and CD4-CD8+ T cells.
In order to compare the immunostimulatory effects of peptides and proteins in the
acidic fraction, we tested separately four majors peaks (labelled peaks) at concentrations of
4 and 40 µg/ml. Significant increased cell proliferation was induced by semi purified
peptides corresponding to peak 1 (1,50± 0,03) and peak 2 (1,68 ± 0,22) when used at 40
µg/ml. It has been reported that several peptides from bacteria are target of both T and B
cell responses and could be exploited for vaccine purposes (Chua-Intra et al., 1998; Hussain
et al., 2004). Peptides receptor such as formyl-peptide receptor (FPR) and its variant
FPRL1 (FPR-like 1) have been found to be expressed at high levels on human leucocytes
involved in inflammatory processes induced by bacteria (Le et al., 2002; Ernst et al., 2004).
The nature of amino acids was reported to influence the immunoactive properties of the
peptide or protein which contains them. For example, a D-methionine-containing peptide,
Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2, has been found to be a stronger activator of neutrophils
than f-Met-Leu-Phe.
D-isomers amino acid are used in protein synthesis only by
prokaryotes and then generate danger signals to the innate immune system (Svensson et al.,
2002).
The overall results suggest that the cytoplasmic peptides (and proteins) are
immunoactive components that contribute to immune stimulation induced by cytoplasm of
B. lactis B12. The differences in cell proliferation could be attributed to the difference in
nature or amino acid composition between peptide and protein from cytoplasm. The low
hydrophobicity of peptides and proteins tested does not appear to be a factor influencing
greatly the immune response. Vinderola et al. (2004) have investigated the relationship
between interaction sites in the gut, hydrophobicity, mucosal immunomodulating capacities
and cell wall protein profiles in lactobacilli, bifidobacteria and enterococci. They
mentioned that the highest interaction capacity with Peyer’s patches and nodules was
observed for enterococci, which presented the smallest hydrophobicity values. While,
96
bifidobacteria and actobacilli, which showed a lower interaction capacity with lymphoid
follicles, presented higher values of hydrophobicity.
3.5.4.2 Effect on cytokine production
To determine the effect of cytoplasmic peptides and proteins from B. lactis B12 on
cytokines secreted by activated lymphocytes, we analyzed the production of IFN-γ and
interleukin IL-4. It is well established now that Helper T cells (Th) are heterogeneous with
regard to cytokine secretion and their functions. Th1 cells produce mainly IL-2 and IFN-γ,
while Th2 cells predominantly produce IL-4 and IL-6. These two cytokines are shown to
have antagonistic functions (Yazdanbakhsh et al.,1999; Valentini et al., 2001).
The production of IFN-γ and IL-4 by splenocytes cultured with various
concentration of cytoplasmic extract, and the acidic and basic fractions is illustrated by
Figure 3.5 and Figure 3.6.
Acidic fraction
Basic fraction
Cytoplasmic content
Cells+PHA (10 µg/ml)
e
1400
1200
IFN-γ (pg/ml)
1000
d
cd
800
bc
600
400
200
ab
ab
ab
a ab
a a
a
0
0,4
4
40
100
PHA
Fraction (µmg/ml)
Figure 3.5.. Effect of acidic fraction, basic fraction, and crude cytoplasmic extract
from B. lactis Bb12 on splenocyte IFN-γ production. The cytoplasmic preparation was
normalized on the basis of its protein content. Columns with different letters are
significantly different.
97
16
e
14
de
12
IL-4 (pg/ml)
Acidic fraction
Basic fraction
Cytoplasmic content
Cells+PHA (10 µg/ml)
10
8
6
4
bc
c
abc
abc
abc
bc abc
2
cd
ab
ab
a
0
0,4
4
40
100
PHA alone
Fraction (µg/ml)
Figure 3.6. Effect of acidic and basic fraction, and crude cytoplasmic extract from the
strains B. lactis Bb12 on splenocyte IL-4 production. The cytoplasmic preparation was
normalized on the basis of its protein content. Columns with different letters are
significantly different.
According to these results, both crude cytoplasmic extract and basic fraction induce
a bell-shaped dose-response curve. As shown in Figure 3.5, splenocytes stimulated by
cyplasmic extract from B. lactis Bb12 secreted approximately twofold IFN-γ (1199,57
±127,60) higher than when stimulated by the basic fraction (578,55±195,16) and fourfold
when cultured with the acidic fraction (191,08±7,50 pg/ml). While, IFN-γ production
obtained with PHA was estimated at 127,10±101,50 pg/ml. Th1 cells appear to be more
stimulated by basic fraction compared to acidic fraction.
The results reported in Figure 3.6 demonstrate low IL-4 production compared to
those of IFN-γ obtained by cytoplasmic content, and both acidic and basic fractions. Hence,
Th2 cells seem to be weakly stimulated. The most significant production of IL-4 was
obtained by crude cytoplasmic extract (9,14±4,04) and basic fraction (4,14±2,02). While,
the production of IL-4 increased slightly upon treatment with acidic fraction (< 3,86 pg/ml).
98
Th1 lymphocytes stimulate cell-mediated immunity, which is characterized by intense
phagocytic activity. Conversely, Th2 cells stimulate humoral immunity, which is
characterized by high antibody production. Evidence suggested that coinduction of T2
immunity maintains immune homeostasis during T1-mediated defence reactions. Th1 cells
also stimulate moderate levels of antibody production, whereas Th2 cells actively suppress
phagocytosis (Spellberg and Edwards, 2001; Bot et al., 2004).
It has been demonstrated that synthetic peptides stimulate T cell chemotaxis
showing unique signalling and provide a helpful tool to understand the T cell activation
mechanism (Zachariae et al., 1992; Kim et al., 2001). The synthetic peptides were shown to
stimulate the formation of inositol phosphates in lymphocyte cells (Baek et al., 1996).
Wang et al. (2004) reported that a fungal immunomodulatory protein from Flammulina
velutipes (FIP-fve) exhibited potent mitogenic effects on human peripheral blood
lymphocytes, inducing G1/G0 to S phase proliferation. The activation of T cells resulted in
significant production and secretion of IFN-γ associated with intercellular adhesion
molecule 1 expression but low detectable levels of interleukin-4 in vitro or in vivo.
3.6 Conclusion
These results obtained confirmed previous observations that cytoplasm from B.
lactis Bb12 stimulate the cell proliferation and cytokines production in mouse splenocytes.
In this study, we have demonstrated that B. lactis Bb12 cytoplasm contains an
heterogeneous group of peptides and proteins characterized by a wide range of isoelectic
pH and molecular weight. The cytoplasmic peptides and proteins were found to have low
hydrophobicity, and to be heat-stable and immunostimulatory. The acidic fraction (100
µg/ml) stimulated cell proliferation (SI= 1,616 ± 0,085), whereas the basic fraction induced
more IFN-γ secretion (578,55±195,16 pg/ml). The most significant immunostimulation
(SI= 2,96 ± 0,35) was obtained by cytoplasmic content suggesting that the cytoplasm
contains a components acting synergistically with immunostimulatory peptides or proteins.
However, IL-4 secreted by lymphocytes stimulated by cytoplasmic content, and both acidic
and basic fractions, was slightly increased. Further studies could be performed to improve
separation of peptides and/or protein using ionic exchange chromatography, and to identify
99
these components by sequencing method. Furthermore, nonlabelled peaks showing high
hydrophobicity could be explored for their mitogenicity producing high quantities of
material in optimized conditions.
Evidence demonstrates that peptides and proteins derived from B. lactis Bb12
cytoplasm could be delivered in intestinal environment and activate the immunocompetent
cells of the mucosal immune system. The potent immunostimulating effect of cytoplasm
could suggest the possibility of use of bifidobacaterial extract as nutraceutical products.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from FCAR, NOVALAIT, MAPAQ and
NSERC. T. Amrouche was recipient of scholarships from the World Bank. We thank
ADVITEC team mainly S. Gauthier and N. Attouri for their contribution.
Chapitre IV: Production et caractérisation d’anticorps
monoclonaux anti-bifidobactéries et leur application
dans le développement d’une méthode de détection en
immuno-culture. Production and characterization of
anti-bifidobacteria monoclonal antibodies and their
application in the development of an immuno-culture
detection method
T. Amrouche a,b,c, Y. Boutin b,d, O. Moroni a,b, E. Kheadr a,e, and I. Fliss a,b*
a
Dairy Research Center STELA, Pavillon Paul-Comtois, Université Laval,
Québec (Qc) G1K 7P4,
b
Institute of Nutraceutical and Functional Foods INAF, Université Laval,
Québec (Qc) G1K 7P4,
c
Department of Food Technology, Faculty of Agronomy and Biological Sciences,
University of Tizi-Wezzu, Algeria,
d
TransBiotech, CEGEP Lévis Lauzon, Lévis (Qc) G6V 9V6,
e
Department of Dairy Science and Technology, Faculty of Agriculture, University of
Alexandria, Alexandria, Egypt.
Journal of Microbiological Methods: sous presse
101
Les travaux rapportés dans ce chapitre représentent la continuité de ceux présentés
au premier chapitre et qui démontrent la mitogénicité de la paroi des bifidobactéries.
L’objectif visé par ce chapitre est de produire et caractériser des anticorps monoclonaux
spécifiques aux bifidobactéries afin de développer une méthode de détection et de
quantification des bifidobactéries dans les aliments et l’environnement. Des souches
standard ATCC de bifidobactéries d’origine humaine et animale ont été utilisées.
4.1 Résumé
Les bifidobactéries, très connues pour leur potentiel probiotique, sont de plus en
plus utilisées dans l’industrie alimentaire. Cependant, l’un des problèmes liés à leur
utilisation est la détection et l’identification des espèces de bifidobactéries qui survivent
dans les produits alimentaires. Cette étude a pour but de développer un anticorps
monoclonal permettant de détecter spécifiquement les bifidobactéries vivantes dans les
aliments. Dans une étude antérieure on a isolé localement des souches de bifidobactéries et
clairement démontré le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries. Lors de la
présente étude, des protéines de paroi ont été utilisées comme antigènes de surface pour
produire des anticorps monoclonaux contre les bactéries du genre Bifidobacterium. Les
protéines ont été extraites et purifiées à partir de six espèces différentes de bifidobactérie
(B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) cultivées sur
milieu MRS en anaérobiose. L’analyse par SDS-PAGE des extraits protéiques obtenus a
révélé des différences au niveau du profil protéique des parois isolées. Cependant, des
bandes similaires (58 et 34 kDa) indiquant probablement des protéines communes aux
espèces étudiées ont été identifiées. Testées pour immunogénicité, les protéines pariétales
issues de B. bifidum et B. longum ont généré une plus forte production d’immunoglobulines
spécifiques (titre en anticorps de 53333) chez la souris Balb/C. Des anticorps monoclonaux
spécifiques aux bifidobactéries ont été ensuite produits par fusion cellulaire. Les clones
sélectionnés pour leur forte production d’IgG (anti-B. longum) ont montré une réactivité
croisée avec l’ensemble des espèces de bifidobactérie indiquant une forte homologie entre
les différentes espèces. L’antigénicité partagée par les bifidobactéries a été confirmée par le
western-blot révélant un épitope (segment protéique) supporté par une protéine commune
(58 kDa) et reconnu par l’anticorps anti- B. longum. En outre, la spécificité de cet anticorps
102
a été déterminée en le testant sur d’autres bactéries (Propionibacterium freudenreichii,
Pediococcus acidilacticii, Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus faecium et
Listeria innocua) répondant négativement au test. A l’exception de Lactobacillus
rhamnosus qui a donné un signal relativement élevé indiquant une similitude antigénique
avec les bifidobactéries. Par ailleurs, une observation au microscope électronique après un
traitement immunochimique des bifidobactéries
a montré clairement l’interaction
anticorps-antigène bactérien. La sensibilité de l’anticorps produit a été estimée à 10 (5)
cfu/ml. L’anticorps ainsi développé a montré son efficacité dans la détection des
bifidobactéries vivantes par des tests d’immuno-culture et laisse suggérer une possibilité de
son utilisation dans la quantification de ces bactéries dans divers aliments et matrices.
Mots clés : Anticorps monoclonaux, Bifidobactéries, Immuno-culture,
Protéines
pariétales, Quantification.
4.2 Abstract
An immuno-culture method has been developed by combination of specific
monoclonal antibodies and plate culture to allow detection of viable bifidobacteria. Cell
wall proteins were selected as surface antigen to produce antibodies against bifidobacteria.
The cell wall proteins were extracted and purified from six ATCC strains of bifidobacteria
grown in MRS broth using an anaerobic system. To compare the profile of the protein
extracts, all the protein solutions obtained were analyzed by SDS-PAGE. Similar bands
corresponding to the major proteins of each species of bifidobacteria were observed. The
proteins were tested for their immunogenicity in Balb/c mice after immunization and
subsequent analysis using ELISA procedures. Profound immune responses were generated
in mice immunized by proteins from Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium longum.
Monoclonal antibodies were produced against B. longum and tested for their specificity,
sensitivity and cross reactivity with other bifidobacteria species. All the hybridoma cells
selected produced anti-B. longum antibodies cross reacting with native and purified
proteins from five other bifidobacteria species. An epitope supported by a cross-reacting
protein of 58 kDa shared by bifidobacteria was revealed by western blot. This was
confirmed by immune-transmission electron microscopy observations which showed the
103
specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins. Also, the
antibody obtained was found to be specific for the genus Bifidobacterium and sensitive,
allowing the detection of at least 105 target cells/ml. An immuno-culture detection approach
was then developed using the selected anti-B. longum antibodies. This method was shown
to be very efficient for the detection of viable cells of bifidobacteria suggesting the
possibility of its use to quantify this bacteria in various food products and matrices.
Key words: Bifidobacteria, cell wall proteins, monoclonal antibodies, immuno-culture,
quantification.
4.3 Introduction
Bifidobacteria were reported to be the main genus in the gut bacterial population of
infants (Ouwehand et al., 2004). These bacteria are considered essential for maintaining a
healthy equilibrium between the population of beneficial and potentially harmful microorganisms in the gastrointestinal tract (Fuller, 1989, Postnikova et al., 2004). The health
and nutritional benefits attributed to bifidobacteria include maintenance of a healthy
intestinal microflora, improvement of lactose digestibility and tolerance, antitumor activity,
reduction of serum cholesterol levels, synthesis of vitamins, and increasing immunity in
host animals (Noda et al., 1994; Jiang et al., 1996; Pereira and Gibson, 2002; You et al.,
2004; Vinderola et al., 2004).
Therefore, there is an increasing interest in using these bacteria as probiotics, either
in fermented dairy products or formulated as tablets. Indeed, several bifidobacteriacontaining products such as yogurt, fermented milk and health foods are currently sold in
the world particularly in USA, Japan and Europe (Mercenier et al., 2002). Unfortunately,
numerous probiotic products are incorrectly labeled and yielded low bacterial counts, which
may decrease their probiotic potential (Drouault et al., 1999; Bunthof et al., 2001).
Accurate identification of bifidobacterial strains in products must then be implemented so
that consumers can be reliably informed of the content of probiotic products (Tannock,
1999). The use of a microscopic technique is a more direct approach; however, this
104
approach does not allow a differentiation of live and dead bacteria. Auty et al. (2001)
assessed the viability of the human probiotic strains Lactobacillus paracasei NFBC 338
and Bifidobacterium sp. strain UCC 35612 in reconstituted skim milk by confocal scanning
laser microscopy using the LIVE/DEAD BacLight viability stain. However, the viability
staining was limited by environmental factors such as pH, ionic profile, and water activity.
Currently, the approach used to analyze probiotic products is still based on culturedependent methods using specific isolation media and allowing identification of a limited
number of isolates. These methods are relatively insensitive, laborious, and timeconsuming. The detection or enumeration of surviving bifidobacteria in some products such
as yogurts, cheese, butter, and tissues has been most difficult because of lack of a truly
selective medium which can discriminate between the genus Bifidobacterium and other
genera (Lim et al., 1995; Roy, 2001).
However, in the last few years numerous culture-independent approaches based on
molecular methods have emerged for the identification and a rapid detection of
bifidobacteria in mixed probiotic cultures (Matsuki et al., 2004; Takada et al., 2004). This
approach involved extraction of total bacterial DNA directly from the product, polymerase
chain reaction (PCR) amplification of 16S ribosomal DNA, and separation of the amplicons
on a denaturing gradient gel. These methods allowed direct identification of the amplicons
at the species level (Temmerman et al., 2003, Fasoli et al., 2003). For example, culture
independent fluorescent in situ hybridization (FISH) technique, and PCR were recently
used to analyze the development of intestinal flora in infants, and bifidobacteria in human
feces. These methods offer several advantages over cultural methods in terms of sensitivity
and specificity (Kok et al., 1996; Harmsen et al., 2000; Takada et al., 2004). However, the
molecular methods reported are not able to distinguish between dead and live bifidobacteria
in probiotic products.
Comprehensive studies should be initiated to develop new methods able to detect
and quantify viable bifidobacteria in fermented products. The development of antibodies
against a specific cell compound could provide an attractive and reliable method for
detecting micro-organisms in biological samples (Porsch-Ozcurumez et al., 2004).
105
Bacterial-detection immunoassays (ELISA, immunobloting, etc…) and immunomagnetic
separation offer several advantages compared to conventional cultural methods: easy to use,
inexpensive, specific to the target host, and rapid (Varadaraj, 1993).
However, newly prepared antibodies are not tested for their reaction towards live
cells to determine their affinity to viable bacteria (Brovko et al., 2004). A method based on
a combination of semiselective cultivation and colony immunoblotting techniques allowing
simple and quantitative detection of Bifidobacterium animalis strains in human feces has
been developed by Duez et al. (2000) using rabbit polyclonal antibodies. However, the
polyclonal antibodies produced were specific to strains belonging to B. animalis, thus it can
not be used to detect other bifidobacteria i.e. the species or strains most frequently found in
commercial fermented products. Specific monoclonal antibodies allowing the detection of
viable bifidobacterial species and strains in biological media and food products are not
available yet.
The overall aim of this study was to produce and characterize different monoclonal
antibodies against different species of bifidobacteria and to evaluate their effectiveness in
developing a new immuno-culture approach allowing the detection and quantification of
various viable bifidobacteria.
4.4 Material and methods
4.4.1 Bacterial strains and culture conditions
B. animalis ATCC 27536, B. breve ATCC 15700, B. longum ATCC 15708, B.
infantis ATCC 15697, B. bifidum ATCC 15696 and B. pseudolongum ATCC 25526 were
obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Cells were
grown in 300 ml of de Man-Rogosa-Sharpe broth (MRS) (Rosell Institute Inc., Montreal,
PQ, Canada) supplemented with 0.05 % cysteine-HCl (vol/vol) to lower the oxidationreduction potential of the medium and to enhance the anaerobic growth of bifidobacteria
(Sreekumar and Hosono, 1998). Tween 80 was added to the final concentration of 1%
(vol/vol). The incubation of each culture was carried out overnight at 37°C in anaerobic jar
106
containing carbon dioxide generating sachet (AnaeroGen, Oxoid Ltd., Basingstoke,
England).
4.4.2 Protein extraction and purification
The cells were harvested from MRS broth by centrifugation at 5,500 g for 10 min
and washed in 100 ml of phosphate buffered saline (PBS, 0.01M, pH 7.4) to be finally resuspended in 150 ml deionised water. The cells were disturbed mechanically by dynamic
high pressure using High-Pressure Homogenizer (Avestin, Ottawa, ON, Canada). The
suspension was treated five times at 200 Megapascal (MPa) to obtain a maximal cellular
lysis. The suspension was centrifuged three times at 30,000 g for 30 min. The supernatant
was removed and pellets washed with PBS between centrifugations. The pellets containing
cell wall were suspended together in water at the final volume of 1 ml. Sodium dodecyl
sulfate (SDS) was added to the samples at final concentration 20% (wt/vol) and they were
heated at 100°C for 10 min to precipitate other portions of cellular wall away from the
proteins. The proteins were separated by centrifugation at 15,800 g for 25 min. The residual
SDS was removed by maintaining the protein solution overnight at 4°C and then,
centrifuged at 15800 g for 25 min.
The protein concentration of all samples was determined by Lowry method (1951)
using bovine serum albumin (BSA) (Sigma, MO, USA) as standard. The cell wall protein
profile of each bifidobacterial strain was obtained by 10% polyacrylamide gel
electrophoresis (PAGE) performed in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS)
according to Laemmli (1970). Molecular markers (Bio-Rad Laboratories, Hercule CA,
USA) with molecular mass ranging from 21.5 to 97.5 kDa were used to compare the
molecular weight of cell wall proteins.
4.4.3 Immunization of mice and evaluation of specific antibody
production
Six to eight week-old male Balb/c (Charles Rivers, St. Constant, Quebec, Canada)
mice were immunized with cell wall proteins. In brief, 100 µl of protein solution (1 mg/ml)
107
were emulsified in an equal volume of complete Freund adjuvant (Eskenasy, 1968) for the
first injection and incomplete Freund adjuvant for the subsequent injections. The
immunization protocol consisted of four subcutaneous injections of 100 µl emulsion
(protein plus adjuvant) at three-week interval. Serum samples were obtained just before the
first immunization by retro-orbital sinus method to be used as negative control in specific
antibody evaluation. Serum samples were also obtained ten days after each antigen
injection and subsequently analyzed separately.
All sera were analyzed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
procedures to determine specific antibody titer. Briefly, wells of flat-bottomed, polystyrene
plates (Immulon II, Dynatech Laboratories, Alexandria, VA, USA) were coated overnight
at 4°C with a solution (100 µl/well) containing cell wall proteins at optimal concentration
of 1 µg/ml in 0.05 M sodium carbonate buffer (pH 9.6). Microplates were washed twice
with 200 µl Tris-buffered saline (TBS 1X, pH 7.5) - 0.1% (vol/vol) Tween 20 with an
automated ELISA plate washer (Dynex, Chantilly, VA, USA) and then blocked for 1 h at
25°C with PBS – 1% (vol/vol) blocking reagent (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim,
Germany). All serum samples were initially diluted 1/100 in PBS – containing 0.5%
(vol/vol) blocking reagent. If positive, sera were tested at higher dilutions: 1/1000, 1/2000,
1/4000, 1/8000, 1/16000, 1/32000, 1/64000, 1/128000 as needed to determine the antibody
titer. After four washes with TBS–0.1% Tween 20, 100 µl of sample were added in
duplicate in wells and incubated at 37°C for 2 h. Wells were then washed and horseradish
peroxidase-conjugated anti-mouse IgG and IgM (KPL, Maryland, USA) diluted to 1:1000
in PBS – 0.5% BR were added to each well (100 µl/well). Wells incubated with sera
collected before the first antigen injection were used as negative control. The wells were
washed six times with TBS- 0.1% Tween 20 and added with 100 µl of
orthophenylenediamine solution (Sigma, Saint Louis, MO) at 0.4 mg/ml of 0.05 M
phosphate-citrate buffer (pH 5.0) as substrate. The absorbance was measured at 450 nm on
an ELISA plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
108
4.4.4 Monoclonal antibody (Mab) production
Prior to cell fusion, mouse with the highest antibody titer was boosted with 50 µg of
cell wall proteins from B. longum ATCC 15708 without adjuvant for three days
successively. The mouse was then sacrificed by cervical dislocation and splenectomised.
Spleens were removed aseptically from euthanized Balb/C mice and single cell suspensions
were prepared by mechanically disrupting the tissues through a sterile nylon cloth sieve
(100 µm pore size) into Iscove Modified Dulbecco’s media (IMDM) containing
penicillin/streptomycin (1 % vol/vol). The splenocytes were fused with SP2/O-Ag14 mouse
myeloma cells using polyethylene glycol. The fused cells were suspended in IMDM added
with 20% (vol/vol) fetal calf serum, antibiotics and hypoxanthine-aminopterin-thymidine
(HAT). The suspension was dispensed (200 µl/well) into 96-well microplates (Costar,
Cambridge, MA, USA). The microplates were incubated at 37°C in the presence of 4.5%
CO2 for 12 days. In order to screen cultures for antibodies production, 100 µl of culture
supernatant were added to wells of 96-well Immulon II microplates previously coated with
cell wall proteins. The supernatants were also tested on bacterial cells to evaluate the ability
of antibodies to detect bifidobacteria. Briefly, suspension of each bifidobacterial strain was
prepared in PBS (O.D 650 nm = 0.1) and added (100 µl) to wells and centrifuged at 2800 rpm
for 5 min. The cells (pellet) were then immobilized by glutaraldehyde (0.25%, vol/vol) for
15 min at room temperature. The plates were washed and blocked with PBS - 3% (vol/vol)
BSA for 1 hour at 37°C. The ELISA test was completed as described above. Hybridomas
from cultures showing significant antibody production were selected and cloned by limiting
dilution culture.
4.4.5 Purification and isotyping of monoclonal antibody
The supernatants from the selected clones were filtered (0.45 µm) and purified by
affinity chromatography using ImmunoRPure (A/G) IgG Purification Kit (Pierce, Rockford,
IL, USA). The antibodies were eluted using 0.1 M glycine solution (pH 2.5) and harvested
in 1 M K2HPO4 solution (pH 9.5). The antibody solution was dialyzed and concentrated in
PBS by centrifugation using centricon (30,000 Da). The concentrate was aliquoted and
stored at –20°C. The isotype of antibodies from different supernatants was determined
109
using Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche Molecular Biochemicals,
Indianapolis, USA).
4.4.6 Determination of cross reactivity by western blot
To further asses the cross reactivity between bifidobacterial strains, a western blot
analysis was performed using one of the anti-B. longum monoclonal antibodies. Briefly, the
protein solutions were applied to a 10% SDS-polyacrylamide gel to separate proteins. After
electrophoresis, the proteins were transferred in a Immun-Blot PVDF membrane (Bio-Rad
Laboratories) at 100 V for 1 h. The membrane was blocked with 3% (vol/vol) BSA for 1 h
and reacted with diluted anti-B. longum (0.06 µg/ml) for 2 h. The membrane was washed
and incubated for 1 h with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG + IgM
diluted 1:1000. After washing, the substrate (3,3`-Diaminobenzidine tetrahydrochloride,
Sigma) was added.
4.4.7 Antibody specificity test
The specificity of the Mab produced was determined by ELISA comparing the
reactivity of the antibody between the different strains of bifidobacteria and nonbifidobacterial species which can be present in foods or tissues: Propionibacterium
freudenreichii P36, Pediococcus acidilacticii R1001, Lactobacillus rhamnosus R0011,
Lactococcus lactis subsp lactis R0058 and Enterococcus faecium R0026 were obtained
from Rosell Institute Inc. Listeria innocua HPB13 was obtained from Health Protection
Branch (Health and Welfare Canada, Ottawa, ON, Canada). The bacteria were immobilized
using glutaraldehyde according to the procedure mentioned above.
4.4.8 Sensitivity test
Bifidobacterial cells from an overnight culture were enumerated on agar media and
diluted at 108 cfu/ml in PBS 1X. Serial dilutions from 108 to 103 cfu/ml were prepared to be
added at 100 µl/well in 96-well plates (Immulon II) and immobilized by gluataraldehyde as
described above. ELISA was carried out using purified antibody (anti-B. longum) at
optimal concentration of 0.5 µg/ml.
110
4.4.9 Immune-Transmission electron microscopy (TEM)
Cells from 18 h MRS culture of B. longum ATCC 15708 were washed and
encapsulated in 3% (wt/vol) agarose. Cubes of agarose (0.8 to 1.0 mm) were fixed
overnight at 4°C in 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH
7.2). After being washed four more times with sodium cacodylate buffer, the samples were
dehydrated in a graded ethanol series, embedded in Quetol (Marivac, Halifax, NS, Canada),
and polymerized at 55°C overnight (Abad et al. 1987). Ultrathin sections (0.1 µm) of
samples were cut with an ultramicrotome (Reichert-Jung, Vienna, Austria) and collected on
Formvar-coated nickel grids (JBEM, Dorval, PQ, Canada). For the immunological reaction,
the grids were incubated at 37°C for 1 h in 0.3% (wt/vol) BSA and washed with PBS. The
grids were then incubated at 37°C for 1 h with Mab anti-B. longum (5 µg protein /ml). The
grids were then washed five times (10 min each) in PBS. Gold labeling was carried out by
incubating the grids for 15 min at room temperature with protein A-colloidal gold (10 nm
in diameter; Sigma) diluted 1/10 in PBS containing 0.2% (wt/vol) polyethylene glycol 8000
(Sigma). The grids were washed again six times, dried, stained with uranyl acetate and lead
citrate, and examined with a JEOL 1200 EX transmission electron microscope (Tokyo,
Japan) at 80 kV. Eight to twelve fields from five to seven ultrathin sections resulting from
four grids were examined, and photographs were taken through the observed grids.
4.4.10 Detection of bifidobacteria using an Immuno-culture (IC) method
An original approach using a combination of the anti-B. longum Mab and a selective
culture medium was developed for the specific detection of strains belonging to the genus
Bifidobacterium (genera). To perform this test, anti-B. longum monoclonal antibodies were
diluted in PBS to final concentration of 2.5 and 1.5 µg/ml and immobilized on multiwell
TM 6-well (Falcon-BD, NJ, USA) plate directly or via protein A. In the last case, protein A
was added to microplate wells at a concentration of 10 µg/ml prior to the addition of anti-B.
longum Mab. Wells were then washed three times with PBS (1ml/well) and blocked with 1
ml of 0.3% (wt/vol) BSA solution at 37oC for 1h. Wells were washed three times with PBS
and then 800 µl of B. longum culture was added at different concentrations. Plates were
incubated at 37oC for 2h, before wells were washed four times with PBS. Three ml of
MRS-agar supplemented with 0.05, (wt/vol) of L-cysteine were poured into each well and
111
plates were incubated again at 37oC for 24 to 48 h before bifidobacteria colonies were
counted.
4.5 Results and discussion
To develop an Mab able to be used as molecular tool to detect specifically
bifidobacteria species in foods and environment, the cell wall proteins of bifidobacteria
were selected as antigens for the present study. These cell components are more
advantageous because they should be detected on surface of whole cells. Also, the cell wall
proteins should have several amino-acid sequences common to the bifidobacterial strains.
However, the composition and the conformation of these proteins are not known. These
antigens were purified, analyzed and tested for their immunogenicity by immunization of
mice. The profiles of cell wall proteins from six species of bifidobacteria used in this study
are represented in Figure 4.1. Major proteins with similar molecular weight around 58, 48,
37 and 34 kDa were visualized after coomassie blue coloration in each strain. The similar
bands indicate the probable common proteins shared by the species of bifidobacteria
studied.
kDa
M
gum
n
lis e
o
s
l
a
um o
m
um t i
ani . brev. long . infan. bifid pseud
.
B
B B
B
B B.
97,5
66
45
31
21,5
Figure 4.1. SDS-PAGE of cell wall proteins from six bifidobacteria strains carried out
with 10 % acrylamide gel.
However, other bands showing difference between bifidobacteria were also
observed. Indeed, the proteins from B. animalis ATCC 27536, B. breve ATCC 15700 and
112
B. longum ATCC 15708 show some difference with those from B. infantis ATCC 15697, B.
bifidum ATCC 15696 and B. pseudolongum ATCC 25526. B. animalis ATCC 27536, B.
breve ATCC 15700 and B. longum ATCC 15708 show similar profiles, with major bands
of 59, 48, 37 34 and 25 kDa. Whereas, B. infantis has an electrophoretic profile different
from the other with a major band of 83 kDa. Protein profiles of B. bifidum and B.
pseudolongum are similar but different from the other species.
No earlier studies have reported characterization of cell wall proteins from
bifidobacteria with antibodies. To study the immunogenicity of proteins used for
immunization, antibody titers in sera were evaluated by ELISA after the mice received four
injections of the same antigen. The antibody titer is defined by the dilution giving twice the
signal (OD450 nm) compared to the serum from a non immunized mouse. The variations of
polyclonal antibody generation are shown in Figure 4.2. Sera of mice receiving cell wall
proteins from bifidobacteria strains showed an antibody titer increasing with protein
administration (data not shown). The maximal antibody titers ranging from 6666 to 53333
were obtained after three or four immunizations of mice by proteins.
However, significant differences in antibody responses against the proteins were
observed in mice. Indeed, optimal antibody titers were observed with mice immunized by
proteins from B. longum ATCC 15708 and B. bifidum ATCC 15696. In contrast, the cell
wall proteins from B. animalis ATCC 27536 generated the lowest antibody production in
mice (6666). Our results are not in accordance with those reported by Duez et al. (2000)
revealing high immunogenic protein in cell wall of B. animalis strain DN-173 010. They
demonstrated that a protein of about 45 kDa was detected by specific rabbit polyclonal
antibodies at 1: 64,000 dilution of the serum. The contrasting results on the generated
antibodies capacity against proteins tested could depend on several factors including
variations in composition and/or structure of proteins administrated, purity of protein and
immunization procedure and genetic characteristics of mice. The results obtained are in
accordance to those reported by Magnarelli et al. (2002). These authors observed a cross
reactivity between human sera and several antigens (membrane protein) from Borrelia
113
burgdorferi. Regardless of the antibody levels obtained, the proteins used in our study were
able to induce a significant immune response.
80000
70000
Antibody titer
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
B.
ma
a ni
lis
B
e
. br
ve
B.
gu
l on
m
B.
an
i nf
ti s
B
f
. bi
i du
m
ps
B.
eu
on
dol
gum
Bifidobacteria
Figure 4.2. Antibody level of mice immunized by cell wall proteins from six
bifidobacterial species. The averages presented were calculated from values
corresponding to the three mice receiving the same antigen.
To further study the reactivity between polyclonal antibody produced and the
native total protein exposed on cell surfaces of bifidobacteria, sera raised against purified
proteins were tested on all bifidobacteria used in this study. All the sera obtained in 9
weeks were tested against cell wall proteins and whole cells of six bifidobacteria
immobilized by glutaraldehyde (data not shown). The sera showed a high reactivity with
bifidobacteria species tested compared to the negative control (non immunized mouse).
They gave similar or high signals with purified proteins suggesting the exposure of the
proteins on cell surface of bifidobacteria. According to Li and Magee (1993), the antibodies
react strongly with purified antigen but weakly with native total protein antigen. In
addition, the sera cross reacted with all bifidobacteria used due probably to the common
proteins mentioned above.
As mice immunized with proteins from B. longum ATCC 15708 and B. bifidum
ATCC 15696 gave the highest antibody levels, they were selected to produce monoclonal
114
antibodies. Twenty two clones selected for their significant antibody production compared
to the positive control (sera from immunized mice) were tested for their cross reactivity
with the cell wall protein of bifidobacteria. Interestingly, all supernatants tested reacted
with the proteins from the six bifidobacteria species. These results confirm the cross
reactivity observed previously with polyclonal antibodies. In order to produce a Mab that
will recognize most members of the bifidobacterial genus, only one clone producing
antibody potentially specific for B. longum ATCC 15708 was selected and used in our
study. This clone was found to produce an antibody cross-reacting with all bifidobacteria
used. Indeed, when tested on bacterial cells immobilized by glutaraldehyde it recognized
the bifidobacterial species as well as observed in sera from mice immunized (data not
shown).
The isotype of the monoclonal antibody obtained was found to be Ig G2bκ or Ig
Mκ. A western blot was done to determine if the cell wall protein detected by SDS-PAGE
matched the cross reacting protein found in ELISA assays. Western blotting carried out
using cell wall proteins (Figure 4.3) validate the ELISA results mentioned above and
revealed one cross reacting protein at a mass of approximately 58 kDa.
an
B.
im
s
a li
d
um
tis
um
e v e lo n g in fa n b ifid p se u
r
b
.
.
.
B
B
B
B.
B.
n
o lo
gu
m
kDa
97,5
58 kDa
66
45
31
21,5
Figure 4.3. Western blot carried out with protein solution from bifidobacteria using
purified monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 at concentration of 0.06
µg/ml. The proteins were separated on acrylamide (10%) gel and transferred in PVDF
membrane.
Presence of a common epitope in bifodobacterial species indicate antigenic
similarities between different species tested. The same results were obtained by the cells of
115
bifidobacteria (data not shown) suggesting the ability of the antibody to bind its targeted
protein on the cell wall. A reasonable explanation of results is that the monoclonal antibody
produced was raised against an epitope inherent in the common protein (58 kDa) shown by
SDS-PAGE analysis. On the other hand, B. longum cells were observed by TEM after
immunochemical treatment. Figure 4.4 indicated that the monoclonal antibody is fixed on
cells of bifidobacteria compared to the negative control.
a
b
Figure 4.4. Bifidobacterium longum cells bounded by the monoclonal antibody
produced against B. longum ATCC 15708 shown by transmission electronic
microscopy: (a) negative control (treatment without antibody), (b) treatment with
antibody. Bar indicate 200 nm.
In order to determine the specificity of the Mab, the reactivity of the antibody was
tested comparatively against bifidobacteria species and other bacteria: Propionibacterium
freudenreichii P36, Pediococcus acidilacticii R1001, Lactobacillus rhamnosus R0011,
Lactococcus lactis subsplactis R0058, Enterococcus faecium R0026 and Listeria innocua
(strain number). The comparison of the reactivity of Mab between bifidobacteria and other
bacteria immobilized by glutaraldehyde is given in Figure 4.5 a,b. The results show a
distinction between bifidobacteria and other bacteria according to signals obtained by cells
116
immobilized (OD650 nm = 0.1) and Mab (0.5 µg/ml). Compared to bifidobacteria, Listeria
innocua like Propionibacterium freudenreichii P36, Pediococcus acidilacticii R1001,
Lactococcus lactis subsp lactis R0058, Enterococcus faecium R0026 shown insignificant
signal.
a
0,8
0,7
O.D
O.D (450nm)
(450 nm)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
B
im
. an
as
ali
B
ng
. lo
b
um
B
e
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vec
B
fa
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d
s
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B
f id
. bi
Bifidobacteria
b
ume
ps
B.
eud
ng
olo
umf
C
ro
ont
l (+
)
0,8
O.D
(450 nm)
O.D (450nm)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
P
e
. fr
ud
e
e
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ii
P.
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E.
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iu m
ua
(+ )
oc
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n
r
t
n
n
L. i
Co
Other species
Figure 4.5. Specificity of monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 tested
against cells (OD650 nm = 0.1) from (a) Bifidobacterium genera and (b) other species of
bacteria at concentration of 0.5 µg/ml. Control (+), supernatant from clone culture
tested for anti-B. longum production.
The bifidobacterial species showed high signals compared to other bacterial species;
this result indicate revealed the specificity of the antibody produced to bifidobacteria tested.
However, Lactobacillus rhamnosus R0011 was found to give signals nearly similar to those
117
shown by the bifidobacteria suggesting antigenic similarities between the two bacterial
genera. According to Orla-Jensen (1924), bifidobacteria were first grouped in the genus
Bacillus and then the genus Bifidobacterium was proposed in the 1920’s. However, there
was not a taxonomic consensus for this new genus and it was classified in the genus
Lactobacillus, due to their rod-like shapes and obligate fermentative characteristics. The
Bifidobacterium genus was characterized by a unique hexose metabolism that occurs via a
phosphoketolase (Fructose-6-phosphate phosphoketolase or F6PPK) pathway often termed
the ‘bifid shunt’s (Grill et al., 1995). These results suggested that the bacteria not belonging
to bifidobacteria genus are not recognized by the antibody anti-B. longum ATCC 15708,
probably because of the difference in the characteristics of protein surface. These results
agree with those reported by Bolin et al. (1995) demonstrating the high specificity of
monoclonal antibodies raised against membrane preparations of Helicobater pylori. To
study the effect of the concentration of the Mab on the signal intensity distinguishing
between bifidobacteria and other bacterial species, a serial dilution of the Mab ranging from
0.5 to 0.00005 µg/ml was carried out and tested comparatively on bifidobacteria,
Lactobacillus rhamnosus and Listeria innocua. According to the results shown in Figure
4.6, the signal decreased significantly when the Mab concentration diminished from 0.5 to
O.D
nm)
O.D(450
(450 nm)
0.05 µg/ml giving an optimal signal for all the bifidobacterial species.
0,8
B. animalis
0,7
B. breve
0,6
B. longum
0,5
B. infantis
0,4
B. bifidum
0,3
B. pseudolongum
0,2
L. rhamnosus
0,1
Listeria innocua
0
5
0,5
Anti- B. longum (µg/ml )
0,05
0,005 0,0005 0,00005
Figure 4.6. Variation of the reactivity of the monoclonal antibody produced against
B. longum ATCC 15708 tested at different concentration against bacterial cells
(OD650 nm= 0.1). Supernatant from clone culture tested for anti-B. longum production
was used as positive control.
118
The sensitivity of the Mab obtained was evaluated by studying the effect of the
concentration of bacterial cells on the signal. Serial dilution of bacterial suspension from
103 to 107 cfu/ml were prepared from overnight culture and tested by ELISA using an
optimal antibody concentration of 0.5 µg/ml. The results shown in Figure 4.7 indicate that
the purified Mab anti-B. longum ATCC 15708 is more reactive with the antigen (cells) at
concentration of 105 cfu/ml. Auty et al. (2001) mentioned that a minimum detection limit
for in situ viability staining in conjunction with confocal scanning laser microscopy
enumeration was around 108 bacteria/ml (equivalent to around 107 cfu/ml), based on
Bifidobacterium sp. strain UCC 35612 counts.
Immune-TEM observations showed that bacterial cell envelopes were uniformly
recovered by protein-A colloidal gold. The cell wall protein appears to be target of the
monoclonal antibody produced. Use of the anti-B. longum for direct immunofluorescence
labeling of bacteria in fixed food samples and epifluorescence microscopy could represent
an alternative method to detect bifidobacterial species in fermented product.
0,5
aB. animalis
bB. breve
O.D (450 nm)
0,4
cB. longum
0,3
dB. infantis
eB. bifidum
0,2
fB. pseudolongum
0,1
00
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
Bifidobacteria (cells/ml)
Figure 4.7. Sensitivity test carried out with diluted cell suspension using purified
monoclonal antibody anti-B. longum ATCC 15708 at the optimal concentration of 0.5
µg/ml.
119
Detection and quantification of bifidobacteria remains a major limitation in the field
of probiotic research. Until recently, there is no efficient method allowing a specific
detection of viable bifidobacteria even in non complex food or environmental matrices.
Moreover there is no efficient selective medium for the specific culture of bifidobacteria. In
this study, a powerful system based on the use of a combination of a specific Mab and a
culture medium was developed for the specific detection and quantification of viable
bifidobacteria. Using the developed IC detection method and as reported in Figure 4.8,
panel A1, bifidobacteria colonies were detected only when the anti-bifidobacteria Mab was
added indicating that these colonies from bifidobacterial cells were being captured by the
antibody. There was no bacterial colonies in wells that do not contain specific antibifodobacteria Mabs (Figure 4.8, panel A2). The specificity of the IC detection system was
further confirmed by using three different concentrations of bifidobacteria. As shown in
Figure 4.8, panel B the number of colonies detected in the microplate wells is proportional
to the initial number of bacteria added.
A
B
1
2
Figure 4.8. Immune-culture test carried out with anti-B. longum and fresh culture of
B. longum using 6-wells plate. Because of high size of wells in culture plate a maximal
concentration of anti-B. longum (1.5 µg/ml) was used for coating; mother- solution of
B. longum: 1.4x 109 cfu/ml; dilution A1: 10-7, B2: 10-6, and B1:10-5; A2: negative
control (non-coated well).
120
The IC detection system offers several advantages over the traditional culture
methods. Even though a similar sensitivity was obtained, higher specificity was observed
with IC detection system because of the addition of the anti-bifidobacteria Mab as a capture
probe prior to the addition of MRS-cysteine. Moreover, this method was simple to perform
and no special equipment (anaerobic jar containing carbon dioxide generating sachet) was
needed to create such as an anaerobic conditions for the growth of bifidobacteria. Only
viable bifidobacteria are still detected.
4.6 Conclusion
This study was performed to produce specific monoclonal antibody able to detect
live bifidobacteria using proteins present on the bacterial cell surface. Cell wall of
bifidobacteria was found to have some similar proteins with molecular size ranging from 58
to 34 kDa. Furthermore, proteins extracted and purified from bifidobacteria are shown to be
immunogenic in Balb/c mice. Monoclonal antibody was then produced against cell wall
protein of B. longum ATCC 15708 and found to be more immunogenic. Interestingly, the
antibody produced showed a cross reactivity with purified cell wall proteins and whole
cells from other bifidobacterial species studied (B. breve ATCC 15700, B. infantis ATCC
15697, B. bifidum ATCC 15696 B. pseudolongum ATCC 25526 and B. animalis ATCC
27536) sharing antigenicity with B. longum ATCC 15708. The antigenicity shared by
bifidobacteria was confirmed by western blot revealing an epitope supported by common
protein of 58 kDa recognized by the monoclonal antibody obtained. The antibody produced
was also shown to be specific to members of bifidobacterial genus. The sensitivity of the
antibody produced was estimated at 105 cfu/ml. Immuno-culture test developed with best
detection of viable cells of bifidobacteria using specific monoclonal antibody would be a
good tool to detect and quantify viable species of human and animal origin bifidobacteria in
bifidus food and tissues.
121
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from FCAR, NOVALAIT, MAPAQ, NSERC.
T. Amrouche was recipient of fellowship from World Bank. Stephen Davids is thanked for
reading the manuscript.
Conclusion générale
Les études antérieures ont démontré les propriétés immunomodulatrices des
probiotiques sans pour autant parvenir à élucider clairement tous les mécanismes impliqués
dans les effets observés. Le présent travail a pour objectif principal d’étudier le potentiel
immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries en déterminant in vitro et ex
vivo l’effet de leurs composants endo et exocellulaires sur les paramètres immunologiques
indicateurs de la réponse immunitaire spécifique chez la souris. Les résultats obtenus
démontrent que les composants cellulaires des bifidobactéries lysées exercent un effet
immunostimulant significatif sur les splénocytes de souris. En effet, la paroi cellulaire et le
contenu cytoplasmique des bifidobactéries stimulent la prolifération des lymphocytes et
augmentent la production de deux cytokines, IFN-γ et IL-10, jouant un rôle clé dans les
mécanismes de l’immunomodulation. Cependant, les effets observés dépendaient de la
souche ou espèce de bifidobactérie, du composant cellulaire et de la dose utilisée. La
souche B. lactis Bb12 s’est avérée potentiellement mitogène.
Les EPS produits par les bifidobactéries dans le milieu de culture n’induisent pas
d’effets stimulants significatifs sur la réponse immunitaire. Les EPS ont été extraits et
purifiés par une méthode conventionnelle impliquant une précipitation des macromolécules
à l'aide d'un solvant organique, une précipitation des protéines avec le TCA, une
purification par la dialyse et une lyophilisation. Cette méthode d’extraction et de
purification semble affecter la nature et l’activité mitogénique des EPS produits. Il serait
donc intéressant d’utiliser d’autres méthodes comme la technique d’ultrafiltration
permettant de préserver l’activité biologique des EPS.
122
L’étude comparative des fractions peptidiques et protéiques du cytoplasme B. lactis
Bb12 a mis en évidence la présence de peptides et de protéines de nature acide et basique,
de faible hydrophobicité et de poids moléculaire très variable. Les peptides acides stimulent
significativement la prolifération des splénocytes et induisent la sécrétion de IFN-γ et IL-4
impliqués dans les mécanismes de la stimulation de la réponse immunitaire. Cependant, la
présence d’éventuels oligonucléotides dans les fractions peptidiques/protéiques acides et
basiques brutes obtenues à partir du cytoplasme de B. lactis Bb12 n’a pas été vérifiée. Il
serait donc intéressant de déterminer à l’avenir la teneur de ces composants
intracytolplasmiques et leurs effets sur la réponse immunitaire.
En outre, la méthode de fractionnement par RP-HPLC n’a pas permis d’obtenir des
fractions peptidiques et protéiques pures, ceci pourrait s’expliquer par la faible
hydrophobicité montrée par les peptides et les protéines du cytoplasme des bifidobactéries.
Il serait donc plus judicieux d’employer une autre méthode de fractionnement comme la
chromatographie d’échange d’ions pouvant améliorer la séparation des peptides et des
protéines intra cytoplasmiques. Par ailleurs, la quantité de matériel (peptides et protéines)
obtenue à partir du cytoplasme est très limitée, ceci nécessiterait alors une production
maximale de biomasse bactérienne dans des conditions de culture optimales.
Dans cette étude, nous avions utilisé deux méthodes de mesure de la prolifération
cellulaire différentes par leur principe. La méthode basée sur l’incorporation du BrdU dans
l’ADN des cellules immunitaires est longue et nécessite un test ELISA. Par contre, la
technique à Alamar Blue, basée sur la coloration de cet indicateur en présence d’un
métabolisme cellulaire (potentiel d’oxydoréduction), est plus rapide, simple et génère
moins de variabilité dans les résultats.
Les résultats de cette étude laissent suggérer que les cellules bactériennes viables ne
sont pas nécessairement requises pour influencer le système immunitaire de l’hôte. Ceci
laisserait penser que les composants cellulaires (surtout la paroi) issus de l’autolyse des
bifidobactéries ou de la lyse enzymatique ou acide dans le milieu gastro-intestinal, peuvent
donc stimuler la réponse immunitaire. Par ailleurs, l’utilisation de cellules non viables offre
123
plus d’avantages en permettant une longue durée de vie ou de stockage des produits
probiotiques à potentiel immunomodulateur.
Compte tenu de la complexité de la composition de la paroi cellulaire et du
cytoplasme des bifidobactéries, il serait fort intéressant d’envisager d’autres études afin
d’identifier d’autres agents responsables de l’immunomodulation, particulièrement les
molécules favorisant l’activité des cellules T régulatrices. La compréhension de ces
fonctions immunomodulatrices offrirait certainement une opportunité unique pour prévenir
ou traiter les désordres intestinaux associés aux allergies et aux maladies de l’inflammation
de l’intestin et auto-immunes. Ainsi, les bactéries probiotiques pourraient être utilisées
comme suppléments nutritionnels destinés aux personnes âgées ou aux nouveau-nés, dont
la fonction immunitaire est réduite. L’utilisation des probiotiques comme ingrédients dans
les aliments fonctionnels nécessiterait cependant des études cliniques. Etant donné que les
bifidobactéries et les bactéries lactiques appartiennent à la flore naturelle habitant l’intestin
de l’homme sain, et qu’elles sont déjà utilisées avec innocuité dans les aliments depuis
longtemps partout dans le monde, il serait donc convenu d’utiliser les bifidobactéries
comme probiotiques ou agents immunomodulateurs sous forme de nutraceutiques pour la
prévention et le traitement des maladies médiées par le système immunitaire.
Comme la viabilité des souches probiotiques est requise pour obtenir d’autres effets
bénéfiques sur la santé comme la prévention ou le traitement des infections intestinales
(compétition d’exculsion), la réduction du taux de cholestrol, la digestion du lactose, la
production de vitamines, nous avions aussi songé à développer dans ce projet des anticorps
monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries afin de détecter à l’état viable les espèces
appartenant à ce genre bactérien dans les produits probiotiques. Pour cela, nous avions mis
à profit l’immunogénicité de la paroi des bifidobactéries pour produire des anticorps dirigés
contre leurs protéines de surface. L’analyse du profil protéique de la paroi de plusieurs
espèces de bifidobactérie nous a révélé des protéines communes (poids moléculaire: 34 à
58 kDa) et des différences entre les espèces étudiées. Les protéines de la paroi se sont
avérées immunogènes chez les souris Balb/c (immunisées) en générant une forte production
d’anticorps polyclonaux.
124
Un anticorps monoclonal dirigé contre les protéines de la paroi de B. longum ATCC
15708 a été produit avec succès. Cet anticorps est caractérisé par sa réactivité croisée avec
les autres espèces de bifidobactéries testées (B. breve, B. infantis, B. bifidum, B.
pseudolongum et B. animalis). L’anticorps montre une réaction croisée avec une souche de
L. rhamnosus qui semble avoir une similitude antigénique avec les bifidobactéries.
L’antigénicité partagée chez les bifidobactéries a par ailleurs été confirmée par la méthode
western blot qui a révélé un épitope commun supporté par une protéine de poids
moléculaire de 58 kDa. La fixation de l’anticorps sur la paroi (protéines) de bifidobactéries
a été observée au microscope électronique. L’anticorps développé est capable de détecter
les bifidobactéries de facon non spécifique puisqu’il reconnaît aussi les lactobacilles. Il
serait donc judicieux de rechercher un autre anticorps
de haute spécificité pour les
bifidobactéries. Néanmoins, l’anticorps ainsi obtenu s’est montré sensible (105 cfu/ml).
Par ailleurs, l’anticorps produit a permis de développer un test immunologique de
détection des bifidobactéries. Comparé aux autres méthodes existantes, ce test présente
l’avantage de détecter des bifidobactéries vivantes lorsqu’il est combiné avec la culture
bactérienne sur plaque (immuno-culture). Ces résultats laissent suggérer une possibilité
d’utilisation de cet anticorps comme outil moléculaire pour la détection ou l’identification
des bifidobactéries vivantes dans les aliments et les tissus. Néanmoins, l’anticorps produit
devrait être testé sur des échantillons d’aliments fermentés supplémentés avec des
bifidobactéries afin de rendre possible l’utilisation du test à l’échelle industrielle.
Bibliographie
Aaron A. R. T., Canaday D. H., Henry Boom W., & Harding C. V., 2004. Bacterial heat
shock proteins romote CD91-dependent class I MHC cross-presentation of chaperoned
peptide to CD8+ T cells by cytosolic mechanisms in dendritic cells versus vacuolar
mechanisms in macrophages. The Journal of Immunology, 172, 5277-5286.
Abad A. R., Cease K. R., & Blanchette R. A., 1987. A rapid technique using epoxy resin
Quetol 651 to prepare woody plant tissues for ultrastructural study. Canadian Journal of
Botany, 66, 677-682.
Allez M., & Mayer L., 2004. Regulatory T cells: peace keepers in the gut. Inflammatory
Bowel Diseases, 10, 666-676.
Anderson N., 2004. Probiotics market face EU challenge. Breaking News on Supplements,
Nutrition & Healthy Foods. 08 Janvier, p.1
Ang D. K., Libereck D., Skowyra M. Z., & Georgopoulos C., 1991. Biological role and
regulation of the universally conserved heat shock proteins. Journal of Biological
Chemistry, 266, 24233-24236.
Arbour N., Tremblay P., & Oth D., 1996. N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine
induces and modulates IL-1 and IL-6 in human PBMC. Cytokine, 8, 468-475.
Arroyo L., Cotton L. N., & Martin J. H., 1995. ACM agar-a composite medium for
selective enumeration of Bifidobacterium longum. Cultural Dairy Products Journal, 2, 1215.
Asahara T., Nomoto K., Shimizu K., Watanuki M., & Tanaka R., 2001a. Increased
resistance of mice to Salmonella enterolitica serovar Typhimurium infection by symbiotic
administration of Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides. Journal of
Applied Microbiology, 91, 985-996.
Asahara T., Shimizu K., Nomoto K., Hamabata T., Ozawa A., & Takeda Y., 2004.
Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infection with Shiga toxin-producing
Escherichia coli O157:H7. Infection and Immunity, 7, 2240-2247.
Asahara T., Shimizu K., Nomoto K., Watanuki M., & Tanaka R., 2001 b. Antibacterial
effect of fermented milk containing Bifidobacteria breve, Bifidobacteria bifidum and
Lactobacillus acidophilus against indigenous Escherichia coli infection in mice. Microbial
Ecology in Health and Disease, 13, 16-24.
Attouri N., Bouras M., Tome D., Marcos A., & Lemonnier D., 2002. Oral ingestion of
lactic acid bacteria by rats increases lymphocyte proliferation and interferon-γ production.
British Journal of Nutrition, 87, 367-373.
126
Baek S. H., Seo J. K., Chae C. B., Suh P. G., & Ryu S. H., 1996. Identification of the
peptides that stimulate the phosphoinositide hydrolysis in lymphocyte cell lines from
peptide libraries. Journal of Biological Chemistry, 271,8170-8165.
Ballas Z. D., Rasmussen W. L., & Krieg A. M., 1996. Induction of NK activity in murine
and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. Journal of
Immunology, 157, 1840-1847.
Ballongne J., 1993. Bifidobacteria and probiotic action. In Lactic acid bacteria. Ed.
Salminen A. and Von Wright A., 357-428.
Bartosch S., Woodmansey E. J., Paterson J. C., McMurdo M. E., & Macfarlane G. T.,
2005. Microbiological effects of consuming a synbiotic containing Bifidobacterium
bifidum, Bifidobacterium lactis, and oligofructose in elderly persons, determined by realtime polymerase chain reaction and counting of viable bacteria. Clinical Infectious
Diseases, 40, 28-37.
Baumgart D. C., & Dignass A. U., 2002. Intestinal barrier function. Current Opinion in
Clinical Nutrition & Metabolic Care, 5, 685-94.
Bautista-Garfias C.R., Ixta-Rodriguez O., Martinez-Gomez F., Lopez M.G., & AguilarFigueroa B. R., 2001. Effect of viable or dead Lactobacillus casei organisms administered
orally to mice on resistance against Trichinella spiralis infection. Parasite, 8, 226-228.
Berg R. D., 1998. Probiotics, prebiotics or ‘’conbiotics’’. Trends in Microbiology, 6, 89-92.
Bergmaier D., Lacroix C., Guadalupe Macedo M., & Champagne C. P., 2001. New method
for exopolysaccharide determination in culture broth using stirred ultrafiltration cells.
Applied Microbiology and Biotechnology, 57, 401-406.
Bergmaier D., Champagne C. P., Lacroix C., 2003. Exopolysaccharide production during
batch cultures with free and immobilized Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. Journal of
Applied Microbiology, 95, 1049-57.
Beveridge T., & Graham L., 1991. Surface layers of bacteria. Microbiology Review, 55,
684-705.
Bjorksten B., 2004. Effects of intestinal microflora and the environment on the
development of asthma and allergy. Springer Seminras in Immunopathology, 25, 257-270.
Blaut M., 2002. Relationship of prebiotics and food to intestinal microflora. European
Journal of Nutrition, 41, 11- 16.
Blehaut H., Massot J., Elmer G. W., & Levy R. H., 1989. Disposition kinetics of
Saccharomyces boulardii in man and rat. Biopharmaceutics and Drug Disposition, 10, 353364.
127
Blum S., Delneste Y., Alvarez S., Haller D., Perez P. F., Bode Ch. Hammes W. P., Pfeir A.
M. A., & Schiffrin E. J., 1999. Interactions between commensal bacteria and mucosal
immunocompetent cells. International Dairy Journal, 9, 63-68.
Bokken Gertie C. A. M., Corbee Ronald J., Knapen F. V, & Bergwer A. A., 2003.
Immunochemical detection of Salmonella group B, D and E using an optical surface
plasmon resonance biosensor. FEMS Microbiology Letters, 222, 75-82.
Bolin I., Lonroth H., & Svennerholm A. M., 1995. Identification of Helicobacter pylori by
immunological dot blot method based on reaction of a species-specific monoclonal
antibody with a surface-exposed protein. Journal of Clinical Microbiology, 33, 381-384.
Borriello S. P., Hammes W. P, Holzapfel W., Marteau P., Schrezenmeir J., Vaara M., &
Valtonen V., 2003. Safety of probiotics that contain Lactobacilli or Bifidobacteria. Clinical
Infectious Diseases, 36, 775-780.
Borruel N., Carol M., Casellas F., Antolín M., de Lara F., Espín E., Naval J., Guarner F., &
Malagelada J. R., 2002. Increased mucosal tumour necrosis factor a production in Crohn’s
disease can be down regulated ex vivo by probiotic bacteria. Gut, 51, 659-664.
Bot A., Smith K. A., & Von Herrath M., 2004. Molecular and cellular control of T1/T2
immunity at the interface between antimicrobial defence and immune pathology. DNA and
Cell Biology, 23, 341-350.
Brandtzaeg P., 1996. History of oral tolerance and mucosal immunity. Annals of the New
York Academy of Sciences, 778, 21-27.
Brandtzaeg P., 2002. Current understanding of gastrointestinal immunoregulation and its
relation to food allergy. Annual of New York Academy of Sciences, 964, 13-45.
Brassard D., 1997. Bactéries lactiques et santé. Centre de recherche de l’Académie
d’agriculture francaise, 83, 35-40.
Brubaker J. O., Li Q, Tzianabos A. O., Kasper D. L., & Finberg R.W., 1999. Mitogenic
activity of purified capsular polysaccharide A from Bacteroides fragilis: differential
stimulatory effect on mouse and rat lymphocytes in vitro. Journal of Immunology, 16,
2235-2242.
Bukowska H., Pieczul-Mroz J., Jastrze¸bska M., Chełstowski K., & Naruszewicz M., 1998.
Decrease in fibrinogen and LDL-cholesterol levels upon supplementation of diet with
Lactobacillus plantarum in subjects with moderately elevated cholesterol. Atherosclerosis,
137, 437–438.
128
Bunthof C. J., Bloemen K., Breeuwer P., Rombouts F. M., Abee T., 2001. Flow cytometric
assessment of viability of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology,
67, 2326-2335.
Butt T., Malik H. S., Abbassi S. A., Ahmad R. N., Mahmood A., Karamat K. A., & Anwar
M., 2004. Genus and species-specific IgG and igm antibodies for pulmonary tuberculosis.
Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan., 14, 105-107.
Calder P. C., & Samantha K., 2002. The immune system: a target for functional foods?
British Journal of Nutrition, 88, 165-176.
Cano P. G., & Perdigon G., 2003. Probiotics induce resistance to enteropathogens in a renourished mouse model. Journal of Dairy Research, 70, 433-440.
Carlisle M. S., McGregor D. D., & Appleton J. A., 1991. The role of the antibody Fc region
in rapid expulsion of Trichinella spiralis in suckling rats. Immunology, 74, 552-558.
Casadevall A., Dadachova E., & Pirofski L. A., 2004. Passive antibody therapy for
infectious diseases. Nature Reviews| Microbiology, 2, 695- 703.
Castellino F., Boucher P. E., Eichelberg K., Mayhew M., Rothman J. E., Houghton A. N.,
& Germain, R. N., 2000. Receptor-mediated uptake of antigen/heat shock protein complexe
results in major histocompatibility complex class I antigen presentation via two distinct
processing pathways. Journal of Experimental Medicine, 191, 1957.
Cerning J., Renard C. M. G. C., Thibault J. F., Bouillanne C., London M., Desmazeaud
M., & Topisirovic L., 1994. Carbon source requirements for exopolysaccharides production
by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer. Applied and
Environmental Microbiology, 60, 3914-3919.
Chabot S., Yu H.. L., De Lseleuc L., Cloutier D., Van Calstern M..R.., Lessard M., Roy D.,
Lacroix M., & Oth D., 2001. Exopolysaacharides from Lactobacillus rhamnosus RW9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured immunocompetent
cells, and IFN-γ in mouse splenocytes. Lait, 81, 683-697.
Chadwick V. S., Mellor D. M., Myers D. B., Selden A. C., Keshavarzian A., Broom M. F.,
& Hobson C. H., 1988. Production of peptides inducing chemotaxis and lysosomal enzyme
release in human neutrophils by intestinal bacteria in vitro and in vivo. Scandinavian
Journal of Gastroenterol., 23, 121-128.
Chamberlain P., 2002. Immunogenicity of therapeutic proteins Part 1: Causes and clinical
manifestations of immunogenicity. The Regulatory Review, 5, 4-9.
Champomier-Verges M. C., Maguin E., Mistou M. Y., Anglade P., & Chich J. F., 2002.
Lactic acid bacteria and proteomics: current knowledge and perspectives. Journal of
Chromatography, 771, 329-342.
129
Chaudhary P. M., Ferguson C., Nguyen V., Nguyen O., Massa H. F., Eby M., Jasmin Trask
A, B. J, Hood L., & Nelson P. S., 1998. Cloning and characterization of two
Toll/Interleukin-1 receptor-like genes TIL3 and TIL4: evidence for a multi-gene receptor
family in humans. Blood, 9, 4020-4027.
Chen R. M., Wu J. J., Lee S. C., Huang A. H., & Wu H. M., 1999. Increase of intestinal
Bifidobaterium and suppression of coliform bacteria with short-term yogurt ingestion.
Journal of Dairy Sciences, 82, 2308-2314.
Chiang B. L., Sheih Y. H., Wang L. H., Liao C. K., & Gill H. S., 2000. Enhancing
immunity by dietary consumption of a probiotic lactic acid bacterium (Bifidobacterium
lactis HN019): optimization and definition of cellular immune responses. European
Journal of Clinical Nutrition, 54, 849-855.
Christensen H. R., Frokiaer H., & Pestka J. J., 2002. Lactobacilli differentially modulate
expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. Journal
of Immunology, 168, 171-178.
Chua-Intra, B., Peerapakorn, S., Davey, N., Jurcevic, S., Busson, M., Vordermeier, H. M.,
Pirayavaraporn, C., & Ivanyi, J., 1998. T-cell recognition of mycobacterial GroES peptides
in Thai leprosy patients and contacts. Infection and Immunity, 66, 4903-4909.
Chukeatirote E., 2003. Potential use of probiotics. Songklanakarin Journal of Science and
Technology, 25, 275-282.
Coconier, M. H., Bernet M F., Kernéis S., Chauvière G., Fourniat J., & Servin A. L., 1993.
Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by
Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion. FEMS Microbiology
Letters, 110, 299-306.
Comerford I., & Nibbs R. J., 2005. Post-translational control of chemokines: a role for
decoy receptors? Immunology Letters, 96, 163-174.
Corsetti A., De Angelis M., Dellaglio F., Paparella A., Fox P.F., Settanni L., Gobbetti M.,
2003. Characterization of sourdough lactic acid bacteria based on genotypic and cell-wall
protein analyses. Journal of Applied Microbiology, 94, 641-654.
Cross M. L., Stevenson L. M., & Gill H. S., 2001. Anti-allergy properties of fermented
foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria. International
Immunopharmacology, 1, 891-901.
Cummings J. H., Gibson G. R., & Macfarlane G. T., 1989. Quantitative estimates of
fermentation in the hind gut of man. Acta Veterinaria Scandinavica, 86, 76-82.
130
Cunningham-Rundles S., Ahrne S., Bengmark S., Johann-Liang R., Marshall F., Metakis
L., Califano C., Dunn A. M., Grassey C., Hinds G., & Cervia J., 2000. Probiotics and
immune response. American Journal of Gastroenterology, 95, 22-25.
D’Andrea A., Aste-Amezaga M., Valiante N. M., Ma X, Kubin M., & Trinchieri G., 1993.
Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon gamma-production by
suppressing natural killer cell stimulatory factor / IL-12 synthesis in accessory cells.
Journal of Experimental Medecine, 178, 1041-1048.
Dabbagh K., & Lewis D. B., 2003. Toll-like receptors and T-helper-1/T-helper-2 responses.
Current Opinion in Infectious Diseases, 16, 199-204.
De Angelis M., Di Cagno R., Huet C., Crecchio C., Fox P. F., & Gobbetti M., 2004. Heat
shock response in Lactobacillus plantarum. Applied and Environmental Microbiology, 70,
1336-1346.
De Roos N. M., & Katan M. B., 2000. Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid
metabolism, and carcinogenesis : a review of papers published between 1988 and 1998.
American. Journal of Nutrition, 71, 405-411.
De Simone C., Bianchi Salvadori B., Jirillo E., Baldinelli L., Bitonti F., & Vesely R., 1989.
Modulation of immune activities in humans and animals by dietary lactic acid bacteria. In:
Chandan R. C., editor. Yogurt Nutritional and Health Properties (pp. 201-13). London:
John Libbey Press.
De Simone C., Vesely R., Bianchi Salvadori B., & Jirillo E., 1993. The role of probiotics in
modulation of the immune system in man and in animals. International Immunotherapy, 9,
23-28.
De Vries W. & Stouthamer A. H., 1967. Fermentation of glucose, lactose, galactose,
mannitol and xylose by bifidobacteria. Journal of Bacteriology, 96, 472-478.
De Waard R., Claassen E., Bokken G. C. A. M., Buiting B., Garssen J., & Vos J. G., 2003.
Enhanced immunological memory responses to Listeria monocytogenes in rodents, as
measured by delayed-type hypersensitivity (DTH), adoptive transfer of DTH, and
protective immunity, following Lactobacillus casei Shirota ingestion. Clinical and
diagnostic laboratory immunology, 10, 59-65.
De Wall Malefyt R., Abrams J., Bennet B., Figdor C. G., & De Vries J. E., 1993.
Interleukin 10 (IL-10) inhibits cytokines synthesis by human monocytes: an autoregulatory
role of IL-10 produced by monocytes. Journal of Experimental Medecine, 174, 1209-1220.
Delcour J., Ferain T., Deghorain M., Palumbo E., & Hols P., 1999. The biosynthesis and
functionality of the cell wall of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 76, 159-184.
131
Dijkstra A. J., Alber G., & Keck W., 1997. The naturally occurring muramylpeptide
G(Anh)Mtetra protects mice against Escherichia coli septic shock and induces neutrophilia
in vivo. In Arnoud Jan Dijkstra, editor. The lytic transglycosylase family of Escherichia coli
: in vitro activity versus in vivo function (pp.139-150). University Library Groningen.
Dinakar P., & Mistry V. V., 1994. Growth and viability of Bifidobacterium bifidum in
cheddar cheese. Journal of Dairy Science, 77, 2854-2864.
Dobrotina N. A., Ezhova G. P., Kazatskaia Z. A., Ladygina G. N., & Kurova M. V.,1992.
The comparative characteristics of the biological and immunomodulating activities of
enzyme preparations of microbial origin. Nauchnye Doki Vyss Shkoly Biol Nauki, 2, 90-96.
Dong X., Cheng G., & Jian W., 2000. Simultaneous identification of five Bifidobacterium
species isolated from human beings using multiple PCR primers. Systematic and Applied
Microbiology, 23, 386-390.
Drouault S., Corthier G., Ehrlich S. D., Renault P., 1999. Survival, physiology, and lysis of
Lactococcus lactis in the digestive tract. Applied and Environmental Microbiology, 65,
4881-4886.
Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., & Reberts P. A., 1956. Colorometric method for
determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 28, 350-356.
Ducluzeau R., Rambaud P., & Bernasconi P., 1984. Flore et écosystème intestinal. Edition
Scientifique Biocodex.
Dunne C., O'Mahony L., Murphy L., Thornton G., Morrissey D., O'Halloran S., Feeney M.,
Flynn S., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., O 'Sullivan G. C., Shanahan F., & Collins J. K,
2001. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in
vivo findings. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 386-392.
Ebina T., Ogata N., & Murata K., 1995. Antitumor effect of Lactobacillus bulgaricus
878R. Biotherapy, 9, 65-70.
Echchannaoui H., Frei K., Schnell C., Leib S. L., Zimmerli W., & Landmann R., 2002.
Toll-like receptor 2-deficient mice are highly susceptible to Streptococcus pneumoniae
meningitis because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation. Journal of
Infectious Dieases, 186, 798-806.
Erickson K. L., & Hubbard N.E., 2000. Probiotic immunomodulation in health and disease.
Journal of Nutrition, 130, 403-409.
Ernst S., Lange C., Wilbers A., Goebeler V., Gerke V., & Rescher U., 2004. An annexin 1
N-terminal peptide activates leukocytes by triggering different members of the formyl
peptide receptor family1. Journal of Immunology, 172, 7669-7676.
132
Faber E. J., Haak M. J., Kamerling J. P., & Vliegenthart J. F. G., 2001. Structure of the
exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus S3. Carbohydrate Research,
331, 173-182.
Fang H., Elina T., Heikki A., & Seppo S., 2000. Modulation of humoral immune response
through probiotic intake. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 29, 47-52.
Fernandez-Espla M., Garault P., Monnet V., & Rul F., 2000. Streptococcus thermophilus
cell wall-anchored proteinase: release, purification, and biochemical and genetic
characterization. Applied and Environmental Microbiology, 66, 4772-4778.
Flo T. H, Halaas O., Torp S., Ryan L., Lien E., Dybdahl B., Sundan A., & Espevik T.,
2001. Differential expression of Toll-like receptor 2 in human cells. Journal of Leukocyte
Biology, 69, 474-481.
Fooks L. J., & Gibson G. R., 2002. Probiotics as modulators of the gut flora. British
Journal of Nutrition, 88, 39-49.
Freer R. J., Day A. R., Muthukumaraswamy N., Pinon D., Wu A., Showell H. J., & Becker
E. L., 1982. Formyl peptide chemoattractants: a model of the receptor on rabbit’s
neutrophils. Biochemistry 21, 257-263.
Fu H., Dahlgren C., & Bylund J., 2003. Subinhibitory concentrations of the deformylase
inhibitor actinonin increase bacterial release of neutrophil-activating peptides: a new
approach to antimicrobial chemotherapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47,
2545-2550.
Fuller R., & Perdigon G., 2000. Probiotics 3: Immunomodulation by the gut microflora and
probiotics. Kluwer Academic Publishers, Dordrecth.
Fuller R., 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, 66, 365378.
Gagnon M., Kheadr E. E., Le Blaya G., & Flissa I., 2004. In vitro inhibition of Escherichia
coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. International Journal of Food
Microbiology, 92, 69-78
Gatti M., Fornasari E., & Neviani E., 1997. Cell wall protein profiles of dairy thermophilic
lactobacilli. Letters in Applied Microbiology, 25, 345-348.
Gavini F., Pourcher A. M., Nut C., Monget D., Romond C., Oger C., & Izard D., 1991.
Phenotypic differentiation of bifidobacteria of human and animal origins. International
Journal of Systematic Bacteriology, 41, 548-557.
Gibson G. R., & Wang X., 1994. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of
other colonic bacteria. Journal of Applied Bacteriology, 77, 412-420.
133
Gibson G. R., & Fuller R., 2000. Aspects of in vitro and in vivo research approaches
directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use. Journal of Nutrition,
130, 391-395.
Gibson G. R., & Roberfroid M. B., 1995. Dietary modulation of the human colonic
microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 125, 1401-1412.
Gill H. S., 1998. Stimulation of the immune system by lactic cultures. International Dairy
Journal, 8, 535-44.
Gill H. S., Rutherfurd K. J., & Cross M. L., 2001. Dietary probiotic supplementation
enhances natural killer activity in the elderly: An investigation of age-related
immunological changes. Journal of Clinical Immunology, 21, 264-271.
Gill H. S., Rutherfurd K. J., Prasad J., & Gopal P. K., 2000. Enhancement of natural and
acquired immunity by Lactobacillus rhamnosus (HN001), Lactobacillus acidophilus
(HN017) and Bifidobacterium lactis (HN019). British Journal of Nutrition, 83, 167-76.
Gobbetti M., Corsetti A., Smacchi E., Zocchetti A., & De Angelis M., 1998. Production of
crescenza cheese by incorporation of Bifidobacteria. Journal of Dairy Science, 81, 37-47.
Godward G., Sultana K., Kailasapathy K., Peiris P., Arumugaswamy R., & Reynolds N.,
2000. The importance of strain selection on the viability and survival of probiotic bacteria
in dairy foods. Milchwissenschaft-Milk Science International, 55, 441- 445.
Gonzalez D., Tzianabos A. O., Genco C. A., & Gibson III F. C., 2003. Immunization with
Porphyromonas gingivalis capsular polysaccharide prevents P. gingivalis-elicited oral bone
loss in a murine model. Infection and immunity, 71, 2283-2287.
Gosselink M. P, Schouten W. R., van Lieshout L. M., Hop W. C., Laman J. D., & Ruselervan Embden J. G., 2004. Delay of the first onset of pouchitis by oral intake of the probiotic
strain Lactobacillus rhamnosus GG. Disease of Colon and Rectum, 47, 876-884.
Gournier-château N., Larpent J. P., Castillanos M. I., & Larpent J. L., 1994. Les
probiotiques en alimentation animale et humaine. Édition Technologie et documentation
Lavoisier pp. 1-192, Paris, France.
Grill J. P., Crociani J., & Ballongue J., 1995. Characterization of fructose 6-phosphate
phosphoketolases purified from Bifidobacterium species. Current Microbiology, 31, 49-54.
Grogono-Thomas R., Blaser M. J., Ahmadi M., & Newell D. G., 2003. Role of S-layer
protein antigenic diversity in the immune responses of sheep experimentally challenged
with Campylobacter fetus subsp fetus. Infection and Immunity, 71, 147-154.
134
Groleau P. E., Jimenez-Flores R., Gauthier S. F., & Pouliot Y., 2002. Fractionation of betalactoglobulin tryptic peptides by ampholyte-free isoelectric focusing. Journal of
Agriculture and Food Chemistry, 50, 578-83.
Guandalini S., 2002. Use of Lactobacillus-GG in paediatric Crohn's disease. Digestive and
Liver Disease, 3, 63-65.
Halassy B., Krstanovic M., Frkanec R., & Tomašie J., 2003. Adjuvant activity of
peptidoglycan monomer and its metabolic products. Vaccine, 21, 971-976.
Halpern M. D., Kurlander R. J., & Pisetsky D. S., 1996. Bacterial DNA induces murine
interferon gamma production by stimulation of IL-12 and tumor necrosis factor-alpha. Cell.
Immunology, 167, 72-78.
Hamann L., El-Samalouti V., Ulmer A. J., Flad H. D., & Rietschel E. T., 1998.
Components of gut bacteria as immunomodulators. International Journal of Food
Microbiology, 41, 141-154.
Hao W. L., & Lee Y. K., 2004. Microflora of the gastrointestinal tract: a review. Methods
in Molecular Biology, 268, 491-502.
He F., Morita H., Ouwehand Arthur C., Hosoda M., Hiramatsu M., Kurisaki J. I., Isolauri
E., Benno Y., & Salminen S., 2002. Stimulation of the secretion of pro-inflammatory
cytokines by Bifidobacterium Strains. Microbiology and Immunology, 46, 781-785.
Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino
K., Wagner H., & Takeda, K., 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature
(London), 408, 740-745.
Higashimura M., Mulder-Bosman B. W., Reich R., Iwasaki T., & Robin G. W., 2000.
Solution properties of viilian, the exopolysaccharide from Lactococcus lactis subsp.
cremoris SBT 0495. Biopolymers, 54, 143-158.
Hirayama K., & Rafter J., 2000. The role of probiotic bacteria in cancer prevention.
Microbes and Infection, 2, 681-686.
Hobson C. H., Roberts E. C., Broom M. F., Mellor D. M., Sherriff R. M., & Chadwick V.
S., 1990. Radio-immunoassay for formyl methionyl leucyl phenylalanine. I. Development
and application to assessment of chemotactic peptide production by enteric bacteria.
Journal of Gastroenterology and Hepatology, 5, 32-37.
Hodgkin P. D., Rush J., Guett A., Bartell G., & Hasbold J., 1998. The logic of intercellular
communication in the immune system. Fener Conference. Immunology and cell Biology,
76, 448- 453.
135
Hokeness K. L., Kuziel W. A., Biron C. A., & Salazar-Mather T. P., 2005. Monocyte
chemoattractant protein-1 and CCR2 interactions are required for IFN-{alpha}/{beta}induced inflammatory responses and antiviral defense in liver. Journal of Immunology,
174, 1549-1556.
Holzapfel W. H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., & Huis in’t Veld J. H. J., 1998.
Overview of gut flora and probiotics. International. Journal of Food Microbiology, 41, 85101.
Hooper L. V., & Gordon J. I., 2001. Commensal host-bacterial relationships in the gut.
Science, 292, 1115-1118.
Hoover Dallas G., 1993. Bifidobacteria: Activity and potential benefits. Food Technology,
June, 120-124.
Hopkins M. J., Sharp R., & Macfarlane G. T., 2002. Variation in human intestinal
microbiota with age. Digestive and Liver Diseases, 34, 12-18.
Hosono J. L., Amenati A., Natsume M., Hirayama M., Adachi T., & Kaminogawa S., 1997.
Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating
activity from Bifidobacterium adolescentis M101-4. Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry, 61, 312-316.
Houba V., Berger F. M., Dinarello C. A., Johnson A.G., Le J., Mauel J., Van der Meer J.
W., Philippeaux M. M., Vilcek J., & Vogels M. T., 1992. Protodyne: an
immunostimulatory protein component, prepared from gram-positive Bacillus subtilis.
Development in Biological Standardization, 77, 121-128.
Hughes D. B., & Hoover D. G., 1995. Viability and enzymatic activity of bifidobacteria in
milk. Journal of Dairy Sciences, 78, 268-276.
Hussain R., Shahid F., Zafar S., Dojki M., & Dockrell H. M., 2004. Immune profiling of
leprosy and tuberculosis patients to 15-mer peptides of Mycobacterium leprae and M.
tuberculosis GroES in a BCG vaccinated area: implications for development of vaccine and
diagnostic reagents. Immunology, 111, 462-471.
Ibnou-Zekri N., Blum S., Schiffrin E. J., & von der Weid T., 2003. Divergent patterns of
colonization and immune response elicited from two intestinal Lactobacillus strains that
display similar properties in vitro. Infection and immunity, 71, 1428-1436.
Iliev I. D., Kitazawa H., Shimosato T., Katoh S., Morita H., He F., Hosoda M., Saito T.,
2005. Strong immunostimulation in murine immune cells by Lactobacillus rhamnosus GG
DNA containing novel oligodeoxynucleotide pattern. Cellular Microbiology, 7, 403-414.
136
Iribe H., Koga T., Onoue K., Kotani S., Kusumoto S., & Shiba T., 1981. Macrophagestimulating effect of synthetic muramyl dipeptide and its adjuvant-active and -inactive
analogs for the production of T cell activating monokines. Cellular Immunology, 64, 73-83.
Ishibashi N., & Shimamura S., 1978. Bifidobacteria: research and development in Japon.
Food Technology, 126-134.
Ishii K. J., Gursel I., Gursel M., & Klinman D. M., 2004. Immunotherapeutic utility of
stimulatory and suppressive oligodeoxynucleotides. Current Opinion in Molecular
Thermodynamic, 6, 166-174.
Isolauri E., Kirjavainen P. V., & Salminen S., 2002. Probiotics: a role in the treatment of
intestinal infection and inflammation? Gut, 50, 54-59.
Isolauri E., Salminen S., & Ouwehand A. C., 2004. Probiotics. Best Practice & Research
Clinical Gastroenterology, 18, 299-313.
Isolauri E., Sütas Y., Kankaanpää P., Arvilommi H., & Salminen S., 2001. Probiotics:
effects on immunity. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 444-450.
Jain P. K., McNaught C. E., Anderson A. D., MacFie J., & Mitchell C. J., 2004. Influence
of synbiotic containing Lactobacillus acidophilus La5, Bifidobacterium lactis Bb 12,
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus and oligofructose on gut barrier
function and sepsis in critically ill patients: a randomised controlled trial. Clinical
Nutrition, 23, 441-445.
Jiang T., Mustapha A., & Savaiano D. A., 1996. Improvement of lactose digestion in
humans by ingestion of unfermented milk containing Bifidobacterium longum. Journal of
Dairy Sciences, 79, 750-757.
Jijon H., Backer J., Diaz H., Yeung H., Thiel D., McKaigney C., De Simone C., & Madsen
K., 2004. DNA from probiotic bacteria modulates murine and human epithelial and
immune function. Gastroenterology, 26, 1358-1373.
Kagnoff, M. F., & Eckmann L., 1997. Epithelial cells as sensors for microbial infection.
Journal of Clinical Investigation, 100, 6-10.
Kaila K., & James C., 2000. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with
reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunology and cell
Biology, 78, 80-88.
Kaila M., Isolauri E., Soppi E., Virtanen V., Laine S., & Arrilommi H. 1992. Enhancement
of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhoea by a man lactobacilli
strain. Pediatric Research, 32, 141-144.
137
Kailasapathy K., & Chin J., 2000. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms
with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunology and Cell
Biology, 78, 80-88.
Kailasapathy K., 2002. Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential
applications. Current Issues in Intestinal Microbiology, 3, 39-48.
Kalka-Moll W. M., Tzianabos A. O., Bryant P. W., Niemeyer M., Ploegh H. L., & Kasper
D. L., 2002. Zwitterionic polysaccharides stimulate T cells by MHC class II-dependent
interactions. Journal of Immunology, 169, 6149-6153.
Kaminogawa S., 1996. Food allergy, oral tolerance and immunomodulation-Their
molecular and cellular mechanisms. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 60, 17491756.
Kankaanpa P., Sutasb Y., Salminena S., & Isolaurib E., 2003. Homogenates derived from
probiotic bacteria provide down-regulatory signals for peripheral blood mononuclear cells.
Food Chemistry, 83, 269-277.
Kaplan H., & Hutkins R., 2000. Fermentation of fructooligosaccharides by lactic acid
bacteria and bifidobacteria. Applied and Environnemental Microbiology, 66, 2682-2684.
Kato I., Tanaka K., & Yokokura T. 1999. Lactic acid bacterium potently induces the
production of interleukin-12 and interferon- by mouse splenocytes. International Journal of
Immunopharmacology, 21, 121-131.
Kaur I. P., Chopra K., & Saini A., 2002. Probiotics: potential pharmaceutical applications.
European Journal of Pharmaceutical Sciences, 15, 1-9.
Kawai T., Seki M., Hiromatsu K., Eastcott J. W., Watts G. F., Sugai M., Smith D. J.,
Porcelli S. A., & Taubman M. A., 1999. Selective diapedesis of Th1 cells induced by
endothelial cell RANTES. Journal of Immunology, 15, 3269-3278.
Kawakami K., 2003. Promising immunotherapies with Th1-related cytokines against
infectious diseases. Journal of Infections and Chemotherapy, 9, 201-209.
Kemp K., 2000. Cytokine-producing T cell subsets in human leishmaniasis. Archivum
Immunologiale Therapiae Experimentalis (Warsz), 48, 173-176.
Kerr M. A., 1990. The structure and function of human IgA. Biochemistry Journal, 271,
285-296.
Kidd P., 2003. Th1/Th2 balance: The hypothesis, its limitations, and implications for health
and disease. Alternative Medicine Review, 8, 223-246.
138
Kim J., Woo H. J., Kim Y. S., Kim K. H, & Lee H. J., 2003. Cell cycle dysregulation
induced by cytoplasm of Lactococcus latis ssp. lactis in SNUC2A, a colon cancer cell line.
Nutrition and Cancer, 46, 197-201.
Kim Y., Bae Y. S., Park J. C., Suh P. G., & Ryu S. H., 2001. The synthetic peptide, HisPhe-Tyr-Leu-Pro-Met, is a chemoattractant for Jukat T cells. Experimental and Molecular
Medecine, 33, 257-262.
Kimura K., McCartney A. L., McConnell M. A., & Tannock G. W., 1998. Analysis of fecal
populations of bifidobacteria and lactobacilli and investigation of the immunological
responses of their human hosts to the predominant strains. Applied and Environmental.
Microbiology, 63, 3394-3398.
Kirjavainen P. V., Elnezami H. S., Salminen S. J., Ahokas J. T., & Wright P. F. A., 1999.
Effects of orally administered viable Lactobacillus rhamnosus GG and Propionibacterium
freudenreichii subsp. shermanii JS on mouse lymphocyte proliferation. Clinical and
Diagnostic Laboratory Immunology, 6, 799–802.
Kitazawa H., Harata T., Uemura J., Saito T., Kaneko T., & Itoh T., 1998. Phosphate group
requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular
phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. International
Journal of Food Microbiology, 40, 169-175.
Kitazawa H., Ishii Y., Uemura J., Kawai Y., Saito T., Kaneko T., Noda K., & Itoh T., 2000.
Augmentation of macrophage functions by an extracellular phosphopolysaccharide from
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Food Microbiology, 17, 109-118.
Kitazawa H., Itoh T., Tomioka Y., Mizugaki M., & Yamaguchi T., 1996. Induction of IFNγ and IL-1a production in macrophages stimulated with phosphopolysaccharide produced
by Lactococcus lactis ssp. cremoris. International Journal of Food Microbiology, 31, 99106.
Klein G., 2003. Use of molecular methods in food microbiology with the example of
probiotic use of lactobacilli. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 116, 510-516.
Klinman D. M., Currie D., Gursel I., & Verthelyi D., 2004. Use of CpG
oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews, 199, 201-216.
Knopf P. M., 2000. Immunomodulation and allergy. Allergy Asthma Proceedings, 21, 215220.
Laas T., 1998. Isoelectric focusing. In Protein purification; Janson, J.-C., Ryden, L., Eds. p.
495; Wiley: Toronto, Canada.
139
Labischinski H., & Maidhof H., 1994. Bacterial peptidoglycan: overview and evolving
concepts. In J. M. Ghuysen and R. Hakenbeck, Bacterial Cell Wall, (pp. 23-38). Elsevier,
Amsterdam, Hollande.
Laemmli U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 22, 680-685.
Lammers K. M., Brigidi P., Vitali B., Gionchetti P., Rizzello F., Caramelli E., Matteuzzi
D., & Campieri M., 2003. Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and
IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunology and
Medical Microbiology, 38, 165-172.
Lancaster M., & Fields R. D., 1996. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays
using resazurin and poising agents. US patent #5501959.
Lauer E., & Kandler O., 1983. DNA-DNA homology, murein types and enzyme patterns
in the type strains of the genus Bifidobacterium. Systematic and Applied Microbiology, 4,
42-64.
Le Y., Murphy P. M., & Wang J. M., 2002. Formyl-peptide receptors revisited. Trends in
Immunology, 23, 541-548.
Lee J. W., Shin J. G., Kim E. H., Kang H. E., Yim I. B., Kim J. Y., Joo H. G. & Woo H. J.,
2004. Immunomodulatory and antitumor effects in vivo by the cytoplasmic fraction of
Lactobacillus casei and Bifidobacterium longum. Journal of Veterinary Sciences 5, 41-48.
Li Q., & Magee W. E., 1993. An antibody adsorption technique facilitates antigen selection
for development of serotype-specific monoclonal antibodies to Yersinia entercolitica.
Biotechniques, 14, 962-970.
Lilly D. M., & Stillwell R. H., 1965. Probiotics: growth-promoting factors produced by
microorganisms. Science, 147, 747-748.
Lima-Filho J. V., Vieira L.Q., Arantes R. M., & Nicoli J. R., 2004. Effect of the
Escherichia coli EMO strain on experimental infection by Salmonella enterica serovar
Typhimurium in gnotobiotic mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,
37, 1005-1013.
Lin H. C., Su B. H., Chen A. C., Lin T. W., Tsai C. H., Yeh T. F., & Oh W., 2005. Oral
probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth
weight infants. Pediatrics, 115, 1-4.
Litvak D. A, Evers B. M., Hwang K. O., Hellmich M. R., Ko T. C., Townsend C. M., Jr.,
1998. Butyrate-induced differentiation of Caco-2 cells is associated with apoptosis and
early induction of p21Waf1/Cip1 and p27Kip1. Surgery, 124, 161-169.
140
Lodinova-Zadnikova R., Cukrowska B., & Tlaskalova-Hogenova H., 2003. Oral
administration of probiotic Escherichia coli after birth reduces frequency of allergies and
repeated infections later in life (after 10 and 20 years). International Archives of Allergy
and Immunology, 131, 2009-2011.
Looijesteijn P. J., Trapet L., De vries E., Abee T., & Hugenholdz J., 2001. Physiological
function of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis. International Journal of
Food Microbilogy, 64, 71-80.
Macatonia S. E., Doherty T. M., Knight S. C., & O’Garra A., 1993. Differential effect of
IL-10 on dentritic cell-induced T cell proliferation and IFN- production. Journal of
Immunology, 150, 3755-3765.
Magnarelli L. A., Matthew Norris L., Steven J., & Fikrig E., 2002. Comparative reactivity
of human sera to recombinant VisE and other Borrelia burgdorferi antigens in classspecific enzyme-linked immnosorbant assays for Lyme borreliosis. Journal of Medicine
and Microbiology, 51, 649-655.
Makelainen H., Tahvonen R., Salminen S., & Ouwehand A. C., 2003. In vivo safety
assessment of two Bifidobacterium longum strains. Microbiology and Immunology, 47,
911-914.
Marasco W. A., Phan S. H., Krutzsch H., Showell H. J., Feltner D. E., Nairnll Becker R. E.
L., & Ward P. A., 1984. Purification and identification of formyl-Methionyl-LeucylPhenylalanine as the major peptide neutrophil chemotactic factor produced by Escherichia
coli. Journal of Biological Chemistry, 259, 5430-5439.
Marelli G., Papaleo E., & Ferrari A., 2004. Lactobacilli for prevention of urogenital
infections: a review. European Review of Medicine and Pharmacology Sciences, 8, 87-95.
Marin M. L., Lee J. H., Murtha J., Ustunol Z., & Pestika J. J., 1997. Differential cytokine
production in clonal macrophage and T-cell lines cultured with Bifidobacteria. Journal of
Dairy Science, 80, 2713-2720.
Markus S., Failing K., & Baumgartner W., 2002. Increased expression of pro-inflammatory
cytokines and lack of up-regulation of anti-inflammatory cytokines in early distemper CNS
lesions. Journal of Neuroimmunology, 125, 30-41.
Marteau P., & Vesa T., 1998. Pharmacokinetics of probiotics and biotherapeutic agents in
humans. Bioscience Microflora, 17, 1-6.
Marteau P., & Shanahan F., 2003. Basic aspects and pharmacology of probiotics: an
overview of pharmacokinetics, mechanisms of action and side effects. Best Practices &
Research Clinical Gastroenterology ,17, 725-740.
141
Masco L., Ventura M., Zink R., Huys G., & Swings J., 2004 . Polyphasic taxonomic
analysis of Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactis reveals relatedness at the
subspecies level: reclassification of Bifidobacterium animalis as Bifidobacterium animalis
subsp. animalis subsp. nov. and Bifidobacterium lactis as Bifidobacterium animalis subsp.
lactis subsp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54,
1137-1143.
Mastrandrea F., Coradduzza G., Serio G., Minardi A., Manelli M., Ardito S., & Muratore
L., 2004. Probiotics reduce the CD34+ hemopoietic precursor cell increased traffic in
allergic subjects. Allergy and Immunology (Paris), 36, 118-122.
Matsuguchi T., Takagi A., Matsuzaki T., Nagaoka M., Ishikawa K., Yokokura T., &
Yoshikai Y., 2003. Lipoteichoic acids from Lactobacillus strains elicit strong tumor
necrosis factor alpha-inducing activitives in macrophages through toll-like receptor 2.
Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 10, 259-266.
Matsumoto M., & Benno Y., 2004. Consumption of Bifidobacterium lactis LKM512 yogurt
reduces gut mutagenicity by increasing gut polyamine contents in healthy adult subjects.
Mutation Research, 568, 147-153.
Matsuzaki T., & Chin J., 2000. Modulating immune response with probiotic bacteria.
Immunology and Cell Biology, 78, 67-73.
Matteuzzi D., Crociani F., Zani G. & Trovatelli L. D., 1971. Bifidobacterium suis n. sp.: a
new species of the genus Bifidobacterium isolated from pig feces. Zeitschrift Fur
Allgemeine Mikrobiologie, 11, 387-395.
Mattila-Sandholm T., Matto J., & Saarela M., 1999. Lactic acid bacteria with health claimsinteraction and interference with gastrointestinal flora. International Dairy Journal, 9, 2535.
Matto J., Malinen E., Suihko M. L., Alander M., Palva A., & Saarela1 M., 2004. Genetic
heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. Journal of Applied
Microbiology, 97, 459-470.
McCarthy J., O'Mahony L., O'Callaghan L., Sheil B., Vaughan E. E., Fitzsimons N.,
Fitzgibbon J., O'Sullivan G. C., Kiely B., Collins J. K., & Shanahan F., 2003. Double blind,
placebo controlled trial of two probiotic strains in interleukin 10 knockout mice and
mechanistic link with cytokine balance. Gut,52, 975-980.
McCracken V. J., & Lorenz R. G., 2001. The gastrointestinal ecosystem: a precarious
alliance among epithelium, immunity and microbiota. Cellular Microbiology, 3, 1-11
McGuirk P., & Mills K. H.G., 2002. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in
the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends in Immunology, 23, 450455.
142
McHeyzer-Williams L. J., & McHeyzer-Williams M. G., 2005. Antigen specific memory
B cell development. Annual Review of Immunology, 23, 487-513.
Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., & Janeway C. A. Jr, 1997. A human homologue of the
Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 388, 394-397.
Meile L., Rohr L. M., Geissmann T. A., Herensperger M., & Teuber M., 2001.
Characterization of the D- xylulose 5 phosphate/ D-fructose 6-phosphate phosphoketolase
gene (xfp) from Bifidobacterium lactis. Journal of Bacteriology, 183, 2929-2936.
Mercenier A., Pavan S., & Pot B., 2002. Probiotics as biotherapeutic agents: Present
knowledge and future prospects. Current Pharmaceutical Design, 8, 99-110.
Metchnikoff E., 1907. The prolongation of life. In Optimistic Studies (Heinemann W., Ed.),
pp. 1-100. G. P. Putnam and Sons, London, UK.
Metzger H., 1970. Structure and function of gamma M macroglobulins. Advances in
Immunology, 12, 57-116.
Meydani S. N., & Ha N. K., 2000. Immunological effects of yogourt. American Journal of
Clinical Nutrition, 71, 861-872.
Mitsuoka T., 1969. Comparative studies on bifidobacteria isolated from the alimentary tract
of man and animals incluing descriptions of Bifidobacterium thermophilum nov. spec. and
Bifidobacterium pseudolongum nov. spec. Zentralblatt fur Bakteriologie, 210, 52-64.
Mitsuoka T., 1989. Microbes in the intestine. Ed. Yakult Honsha Co., Tokyo, Japan
Mitsuoka T., 1990. Bifidobacteria and their role in human health. Society for Microbiology,
288, 263-267.
Miyake T., Watanabe K., Watanabe T., & Oyaizu H., 1998. Phylogenetic analysis of the
genus Bifidobacterium and related genera based on 16S rDNA sequences. Microbiology
and Immunology, 42, 661-667.
Monteleone I., Vavassori P., Biancone L., Monteleone G., & Pallone F., 2002.
Immunoregulation in the gut: success and failures in human disease. Gut, 50, 60-64.
Moore W. E. C., & Holdeman L. V., 1974. Human faecal flora: the normal flora of 20
Japanese-Hawaiians. Applied Microbiology, 27, 961-979.
Moreillon P., & Majcherczyk P. A., 2003. Proinflammatory activity of cell-wall
constituents from Gram-positive bacteria. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 35,
632-641.
143
Morita H., He F., Fuse T., Ouwehand A. C., Hashimoto H., Hosoda M., Mizumachi K., &
Kurisaki J. I., 2002. Cytokine production by the murine macrophage cell line J774.1 after
exposure to lactobacilli. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 66,1963-1966.
Mortensen P. B., & Clausen M. R., 1996. Short-chain fatty acids in the human colon:
relation to gastrointestinal health and disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology,
216, 132-148.
Mosmann T. R., & Coffman R. L., 1989. Th1 and Th2 cells. Different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of
Immunology, 7, 145-173.
Mullié C., Yazourth A., Singer E., Lecroix F., Blareau J. P., Romond M. B., & Romond C.,
2002. Partial characterization of Bifidobacterium breve C50 cell-free whey compounds
inducing modifications to the intestinal microflora. Journal of Dairy Science, 85, 13831389.
Nader de Macìas M. E., Apella M. C., Romero N. C., González S. N., & Oliver G., 1992.
Inhibition of Shigella sonnei by Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. Journal
of Applied Bacteriology, 73, 407-411.
Nast C. C., & LeDuc L. E., 1988. Chemotactic peptides. Mechanisms, functions, and
possible role in inflammatory bowel disease. Digestive and Disease Sciences, 33, 50- 57.
Neurath M. F., Finotto S., & Glimcher L. H., 2002. The role of Th1/Th2 polarization in
mucosal immunity. Nature Medicine, 8, 567-573.
Neumann E., Oliveira M. A., Cabral C. M., Moura L. N., Nicoli J. R., Vieira E. C., Cara D.
C., Podoprigora G. I., & Vieira L. Q., 1998. Monoassociation with Lactobacillus
acidophilus UFV-H2b20 stimulates the immune defense mechanisms of germfree mice.
Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 31, 1565-1573.
Nishimura-Uemura J., Kitazawa H., Kawai Y., Itoh T., Oda M., & Saito T., 2003.
Functional alteration of murine macrophages stimulated with extracellular polysaccharides
from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1. Food Microbiology, 20, 267273.
Nouaille S., Ribeiro L. A., Miyoshi A., Pontes D., Le Loir Y., Costa Oliveira S., Langella
P., & Azevedo V., 2003. Heterologous protein production and delivery systems for
Lactococcus lactis. Genetics and Molecular Research, 2, 102-111.
Noverr M. C., & Huffnagle1 G. B., 2004. Does the microbiota regulate immune responses
outside the gut? Trends in Microbiology, 12, 562-568.
144
Oda M., Hasegawa H., Komatsu S., Kambe M., & Tsuchiya F., 1983. Anti-tumor
polysaccharide from Lactobacillus sp.. Agricultural and Biological Chemistry, 47, 16231625.
Ogawara H., Handa H., Yamazaki T., Toda T., Yoshida K., Nishimoto N., & Al-Ma'quol,
2005. High Th1/Th2 ratio in patients with multiple myeloma. Leukemia Reserach, 29, 135140.
Ollier William E. R., 2004. Cytokine genes and disease susceptibility. Cytokine, 28, 174178.
Orla-Jensen S., 1924. La classification des bactéries lactiques. Lait 4, 468-474.
Ouwehand A. C., & Vesterlund S., 2003. Health aspects of probiotics. Drugs, 6, 573-580.
Ouwehand A. C., Kirjavainen P. V., Gronlund M. M., Isolauri S. J., & Salminen S., 1999.
Adhesion of probiotic microorganisms to intestinal mucus. International Dairy Journal, 9,
623-630.
Ouwehand A., Isolauri E., & Salminen S., 2002. The role of the intestinal microflora for the
development of the immune system in early childhood. European of Journal Nutrition, 41,
32- 37.
Panaro M. A., & Mitolo V., 1999. Cellular responses to FMLP challenging: a mini-review.
Immunopharmacology and Immunotoxicology, 21, 397-419.
Parker R. B., 1974. Probiotics, the other half of the antibiotic story. Animal Nutrition and
Health, 29, 4-8.
Pathmakanthan S., Li C. K., Cowie J., & Hawkey C. J., 2004. Lactobacillus plantarum 299:
beneficial in vitro immunomodulation in cells extracted from inflamed human colon.
Journal of Gastroenterology and Hepatology, 19, 166-173.
Pavan S., Desreumaux P., & Mercenier A., 2003. Use of mouse models to evaluate the
persistence, safety, and immune modulation capacities of lactic acid bacteria. Clinical and
Diagnostic Laboratory Immunology, 10, 696-701.
Peeters T., & Vantrappen G., 1975. The paneth cell: a source of intestinal lysozyme. Gut,
16, 553-558.
Perdigon G., Fuller R., & Raya R., 2001. Lactic acid bacteria and their effect on the
immune system. Current Issues Intestinal Microbiology, 2, 17-42.
Perdigon G., Locascio M., Medici M., Pesce de Ruiz Holgado A., Oliver G., 2003.
Interaction of bifidobacteria with the gut and their influence in the immune function.
Biocell, 27, 1-9.
145
Perdigon G., Maldonado Galdeano C., Valdez J. C., Medici M., 2002. Interaction of lactic
acid bacteria with the gut immune system. European Journal of Clinical Nutrition, 56, 2126.
Pessi T., Sütas Y., Saxelin M., Kallioinen H., & Isolauri E., 1999. Antiproliferative effects
of homogenates derived from five strains of candidate probiotic bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, 65, 4725-4728.
Pestka J. J., Ha C. L., Warner R. W., Lee J. H., & Ustunol Z., 2001. Effects of ingestion of
yogurts containing Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus on spleen and Peyer's
patch lymphocyte populations in the mouse. Food Protection., 64, 392-395.
Pfeifer A., & Rosat J. P., 2000. Probiotics in alimentation: clinical evidence for their
enhancement of the natural immunity of the gut. In Probiotics, other nutritional factors and
intestinal microflora. Lippincott-Raven, (pp. 243-257), Philadelphia.
Plummer S., Weaver M. A., Harris J. C., Dee P., & Hunter J., 2004. Clostridium difficile
pilot study: effects of probiotic supplementation on the incidence of C. difficile diarrhoea.
International Microbiology, 7, 59-62.
Prasad J., McJarrow P., & Gopal, P., 2003. Heat and osmotic stress responses of probiotic
Lactobacillus rhamnosus HN001 (DR20) in relation to viability after drying. Applied and
Environmental Microbiology, 69, 917-925.
Prioult, G., Fliss, I., & Pecquet, S., 2003. Effect of probiotic bacteria on induction and
maintenance of oral tolerance to β-lactoglobulin in gnotobiotic mice. Clinical Diagnostic
and Laboratory Immunology, 10, 787-792.
Pulendran B., 2004. Modulating Th1/Th2 responses with microbes, dendritic cells, and
pathogen recognition receptors. Immunology Research., 29, 187-196.
Pyo C. W, Hur S. S., Kim Y. K., Choi H. B., Hong Y. S., Kim D. W., Kim C. C., Kim H.
K., & Kim T. G., 2003. Polymorphisms of IL-1B, IL-1RN, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, and
IFN-gamma genes in the Korean population. Human Immunology, 64, 979-989.
Rangavajhyala N., Shahani M., Sridevi G., & Srikumaran S., 1997. Nonlipopolysaccharide
component(s) of Lactobacillus acidophilus stimulate(s) the production of interleukin-1
alpha and tumor necrosis factor-alpha by murine macrophages. Nutrition and Cancer, 28,
130-134.
Rastall R. A., 2004. Bacteria in the gut: Friends and foes and how to alter the balance.
Journal of Nutrition, 134, 2022-2026.
146
Reddy B. S., & Rivenson A., 1993. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon,
mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo (4,5-f) quinoline,
a food mutagen. Cancer Research, 53, 3914-3918.
Reid G., & Burton J., 2002. Use of Lactobacillus to prevent infection by pathogenic
bacteria. Microbes and Infection, 4, 319-324.
Reid G., Charbonneau D., Erb J., Kochanowski B., Beuerman D., Poehner R., & Bruce A.
W., 2003. Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14
significantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women.
FEMS Immunology and Medical Microbiology, 35, 131-134.
Reid G., Siang Gan B., She Y. M., Ens W., Weinberger S., & Howard J. C., 2002. Rapid
identification of probiotic Lactobacillus biosurfactant proteins by proteinchip tandem mass
spectrometry tryptic peptide sequencing. Applied and Environmental Microbiology, 68,
977-980.
Report of FAO/WHO, 2002. Report of a joint FAO/WHO working group on drafting
guidelines for the evaluation of probiotics in food. London Ontario, Canada, April 30 and
May 1, pp 1-11.
Ricciardi A., & Clementi F., 2000. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: structure,
production and technological applications. Italian Journal of Food Science, 12, 23-45.
Rinkinena M., Jalavab K., Westermarcka E., Salminenc S., & Ouwehand A. C., 2003.
Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor
for intestinal Enterococcus faecium colonization? Veterinary Microbiology, 92, 111-119.
Roberts C. M., Fett W. F., Osman S. F., Wijey C., O’Connor J. V., & Hoover D.G., 1995.
Exopolysaccharide production by Bifibobacterium longum BB-79. Journal of Applied
Bacteriology, 78, 463-468.
Robinson D. S., 2004. T-cell cytokines: what we have learned from human studies.
Paediatric respiratory reviews, 5, 53-58.
Rolfe R. D., 2000. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health.
Journal of Nutrition, 130, 396- 402.
Romagnani S., 2004. Immunologic influences on allergy and the Th1/Th2 balance. Jounal
of Allergy and Clinical Immunology, 113, 395-400.
Roman M., Martin-Orozco E., Goodman J. S., Nguyen M. D., Sato Y., Ronaghy A.,
Kornbluth R. S., Richman D. D., Carson D.A., & Raz E., 1997. Immunostimulatory DNA
sequences function as T helper-1 promoting adjuvants. Nature Medicine, 3, 849-854.
147
Rook G.A., & Brunet L. R., 2005. Microbes, immunoregulation, and the gut. Gut, 54, 31720.
Rosenfeldt V., Benfeldt E., Valerius N. H., Paerregaard A., & Michaelsen K. F., 2004.
Effect of probiotics on gastrointestinal symptoms and small intestinal permeability in
children with atopic dermatitis. Journal of Pediatry, 145, 612-616.
Rosenfeldt V., Michaelsen K. F., Jakobsen M., Larsen C.N., Moller P. L., Pedersen P.,
Tvede M., Weyrehter H., Valerius N. H., Paerregaard A., 2002. Effect of probiotic
Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea. Pediatry and
Infectious Diseases Journal, 21, 411-416.
Ruas-Madiedo P., Hugenholtz J., & Zoon P., 2002. An overview of the functionality of
exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 12, 163171.
Ruiz-Bravo A., Jimenez-Valera M., Moreno E., Guerra V., & Ramos-Cormenzana A.,
2001. Biological response modifier activity of an exopolysaccharide from Paenibacillus
jamilae CP-7. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8, 706-710.
Saarela M., Mogensen G., Fondén R., Matto J., & Mattila-Sandholm T., 2000. Probiotic
bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology, 84, 197215.
Saavedra J. M, & Tschernia A., 2002. Human studies with probiotics and prebiotics:
clinical implications. British Journal of Nutrition, 87, 241-246.
Saito T., 2004. Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus
acidophilus group and their applications to functional foods. Animal Science Journal, 75, 113.
Salmimen S., Von Wright A., Morelli L., Marteau P., Brassard D., de vos W. M., Fonden
R., Saxelin M., Collins K., Mogensen G., Birkeland S. E., & Mattila Sandholm T., 1998.
Demonstration of safety of probiotics- a review. International Journal of Food
Microbiology, 44, 93- 106.
Salminen S., Isolauri E., & Salminen, E., 1996. Clinical uses of probiotics for stablising gut
mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70,
347-358.
Samartsev A. A., Astapovich N. I., & Novik G. I., 2000. Production of cell-wall-bound
proteinases in Bifidobacterium adolescentis 94-BIM. Microbiology, 69, 655-658.
Sanders M. E., 2000. Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human
health. Journal of Nutrition, 130, 384-390.
148
Saxelin M., Pessi T., & Salminen S., 1995. Fecal recovery following oral administration of
Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) in gelatine capsules to healthy volunteers.
International Journal of Food Microbiology, 25, 199-203.
Scardovi V., & Trovatelli L. D., 1974. Bifidobacterium animalis (Mitsuoka) comb. nov.
and the ‘minimum’ and ‘subtile’ groups of new bifidobacteria found in sewage.
International Journal of Systematic Bacteriology, 24, 21-28.
Scardovi V., 1984. Genus Bifidobacterium Orla-Jensen, 1924, 472, p. 1418-1434. In
Bergey’s manual of systematic bacteriology. Krieg N.R. and Holt J.G. (eds), , Vol. 1.
Williams and Wilkins, Baltimore, Md, USA.
Schiffmann E., Showell H. J., Corcoran B. A., Ward P. A., Smith E., & Becker E. L., 1975.
The isolation and partial characterization of neutrophil chemotactic factors from
Escherichia coli. Journal of Immunology, 114, 1831- 1837.
Schiffrin E. J., & Blum S., 2002. Interactions between the microbiota and the intestinal
mucosa. European Journal of Clinical Nutrition, 56, 60-64.
Schloter M., Assmus B., & Hartmann A., 1995. The use of immunological methods to
detect and identify bacteria in the environment. Biotechnology Advances, 13, 75-90.
Schrezenmeir J., & de Vrese M., 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics-approaching a
definition. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 361- 364.
Schultz M., Linde H. J., Lehn N., Zimmermann K., Grossmann J., Falk W., & Scholmerich
J., 2003. Immunomodulatory consequences of oral administration of Lactobacillus
rhamnosus strain GG in healthy volunteers. Journal of Dairy Research,70, 165-173.
Screekumar O., & Hosono A., 1998. The antimutagenic properties of a polysaccharide
produced by Bifibobacterium longum and its cultured milk against some heterocyclic
amines. Canadian Journal of Microbiology, 44, 1029-1036.
Sgouras D., Maragkoudakis P., Petraki K., Martinez-Gonzalez B., Eriotou E., S.
Michopoulos, Kalantzopoulos G., Tsakalidou E., & Mentis A., 2004. In vitro and in vivo
inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacillus casei strain shirota. Applied and
environmental microbiology, 70, 518-526.
Shah N. P., 2000. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods.
Journal of Dairy Sciences, 83, 894-907.
Sheikh A., & Strachan D., 2004. The hygiene theory: fact or fiction? . Current Opinion in
Otolaryngology & Head & Neck Surgery, 12, 232-236.
Sherwood L., & Gorbach M. D., 2000. Probiotics and gastrointestinal health. American
Journal of Gastroenterology, 95, 1-4.
149
Shu Q., Lin H., Rutherfurd K. J., Fenwick S. G., Prasad J., Gopal P. K., & Gill H. S., 2000.
Dietary Bifidobacterium lactis (HN019) enhances resistance to oral Salmonella
typhimurium infection in mice. Microbiology and Immunology, 44, 213-222.
Simons C. D., Ciardi A., Grassi A., Gardini S. L., Tzantzoglou S., Trinchieri V., Moretti S.,
& Jirillo E., 1992. Effect of Bifibobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus of gut
mucosa and peripheral blood B lymphocytes. Immunopharmacology and
Immunotoxicology, 14, 333-340.
Simpson P. J., Stanton C., Fitzgerald G. F. & Ross R. P., 2003. Genomic diversity and
relatedness of bifidobacteria isolated from a porcine cecum. Journal of Bacteriology, 185,
2571-2581.
Spahn T. W., & Kucharzik T., 2004. Modulating the intestinal immune system: The role of
lymphotoxin and galt organs. Gut, 53, 456-465.
Spellberg B., & Edwards J. E., 2001. Type 1/Type 2 immunity in infectious diseases.
Clinical Infectious Diseases, 32, 76-102.
Sreekumar, O., & Hosono A., 1998. The antimutagenic properties of a polysaccharide
produced by Bifibobacterium longum and its cultured milk against some heterocyclic
amines. Canadian Journal of Microbiology, 44, 1029-1036.
Standford T. J., Arenberg D. A, Danforth J. M., Kunkel S. L., Van Otteren G. M., &
Strieter R. M., 1994. Lipoteichoique acid induces secretion of interleukin-8 from human
blood monocytes: a cellular and molecular analysis. Infection and Immunity, 62, 119-125.
Stanton C., Gardiner G., Meehan H., Collins K., Fitzgerald G., Lynch P. B., & Ross R . P.,
2001. Market potential for probiotics. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 476- 483.
Stingele F., Corthesy B., Kusy N., Porcelli S. A., Kasper D. L., & Tzianabos A. O., 2004.
Zwitterionic polysaccharides stimulate T cells with no preferential V{beta} usage and
promote anergy, resulting in protection against experimental abscess formation. Journal of
Immunology, 172, 1483-1490.
Sullivan A., & Nord C. E., 2002. The place of probiotics in human intestinal infections.
International Journal of Antimicrobial Agents, 20, 313-319.
Sullivan A., & Nord C. E., 2005. Probiotics and gastrointestinal diseases. Journal of
Internal Medicine, 257, 78-92.
Sun J., Walsh M., Villarino A. V., Cervi L., Hunter C. A., Choi Y., & Pearce E. J., 2005.
TLR ligands can activate dendritic cells to provide a MyD88-dependent negative signal for
Th2 cell development. Immunology, 174, 742-751.
150
Sun S., Zhang X., Tough D. F., & Sprent J., 1998. Type I interferon-mediated stimulation
of T cells by CpG DNA. Journal of Experimental Medicine, 188, 2335-2342.
Svensson L., Dahlgren C., & Wenneras C., 2002. The chemoattractant Trp-Lys-Tyr-MetVal-D-Met activates eosinophils through the formyl peptide receptor and one of its
homologues, formyl peptide receptor-like 1. Journal of Leukocyte Biology, 72, 810-818.
Swain S. L., 1993. IL-4 dictates T-cell differentiation. Research in Immunology, 144, 616620.
Takeuchi O., Hoshino K., & Akira S., 2000. Cutting edge: TLR2-deficient and MyD88deficient mice are highly susceptible to Staphylococcus aureus infection. Journal of
Immunology, 165, 5392-5396.
Tan Y. J, Zhang Y. B., Feng D. Y., Xie B., Lin Z.Y., Chen H. G., & Li Y. G., 2004. The
change and the clinical significance of peripheral blood Th1/Th2 cells in patients with
pulmonary tuberculosis. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 27, 385-389.
Tanaka K., & Ishikawa H., 2004. Role of intestinal bacterial flora in oral tolerance
induction. Histology and Histopathology, 19, 907-914.
Tang X. L., Peppler M. S., Irvin R. T., & Suresh M. R., 2004. Use of bispecific antibodies
in molecular velcro assays whose specificity approaches the theoretical limit of
immunodetection for Bordetella pertussis. Clinical Diagnostic and
Laboratory
Immunology, 11, 752-757.
Tannock G. W., 1999a. The normal microflora: an introduction. In Medical importance of
normal microflora. Tannock, G. W., Ed., pp. 1-23, Kluwer Academic Publishers, London,
UK.
Tannock G. W., 1997. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for
fundamental R & D. Trends in Biotechnology, 15, 270-274.
Tannock G. W., 1999b. Analysis of the intestinal microflora: a renaissance. Antonie Van
Leeuwenhoek. 76, 265-278.
Tannock G. W., Munro K., Bibiloni R., Simon M. A., Hargreaves P., Gopal P., Harmsen
H., & Welling G., 2004. Impact of consumption of oligosaccharide-containing biscuits on
the fecal microbiota of humans. Applied and Environmental Microbiology, 70, 2129-2136.
Tejada-Simon M. V., & Pestka J. J., 1999. Proinflammatory cytokine and nitric oxide
induction in murine macrophages by cell wall and cytoplasmic extracts of lactic acid
bacteria. Journal of Food Protection, 62, 1435-1444.
Till S. J., Francis J. N., Nouri-Aria K., F. R. C. Path, & Durham S. R., 2004. Mechanisms
of immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113, 1025-1034.
151
Tlaskalová-Hogenová H., Štepánková R., Hudcovic T., Tucková L., Cukrowskab B.,
Lodinová-Žádnıková R., Kozáková H., Rossmanna P., Bártová J., Sokol D., Funda D. P.,
Borovská D., Reháková Z., Šinkora J., Hofmana J., Drastich P., & Kokešová A., 2004.
Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and
autoimmune diseases. Immunology Letters, 93, 97-108.
Tobian A. A., Canaday D. H., Boom W. H., & Harding C. V., 2004. Bacterial heat shock
proteins promote CD91-dependent class I MHC cross-presentation of chaperoned peptide to
CD8+ T cells by cytosolic mechanisms in dendritic cells versus vacuolar mechanisms in
macrophages. Journal of Immunology, 172, 5277-5286.
Tomasî icâ J., Dujmovicâ I. H., Ï poljar B., Vranesi icâ B., Ï antak M. S., & Jovici icâ A.,
2000. Comparative study of the effects of peptidoglycan monomer and structurally related
adamantyltripeptides on humoral immune response to ovalbumin in the mouse. Vaccine,18,
1236-1243.
Tone-Shimokawa Y., Toida T., & Kawashima T., 1996. Isolation and structural analysis of
polysaccharide containing galactofuranose from the cell walls of Bifidobacterium infantis.
Journal of Bacteriology, 178, 317-320.
Touré R., Kheadr E., Lacroix C., Moroni O., & Fliss I., 2003. Production of antibacterial
substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria
monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, 95, 1058-1069.
Townsend M. J., & McKenzie A. N., 2000. Unravelling the net ? cytokines and diseases.
Journal of Cell Sciences, 113, 3549-3550.
Trindade C. S. F., & Grosso C. R. F., 2000. The effect of the immobilisation of
Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in alginate on their tolerance to
gastrointestinal secretions. Milchwissenschaft-Milk Science International, 55, 496-499.
Tuinier R., van Casteren W. H. M., Looijesteijn P. L., Schols H. A., Voragen A. G. J., &
Zoon P., 2001. Effects of structural modifications on some physical characteristics of
exopolysaccharides from Lactoccus lactis. Biopolymers, 59, 160-166.
Turchet P., Laurenzano M., Auboiron S., & Antoine J. M., 2003. Effect of fermented milk
containing the probiotic Lactobacillus casei DN-114001 on winter infections in free-living
elderly subjects: a randomised, controlled pilot study. Journal of Nutrition and Health
Aging, 7, 75-77.
Tursi A., Brandimarte G., Giorgetti G. M., & Modeo M. E., 2004. Effect of Lactobacillus
casei supplementation on the effectiveness and tolerability of a new second-line 10-day
quadruple therapy after failure of a first attempt to cure Helicobacter pylori infection.
Medical Science Monitor, 10, 662-666.
152
Tzianabos A. O., Finberg R. W., Wang Y., Chan M., Onderdonk A. B., Jennings, H. J., &
Kasper D. L., 2000. T cells activated by zwitterionic molecules prevent abscesses induced
by pathogenic bacteria. Journal of Biological Chemistry, 275, 6733.
Tzianabos A. O., Wang J. Y., & Kasper D. L., 2001. Structural rationale for the modulation
of abscess formation by Staphylococcus aureus capsular polysaccharides. Proceedings of
the National Academy Science of USA, 98, 9365.
Tzianabos A., Wang J. Y., & Kaspera D. L., 2003. Biological chemistry of
immunomodulation by zwitterionic polysaccharides. Carbohydrate Research, 338, 25312538.
Ulisse S., Gionchetti P., D’Alo S., Paola Russo F., Pesce I., Ricci G., Rizzello F., Helwig
U., Grazia Cifone M., M. Campieri, & De Simone C., 2001. Expression of cytokines,
inducible nitric oxide synthase, and matrix metalloproteinases in pouchitis: Effects of
probiotic treatment. The americain Journal of Gastroenterology, 96, 2691-2699.
Valentini G., Baroni A., Esposito K., Naclerio C., Buommino E., Farzati A., Cuomo G., &
Farzati B., 2001. Peripheral blood T lymphocytes from systemic sclerosis patients show
both Th1 and Th2 activation. Journal of Clinical Immunology, 21, 210-217.
Valeur N., Engel P., Carbajal N., Connolly E., & Ladefoged K., 2004. Colonization and
immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal
tract. Applied and Environmental Microbiology, 70, 1176-1181.
van Amelsfort J. M, Jacobs K. M, Bijlsma J. W., Lafeber F. P., & Taams L. S., 2004.
CD4+CD25+ regulatory T cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence,
phenotype, and function between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis
Rheumatism., 50, 2775-2785.
Van Calsteren M. R., Pau-Roblot C., Begin A., & Roy D., 2002. Structure determination of
the exopolysaccharide produced by Lactobacillus rhamnosus strains RW-9595M and R.
Biochemical Journal, 363, 7-17.
Vaningelgem F., Zamfir M., Mozzi F., Adriany T., Vancanneyt M., Swings J., De Vuyst L.,
2004. Biodiversity of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus strains
is reflected in their production and their molecular and functional characteristics. Applied
and Environmental microbiology, 70, 2900-2912.
Varcoe J. J., Krejcarek G., Busta F., & Brady L., 2003. Prophylactic feeding of
Lactobacillus acidophilus NCFM to mice attenuates overt colonic hyperplasia. Journal of
Food Protection, 66, 457-465.
Velazquez P., Wei B., & Braun J., 2004. Surveillance B lymphocytes and mucosal
immunoregulation. Springer Seminars in Immunopathology, Dec 18 (Epub ahead of print).
153
Ventura M., van Sinderen D., Fitzgerald G. F., & Zink R., 2004. Insights into the
taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. Antonie van Leeuwenhoek,86, 205223.
Verdu E. F, Bercik P., Bergonzelli G. E., Huang X. X., Blennerhasset P., Rochat F., Fiaux
M., Mansourian R., Corthesy-Theulaz I., & Collins S. M., 2004 Lactobacillus paracasei
normalizes muscle hypercontractility in a murine model of postinfective gut dysfunction.
Gastroenterology, 127, 826-837.
Vermont C. L., Dijken H. H van., Kuipers A. J., Limpt C. J. P. Van, Keijzers W. C. M.,
Ende A. van der, Groot R. de, Alphen L. van, & van den Dobbelsteen G. P. J. M., 2003.
Cross-reactivity of antibodies against PorA after vaccination with a meningococcal B outer
membrane vesicle vaccine. Infection and immunity, 71, 1650-1655.
Villarino A. V., Huang E., & Hunter C. A., 2004. Understanding the pro- and antiinflammatory properties of IL-27. Immunology, 173, 715-720.
Vinderola C. G, Medici M., & Perdigon G., 2004. Relationship between interaction sites in
the gut, hydrophobicity, mucosal immunomodulating capacities and cell wall protein
profiles in indigenous and exogenous bacteria. Journal of Applied Microbiology, 96, 23043.
Vitali B., Candela M., Matteuzzi D., & Brigidi P., 2003. Quantitative detection of probiotic
Bifidobacterium strains in bacterial mixtures by using real-time PCR. Systematic and
Applied Microbiology, 26, 269-276.
Von der Weid T., Ibnou-Zekri N., & Pfeifer A., 2002. Novel probiotics for the management
of allergic inflammation. Digestive and Liver disease, 349, 25-28.
Von Heijne G., 1990. The signal peptide. Journal of Membrane Biology, 115, 195-201.
Wallinder I. B., & Neujahr H. Y., 1971. Cell wall and peptidoglycan from Lactobacillus
fermenti. Journal of bacteriology, 105, 918-926.
Wang J. E., Dahle M. K., McDonald M., Foster S. J., Aasen A. O., & Thiemermann C.,
2003. Peptidoglycan and lipoteichoic acid in gram-positive bacterial sepsis: receptors,
signal transduction, biological effects, and synergism. Shock, 20, 402-414.
Wang J. L., Kang L., & Jia H. L., 2004. Generation and characterization of monoclonal
antibodies against Botulinum neurotoxin type A (BoNT/A). Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue
Za Zhi. 20, 83-85.
Wang M. F., Lin H. C., Wang Y. Y., & Hsu C. H., 2004. Treatment of perennial allergic
rhinitis with lactic acid bacteria. Pediatric Allergy and Immunology, 15, 152-158.
154
Wang X., Brown I. L., Evans A. J., & Conway P. L., 1999. The protective effects of high
amylose maize (amylomaize) starch granules on the survival of Bifidobaterium spp. in the
mouse intestinal tract. Journal of Applied Microbiology, 87, 631-639.
Wang P. H., Hsu C. I., Tang S. C., Huang Y. L., Lin J. Y., & Ko J. L., 2004. Fungal
immunomodulatory protein from Flammulina velutipes induces interferon-gamma
production through p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52, 2721-2725.
Ward P. A., Lepow I. H., & Newman L. J., 1968. Bacterial factors chemotactic for
polymorphonuclear leukocytes. American Journal of Pathology, 52, 725-736.
Weintraub A., 2003. Immunology of bacterial polysaccharide antigens. Carbohydrate
Research, 338, 2539-2547.
Welman A. D., & Maddox I. S., 2003. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria:
perspectives and challenges. Trends in Biotechnology, 21, 269-274.
Whitfield C., & Valvano M. A, 1993. Biosynthesis and expression of cell-surface
polysaccharides in gram-negative bacteria. Advances in Microbiology and physiology, 35,
135-146.
Yamamoto A., Usami H., Nagamuta M., Sugawara Y., Hamada S., Yamamoto T., Kato K.,
Kokeguchi S., & Kotani S., 1985. The use of lipoteichoic acid (LTA) from Streptococcus
pyogenes to induce a serum factor causing tumour necrosis. British Journal of Cancer, 51,
739-742.
Yamazaki S., Machii K., Tsuyuki S., Momose H., Kawashima T., & Ueda K, 1985.
Immunological responses to monoassociated Bifidobacterium longum and their relation to
prevention of bacterial invasion. Immunology, 56, 43-50.
Yamazaki S., Tsuyuki S., Akashiba H., Kamimura H., Kimura M., Kawashima T., & Ueda
K., 1991. Immune response of Bifidobacterium-monoassociated mice. Bifidobacteria
Microflora, 10, 19-31.
Yan F., & Polk D. B., 2002. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in
intestinal epithelial cells. The journal of biological chemistry, 27, 50959-50965.
Yasui H., Shida K., Matsuzaki T., & Yokokura T., 1999. Immunomodulatory function of
lactic acid bacteria. Antoine Leewenhoekn international journal of general and molecular
Microbiology, 76, 383-38.
Yazdanbakhsh M., & Rodrigues L. C., 2001. Allergy and the hygiene hypothesis: the
Th1/Th2 counterregulation can not provide an explanation. Wiener Klinische Wochenschrift,
113, 899-902.
155
Yildirim Z., & Johnson M. G., 1998. Characterization and antimicrobial spectrum of
bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. Journal of
Food Protection, 61, 47-51.
Zachariae C. O., Jinquan T., Nielsen V., Kaltoft K., & Thestrup-Pedersen K., 1992.
Phenotypic determination of T-lymphocytes responding to chemotactic stimulation from
fMLP, IL-8, human IL-10, and epidermal lymphocyte chemotactic factor. Archives of
Dermatology Research, 284, 333-338.
Zarate S., & Lopez-Leiva M. H., 1990. Oligosaccharide formation during enzymatic lactose
hydrolysis: a literature review. Journal of Food Protection, 53, 262-268.
Zoetendal E. G., Collier C. T., Koike S., Mackie R. I., & Askins H. R., 2004. Molecular
ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: A review. Journal of Nutrition, 134,
465-472.