contribution à l`étude du pouvoir immunomodulateur des

TAHAR AMROUCHE
CONTRIBUTION À L’ÉTUDE DU POUVOIR IMMUNOMODULATEUR
DES BIFIDOBACTÉRIES : ANALYSE IN VITRO ET ÉTUDE EX VIVO
DES MÉCANISMES MOLÉCULAIRES IMPLIQUÉS
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Sciences et Technologie des aliments
pour l’obtention du grade de Philosophiæ doctor (Ph.D.)
DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION
FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2005
© Tahar Amrouche, 2005

Résumé
Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets
bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes
fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont
rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches
probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes
impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce
projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries
isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels
ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois
souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides (B.
thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis
Bb12 et des souches ATCC (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B.
pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire
induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée
d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une
stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu
cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les
exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus
approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité
immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou
protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs,
le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des
anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre
Bifidobacterium. Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ
58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés,
ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant
la détection spécifique et sensible des bifidobactéries.

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Résumé long
Les bifidobactéries sont des bactéries candidates potentielles aux probiotiques à
cause de leurs effets bénéfiques sur la santé de l’homme incluant la prévention et/ou
traitement des gastro-entérites, intolérance au lactose, cancer, hypercholestérolémie, etc.
Une des propriétés intéressantes des bifidobactéries est leur capacité à moduler certaines
fonctions du système immunitaire et remédier à certaines pathologies immunologiques.
Cependant, les études rapportées démontrant les effets immunomodulateurs des
probiotiques sont basées sur des modèles utilisant des cellules bactériennes vivantes et
limités à certaines souches probiotiques. L’effet des composants issus de la lyse cellulaire
dans le tractus gastro-intestinal sur le système immunitaire demeure mal connu, d’où alors
la nécessité d’élucider les mécanismes d’immunostimulation induits par ces derniers. Le
but de ce projet est d’étudier le potentiel immunomodulateur de certaines souches de
bifidobactérie isolées d’humains et utilisées à l’état non viable et d’explorer les mécanismes
moléculaires impliqués dans cette action immunomodulatrice. Notre étude visait d’une part,
à évaluer les effets de certains composants cellulaires de bifidobactérie notamment le
contenu cytoplasmique brut, la paroi cellulaire, et les exopolysaccharides (EPS) sur la
réponse immunitaire, et d’autre part, caractériser à l’échelle moléculaire les composants à
pouvoir immunomodulateur et exploiter leur propriété pour produire des anticorps
monoclonaux permettant de détecter spécifiquement les bifidobactéries dans les aliments.
Trois souches locales de bifidobactéries, B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64
(fèces de bébés) productrices d’EPS ont été étudiées et comparées au Bifidobacterium lactis
Bb12 (souche de référence). Des souches ATCC de bifidobactéries ont également été
utilisées pour développer des anticorps monoclonaux.
Les résultats obtenus montrent des effets immunostimulants dépendant de la
souche/espèce, du composant cellulaire et de la dose utilisée. Une meilleure stimulation de
la prolifération cellulaire (Indice de stimulation =16) est obtenue avec la paroi cellulaire de
B. lactis Bb12 (40 µg/ml). Le contenu cytoplasmique stimule la réponse immunitaire à un
niveau moindre que la paroi, par contre, les EPS bruts ou fractionnés n’induisent aucun
effet. La stimulation de la prolifération à été confirmée par le dosage des cytokines révélant

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une forte production de IFN-γ (> 4 µg/ml) générée par la paroi cellulaire, et une stimulation
de la sécrétion de IL-10 dans le milieu (< 1 µg/ml). Par ailleurs, les résultats obtenus
démontrent que l’effet immunostimulant induit par le cytoplasme de B. lactis Bb12 est
associé aux fractions peptidiques et/ou protéiques intracytoplasmiques, notamment les
fractions acides. Les peptides et les protéines immunostimulants sont de poids moléculaire
très variable et de caractère moins hydrophobe. Toutefois, des études in vivo et cliniques
devraient être réalisées afin de valider ces résultats et laisser envisager une perspective
d’utilisation des bifidobactéries à l’état de lysats cellulaires comme agents
immunomodulateurs commercialisables sous forme de nutraceutiques.
Il était prévu dans ce projet de mettre à profit les propriétés immuno-actives des
bifidobactéries pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques aux bifidobactéries.
Par cette approche, nous voulions aborder une problématique liée à l’utilisation des
bifidobactéries comme probiotiques vivants dans les produits alimentaires et se résumant
en la difficulté de détecter les souches de bifidobactéries vivantes dans ces produits. Cette
partie du projet a pour objectif de produire et caractériser des anticorps monoclonaux
dirigés contre les protéines de paroi (antigène de surface) de bifidobactéries en vue de
mettre au point des tests immunologiques combinés à la culture bactérienne (en plaque)
permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries vivantes dans les aliments.
L’analyse du profil protéique des parois (SDS-PAGE) de six espèces différentes de
bifidobactérie (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B.
pseudolongum) a révélé des bandes différentes et des bandes similaires (PM: 34 à 58 kDa)
(protéines communes probables).
Testées pour leur immunogénicité chez des souris Balb/c, une forte production
d’anticorps polyclonaux a été mise en évidence (test ELISA) chez les souris immunisées
avec les protéines de B. bifidum et B. longum (titre en anticorps de 53333). Ces deux souris
ont alors été sélectionnées pour la fusion cellulaire et la production d’anticorps
monoclonaux. Les anticorps (IgG) anti-B. longum produits ont montré une réactivité
croisée avec l’ensemble des espèces de bifidobactérie testées indiquant une antigénécité

iv
partagée entre les espèces de bifidobactéries. En effet, un épitope commun porté par une
protéine de 58 kDa (PM) a été révélé par une analyse de type "western-blot".
De plus, une analyse en ELISA directe a permis de confirmer la spécificité des
anticorps produits puisque le test s’est révélé négatif avec d’autres souches non apparentées
aux bifidobactéries. La fixation de l’anticorps sur les bifidobactéries a été observée au
microscope électronique après un traitement immunochimique. La sensibilité de l’anticorps
a été estimée par ELISA à 105 cfu/ml. La détection des cellules viables de bifidobactéries
par l’anticorps produit a été par ailleurs démontrée par le test d’immuno-culture. Toutefois,
les résultats de ce test devraient être validés sur des produits probiotiques (yogourt, lait
fermenté, etc) afin de rendre le test utilisable à l’échelle industrielle.
Mots clés : Nutraceutiques, probiotiques, Bifidobactéries, système immunitaire,
immunomodulation, prolifération cellulaire, Cytokines, Cytoplasme, Exopolysaccharides,
Paroi cellulaire, Anticorps.