Expression et fonction des intégrines liant le collagène chez les
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Expression et fonction des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes Th1 Thèse Marc Boisvert Doctorat en physiologie-endocrinologie Philosophiae Doctor (Ph. D.) Québec, Canada © Marc Boisvert, 2013 Résumé Les lymphocytes Th17 sont une sous-population de lymphocyte T découverte récemment et dont la particularité est de produire de l’IL-17. Ces cellules ont été impliquées dans le développement de maladies auto-immunes. Toutefois, les mécanismes régulant les fonctions des lymphocytes Th17 dans ces maladies ne sont pas très bien connus. Plusieurs études indiquent que les intégrines liant le collagène sont des molécules de costimulation pour les lymphocytes T effecteurs. De plus, ces intégrines ont été impliquées dans le développement de plusieurs maladies auto-immunes. On les retrouve entre autres sur les lymphocytes T arthritiques du liquide synovial. Cependant, l’expression et les fonctions des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes Th17 sont inconnues. Nous avons montré que l’intégrine liant le collagène alpha2beta1 (α2β1) est exprimée sur les cellules Th17, mais que l’intégrine α1β1 ne l’est pas. Nous avons également observé que les collagènes de type I et de type II costimulent la production d’IL-17A, d’IL-17F et d’IFN-γ dans les lymphocytes Th17 humains activés par le récepteur des cellules T (TCR) alors que le collagène de type IV, liant l’intégrine α1β1, n’a pas d’effet sur la production de ces cytokines. Nous avons également montré que les lymphocytes T expriment un autre récepteur pour le collagène, soit DDR1. Nos résultats suggèrent que ce récepteur n’est pas impliqué dans l’adhésion, mais plutôt dans la migration des lymphocytes T dans le collagène tridimensionnel. Nous avons trouvé que les lymphocytes Th17 expriment DDR1, mais que celui-ci n’est pas impliqué dans la costimulation par le collagène. Nos résultats ont mis en évidence le rôle des voies de signalisation MAPkinases ERK, JNK et la voie PI3K/AKT pour l’expression et la production d’IL-17 suite à la stimulation par le TCR alors que la voie MAPkinase p38 n’est importante que pour la costimulation de l’IL-17 par l’intégrine α2β1. Nos résultats ont également montré que l’expression du facteur de transcription RORc, qui joue un rôle central dans la différenciation Th17 et l’expression de l’IL-17, est augmentée par la costimulation du collagène. L’expression de RORc nécessite les voies MAPkinase ERK et PI3K/AKT qui sont aussi augmentées par le collagène. Nos résultats indiquent que l’intégrine α2β1 participe à l’activation des lymphocytes Th17 et de ce fait peut réguler à la hausse le développement des maladies auto-immunes dans les tissus riches en collagène. iii Abstract Th17 cells are a new subset of T cells defined by their ability to produce IL-17. These cells have been implicated in the development of autoimmune diseases. However, the mechanisms regulating the functions of Th17 cells in these diseases are still poorly understood. Several studies have shown that collagen-binding integrins are important costimulatory molecules of effectors T cells. Also, these integrins have been implicated in the development of autoimmune diseases. However, the expression and functions of collagen-binding integrins in Th17 cells are currently unknown. We have shown that the collagen-binding integrin alpha2beta1 (α2β1), but not alpha1beta1 (α1β1), is expressed on Th17 cells. We have demonstrated that both collagen type I and II, by binding to α2β1 integrin, are efficient costimulatory molecules as they increase expression and production of IL-17A, IL-17F and IFN-γ by human effector Th17 cells activated through the T-cell receptor (TCR). However, collagen type IV, which binds α1β1 integrin, did not. We have also shown that T cells express another collagen-binding receptor, namely the discoidindomain receptor 1 (DDR1). Our results suggest that this receptor is not required for cell adhesion but rather for T cell migration through three dimensional collagen matrices. We found that Th17 cells express DDR1 but that it is not implicated in the costimulation induced by collagen. Our results have also shown that the ERK and JNK MAPkinases pathways, as well as the PI3-K/AKT pathway, are required for the expression and production of IL-17 by the TCR while the p38 MAPKinase pathway is only required for the costimulation of IL-17 by α2β1. Lastly, our results have demonstrated that the expression of transcription factor RORC, the Th17 master regulator, is increased by collagen. This expression requires the ERK MAPKinase and PI3-K/AKT pathways which are both increased by collagen. Thus, our results indicate that the collagen-binding integrin α2β1 is a major costimulatory molecule in the activation of Th17 cells and could regulate the development of autoimmune diseases in collagen-rich tissues. v Table des matières Résumé.................................................................................................................................. iii Abstract ................................................................................................................................... v Table des matières ............................................................................................................... vii Liste des tableaux...................................................................................................................xi Liste des schémas................................................................................................................ xiii Liste de figures...................................................................................................................... xv Liste des abréviations......................................................................................................... xvii Remerciements.................................................................................................................. xxiii Avant-propos ...................................................................................................................... xxv Chapitre 1 : Introduction ..................................................................................................... 1 1.1 Lymphocytes T ............................................................................................................. 1 1.2 Récepteur des cellules T ........................................................................................... 3 1.3 Différenciation des lymphocytes T auxiliaires ............................................................. 4 1.3.1 Th1 ......................................................................................................................... 5 1.3.2 Th2 ......................................................................................................................... 7 1.3.3 Th9 ......................................................................................................................... 7 1.3.4 Th17 ....................................................................................................................... 7 1.3.5 Treg ...................................................................................................................... 11 1.3.6 Plasticité des lymphocytes T auxiliaires .............................................................. 12 1.4 Cytokines proinflammatoires ...................................................................................... 16 1.4.1 IL-17 .................................................................................................................... 16 1.4.2 IFN-γ .................................................................................................................... 19 1.4.3 IL-21 .................................................................................................................... 22 1.4.4 IL-22 .................................................................................................................... 22 1.5 Lymphocytes T auxiliaires et développement des maladies auto-immunes. .............. 22 1.5.1 Arthrite rhumatoïde.............................................................................................. 23 1.5.2 Sclérose en plaques .............................................................................................. 27 1.5.3 Maladies inflammatoires des intestins ................................................................. 29 1.6 Signalisation du TCR .................................................................................................. 30 1.6.1 Initiation de la signalisation ................................................................................. 31 1.6.2 IP3 et la voie du calcium...................................................................................... 32 1.6.3 DAG et la voie de PKC........................................................................................ 35 1.6.4 Activation des MAP kinases ................................................................................ 35 1.6.5 Activation de STAT3 ........................................................................................... 38 1.7 Récepteurs de costimulation et de régulation ............................................................. 40 1.7.1 Les récepteurs de la famille du CD28 .................................................................. 40 1.7.1.1 Signalisation du CD28 .................................................................................. 42 vii 1.7.2 Les récepteurs de la famille du TNF ................................................................... 43 1.8 Intégrines .................................................................................................................... 44 1.8.1 Structure et expression des intégrines ................................................................. 45 1.8.2 Activation des intégrines ..................................................................................... 49 1.8.3 Signalisation des intégrines ................................................................................. 51 1.8.4 Fonctions des intégrines ...................................................................................... 53 1.8.4.1 Migration ...................................................................................................... 53 1.8.4.2 Prolifération et survie ................................................................................... 53 1.9 Intégrines et lymphocytes T ....................................................................................... 54 1.9.1 Expression des intégrines chez les lymphocytes T ............................................. 54 1.9.2 Fonctions des intégrines chez les lymphocytes T ............................................... 55 1.9.2.1 Fonctions des intégrines β2 .......................................................................... 55 1.9.2.2 Fonctions des intégrines β1 .......................................................................... 56 1.9.3 Intégrines liant le collagène................................................................................. 56 1.9.3.1 Expression des intégrines liant le collagène ................................................. 57 1.9.3.2 Fonctions des intégrines liant le collagène ................................................... 58 1.10 Rôles des intégrines dans le développement des maladies auto-immunes. .............. 60 1.10.1 Arthrite rhumatoïde ........................................................................................... 60 1.10.2 Sclérose en plaques ........................................................................................... 61 1.10.3 Maladies inflammatoires des intestins (IBD) .................................................... 62 1.11 Récepteurs à domaine discoïdine ............................................................................. 63 1.12 Problématique et hypothèse...................................................................................... 64 1.13 Buts........................................................................................................................... 65 Chapitre II : L’intégrine alpha2beta1 est la principale intégrine liant le collagène chez les lymphocytes Th17 ................................................................................................ 67 2.1 Résumé ....................................................................................................................... 67 2.2 Abstract ...................................................................................................................... 71 2.3 Introduction ................................................................................................................ 73 2.4Results ......................................................................................................................... 75 2.4.1 Th17 cells differentiation preferentially upregulate α2β1 integrin. .................... 75 2.4.2 Th17 cell adhesion to collagens is dependent on α2β1 integrin.......................... 76 2.4.3 α2β1 enhances the production of Th17 cytokines. .............................................. 77 2.5 Discussion .................................................................................................................. 78 2.6 Materials and Methods ............................................................................................... 81 2.6.1 Antibodies and reagents ...................................................................................... 81 2.6.2 Isolation of primary T cells and T helper cell differentiation ............................. 81 2.6.3 Real-Time RT-PCR analysis ............................................................................... 82 2.6.4 Cell surface molecule expression ........................................................................ 82 2.6.5 Staining for integrin receptors and intracellular IL-17........................................ 83 2.6.6 Cell adhesion assays ............................................................................................ 83 viii 2.6.7 T cell costimulation and IL-17 ELISA ................................................................ 83 2.7 References ................................................................................................................... 85 2.8 Figure and legends ...................................................................................................... 89 Chapitre III : L’intégrine alpha2beta1 costimule les lymphocytes Th17 par les voies de signalisation MAPKinase ERK et p38 ainsi que la voie PI3-K/AKT .............. 95 3.1 Résumé........................................................................................................................ 95 3.2 Abstract ....................................................................................................................... 99 3.3 Introduction ............................................................................................................... 101 3.4 Materials and methods .............................................................................................. 103 3.4.1 Antibodies and reagents ..................................................................................... 103 3.4.2 Isolation of human naïve CD4 T cells and differentiation of Th17 ................... 103 3.4.3DDR expression and IL-17 intracellular staining ............................................... 103 3.4.4Real-Time RT-PCR analysis .............................................................................. 104 3.4.5 Th17 cell activation experiments and IL-17 expression .................................... 104 3.4.6 Immunoblotting, activation of MAPKs, AKT and STAT3 ............................... 105 3.5 Results ....................................................................................................................... 106 3.5.1 The costimulatory effect of collagen is mediated via β1 integrin independently from the discoidin domain receptors. ......................................................................... 106 3.5.2 α2β1 integrin co-stimulates IL-17 via ERK and p38 MAPK. ........................... 106 3.5.3 α2β1 integrin weakly co-stimulates the PI3 Kinase /AKT pathway. ................. 107 3.5.4 Collagen costimulates RORc in human Th17 cells. .......................................... 107 3.5.5 STAT3 is not involved in IL-17 production. ..................................................... 108 3.6 Discussion ................................................................................................................. 109 3.7 Figure and legends .................................................................................................... 112 Chapitre IV : L’expression du récepteur à domaine discoïdine 1 chez les lymphocytes T activés est régulée par la voie MAP Kinase ERK ............................................. 123 4.1 Résumé...................................................................................................................... 123 4.2 Abstract ..................................................................................................................... 127 4.3 Introduction ............................................................................................................... 129 4.4 Materials and Methods.............................................................................................. 131 4.4.1 Antibodies and reagents ..................................................................................... 131 4.4.2 T cell isolation and activation ............................................................................ 131 4.4.3 Collagen I binding analysis ................................................................................ 131 4.4.4 Cell adhesion assay ............................................................................................ 132 4.4.5 Plasmids and Jurkat T Cell transfection ............................................................ 132 4.4.6 Immunoblot analysis .......................................................................................... 132 4.4.7 RT-PCR analysis................................................................................................ 133 4.5 Results ....................................................................................................................... 134 4.5.1 DDR1 expressed by activated T cells binds collagen I. .................................... 134 ix 4.5.2 DDR1 doesn’t enhance T cell adhesion to collagen I. ...................................... 134 4.5.3 CD28 costimulation does not upregulate DDR1 expression. ............................ 135 4.5.4 TCR-induced DDR1 expression is not regulated by the Ca2+ signaling cascade. .................................................................................................................................... 135 4.5.5 TCR-induced DDR1 expression is regulated by the Ras/Raf/ERK MAPK signaling pathway. ...................................................................................................... 136 4.5.6 TCR- induced DDR1 expression is dependent on PKC pathway. .................... 136 4.5.7 Inhibition of ERK MAPK and PKC reduces the ability of activated T cells to bind collagen I. ........................................................................................................... 137 4.6 Discussion ................................................................................................................ 138 4.7 Figures and legends .................................................................................................. 141 4.8 References ................................................................................................................ 149 Chapitre V : Discussion ................................................................................................... 153 5.1 Perspective ............................................................................................................... 161 Bibliographie..................................................................................................................... 163 Annexe I ............................................................................................................................ 189 A.1 Abstract ................................................................................................................... 191 A.2 Introduction ............................................................................................................. 193 A.3 Expression of VLA-2 on T cells.............................................................................. 194 A.4 VLA-2-mediated T cell adhesion to collagen ......................................................... 195 A.5 Role of VLA-2 in T cell survival ............................................................................ 196 A.5.1 Regulation of activation-induced cell death (AICD) in T cells........................ 196 A.5.2 Inhibition of Fas-L expression ......................................................................... 197 A.5.3 Inhibition of Fas-induced signaling .................................................................. 198 A.5.4 Modulation of other forms of apoptosis ........................................................... 201 A.6 Role of VLA-2 signaling in T cell costimulation (cytokine production and proliferation)................................................................................................................... 202 A.7 VLA-2 signal transduction ...................................................................................... 204 A.7.1 VLA-2-mediated activation of the MAPK/ERK signaling pathway................ 204 A.7.2 VLA-2 signaling in the context of TCR ........................................................... 206 A.8 Role of VLA-2 in inflammatory diseases ................................................................ 209 A.9 Concluding remarks ................................................................................................ 210 A.10 References ............................................................................................................. 211 x Liste des tableaux Tableau 1 : Cytokines impliquées dans la différenciation Th17 .......................................... 10 Tableau 2 : Sous unités des intégrines selon la classification CD ........................................ 46 Tableau 3 : Les intégrines et leurs ligands ............................................................................ 48 xi Liste des schémas Schéma 1 : Différenciation des lymphocytes T auxiliaires .................................................... 6 Schéma 2 : Méthylation des gènes de facteurs de transcription selon le phénotype ............ 15 Schéma 3 : Rôle de l’IL-17 dans le développement de l’arthrite rhumatoïde ...................... 26 Schéma 4 : Signalisation induite lors de l’activation du TCR .............................................. 34 Schéma 5 : Activation de ERK par le TCR .......................................................................... 37 Schéma 6 : Activation de p38 et JNK par le TCR ................................................................ 39 Schéma 7 : Combinaison des différentes sous-unités α et β des intégrines .......................... 47 Schéma 8 : Liaison des intégrines avec le cytosquelette ...................................................... 50 Schéma 9 : Signalisation des intégrines ................................................................................ 52 Schéma 10 : Modèle de fonction de l’intégrine α2β1dans l’arthrite rhumatoïde ............... 160 xiii Liste de figures Chapitre II Figure 1 : Th17 differentiation of human naïve CD4+ T cells. ............................................. 89 Figure 2 : Expression of α1, α2 and β1 integrins on human naïve CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions. ....................................................................... 90 Figure 3 : Expression of α1 and α2 integrin chains on human Th 17 cells. ......................... 91 Figure 4 : Cell adhesion of human Th17 cells to collagen matrices. .................................... 92 Figure 5 : Costimulation of human Th17 cells by collagens. ............................................... 93 Figure 6 : Collagen costimulation of IL-17F and IFN-γ production. ................................... 94 Chapitre III Figure 1 : Collagen co-stimulatory effect does not require DDR1 or DDR2. .................... 112 Figure 2 : Collagen costimulates IL-17 expression via ERK and p38 MAPK. .................. 113 Figure 3 : Collagen activation of ERK, JNK and p38 MAPKs. ......................................... 114 Figure 4 : Collagen co-stimulation of IL-17 involves the PI3 Kinase/AKT pathway. ....... 115 Figure 5 : Collagen co-stimulates the expression of RORc via MAPK/ERK and PI3 kinase/AKT. ....................................................................................................... 116 Figure 6 : STAT3 activation is not required for IL-17 co-stimulation by collagen. ........... 117 Figure 7 : Model of cooperation between α2β1 integrin and TCR/CD3 signalling in human Th17 cells. .......................................................................................................... 118 Chapitre IV Figure 1 : DDR1 expressed by activated T cells binds to collagen I. ................................. 141 Figure 2 : DDR1 does not enhance T cell adhesion to collagen I. ..................................... 142 Figure 3 : CD28 costimulation does not upregulate DDR1 expression. ............................. 143 Figure 4 : The Ca2+/calcineurin-signaling pathway is not involved in DDR1 expression.. 144 Figure 5 : TCR-induced DDR1 expression is regulated by the Ras/Raf/ERK pathway but not by the p38 or the JNK MAP Kinases. .......................................................... 145 Figure 6 : PKC is involved in TCR- and PMA-induced DDR1 expression in T cells. ...... 146 Figure 7 : Inhbition of ERK MAPK and PKC reduces the ability of activated T cells to bind collagen I. ........................................................................................................... 147 Figure 8 : A model by which TCR/CD3 signaling induces the expression of DDR1 in human T cells. .................................................................................................... 148 Annexe Figure 1 : Model for Coll I/ VLA-2-dependent inhibition of AICD in T cells................... 200 Figure 2 : Model for VLA-2-mediated costimulation in T cells......................................... 208 xv Liste des abréviations AICD Mort induite par l'activation (Activation-induced cell death) AR Arthrite rhumatoïde ATF-2 Facteur de transcription activateur-2 (Activating Transcription Factor-2) AP-1 Protéine activatrice 1 (Activator Protein 1) CD Cluster de Différenciation (Cluster of Differentiation CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité CPA Cellule Présentatrice d’Antigène CRAC Canaux dépendant du relargage du calcium (Calcium Release Activated Channels) CTLA-4 Agent cytotoxique des lymphocytes T 4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) DAG Diacyl Glycerol DDR Récepteur à domaine discoïdine (Discoidin domain receptor) DMARD Drogue anti-rhumatique modifiant la maladie (Disease Modifying Anti-Rhumatic Drug) EAE Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) ERK Kinase régulée par des signaux extracellulaires (Extracellular signal-regulated kinase) FAK Kinase de l'adhésion focale (Focal adhesion kinase) FasL Ligand de Fas (Fas Ligand) Foxp3 Forkhead box P3 Grb2 Protéine couplée aux récepteurs de facteurs de croissance-2 (Growth factor receptor-bound protein-2) xvii IBD Maladie inflammatoire des intestins (Inflammatory Bowel Disease) ICAM-1 Molécule d'adhésion intercellulaire 1 (Intercellular adhesion molecule 1) ICOS Molécule de costimulation inductible (Inducible costimulator molecule) IκB Inhibiteur de NF-κB (Inhibitor of NF-κB) IKK Kinase de IκB (IκB Kinase) ILK Kinase liée aux intégrines (Integrin-linked kinase) IFN-γ Interféron-γ Ig Immunoglobuline IL Interleukine IP-3 inositol 1,4,5-triphosphate ITAM Motif d’activation des immunorécepteurs via une tyrosine (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) iTreg Treg induit (Inducible Treg) JAK Janus kinase JNK Kinase de c-Jun en N-terminale (c-Jun N-terminal kinase) KO Knock Out LAT Lien d’activation des lymphocytes T (Linker for Activation of T cells) LCMV Virus lymphocytique choriomeningitique (Lymphocoriomeningitis virus) LFA-1 Antigène associé à la fonction lymphocytaire (Lymphocyte function-associated antigen) LPS Lipopolysaccharide MAPK Protéine kinase à action mitogène (Mitogen activated protein kinases) MAPKK MAPK kinase xviii MEC Matrice extracellulaire MEK MAPK/ERK kinase MMP Métalloprotéinase nTreg Treg naturel (naturaly occuring Treg) RORc Récepteur orphelin apparenté à RAR c (RAR-related Orphan Receptor c) NF-AT Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (Nuclear factor of activated T cells) NF-κB Facteur nucléaire-κB (Nuclear factor-κB) PD-1 Protéine de mort programmée 1 ( Programmed Death 1) PHA Phytohémagglutinine PI3-K Kinase des phosphatidylinositols 3 (Phosphatidylinositol 3-kinase) PIP2 Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PKB Protéine Kinase B PKC Protéine Kinase C PLCγ Phospholipase C γ PMA Phorbol-12-Myristate 13-Acétate PP2A Protéine phosphatase 2A PYK2 Tyrosine kinase riche en proline 2 ( Proline-rich Tyrosine Kinase 2) RANK Récepteur activateur de NF-KB (Receptor-activator of NF-KB) RANKL RANK ligand Rap1 Ras-related protein 1 RAPL Ligand de Rap1 (Rap 1 Ligand) xix RasGRP Protéine de relargage de guanyle associée à Ras (Ras guanyl-nucleotide-releasing protein) SH2 Homologie à Src-2 (Src homology-2) SLP-76 Phosphoprotéine contenant un domaine SH-2 des leukocytes de 76 kDa (SH2 domain-containing leukocyte phosphoprotein of 76 kDa) SNC Système Nerveux Central Sos Son of Sevenless STAT Transducteur de Signal et Activateur de la Transcription (Signal Transducer and Activator of Transcription) TCR Récepteur des cellules T (T Cell Receptor) Th Lymphocyte T auxiliaire (T helper) Tfh Lymphocyte T folliculaire auxiliaire TGF-β Facteur de croissance transformant β (Transforming Growth Factor β) TNF Facteur de nécrose des tumeurs (Tumor Necrosis Factor) TNFR Récepteur du TNF (TNF Receptor) TRAF Facteur associé au récepteur du TNF (TNF receptor-associated factor) Treg Lymphocyte T régulateur VCAM-1 Molécule d'adhésion cellulaire vasculaire 1 (Vascular cell adhesion molecule 1) VLA Antigène très tardif (Very Late Antigen) ZAP-70 Protéine de 70 kDa associée à δ (δ-associated protein of 70 kDa ) xx À Marie-Claude xxi Remerciements En premier lieu, je voudrais remercier mon directeur de recherche, Dr Fawzi Aoudjit pour sa supervision, son enseignement, ses bons conseils et ses encouragements qui m’ont permis de mener à bien mes travaux de recherche. Je lui témoigne toute ma reconnaissance. Merci aux membres de l’équipe, anciens (Nizar Chetoui, Steve Gendron et Marie-Ève Bergeron) et actuels (Dalila Naci et Amine El Azreq), pour les discussions et l’atmosphère agréable du laboratoire. Merci également à tous les membres du CRRI que j’ai côtoyé au cours des années. Merci aux membres de ma famille d’avoir fait de moi qui je suis et merci à mon amoureuse de rendre ma vie aussi intensément agréable. xxiii Avant-propos Cette thèse contient la majeure partie de mes travaux de doctorat, paru dans deux articles publiés, un troisième à venir et un chapitre de livre. Chapitre II : Alpha2beta1 integrin is the major collagen-binding integrin expressed on human Th17 cells. Eur J Immunol. 2010 Oct;40(10):2710-9. Dans cet article, j’ai réalisé l’ensemble des manipulations qui ont mené aux figures présentées. J’ai participé à la planification des expérimentations et à l’analyse des résultats ainsi qu’à la rédaction et la correction du manuscrit. Steve Gendron a mis au point le protocole de génération des Th17 et Nizar Chetoui a contribué à l’analyse des résultats de cytométrie de flux (Figure 2 et 3). Chapitre III : Alpha2beta1 integrin co-stimulates Th17 cells via ERK, p38 MAPKs and PI3 Kinase/AKT signaling pathways. Non publié (en préparation) Dans cet article, j’ai réalisé l’ensemble des manipulations qui ont mené aux figures présentées. J’ai participé à la planification des expérimentations et à l’analyse des résultats ainsi qu’à la rédaction et la correction du manuscrit. Jamila Chakir m’a aidé à réaliser les expérimentations de PCR en temps réel. xxv Chapitre IV : Discoidin domain receptor 1 expression in activated T cells is regulated by the ERK MAP kinase signaling pathway. J Cell Biochem. 2011 Dec;112(12):3666-74. Dans cet article, Nizar Chetoui a réalisé les manipulations en lien avec la signalisation (Figure 3 à 6). Amine El Azreq a rédigé le manuscrit et Marie-Ève Bergeron a réalisé l’analyse des interactions entre le collagène et DDR1 par cytométrie de flux (Figure 1 et 7). Pour ma part, j’ai réalisé les tests d’adhésions qui ont mené à la figure 2. J’ai contribué aux manipulations et à l’analyse des interactions entre DDR1 et le collagène (Figure 1 et 7). J’ai également participé à la correction du manuscrit. Annexe I : VLA-2 signaling on T cells: a new emerging costimulatory pathway in effector/memory T cell subsets? Effector memory T cells subsets in the extralymphatic tissue-interactions with the extracellular matrix influencing functions. 2009 Cet article de revue fut écrit sous l'invitation du Dr.Ilan Bank de l'Université de Tel-Aviv, pour un livre concernant le rôle des interactions des lymphocytes T effecteurs et mémoires avec la matrice extracellulaire. J'ai contribué à hauteur de 40% à la rédaction du manuscrit. Cette part est égale à celle de Steve Gendron avec qui je partage la place de 1 er auteur. Nizar Chetoui a corrigé le manuscrit. xxvi Chapitre 1 : Introduction Chez l’humain, le système immunitaire est composé de nombreuses cellules qui interagissent afin de protéger l’organisme contre la myriade de pathogènes présents dans l’environnement. Le système immunitaire peut être divisé en deux volets soit l’immunité innée et l’immunité acquise. L’immunité innée est la première ligne de défense de l’organisme et les cellules qui la composent reconnaissent différentes molécules associées aux pathogènes. Ce volet de l’immunité est rapidement activé en présence de pathogènes. L’activation du système immunitaire inné mènera éventuellement à l’activation de l’immunité acquise. Chaque cellule de l’immunité acquise, contrairement à celles de l’immunité innée, ne reconnaissent qu’un seul antigène. C’est pour cette raison que l’immunité acquise est également connue sous le nom d’immunité spécifique. Les cellules qui la composent sont les lymphocytes B et les lymphocytes T. Ces derniers se divisent en deux catégories soit les lymphocytes T cytotoxiques et les lymphocytes T auxiliaires. Les lymphocytes T cytotoxiques peuvent tuer les cellules infectées de même que les cellules transformées telles que les cellules cancéreuses. Les lymphocytes T auxiliaires quant à eux, vont organiser et diriger la réponse immunitaire acquise en produisant différentes cytokines et chimiokines. En plus de leur rôle dans l’immunité protective, les lymphocytes T sont également impliqués dans la réponse inflammatoire associée aux maladies auto-immunes. 1.1 Lymphocytes T Les lymphocytes T immatures sont issus de la moelle osseuse, générés par l’hématopoïèse. Ils migrent alors jusqu’au thymus où ils seront sélectionnés pour leur capacité à interagir avec le complexe majeur d’histocompatibilité (sélection positive) sans reconnaître les antigènes du soi (sélection négative). Les lymphocytes T qui ne passent pas ces étapes de sélection sont généralement éliminés par apoptose, mais peuvent également survivre dans un état anergique, c’est-à-dire réfractaire à l’activation1. Ceux qui passent les deux étapes 1 de sélection deviennent des lymphocytes T matures. Les lymphocytes T matures se divisent en trois groupes que l’on nomme naïfs, effecteurs et mémoires. Les lymphocytes T restent naïfs tant qu’ils n’ont pas rencontré leur antigène, suite à quoi ils deviennent effecteurs. Les lymphocytes T mémoires sont des cellules qui ont rencontré l’antigène et qui persistent après l’élimination du pathogène, participant ainsi à la création de la mémoire immunologique. Les lymphocytes T naïfs migrent vers les systèmes lymphatiques et circulatoires à la recherche de l'antigène pour lequel ils sont spécifiques. Cet antigène devra être présenté par un complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de type I ou II selon que le lymphocyte T est CD8+ (cytotoxique) ou CD4+ (auxiliaire) respectivement. Les molécules de CMH I sont exprimées par pratiquement toutes les cellules de l'organisme, alors que les molécules de CMH II ne sont exprimées principalement que par les cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Les principales CPAs sont les cellules dendritiques et les macrophages. Toutefois, les lymphocytes B, les monocytes et les neutrophiles ont également des fonctions de CPA2– 4 . De nombreuses CPAs s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques et c’est principalement à cet endroit que les lymphocytes T naïfs rencontreront leur antigène. La rencontre entre la CPA présentant l’antigène et le lymphocyte T active ce dernier. Cette activation le fait passer du stade naïf au stade effecteur. Le lymphocyte T effecteur quitte alors le ganglion lymphatique et migre vers le site inflammatoire, guidé par le gradient de chimiokines et de cytokines pro-inflammatoires5. Le passage du stade naïf à effecteur nécessite deux signaux6,7. Le premier signal est celui qui provient du récepteur des cellules T (TCR) lorsque celui-ci rencontre son antigène présenté par une molécule de CMH dont la classe correspond au type de lymphocyte T. Le deuxième signal qui provient des molécules de costimulation dont les ligands sont exprimés par les CPAs. La costimulation est tout aussi importante que la reconnaissance de l’antigène par le TCR car sans costimulation, les lymphocytes T naïfs subissent le même sort que les lymphocytes T immatures qui ne parviennent pas à passer la sélection thymique. Autrement dit, un lymphocyte T naïf qui rencontre son antigène sans recevoir de signal de costimulation deviendra soit apoptotique soit anergique8, bien que pour les lymphocytes T naïfs, l’anergie est plus fréquente. 2 La molécule de costimulation principale exprimée par les lymphocytes T est le CD289. Ce dernier possède deux ligands, B7.1 et B7.2, aussi appelés CD80 et CD86 respectivement. On retrouve ces deux molécules sur la plupart des CPAs. Le CD28 n'est cependant pas la seule molécule de costimulation disponible pour le lymphocyte T. De nombreux récepteurs de la famille du TNF ainsi que les molécules d’adhésion peuvent jouer ce rôle8,10,11. La costimulation des lymphocytes T est décrite de façon plus approfondie dans une section ultérieure. 1.2 Récepteur des cellules T Le TCR est un récepteur membranaire dont le ligand est un antigène associé à une molécule de CMH de type I ou II. La molécule de CMH nécessaire pour présenter l’antigène ne dépend pas du TCR, mais plutôt d’une autre molécule de surface, le CD4 ou le CD8, acquise lors de la maturation thymique12. Ces molécules ne font pas partie du TCR, elles sont très importantes pour l’activation par le TCR13,14. Le CD4 est une glycoprotéine membranaire monomérique contenant quatre domaines extracellulaires immunoglobuliniques. Le CD8 est un dimère αβ bien que des dimères αα puissent exister. Les sous-unités du CD8 sont aussi des glycoprotéines transmembranaires et possèdent un domaine immunoglobulinique. Ces deux molécules possèdent également un domaine intracellulaire dont plusieurs résidus peuvent être phosphorylés. Comme il a été mentionné plus haut, les lymphocytes T matures n’expriment que l’une ou l’autre de ces molécules, ce qui déterminera dans quel contexte le lymphocyte reconnaîtra l’antigène. Le rôle de ces molécules sera décrit plus loin. Le TCR est un récepteur hétérodimérique composé de sous-unité αβ ou γδ. Le dimère αβ est le plus commun des deux. Les lymphocytes T qui expriment le TCR γδ sont des lymphocytes T qui n’ont pas réussi à exprimer un TCR αβ fonctionnel15. L’expression de γδ est un mécanisme de survie qui permet la génération de lymphocytes T différents, mais qui ont tout de même un rôle important dans la réponse immune16,17. Le TCR fait partie de la super famille des immunoglobulines et, de façon semblable à un anticorps, possède une région variable responsable de la spécificité du récepteur ainsi qu’une région constante qui 3 permet de l’ancrer à la membrane. Le TCR ne peut cependant activer les lymphocytes T à lui seul, car il ne possède qu’une courte région intracellulaire incapable d’activer les voies de signalisations. Pour ce faire, il s’associe à un complexe moléculaire de surface, le CD3. Le CD3 est composé de trois dimères, soit γε, δε et δδ. Il arrive parfois que le dimère δδ soit remplacé par un dimère δε. Les sous-unités γ, δ et ε font partie de la superfamille des immunoglobulines. Cependant, ces sous-unités ne lient pas l’antigène ni le CMH. Elles font partie des immunoglobulines, car structurellement, elles présentent un repliement que l’on dit immunoglobulinique. Ce repliement permet d’interagir et de se lier au TCR 15. Ces trois sous-unités possèdent également un domaine intracellulaire. Les sous-unités δ et ε ne font pas partie de la famille des immunoglobulines. Elles possèdent en fait un très court domaine extracellulaire et un long domaine intracellulaire. Ces deux sous-unités sont les principales responsables de la signalisation induite par le TCR. Les régions intracellulaires des sous-unités du CD3 possèdent des motifs d’activation des immunorécepteurs via une tyrosine (ITAM). Les sous-unités γ, δ et ε en possèdent chacun un alors que les sous-unités δ et ε en possèdent trois. Ces motifs ITAMs sont les sites de phosphorylation qui permettront l’induction de la signalisation intracellulaire18. Leur rôle ainsi que la séquence d’événements qui mène à l’activation seront décrits plus loin. En plus des domaines immunoglobuliniques des sous-unités γ, δ et ε, le complexe TCR/CD3 est maintenu ensemble par une force électrostatique. La région transmembranaire du TCR possède une charge positive alors que la région transmembranaire du CD3 possède une charge négative. Puisque le TCR a absolument besoin du CD3, le terme TCR fait habituellement référence au complexe TCR/CD3. Ce sera le cas ici. 1.3 Différenciation des lymphocytes T auxiliaires L’un des acteurs les plus importants dans l’immunité acquise et l’auto-immunité est le lymphocyte T CD4+ ou Th pour « T helper », car celui-ci peut diriger la réponse immunitaire en fonction de son phénotype. On connaît plusieurs phénotypes de lymphocytes T auxiliaires différents. En ordre chronologique, les Th1 et Th2 ont été définis par Mosmann et Coffman il y a plus de vingt- 4 cinq ans19. Par la suite, se sont ajoutés les lymphocytes T régulateurs (Treg) qui étaient connus depuis longtemps sous le nom de lymphocytes T suppresseurs20,21. Plus récemment, les lymphocytes Th1722–24, les lymphocytes T folliculaires (Tfh)25,26 et les Th927,28 ont été ajoutés (Schéma 1). Toutefois, puisque notre travail porte sur les Th17, l'accent sera mis sur ce phénotype. 1.3.1 Th1 Les lymphocytes Th1 sont associés à l’immunité cellulaire. Les Th1 sont activés en réponse aux pathogènes intracellulaires tels que les bactéries et les virus. Ils sont également impliqués dans la réponse inflammatoire associée aux maladies auto-immunes29. Les cytokines qu’ils produisent, tel que l’IFN-γ et le TNF, activent les macrophages et les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) qui détruiront les cellules infectées. Ces mêmes cytokines vont induire un changement de classe d’immunoglobulines (Ig) produites par les lymphocytes B. Ces derniers produiront alors des IgG qui activeront le complément ou opsoniseront les cellules infectées et favoriseront leur phagocytose30. Le rôle de l’IFN-γ dans l’inflammation et l’auto-immunité sera discuté plus loin. Les cytokines importantes pour la différenciation des lymphocytes Th1 sont l’IL-12 et l’IFN-γ. L’IL-12 est produite principalement par les cellules dendritiques et les macrophages. L’IL-12 active Stat4 qui à son tour active le facteur de transcription t-bet qui est typiquement associé au phénotype Th131. L’activation de t-bet induit l’expression de gènes spécifiques aux lymphocytes Th1 comme l’IFN-γ et les récepteurs de chimiokines CXCR3 et CCR532,33. L’IFN-γ, parmi ses nombreux effets, augmente la production d’IL-12 par les macrophages et les cellules dendritiques tout en augmentant l’activation de t-bet chez les lymphocytes Th1. Un autre rôle de t-bet est d’inhiber la synthèse des cytokines aux autres phénotypes de lymphocytes T auxiliaires, ce qui favorise la différenciation Th1 et contribue à établir la spécificité du phénotype34. 5 Schéma 1 : Différenciation des lymphocytes T auxiliaires La présence de différentes cytokines [encadré] permet la différenciation en plusieurs phénotypes de lymphocytes T auxiliaires. Chacun de ces phénotypes possède un facteur de transcriptions qui lui est spécifique (entre parenthèses). Inspiré de : Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation35 et Development, regulation and functional capacities of Th17 cells36 6 1.3.2 Th2 Les lymphocytes Th2 sont associés à l’immunité humorale. Ils sont activés en réponse aux pathogènes et aux parasites extracellulaires. Les cytokines produites par les lymphocytes Th2, principalement l’IL-4 et l’IL-5, vont activer la production d’anticorps neutralisant (IgM, IgE et IgG1) par les lymphocytes B30,37. Ces anticorps permettent l’agrégation des pathogènes qui seront ensuite éliminés par les macrophages. Les anticorps peuvent également activer le complément pour éliminer les pathogènes, notamment les parasites trop gros pour être phagocytés par les macrophages. Les cytokines importantes pour la différenciation des Th2 sont l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-10. L’IL-4 active Stat6 qui va activer GATA-3, le facteur de transcription typique des Th238. GATA-3 permet la transcription des gènes associés aux lymphocytes Th2 comme l’IL-4, l’IL5 et les récepteurs de chimiokines CCR3, CCR4 et CCR833,39,40. L’IL-4 produite par les Th2 agit de façon autocrine et favorise la différenciation du phénotype. De plus, GATA-3, de façon semblable à t-bet, inhibe la transcription de cytokines associées aux autres phénotypes41,42. 1.3.3 Th9 Le phénotype Th9 a été décrit récemment, mais le rôle de ces lymphocytes est encore mal défini. Il semblerait toutefois qu’ils aient un rôle à jouer dans la réaction allergique et la protection contre les nématodes27,28. Les cytokines importantes pour la différenciation des lymphocytes Th9 sont l’IL-4 et le TGF-β. Le TGF-β modifie la signalisation de l’IL-4 et favorise la production d’IL-9. Pour l’instant, seule la production élevée d’IL-9 permet d’évaluer la différenciation Th9, car aucun autre récepteur spécifique n’a été identifié. De plus, aucun facteur de transcription spécifique aux lymphocytes Th9 n’a été identifié28. 1.3.4 Th17 Le phénotype Th17 a été décrit il y a environ 6 ans alors que la cytokine caractérisant ce phénotype, l’IL-17, est connue depuis plus de 15 ans. Bien que le phénotype n’ait été décrit que récemment, il est connu que les lymphocytes Th17 ont un rôle dans l’immunité, par 7 exemple lors de réponses contre différentes bactéries et champignons43. Cependant, la majorité des publications au sujet des Th17 concernent leur rôle dans le développement de différentes maladies inflammatoires auto-immunes. Ce rôle sera décrit plus en détail dans une section subséquente. Les lymphocytes Th17 ont été premièrement identifiés chez la souris. Dans cette étude, l’IL-6 et le TGF-β étaient considérées nécessaires et suffisantes à la différenciation des Th1744. Par contre, chez l’humain, la différenciation des Th17 nécessitait la présence de TGF-β, d’IL-6, mais aussi d’Il-23 et d’IL-1. Également, d’autres études ont montré que la présence de TGF-β chez l’humain n’était pas requise et que son rôle serait uniquement d’inhiber la différenciation des Th1 et ainsi favoriser la différenciation des Th1745,46. De plus, certains lymphocytes Th17 humains peuvent exprimer le facteur de transcription t-bet et produire de l’IFN-γ. Ces clones, identifiés Th1/Th17, ont été associés avec les maladies inflammatoires telles que la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse et l’arthrite rhumatoïde47,48. De récentes études ont montré que le TGF-β n’est finalement pas nécessaire, alors que l’IL23 l’est, pour la différenciation Th17 chez la souris ce qui permet de réconcilier les différences entre les Th17 humains et murins49–51. L’une de ces études a montré que les lymphocytes Th17 différenciés en présence d’IL-1, d’IL-6 et de TGF-β ne sont pas pathogéniques lors de transfert adoptif dans un modèle d’EAE alors que les Th17 différenciés en présence d’IL-1, d’IL-6 et d’IL-23 le sont50. Il semblerait que les lymphocytes Th17 les plus pathogéniques, responsables de l’autoimmunité, sont ceux qui co-expriment l’IL-17 et l’IFN-γ. La différence entre les fonctions des Th17 différenciés en présence de TGF-β ou d’IL-23 a également été étudié par un autre groupe qui a trouvé que la présence de TGF-β favorise des fonctions immunosuppressives52. Ce groupe a montré que seule la présence de TGF-β induit l’expression de CD39 et CD73, des ectonucléotidases qui transforment l’ATP et l’ADP en adénosine et il a été démontré que cette molécule à des propriétés immunosuppressives53. De plus, il semblerait que le TGF-β ait préséance sur l’IL-23 lors de la différenciation des Th17 puisque les cellules différenciées en présence d’IL-1, d’IL-6, d’IL-23 et de TGF-β expriment autant, sinon plus, de CD39 et de CD73 que les cellules différenciées en présence d’IL-1, d’IL-6 et de TGF-β. 8 D’autres suggèrent que le TGF-β favorise la différenciation des Th17 en inhibant la différenciation des Th1 et des Th246,54,55. Le rôle du TGF-β dans la différenciation Th17 est donc très complexe et n’est toujours pas complètement élucidé. Cependant, une étude récente a montré que certains isoformes de TGF-β peuvent avoir des effets spécifiques sur la différenciation des Th17. En effet, en présence d’IL-6, le TGF-β1 induit un phénotype de Th17 non pathogénique qui requiert la présence d’IL-23 pour le devenir alors que le TGFβ3 induit directement un phénotype pathogénique même en absence d’IL-2356. Toutefois, il est actuellement accepté que l’IL-1, l’IL-6, l’IL-23 ainsi que le TGF-β sont requises pour obtenir des lymphocytes Th17 à partir de lymphocytes T CD4+ naïfs. Toutes ces études montrent la complexité des mécanismes de différenciation des lymphocytes Th17 en comparaison avec celle des Th1 ou des Th2. Il apparait aussi que les différences de différenciation entre l’humain et la souris sont réconciliées, du moins en grande partie. En effet, pour obtenir des Th17 pathogéniques qui produisent aussi bien de l’IL-17 que de l’IFN-γ, les lymphocytes T naïfs nécessitent la présence d’IL-1, d’IL-6 et d’IL-23. La présence de TGF-β pourrait être requise uniquement pour limiter la différenciation des Th1 et favoriser l’émergence des lymphocytes mixtes Th1/Th17. Les variations observées dans le choix de cytokines peuvent s’expliquer par le rôle de ces cytokines dans la différenciation (Tableau 1). Normalement, comme il le fait chez les iTregs, le TGF-β devrait induire l’expression du facteur de transcription Foxp3. Cependant, l’IL-6, en activant le Transducteur de Signal et Activateur de la Transcription 3 (STAT3), inhibe l’expression de Foxp3 chez les Th17. La combinaison du TGF-β et de l’IL-6 augmente l’expression et l’activation du facteur de transcription RORγt qui est associé aux Th17. De plus, l’IL-6 induit l’expression du récepteur de l’IL-23. L’IL-23, bien qu’elle ne soit pas nécessaire à la différenciation des Th17, active STAT3 et est nécessaire pour obtenir une activation complète de ces lymphocytes. L’IL-1, de son côté, augmente l’expression de RORγt induite par l’IL-6. Finalement, l’IL-21, qui est produite par les Th17, peut remplacer l’IL-6 lors de la différenciation en Th17. Ceci crée donc une boucle d’amplification positive qui peut compenser une perte d’IL-6 dans le milieu. Ainsi, selon les stimuli, il est possible d’obtenir une production d’IL-17, suite à l’activation 9 de RORγt et de STAT3, sans que toutes les cytokines ne soient présentes, ce qui pourrait expliquer les différentes conditions de différenciation des Th17 décrites plus haut. Tableau 1 : Cytokines impliquées dans la différenciation Th17 Cytokines Rôles IL-1 Augmente l’expression de RORγt en conjonction avec l’IL-6 IL-6 Inhibe l’activation de Foxp3 par le TGF-β Augmente l’expression et l’activation de RORγt induite par le TGF-β Active STAT3 Induit l’expression du récepteur de l’IL-23 IL-21 Peut remplacer l’IL-6 dans la différenciation des Th17 IL-23 Active STAT3 Nécessaire à l’activation complète des Th17 Nécessaire à la survie/prolifération des Th17 TGF-β Augmente l’expression du récepteur de l’IL-6 Augmente l’expression de RORγt, mais inhibe son activation Inhibe l’expression de t-bet et GATA-3 10 Ref 57 57,58 57,59,60 57,58 46,54,55,5 7 1.3.5 Treg Les lymphocytes T régulateurs, que l’on nommait auparavant lymphocytes T suppresseurs, ont la capacité de bloquer l’activation des autres lymphocytes T et ainsi favoriser le développement de la tolérance immunitaire. On distingue deux grandes familles de lymphocytes Treg, soit les Tregs naturels (nTreg) et les Tregs induits (iTreg)61. Les nTregs sont générés dans le thymus. Ce sont des lymphocytes CD4+CD25+ qui expriment fortement le facteur de transcription Foxp3 qui est spécifique aux Tregs62. On croyait à l’origine qu’ils n’étaient impliqués que dans le contrôle de la réponse contre les autoantigènes. On sait maintenant qu’ils sont impliqués dans la réponse ciblant les alloantigènes, les antigènes de tumeur et plusieurs agents infectieux63–67. Pour activer les nTregs, le TCR n’est pas suffisant à lui seul, la présence d’IL-2 ou d’IL-4 est nécessaire68. Suite à leur activation, les nTregs inhibent la prolifération des lymphocytes auxiliaires et cytotoxiques69,70. Des expériences in vitro ont également montré que les nTregs peuvent inhiber les lymphocytes B71, les cellules NK72, les monocytes et les macrophages73. Les nTregs inhibent la réaction immunitaire de deux façons. Premièrement, par contact direct avec les cellules. Les nTregs expriment CTLA-4, une molécule de costimulation négative, diminuant ainsi l’activation des cellules avec lesquelles les nTregs entrent en contact74. Les nTregs peuvent également produire de la perforine et du granzyme B et tuer les cellules avec lesquelles ils sont en contact75. Deuxièmement, les nTregs produisent des cytokines qui sont connues pour être anti-inflammatoire telles que l’IL-10, le TGF-β et l’IL-3572,76,77. Ces médiateurs solubles permettent aux nTregs d’atteindre un plus grand nombre de cellules et de créer un microenvironnement où l’activation du système immunitaire est défavorisée. Il est important de noter que la majorité des études réalisées sur les nTregs ont été effectuées chez la souris, mais que plusieurs groupes ont trouvé des cellules semblables chez l’humain74,78. Un autre groupe suggère toutefois que l’étude des nTregs chez l’humain est plus compliquée, car il existe une importante population de lymphocytes T CD4+ qui exprime un niveau intermédiaire de CD25 et que parmi cette population, seule la fraction 11 représentant 2% des cellules exprimant le plus haut niveau de CD25 possède des propriétés régulatrices79. Une autre étude a également montré que l’expression de Foxp3 ne garantit pas un phénotype régulateur puisqu’il existe une population significative de lymphocytes T humains exprimant un niveau intermédiaire de CD25 qui exprime également Foxp3, mais ces cellules ne possèdent pas de fonctions régulatrices80. Les iTregs sont plus près des autres lymphocytes T auxiliaires dans le sens où ils sont générés à partir de lymphocytes T naïfs activés par le TCR. Il existe différents sous-types de lymphocytes iTregs comme les Tr1 et les Th3. Les cytokines nécessaires à la différenciation des iTregs sont l’IL-2 et le TGF-β pour les Th3 ou l’IL-2 et l’IL-10 pour les Tr1. Contrairement aux nTregs, les iTregs n’expriment pas tous le facteur de transcription Foxp3. Par exemple, les Tr1 ne l’expriment pas alors que les Th3 l’expriment, bien que cette expression soit moins forte que chez les nTregs81,82. Les Th3 et les Tr1 utilisent également des moyens différents pour exercer leurs fonctions. Les Th3 utilisent les contacts cellules-cellules ainsi que la production de cytokines, soit le TGF-β82,83. Les Tr1 quant à eux ne répriment pas leurs cibles par contact, mais seulement par la production d’IL-1081. On constate que les iTregs produisent la même cytokine que celle nécessaire à leur différenciation. Les Tregs sont aussi associés avec l’auto-immunité où on a observé une diminution de leur expansion ou de leur fonction. Dans le cas de l’arthrite rhumatoïde, le TNF inhibe grandement les fonctions des Tregs en déphosphorylant Foxp384. 1.3.6 Plasticité des lymphocytes T auxiliaires Suite à la découverte des phénotypes Th1 et Th2, le paradigme dominant était que les lymphocytes T auxiliaires se différenciaient de façon terminale, c’est-à-dire qu’un lymphocyte différencié en Th1 ne pouvait plus changer de phénotype. Ce paradigme découle d’expériences in vitro où les lymphocytes Th1 et Th2, suite à un certain nombre de divisions cellulaires, ne pouvaient plus changer de phénotype même en présence de cytokines associées à l’autre phénotype85. Cependant, depuis la découverte des Th17, mais particulièrement suite aux études qui ont montré que les Tregs, en présence d’IL-6, pouvaient se différencier en Th1786,87, la plasticité des lymphocytes T auxiliaires suscite 12 beaucoup d’intérêt. Le paradigme voulant que les lymphocytes T auxiliaires se différencient de façon terminale semble de moins en moins probable au fur et à mesure que les différentes études démontrent la capacité d’un certain phénotype à acquérir une ou plusieurs caractéristiques d’un autre phénotype. Par exemple, il a été démontré que les Th17 et les Tregs peuvent produire de l’IFN-γ88,89. De leur côté, les Th17 générés in vitro peuvent devenir Th1 ou Th2 en présence d’IL-12 ou d’IL-4 respectivement90,91. La plasticité n’est pas restreinte aux phénotypes les plus récents. Les Th2 peuvent produire de l’IFN-γ92 et les Th1 peuvent également devenir Th2 et produire de l’IL-4 lorsqu’ils sont placés dans les bonnes conditions91. Comme il a été mentionné plus haut, les Tregs peuvent se différencier en Th17 en présence d’IL-6. Toutefois, la conversion inverse, de Th17 à Tregs, n’a pas encore été observée. Malgré le fait que tous les phénotypes puissent posséder un certain degré de plasticité, il semblerait que les Th17 soient ceux qui ont la plus grande capacité à changer de phénotype. Des études sur la méthylation des gènes des facteurs de transcription apporte un élément de réponse important à la question de la plasticité des lymphocytes T35. Ces études ont montré que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 4 (H3K4me3) favorise la transcription des gènes alors que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 27 (H3K27me3) diminue la transcription des gènes. Par exemple, le facteur de transcription associé au phénotype, par exemple t-bet chez les Th1, est méthylé de façon à grandement favoriser son expression alors que les trois autres facteurs de transcription, ici GATA-3, Foxp3 et RORγt, sont méthylés de façon à grandement défavoriser leur expression. Chez les Th17, RORγt est également méthylé afin de favoriser son expression. Cependant, la différence réside au niveau des autres facteurs de transcription. Ceux-ci sont soit non méthylés soit méthylés de façon à rendre leur expression légèrement favorable (Schéma 2). Les Th17 pourraient donc être plus susceptibles à un changement de cytokines dans leur environnement où une dose relativement faible d’une cytokine associée à la différenciation d’un autre phénotype pourrait être suffisante pour activer le facteur de transcription en question et ainsi induire un changement de phénotype chez ces Th17. Par exemple, la présence d’IL-12 dans l’environnement des Th17 induira l’expression de t-bet, en plus de RORγt, chez ces cellules et il en résultera des cellules que l’on nomme Th1/Th17, cellules qui produisent de l’IL-17 et de l’IFN-γ et qui représenteraient les lymphocytes Th17 pathogéniques dont nous avons 13 discuté précédemment47. Le rôle et l’importance de la plasticité des lymphocytes T CD4+ ne sont toutefois pas encore très bien compris. Une étude a montré que l’activation de cellules dendritiques par le récepteur dectin-1, un récepteur membranaire impliqué dans la reconnaissance des champignons, permet la conversion des lymphocytes Tregs en Th17 lorsque les cellules dendritiques et les Tregs sont mis en coculture93. Puisque les Th17 sont impliqués dans la réponse immunitaire contre les champignons, la plasticité des lymphocytes T pourrait être un mécanisme de protection permettant de diminuer le nombre de lymphocytes T produits tout en maximisant l’efficacité de la réponse. Mieux comprendre la plasticité des lymphocytes T sera également important pour le traitement des maladies auto-immunes, car l’une des approches suggérées est l’utilisation de lymphocytes Tregs. Vu leur plasticité, il faudra s’assurer que le contexte dans lequel ils seront utilisés n’est pas propice à la conversion en un phénotype inflammatoire et ainsi aggraver la maladie. De plus, puisqu’aucun cas de plasticité de phénotype Th1, Th2 ou Th17 vers Treg n’a été rapporté, il ne semble pas prometteur d’utiliser la plasticité des lymphocytes T pour diminuer l’inflammation en transformant les lymphocytes T inflammatoires en lymphocytes T régulateurs. 14 Schéma 2 : Méthylation des gènes de facteurs de transcription selon le phénotype La triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 4 (H3K4me3, en vert) favorise la transcription des gènes alors que la triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 27 (H3K27me3, en rouge) diminue la transcription des gènes. Tiré de : Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation35 15 1.4 Cytokines proinflammatoires Les lymphocytes Th17 produisent différentes cytokines proinflammatoire telles que l’IL17, l’IL-21, l’IL-22 et l’IFN-γ. Ici, l’emphase sera mise sur l’IL-17 et l’IFN-γ puisque ces cytokines sont particulièrement importantes dans le développement de différentes maladies auto-immunes. 1.4.1 IL-17 L’IL-17 est la cytokine signature des lymphocytes Th17. Il s’agit en fait d’une famille de cytokines dont on connait six membres soit l’IL-17A, B, C, D, E et F94,95. L’IL-17A est la cytokine prototypique de la famille IL-17 et on la nomme souvent simplement IL-17. Les autres membres de la famille ont un degré plus ou moins élevé de similitude avec l’IL-17A. C’est l’IL-17F qui a le plus haut degré de ressemblance et c’est également la cytokine dont les effets se rapprochent le plus de l’IL-17A. Fait intéressant, l’IL-17E est l’isoforme qui possède le moins d’homologie avec l’IL-17A et avait été préalablement découverte sous le nom d’IL-2596. L’IL-17A et F ne sont pas produites uniquement par les lymphocytes Th17, mais ces derniers restent les producteurs les plus importants, particulièrement pour ce qui est de l’IL17A. De leur côté, les autres membres de la famille IL-17 sont produites par plusieurs types cellulaires et ne sont pas restreintes aux cellules du système immunitaire95. L’IL-17 est un dimère d’environ 30-35 kDa dont chaque monomère fait 150 acides aminés pour environ 15 kDa. On retrouve des homodimères d’IL-17A, d’IL-17F ainsi que l’hétérodimère IL-17A/F97. Dans la suite du texte, l’IL-17 fera référence à l’homodimère d’IL-17A, sauf mention contraire. La production d’IL-17 par les Th17 nécessite, comme pour toutes autres cytokines, l’activation de voies de signalisation intracellulaire. Dans le cas de l’IL-17, ces voies de signalisation sont de plus en plus caractérisées. Il a été démontré que le facteur de transcription spécifique aux Th17, RORγt est important pour la transcription de l’IL-1798. Le promoteur du gène de l’IL-17 possède d’ailleurs plusieurs sites de liaison pour RORγt99. Cependant, l’inhibition de RORγt ne bloque pas complètement l’expression de l’IL-17. Une étude qui a utilisé des souris knock-out pour RORγt ainsi que pour RORα a montré que ce 16 dernier est également important pour la production d’IL-17, bien qu’à un niveau moindre que RORγt, et que le double knock-out de ces deux gènes inhibe complètement l’expression de l’IL-17100. Une autre étude a montré que RORγ, dont RORγt est un isoforme, est requis pour la différenciation Th17. Bien que RORγ soit exprimé par d’autres types cellulaires (muscles, reins) il n’est exprimé dans aucun autre phénotype de lymphocytes T que Th17101. L’activation du TCR est nécessaire pour l’expression de RORγt, mais les voies de signalisation impliquées sont présentement en cours d’études. L’une de ces voies est la voie de STAT3, un autre facteur de transcription impliqué dans la transcription de l’IL-17. Les activateurs principaux de STAT3 dans les Th17 sont l’IL-6, l’IL-21 et l’IL-23. STAT3 intervient directement sur l’expression de l’IL-17102 en se liant à son promoteur103 et indirectement en augmentant l’expression de RORγt et de RORα104. De plus, il a été montré dans un modèle murin que la délétion de STAT3 inhibe la différenciation des lymphocytes T auxiliaires en lymphocytes Th17105. L’absence de STAT3 inhibe également le développement de l’encéphalomyélite aigue expérimentale (EAE), le modèle murin de la sclérose en plaques106,107. Cependant, il semblerait que STAT3 ait besoin de RORγt pour induire l’expression de l’IL-17, car la transfection d’une forme active de STAT3 dans des cellules de souris knock-out pour RORγt n’induit qu’un niveau très faible d’IL-17108. L’activation de STAT3 a également été associée avec l’expression de l’IL-17 chez l’humain109. Une autre étude a montré que les voies du facteur de transcription des lymphocytes T activés (NF-AT) et des MAP kinase ERK et JNK peuvent être importantes pour la production d’IL-17. Dans cette étude, les auteurs ont couplé une séquence retrouvée en amont du gène de l’IL-17 humaine à la luciférase qu’ils ont ensuite transfectée dans des cellules Jurkat. À l’aide d’inhibiteurs chimiques, ils ont montré que les voies de ERK, JNK et particulièrement NF-AT sont nécessaires à la transcription de la luciférase et donc de l’IL-17110. Toutefois, le rôle de la voie de ERK est encore controversé. Une étude différente a trouvé que les voies de NF-κB, JNK et p38, mais pas ERK, étaient nécessaires pour l’expression de l’IL-17 chez la souris111. Cependant, il s’agit là d’une activation par l’ostéopontine et non par le TCR. De plus, deux études ont montré un rôle négatif pour ERK chez la souris. La première a montré que l’inhibition de ERK favorise l’expression d’IL-17112 et la deuxième indique que la voie de ERK inhibe l’expression de l’IL-17 en 17 inhibant l’activation de STAT3 et de RORγt113. Il semblerait donc qu’il y ait une différence entre les voies de signalisation impliquées dans l’expression de l’IL-17 humaine et l’IL-17 murine, particulièrement en ce qui a trait au rôle de la voie ERK. L’importance de p38 dans la production de l’IL-17 a été montrée à plusieurs reprises. Chez la souris, l’utilisation d’un inhibiteur chimique de p38 a diminué grandement la production d’IL-17 chez les lymphocytes Th17114. Cette étude a montré que p38 active le facteur de traduction elF-4E et qu’ainsi, cette MAP Kinase ne serait pas impliquée dans l’expression du gène de l’IL-17, mais favoriserait la traduction de son ARNm en protéine. Le facteur de transcription Batf activé par p38 est un autre facteur important pour la différenciation des Th17 et la production d’IL-17. Chez les souris knock-out pour Batf, les lymphocytes Th1 et Th2 se développent normalement alors que la différenciation en Th17 est grandement diminuée115. Chez ces souris, l’expression de RORα et RORγt ainsi que la production d’IL-17 sont presque totalement inhibées comparativement aux souris normales. Le facteur de transcription c-Maf, lui aussi activé par p38, a été impliqué dans la production d’IL-17, car il favorise l’expression du récepteur de l’IL-23 nécessaire à la pleine activation des lymphocytes Th17116. Il existe d’autres molécules qui ont été impliquées dans la signalisation menant à l’expression de l’IL-17. On retrouve par exemple la voie de PI3-K/AKT. Celle-ci est nécessaire à la production d’IL-17 suite à l’activation par TCR/CD28 chez la souris117 et en réponse à l’IL-2, l’IL-7 et l’IL-15 chez l’humain118. Cependant, une autre étude a montré que l’activation d’AKT inhibe la différenciation Th17 et la production d’IL-17 chez la souris119. Le rôle de la voie PI3-K/AKT dans la production d’IL-17 reste donc à confirmer. D’autres molécules sont impliquées dans l’expression de l’IL-17, comme la kinase inductible des lymphocytes T (ITK), le récepteur pour l’aryl hydrocarbone (Ahr) ainsi que les facteurs de transcription de la famille de NF-κB, c-Rel et RelA. Les souris knock-out pour ITK produisent moins d’IL-17120. Une étude utilisant un knock-out d’Ahr a montré que la signalisation induite par ce récepteur inhibait la différenciation en Th17 et favorisait la différenciation en Treg121. Cependant, le rôle et le mécanisme de ces molécules restent encore à confirmer. De leur côté, c-Rel et RelA sont impliqués dans l’expression de RORγ et RORγt. En effet, les lymphocytes T de souris knock-out pour l’un ou l’autre des facteurs de transcription produisent beaucoup moins d’IL-17 et cette perte a été associée à une 18 diminution de l’expression de RORγ et RORγt101. L’IL-17 est une cytokine pro-inflammatoire aux effets multiples. Ces effets sont médiés par un récepteur membranaire, l’IL-17R. Ce dernier est un dimère dont cinq membres, allant de A à E, ont été identifiés. L’IL-17RA est le récepteur principal pour l’IL-17A alors que l’IL17RC est le récepteur principal pour l’IL-17F bien que l’IL-17A et l’IL-17F puissent respectivement lier l’IL-17RC et l’IL-17RA. Cependant, le récepteur le plus efficace semble être l’hétérodimère IL-17RA/RC qui peut donc très bien lier l’IL-17A, l’IL-17F et l’IL-17A/F122. La distribution des deux isoformes n’est toutefois pas uniforme. Les cellules du système immunitaire expriment généralement une plus grande proportion d’IL-17RA alors que les autres cellules expriment une plus grande proportion d’IL-17RC123. Pour la suite du texte, le récepteur de l’IL-17 ou IL-17R fera référence à l’hétérodimère IL17RA/RC. La liaison de l’IL-17 avec son récepteur induit une signalisation intracellulaire qui inclut l’activation du facteur de transcription NF-κB, la voie des MAP kinases ERK, JNK et p38 ainsi que la voie de PI3-K/AKT124. L’effet principal de l’IL-17 est d’induire la production d’autres cytokines, ainsi que des chimiokines et autres molécules. Puisque pratiquement toutes les cellules expriment l’IL17R, les molécules produites en réponse à l’IL-17 sont très variées. Cependant, ces molécules ont en commun le fait qu’elles sont impliquées de près ou de loin dans le développement de l’inflammation et l’activation du système immunitaire. Par exemple, chez les fibroblastes, l’IL-17 induit la production d’IL-6, d’IL-8 et de prostaglandine E2125. L’IL-17 est toutefois mieux connue pour son rôle dans le développement des maladies inflammatoires auto-immunes. Les études à ce sujet sont extrêmement nombreuses. Je me restreindrai au rôle des Th17 et de l’IL-17 dans trois maladies soit l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et la malade de Crohn. 1.4.2 IFN-γ Les interférons (IFN) forment une famille de cytokine dont on connaît trois membres. L’IFN-α et l’IFN-β, des interférons de type I, sont impliqués dans la réponse antivirale. Les mécanismes par lesquels agissent les interférons de type I sont variés, mais impliquent la diminution de la réplication d’ARN viraux126. L’IFN-γ est le seul interféron de type II. Tout 19 comme les interférons de type I, l’IFN-γ peut protéger les cellules en cas d’infection virale. Cependant, son rôle principal, qui la distingue des interférons de type I, est l’activation de la réponse immunitaire cellulaire et le développement de l’inflammation127,128. L’IFN-γ est produit par plusieurs types cellulaires dont les cellules NK, les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes Th1 et également les lymphocytes Th17. Chez les lymphocytes T, la stimulation par le TCR induit la production d’IFN-γ. Cette production est augmentée chez les lymphocytes Th1 en présence d’IL-12 et d’IL-18. Les voies de signalisation impliquées dans la production de l’IFN-γ incluent les MAP kinases ERK, JNK et p38 de même que la voie PI3- kinase/AKT129–132. L’IFN-γ est une cytokine de 166 résidus que l’on retrouve sous forme de dimère de 34kDa. Comme mentionné plus haut, l’IFN-γ a de nombreux effets sur le système immunitaire. Entre autres, elle active les cellules présentatrices d’antigènes chez qui elle augmente l’expression des molécules de CMH I et II et des molécules de costimulation ainsi que des protéines nécessaires pour le traitement des antigènes128. L’IFN-γ augmente également la production de cytokines proinflammatoires, dont l’IL-1 et le TNF, et de chimiokines chez les macrophages. De plus, cette cytokine augmente les fonctions lytiques des macrophages en activant la phagocyte oxydase et l’oxyde nitrique synthase qui produisent les intermédiaires réactifs de l’oxygène et de l’azote133. Dans les lymphocytes B, l'IFN-γ stimule le changement de classe des anticorps, favorisant les formes reconnues par les phagocytes et activant le système du complément128. Ainsi, l’IFN-γ augmente la présentation antigénique ce qui permet d’activer un plus grand nombre de lymphocytes T. Vu son importance dans l’inflammation, un dérèglement ou une perte de contrôle de la production d’IFN-γ peut mener au développement de maladies inflammatoires autoimmunes134. Cependant, depuis la découverte de l’IL-17 et de son implication dans l’inflammation et les maladies auto-immunes, de nombreuses maladies que l’on associait préalablement aux Th1 et à l’IFN-γ se sont vues converties en maladie de type Th17. À cela se sont ajoutées des études qui ont montrés que l’IFN-γ pouvait inhiber le développement de certaines maladies auto-immunes135,136. Il n’en reste pas moins que l’IFN-γ est une puissante cytokine pro-inflammatoire. D’ailleurs, après la vague Th17 qui a déferlée sur le monde de l’immunologie, on commence à réaliser que la combinaison IL-17 / IFN-γ est 20 probablement responsable du développement des maladies inflammatoires auto-immunes et non pas l’une ou l’autre des cytokines individuellement. L’IFN-γ a été associé aux maladies inflammatoires auto-immunes de différentes façons. Premièrement, il peut réactiver les lymphocytes T autoréactifs qui ont préalablement été anergisés137. Deuxièmement, puisque l’IFN-γ active les CPAs et les macrophages, une dérégulation du contrôle de la production d’IFN-γ qui mènerait à une production constante de la cytokine favorisera la perpétuation de la présentation antigénique et par le fait même de l’activation de la réponse immunitaire acquise lorsque l’antigène ne peut être éliminé, tel un antigène du soi. De plus, les macrophages activés par l’IFN-γ produisent de l’IL-1, l’IL-6 et l’IL-23, ce qui peut contribuer au développement de maladies auto-immunes en favorisant la différenciation Th17133. Troisièmement, bien que la réponse immunitaire soit très importante pour la survie de l’organisme, l’inflammation qui y est associée induit un stress qui peut être néfaste pour l’organe inflammé. C’est pourquoi, en temps normal, la réponse immunitaire est étroitement régulée. Lorsque la production d’IFN-γ devient chronique, il en résulte une production constante, par les macrophages, de molécules réactives dérivées d'oxygène et d'azote ainsi que d’enzymes hydrolytiques qui finiront par détruire le tissu ou l’organe inflammé138,139. Des macrophages activés en trop grand nombre ou pendant trop longtemps, comme dans le cas d'inflammation chronique, peuvent causer des dommages tissulaires majeurs. Bien que l'IFN-γ soit un médiateur de l'inflammation, des études ont démontré qu'il était nécessaire pour mettre fin à la réponse inflammatoire. L'IFN-γ peut sensibiliser les lymphocytes T à l'apoptose en augmentant l'expression des procaspases et ainsi diminuer le nombre de lymphocytes T et réduire l'inflammation137,140. Les lymphocytes T naïfs ou fraîchement activés ne sont pas sensibles à cet effet de l’IFN-γ car ils n’expriment pas la chaîne β du récepteur qui est responsable de l’effet apoptotique de l’IFN-γ chez les lymphocytes141. Les lymphocytes T n’expriment la chaîne β du récepteur de l’IFN-γ qu’après avoir été activés plusieurs fois, ce qui est le cas lors de maladies auto-immunes dépendantes des lymphocytes T. Ces effets pro- et anti-inflammatoires contribuent à la controverse qui existe présentement quant au rôle de l'IFN-γ dans les maladies auto-immunes, c’est-à-dire que la présence 21 d’IFN-γ contribue ou non au développement des maladies auto-immunes. Il a été suggéré que l'effet de l'IFN-γ sur le développement de maladies auto-immunes est dépendant de sa localisation et du temps. Par exemple, chez la souris, l'injection d'IFN-γ dans le liquide synovial favorise le développement de l'arthrite induite par le collagène, alors qu'il l'inhibe lorsqu'il est injecté de façon systémique135–137. 1.4.3 IL-21 L’IL-21 est une cytokine d’environ 15 kDa faisant partie de la famille de l’IL-2142. Elle est exprimée principalement par les lymphocytes T CD4+, mais également par les cellules NKT143–147. Son récepteur, l’IL-21R, active STAT1, STAT3 et STAT5. Elle favorise la prolifération des lymphocytes T, B et des cellules NK148 mais a surtout été étudiée dans le développement de maladies inflammatoires et sera décrite dans les sections suivantes. 1.4.4 IL-22 L’IL-22 est une cytokine d’environ 17kDa de la famille de l’IL-10149. Elle est produite par les lymphocytes T, les monocytes, les macrophages et les cellules NK149,150. Le récepteur de l’IL-22 n’est toutefois pas exprimé par les cellules du système immunitaire151. Les effets de l’IL-22 incluent la prolifération des fibroblastes et des cellules épithéliales ainsi que la production de cytokines telles que MCP-1 et l’IL-8 par ces cellules152,153. 1.5 Lymphocytes T auxiliaires et développement des maladies auto-immunes. Les maladies auto-immunes sont nombreuses et les lymphocytes, particulièrement les lymphocytes T auxiliaires, jouent un rôle dans le développement de plusieurs d’entre elles. Pour ce manuscrit, quatre exemples de maladies auto-immunes ont été retenus : l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Les deux dernières font partie de la famille des maladies inflammatoires des intestins. Ces quatre maladies ont été choisies en fonction de leur prévalence et du rôle des lymphocytes T auxiliaires dans leur développement. 22 1.5.1 Arthrite rhumatoïde L’arthrite rhumatoïde (AR) est une maladie inflammatoire auto-immune dont les causes sont encore mal connues. L’AR est caractérisée par une inflammation chronique des articulations ainsi que par la dégradation irréversible du cartilage et des os des articulations154. Fait particulier, l’atteinte des articulations est souvent symétrique, c’est-àdire que les deux mains ou les deux pieds sont atteints155. Même si les causes de la maladie ne sont pas encore bien connues, certains facteurs ont été associés avec le développement de la maladie. Par exemple, les personnes exprimant les allèles DR1 et DR4 du CMH de classe II auraient plus de chance de développer l’AR car ces allèles favoriseraient la présentation d’auto-antigène156,157. La fumée de cigarette est soupçonnée de favoriser le développement de l’AR158. Il est également possible qu’une infection puisse être à l’origine de la maladie comme dans les cas de mimétisme moléculaire observé dans d’autres maladies159. Cependant, aucun pathogène n’a encore été associé avec un risque plus élevé de développer l’AR. Il n’existe aucun traitement curatif pour la maladie. Toutefois, grâce aux récentes découvertes, il est maintenant possible de diminuer les symptômes et de retarder le développement de la maladie. Les traitements se divisent en trois catégories : les anti-inflammatoires, les DMARDs (disease modifying anti-rheumatic drugs) et les molécules biologiques. Les anti-inflammatoires visent à contrôler la réaction inflammatoire caractéristique de la maladie. Il s’agit soit de glucocorticoïdes ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l’aspirine et l’ibuprofène. Les DMARDs permettent de ralentir le développement de la maladie. Pour être pleinement efficaces, ils doivent être administrés dès le diagnostic de la maladie. Le plus utilisé parmi cette catégorie est le méthotrexate. Finalement, les biologiques sont des anticorps bloquant différentes cytokines ou fonctions des cellules immunitaires. Les plus connus sont les anticorps bloquant pour le TNF (etanercept, infliximab) et pour l’IL-1 (anakinra), mais d’autres biologiques ont démontré un effet protecteur tel que l’anticorps bloquant le récepteur de l’IL-6 (tocilizumab), l’anticorps ciblant les lymphocytes B via CD20 (rituximab) ou la protéine de fusion CTLAIg bloquant la costimulation des lymphocytes T (abatacept). Un anticorps bloquant pour l’IL-17 a également été testé et semble très prometteur160. De façon générale, le traitement le plus efficace consiste à utiliser les trois approches161. Plusieurs types cellulaires participent à l’évolution de la maladie. Les lymphocytes T, les 23 lymphocytes B, les macrophages, les neutrophiles, les plaquettes et les fibroblastes des tissus synoviaux ont tous été impliqués dans le développement de l’inflammation de l’articulation et dans la progression de la maladie162–165. Parmi les lymphocytes T, les lymphocytes Th1 et Th17 jouent un rôle central dans le développement de la maladie en produisant des cytokines (TNF-α, l’IFN-γ, IL-17 et RANKL) qui vont moduler l’inflammation et la dégradation du cartilage et de l’os au niveau de l’articulation arthritique127,166–168. Cependant, les mécanismes qui régulent leur activation au niveau de l’articulation ne sont pas bien connus. À l’origine, cette maladie fut décrite comme étant de type Th1 dû au rôle de l’IFN-γ dans le développement de l’inflammation134. Ceci a été confirmé par l’administration d’IFN-γ à des souris dans un modèle d’arthrite induite par le collagène. Ces souris développent des symptômes plus sévères que les souris normales169,170. Cependant, les souris n’exprimant pas le récepteur de l’IFN-γ ou chez qui l’IFN-γ est neutralisé par des anticorps développent une arthrite plus sévère suggérant un rôle protecteur pour l’IFN-γ dans le développement de l’arthrite135,136. Toutefois, le rôle de l’IFN-γ dans le développement de l’arthrite induite par le collagène est dépendant de l’utilisation de l’adjuvant complet de Freund ou non. Plus précisément, en présence de mycobactéries, l’IFN-γ aura un rôle protecteur et inversement en absence de mycobactéries135. Plus récemment, les lymphocytes Th17 ont été impliqués dans l’arthrite rhumatoïde vu leur capacité à induire l’inflammation et d’activer la résorption osseuse en produisant des cytokines comme l’IL-17 et le TNF-α et en induisant la production de RANKL chez les ostéoblastes166,171,172. L’expression de RANKL permet la maturation des ostéoclastes via le récepteur RANK exprimé chez ces derniers et contribue à la dégradation osseuse. Les lymphocytes Th17 sont les premiers lymphocytes à arriver à l’articulation, mais puisqu’on y retrouve de l’IL-12 en quantité importante, la plupart vont rapidement devenir Th1/Th17 ou Th1 vu leur plasticité88,173,174. Les Th17, les Th1 et les Th1/Th17 contribuent au développement de l’inflammation en produisant différentes cytokines, comme l’IL-17A, l’IL-17F, l’IL-21, l’IL-22 et l’IFN-γ, qui activeront, à différents degrés, les macrophages, les fibroblastes et les chondrocytes. En réponse, ces cellules produiront différentes cytokines pro-inflammatoires ainsi que plusieurs chimiokines mais également plusieurs 24 métalloprotéinases de la matrice (MMP) qui contribuent aux dommages associés à la maladie175,176. Les chimiokines produites permettront le recrutement de leucocytes, principalement des neutrophiles, mais également d’autres Th17173,177. Bien que les trois phénotypes précédents puissent être impliqués dans l’arthrite, il a été proposé que les cellules Th1/Th17 soient les cellules les plus pathogéniques et les plus importantes dans le développement de l’arthrite rhumatoïde. Le rôle de l’IL-17 dans le développement de l’arthrite rhumatoïde a été montré de nombreuse fois dans des modèles animaux. Les souris knock-out pour l’IL-17 développent moins d’arthrite178. Également, le traitement des souris normales avec des anticorps bloquants ou des récepteurs solubles pour l’IL-17 diminue grandement l’inflammation des jointures179,180. De plus, chez les souris knock-out pour l’IL-17R, la production d’IL-1, d’IL-6 et des métalloprotéinases 3, 9 et 13 par les synoviocytes est grandement diminuée lorsque l’on tente d’induire l’arthrite chez ces souris181. L’utilisation de souris knock-out pour l’IL-23 a montré que ces souris développent moins d’arthrite et que cette protection est corrélée avec une diminution du nombre Th17182. Parmi les voies de signalisation connues pour activer la production d’IL-17, le rôle de la voie p38 a été testé dans le modèle murin d’arthrite induite par le collagène. Des études ont montré que des inhibiteurs de cette voie de signalisation pouvaient être efficaces pour diminuer le développement de la maladie183,184. Chez l’humain, on a détecté la présence d’IL-17 et d’IL-23 tant dans le liquide synovial que dans le sang de patients arthritiques185–189. De plus, la présence de Th17, d’IL-17 et d’IL-23 est corrélée positivement avec la sévérité de la maladie189–191. L’IL-17 a de nombreux effets sur les différentes cellules que l’on retrouve au niveau de l’articulation192. Elle contribue au développement de l’inflammation au niveau de l’articulation en induisant la production de TNF par les macrophages124 ou en augmentant le recrutement de neutrophiles suite à la production d’IL-8 par les synoviocytes125. De plus, l’IL-17 contribue à la dégradation du cartilage et de l’os en induisant la production d’oxyde nitrique et de MMPs par les chondrocytes, les synoviocytes et les macrophages124,193. L’IL17 agit également sur les ostéoblastes chez qui il augmente l’expression de RANKL193 et favorise ainsi la formation d’ostéoclastes qui pourront dégrader l’os171,194 (Schéma 3). 25 Schéma 3 : Rôle de l’IL-17 dans le développement de l’arthrite rhumatoïde Les lymphocytes Th17 produisent de l’IL-17 qui active la réponse inflammatoire des macrophages et des fibroblastes. L’IL-17 active également la dégradation du cartilage dépendante des macrophages et des chondrocytes. Les Th17 sont également impliqués dans l’ostéoclastogénèse via l’expression de RANKL et l’induction de RANKL chez les ostéoblastes par l’IL-17 et contribuent ainsi à la dégradation osseuse. Tiré de : IL-17 as a future therapeutic target for rheumatoid arthritis160 26 Il faut noter que l’IL-17 provoque, chez les synoviocytes, la production d’IL-1, d’IL-6 et d’IL-23. Puisque l’on retrouve également de grandes quantités de TGF-β au niveau de l’articulation arthritique, toutes les cytokines nécessaires à la différenciation des lymphocytes T en lymphocytes Th17 sont présentes dans l’articulation, ce qui pourrait contribuer au développement de la chronicité de l’inflammation observée dans la maladie. Les autres cytokines produites par les Th17 sont également impliquées dans le développement de l’arthrite rhumatoïde. L’IL-21 produite par les Th17 peut également favoriser l’ostéoclastogénèse en augmentant l’expression de RANKL chez les lymphocytes T CD4+ et chez les synoviocytes de patients arthritiques195. De plus, il a été observé que le niveau d’expression de l’IL-21 est associé avec la sévérité de la maladie lors de la phase de développement ainsi qu’avec l’expression du facteur rhumatoïde196,197. L’IL-22 a également été associé avec le développement de la maladie. L’IL-22 est détectée chez les patients arthritiques et est corrélée à la présence de facteur rhumatoïde. De plus, l’IL-22 augmente l’expression de RANKL chez les fibroblastes synoviaux et une forte expression d’IL-22 a été associée à la dégradation osseuse198,199. Une autre étude a montré que l’IL-22 favorise la prolifération des fibroblastes et pourrait donc contribuer au développement du pannus200. Des résultats similaires ont été obtenus chez la souris dans le modèle d’arthrite induite par le collagène201. Une étude utilisant le modèle des souris KO pour l’IL-1Ra, qui développent l’arthrite de façon spontanée, suggère que l’IL-22 présente dans la maladie provienne des cellules produisant également de l’IL-17 donc probablement les Th17202. 1.5.2 Sclérose en plaques La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune où la gaine de myéline des axones du cerveau et de la moelle épinière, soit le système nerveux central (SNC), est détruite. La démyélinisation des neurones empêche l’influx nerveux de se propager d’un axone à l’autre, ce qui peut entraîner différents troubles moteurs, mais également des troubles psychologiques. La démyélinisation des axones se fait suite à la reconnaissance et à la destruction de la myéline par le système immunitaire. De façon semblable à l’arthrite 27 rhumatoïde, les causes menant à la sclérose en plaques sont encore mal connues. Parmi les facteurs probables, on retient des facteurs génétiques et environnementaux ainsi que certaines infections203,204. Actuellement, aucun traitement ne permet de guérir la maladie. On utilise principalement les corticostéroïdes pour diminuer la réponse immunitaire. Certains DMARDs sont également utilisés, bien que les résultats soient souvent mitigés. Le rôle de l’IL-17 dans le développement de la sclérose en plaques n’est pas très bien connu. De nombreuses études ont évalué l’importance de l’IL-17 dans le développement de l’EAE, un modèle animal de maladie inflammatoire du système nerveux. Avant la découverte de l’IL-17, l’EAE était considérée, tout comme l’arthrite, une maladie de type Th1. On classait l’EAE comme une maladie de type Th1, car bloquer l’IL-12 protégeait les souris de la maladie. C’est en partie grâce aux études dans l’EAE que les Th17 ont été découverts, car c’est alors qu’il a été trouvé que l’IL-12 et l’IL-23 ont une sous-unité commune, la sous-unité p40. Des études subséquentes ont montré que les souris knock-out pour la sous-unité spécifique à l’IL-12 ne sont pas protégées contre la maladie alors que les souris knock-out pour la sous-unité spécifique à l’IL-23, la sous-unité p19, sont complètement protégées contre l’induction de l’EAE23. Dans cette même étude, l’ajout d’IL-23 aux lymphocytes T augmente la production d’IL-17 et le transfert adoptif de ces cellules est suffisant pour induire l’EAE dans une souche de souris susceptible à la maladie. Une autre étude a montré que des souris recevant des injections d’anticorps bloquant pour l’IL-23 sont moins nombreuses à développer l’EAE et que celles qui développent tout de même l’EAE ont des symptômes beaucoup moins importants205. Cette même étude a montré que bloquer l’IL-23 était plus efficace que de bloquer directement l’IL-17, probablement à cause du rôle d’activateur que l’IL-23 a sur les lymphocytes Th17, ce qui permet d’inhiber l’expression de plusieurs cytokines à la fois. Il a également été démontré que la voie p38 est fortement activée dans les lymphocytes T que l’on retrouve au niveau des lésions associées à l’EAE chez le rat206. L’utilisation d’inhibiteurs chimiques et de mutant constitutivement actif de p38 a montré que cette voie de signalisation est impliquée dans la production d’IL-17, et que plus elle est activée, plus la sévérité de la maladie est grande114. Contrairement à son rôle dans l’arthrite rhumatoïde, l’IL-21 semble avoir un rôle protecteur lors du développement de l’EAE car le blocage ainsi que le KO de son récepteur exacerbent la maladie207,208. Le rôle de l’IL-22 dans le développement de la maladie n’est 28 pas très bien connu, mais il semble que la cytokine ne soit pas nécessaire209. Chez l’humain, les études sont moins directes. Il a été montré que les cellules dendritiques dérivées de macrophages de patients atteints de sclérose en plaques produisent plus d’IL-23 que les mêmes cellules de patients normaux210. Une autre étude a montré que les lymphocytes Th17 sont plus efficaces pour traverser la barrière hématoencéphalique que les lymphocytes Th1211. Malgré l’importance que les lymphocytes Th17 semblent avoir dans le développement de l’EAE chez la souris, leur rôle dans le développement de la sclérose en plaques reste encore à élucider. Il a toutefois été observé que les lymphocytes Th1/Th17 sont associés avec la phase de rechute (relapse) de la maladie alors qu’ils sont absents de patients sains ou sans rechute212. Un des mécanismes proposés par la même étude pour expliquer la pathogénicité de ces cellules est que l’IFN-γ rendrait la barrière hématoencéphalique plus perméable et permettrait donc au Th1/Th17 de migrer plus facilement jusqu’au SNC. 1.5.3 Maladies inflammatoires des intestins Les maladies inflammatoires des intestins (IBD) sont en fait une famille de maladies. Parmi celles-ci, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont les plus connues. La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire auto-immune qui peut affecter n’importe quel organe du tractus digestif. Les symptômes de la maladie sont variés selon le ou les organes touchés, mais incluent le plus fréquemment des douleurs abdominales, de la diarrhée et des vomissements. Tout comme les maladies précédentes, les causes exactes ne sont pas très bien connues. Encore une fois, les facteurs génétiques et environnementaux semblent importants213,214. Il n’existe également aucun traitement permanent pour la maladie de Crohn, les traitements aux anti-inflammatoires et antibiotiques ne permettant que de contrôler les symptômes. La colite ulcéreuse est une maladie semblable à la maladie de Crohn215. Les différences majeures se trouvent au niveau des organes touchés. Les traitements sont également semblables à la différence que l’ablation locale du côlon et du rectum permet habituellement de guérir la maladie. La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse sont deux maladies dont le développement a été 29 associé à l’IL-17. Cependant, tout comme pour la sclérose en plaques, l’implication de l’IL17 a surtout été évaluée de façon indirecte en étudiant le rôle de l’IL-23 et des Th17 dans le développement de ces maladies216,217. Il a été montré que dans des modèles murins d’IBD, l’IL-23, mais pas l’IL-12 est importante pour le développement de l’inflammation intestinale218,219. Chez la souris, une étude récente a montré que le contrôle des lymphocytes Th17 se faisait au niveau des intestins220. Puisque les lymphocytes Th17 ont tendance à s’accumuler au niveau de l’intestin, s’ils ne sont pas bien contrôlés, cette accumulation peut certainement contribuer au développement de maladies inflammatoires tel que la colite ulcéreuse. Dans un modèle murin de colite ulcéreuse, la présence d’IL-21 a été associée à une augmentation de l’inflammation intestinale en diminuant la différenciation des cellules régulatrices et en augmentant la résistance des lymphocytes CD4+ face aux Tregs221. Cette cytokine peut également induire l’expression de MMP-1, MMP-2, MMP-3 et MMP-9 chez les fibroblastes intestinaux ce qui contribue à la formation des ulcères222. Dans le même modèle, il a été démontré que l’IL-22 inhibe le développement de la colite ulcéreuse en diminuant l’inflammation et favorise la production de mucus protecteur223,224. Chez l’humain, plusieurs études ont montré que l’IL-17 serait importante pour le développement de la colite ulcéreuse alors que l’IFN-γ serait important pour le développement de la maladie de Crohn225–227. Le rôle de ces cytokines n’est pas encore bien défini puisque tel que mentionné précédemment, les lymphocytes Th1/Th17 sont impliqués dans le développement des deux maladies47,48. 1.6 Signalisation du TCR Il a été mentionné plus haut que deux signaux étaient nécessaires à l’activation des lymphocytes T CD4+. Nous examinerons premièrement la signalisation induite par le TCR et dans un second temps la signalisation des molécules de costimulation. Pour les deux premiers signaux, soit le TCR et la costimulation, une étroite interaction entre les lymphocytes T et les CPAs est requise. Cette interaction est facilitée par le 30 réarrangement des molécules de surfaces des deux cellules. Ce réarrangement crée ce que l’on appelle la synapse immunologique228,229. Le centre de la synapse immunologique est constitué du TCR et des molécules de costimulation du côté du lymphocyte ainsi que du CMH et des ligands des molécules de costimulation du côté de la CPA. On retrouve également de nombreuses molécules d’adhésion, tel que LFA-1 et ICAM-1, en périphérie du complexe TCR/CMH/molécules de costimulation. Ces molécules d’adhésion servent à solidifier le lien entre les deux cellules, mais peuvent également contribuer directement à l’activation des lymphocytes T. Il a été proposé que les récepteurs que l’on retrouve dans la synapse immunologique aient naturellement tendance à se regrouper à la surface de la cellule dans ce que l’on appelle des radeaux lipidiques. Toutefois, le rôle des radeaux lipidiques dans la colocalisation des récepteurs et dans l’activation des lymphocytes T est encore contesté, car bien que certains observent une inhibition de l’activation lors de la perturbation de ces derniers230–232, d’autres doutent de la validité des méthodes d’identifications des radeaux lipidiques233–235. La signalisation par le TCR est un élément précoce dans l’activation de la réponse des lymphocytes T. La reconnaissance de l’antigène présenté par une molécule de CMH induit une signalisation intracellulaire en quelques minutes. Parmi les voies de signalisation activées, on retrouve la voie de la phospholipase Cγ1 (PLCγ) qui elle-même active les voies du calcium et de la protéine kinase C (PKC) ainsi que les protéines kinases activées par mitogène, (MAP kinase). Ces voies de signalisation mènent à l’activation de facteurs de transcription communs comme NF-κB, NF-AT, AP-1 (Schéma 4), mais également de facteurs de transcription plus spécifiques comme ceux que l’on retrouve chez les lymphocytes T auxiliaires soit t-bet, GATA, RORγt et Foxp3 pour les Th1, Th2, Th17 et Treg respectivement. Ainsi, l’activation par le TCR aboutit à la différenciation des lymphocytes T et à l’expression de cytokines spécifiques. 1.6.1 Initiation de la signalisation L’initiation de la signalisation par le TCR débute avec l’activation de Lck et de Fyn 236. Ces deux molécules sont des protéines tyrosines kinases de la famille Src. Lck et Fyn possèdent deux sites de phosphorylation, l’un activateur et l’autre inhibiteur. Au repos, le site inhibiteur est phosphorylé alors que le site activateur ne l’est pas. Pour que ces protéines 31 soient activées, leur site activateur doit être phosphorylé et leur site inhibiteur déphosphorylé. La phosphorylation du site activateur de Lck et de Fyn se fait par autophosphorylation237,238 alors que la déphosphorylation de leur site inhibiteur se fait via le CD45, une protéine tyrosine phosphatase membranaire que l’on retrouve chez les leucocytes239. Lck est la première à être activée, car elle est associée à la queue cytoplasmique du CD4 et du CD8 ce qui favorise son recrutement au niveau du TCR240 alors que Fyn est restreinte à certains domaines lipidiques et est activée plus tardivement, ce qui permet une prolongation du signal241. Une fois activée et présente dans l’environnement immédiat du complexe CD3, Lck va phosphoryler les ITAMS présents sur celui-ci. La phosphorylation des chaînes δ est particulièrement importante, car cela va créer des sites d’arrimage pour les domaines SH2 de la protéine de 70kDa associée à zêta (ZAP-70). Le recrutement de ZAP-70 va permettre à Lck de phosphoryler et d’activer cette dernière. Fyn peut jouer le même rôle, c’est-à-dire recruter et activer ZAP-70. Cependant, on ne lui connaît pas de molécule associée, mais l’on croit qu’elle se retrouverait au niveau des radeaux lipidiques242. Suite à son activation, ZAP-70 va phosphoryler et ainsi activer la molécule de liaison des lymphocytes T activés (LAT) et la protéine de 76 kDa des leucocytes contenant un domaine SH2 (SLP-76), deux molécules adaptatrices qui vont recruter et activer les acteurs subséquents nécessaires à la signalisation du TCR243,244. LAT et SLP-76 vont recruter plusieurs protéines qui créeront un amalgame complexe. On peut toutefois dégager une protéine particulièrement importante pour la signalisation du TCR, soit la PLCγ. Cette protéine fait partie de la famille des phospholipases C, des enzymes qui transforment le phosphatidylinositol 4,5biphosphate (PIP2) de la membrane plasmique245. Elle est recrutée au niveau du TCR par LAT mais c’est SLP-76 qui l’active. Une fois activée, la PLCγ hydrolyse le PIP2 en inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et en diacylglycérol (DAG)236. L’IP3 et le DAG sont des seconds messagers qui activent chacun une voie de signalisation différente (Schéma 4). 1.6.2 IP3 et la voie du calcium L’IP3 induit le relargage du calcium (Ca2+) contenu dans le réticulum endoplasmique. L’augmentation de la concentration intracellulaire du Ca2+ va permettre l’ouverture des canaux dépendants du relargage du calcium (CRAC) situé au niveau de la membrane 32 plasmique. L’ouverture de CRAC augmentera de façon importante la concentration de Ca2+ intracellulaire qui se liera à la calmoduline, ce qui dissociera la calmoduline de la calcineurine246. La calcineurine est une phosphatase qui est inactive lorsque la calmoduline y est liée. La dissociation de la calmoduline et de la calcineurine permet donc d’activer cette dernière qui pourra alors déphosphoryler NF-AT. Cette déphosphorylation permet d’activer NF-AT qui pourra alors transloquer dans le noyau et induire l’expression de différents gènes (Schéma 4). 33 Schéma 4 : Signalisation induite lors de l’activation du TCR La rencontre d’un antigène présenté par un CMH recrute Lck qui active ZAP-70 au niveau du CD3(bleu). ZAP-70 active les molécules adaptatrices LAT et SLP-76(turquoise). Il en résulte un complexe qui activera la MAP kinase ERK via Ras(vert). Le complexe active également la PLCγ qui dégradera le PIP2 en DAG et IP3. Le DAG activera Ras via RasGRP(vert) et NF-κB via PKCζ(rose). L’IP3 activera NF-AT via la voie du calcium (jaune) Tiré de : How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens247 34 1.6.3 DAG et la voie de PKC Le deuxième second messager produit par la PLCγ, le DAG, active la PKC. Dans les lymphocytes T, l’isoforme principal de PKC est l’isoforme theta (PKCΘ) qui à son tour active une MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) qui activera la kinase d’IκB (IKK). Cette dernière va phosphoryler l’inhibiteur de κB (IκB) ce qui va induire son ubiquitination et ultimement sa dégradation. La dégradation d’IκB permet la libération du facteur de transcription augmentant la chaîne légère kappa des lymphocytes B (NF-κB). NF-κB pourra alors, tout comme NF-AT transloquer au niveau du noyau et activer l’expression de différents gènes248. Malgré son nom, qui reflète sa découverte, NF-κB est très important pour l’activation des lymphocytes T. Le DAG peut également activer la voie des MAP kinases en activant RasGRP, un facteur d’échange de guanine. RasGRP va activer Ras, une petite protéine G, qui induira une cascade de signalisation menant éventuellement à l’activation de la MAP kinase ERK236. 1.6.4 Activation des MAP kinases En plus de l’activation de NF-AT et de NF-κB par la PLCγ, la signalisation par le TCR active également la voie des MAP kinases. Ces protéines sont des sérines-thréonines kinases qui peuvent activer différents facteurs de transcription, tels que AP-1, Elk-1 et ATF-2 qui sont tous importants pour la production de cytokines par les lymphocytes T 249. Les MAP kinases se divisent en trois catégories soit les kinases régulées par des signaux extracellulaires (ERK), les kinases de c-Jun en N-terminal (JNK) et les protéines kinases de 38 kDa (p38). Les ERKs sont composées de plusieurs membres, de ERK1 à ERK6. Chez les lymphocytes, les membres ERK1 et ERK2 sont les plus étudiés. Les JNKs sont composées de trois membres, de JNK1 à JNK3. Cependant, les lymphocytes T n’expriment que JNK1 et JNK2249. De leur côté, les p38 existent sous quatre isoformes, α, β, γ et δ mais l’isoforme γ est absent chez les lymphocytes T250. Les trois groupes de MAP kinases sont activés de façon similaire. La cascade d’activation correspond à une séquence de trois kinases activées séquentiellement. Premièrement, des MAP kinases kinases kinases (MEKK, MKKK ou MAP3K) activent des MAP kinases kinases (MEK, MKK ou MAP2K). Les MEKs vont ensuite activer les MAP kinases. Comme leur nom l’indique, cette chaîne d’activation se 35 fait par phosphorylation. Il existe de nombreuses MEKs et MEKKs. Plusieurs MEKKs peuvent activer les mêmes MEKs mais en général une MAP kinase n’est activée que par une ou deux MEKs251. Ainsi, il est possible de relier différents stimuli à l’activation spécifique de MAP kinases252. Comme il a été mentionné, l’initiation de la signalisation par le TCR commence avec l’activation de ZAP-70. Cependant, contrairement à la voie de la PLCγ, les MAP kinases sont activées par LAT et SLP-76 séparément. LAT recrute Grb2, une molécule adaptatrice, qui recrutera SOS (Son Of Sevenless)253. Sos est un facteur d’échange de guanine qui va activer Ras en remplaçant le GDP de ce dernier par un GTP. Ras va ensuite activer Raf qui activera des MEKs, soit MEK1 et MEK2. MEK1/2 sont responsable de l’activation de ERK1 et ERK2 (Schéma 5). ERK1/2 vont ensuite activer le facteur de transcription Elk-1 qui induira l’expression de Fos. Fos est une composante du facteur de transcription AP-1. 36 Schéma 5 : Activation de ERK par le TCR Inspiré de : The function of E- and id proteins in lymphocyte development254 37 De son côté, SLP-76 recrute Vav, un autre facteur d’échange de guanine. Vav va activer Rac, une GTPase de la famille de Rho. Rac active plusieurs MEKs, soit MEK 3, MEK4, MEK6 et MEK7. MEK3/4/6 vont activer les différents isoformes de p38 qui activeront à leur tour le facteur de transcription ATF-2 (Schéma 6). ATF-2 permet entre autres l’expression de Jun. De leur côté, MEK4/7 active JNK1/2 qui activeront Jun255–257 (Schéma 7). La dimérisation de Jun avec Fos forme un facteur de transcription de la famille AP-1. Bien que le TCR active les voies de JNK et de p38, il requiert la signalisation induite par le CD28. De plus, cette activation est relativement faible comparativement à l’activation de ces voies par des récepteurs tyrosines kinases tels que les récepteurs du TNF et de l’IL-1251. Dans ce contexte, d’autres GTPases de la famille de Rho comme CDC42 sont également impliquées. 1.6.5 Activation de STAT3 Tel qu’il a été mentionné plus haut, STAT3 est un facteur de transcription très important pour la différenciation et les fonctions des Th17. L’activation classique de STAT3 fait suite à l’activation des Janus kinase (JAK) JAK1, JAK2 et TYK2 par des récepteurs de cytokines ou de facteurs de croissance258. Cependant, bien que les récepteurs de cytokines soient les principaux activateurs de STAT3, le TCR peut également activer ce facteur de transcription via la voie des Src kinases259–261. De plus, il a été montré, à l’aide de souris knock-out et de dominant négatif, que NF-κB et AP-1 activés par PKCΘ induisent l’expression de STAT3 et peuvent ainsi favoriser la différenciation et l’activation des Th17262. 38 Schéma 6 : Activation de p38 et JNK par le TCR Inspiré de : T cell receptor signaling236 et : The p38 mitogen-ativated protein kinase signaling cascade in CD4 T cells263 39 1.7 Récepteurs de costimulation et de régulation Comme il a été mentionné plus haut, la reconnaissance de l’antigène par le TCR n’est pas suffisante pour activer les lymphocytes T naïfs. Pour cela, le signal de costimulation provenant des CPAs est nécessaire. Ce signal arrive approximativement en même temps que la stimulation par le TCR puisque les mêmes cellules sont impliquées. De nombreuses molécules peuvent jouer le rôle de récepteur de costimulation. Parmi celles-ci, on retrouve en tête de liste le CD28, molécule de costimulation par excellence. Plusieurs récepteurs de la famille du TNF peuvent également jouer un rôle de costimulation. Finalement, il a été montré que les intégrines peuvent également agir comme molécules de costimulation. La costimulation est particulièrement importante pour l’activation des lymphocytes T naïfs, bien que les lymphocytes T effecteurs profitent aussi de la costimulation dans leur activation. Il existe cependant des molécules qui inhibent l’activation des lymphocytes T. Parmi celles-ci, on retrouve CTLA-4, une molécule de la famille du CD28 et dont le rôle est de contrôler l’activation des lymphocytes T. De façon générale, la costimulation favorise la prolifération et la survie des lymphocytes T. Elle augmente également les fonctions effectrices, c’est-à-dire la production de cytokines dans le cas des lymphocytes T auxiliaires. Il est particulièrement intéressant de comprendre les mécanismes de costimulation dans le cadre de maladies inflammatoires auto-immunes puisque la costimulation peut contribuer à l’exacerbation de la réponse immunitaire et ainsi contribuer au développement de l’inflammation et des dommages tissulaires associés. 1.7.1 Les récepteurs de la famille du CD28 Le CD28 est le récepteur prototypique d’une famille de récepteur du même nom. Dans la famille du CD28, on retrouve également l’antigène 4 des lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4), le costimulateur inductible des lymphocytes T (ICOS) et la protéine de mort programmée 1 (PD-1)264,265. À l’exception du CD28 qui est exprimé de façon constitutive, les membres de la famille CD28 sont inductibles. Les quatre récepteurs font partie de la superfamille des immunoglobulines et possèdent un domaine cytoplasmique pouvant être phosphorylé et transmettre une signalisation intracellulaire. On retrouve CD28, ICOS et CTLA-4 sous forme d’homodimères alors que PD-1 existe sous forme monomérique. 40 Les quatre membres de la famille CD28 sont des molécules costimulatrices dans le sens où ils modifient l’activation des lymphocytes T. Cependant, seuls CD28 et ICOS augmentent leur activation. CTLA-4 et PD-1 sont en fait des inhibiteurs de l’activation des lymphocytes T et ont un rôle important à jouer dans la régulation de la réponse immunitaire. Tous les membres de la famille CD28 ont pour ligand des protéines de la famille B7. Le CD28 possède deux ligands, B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86) exprimés chez les cellules présentatrices d’antigènes266. La liaison de CD28 avec un de ses ligands induit la prolifération et la survie des lymphocytes T en augmentant l’expression d’IL-2 et de Bcl-xL respectivement267. De plus, la liaison de CD28 permet de diminuer le seuil d'activation des lymphocytes T, c'est-à-dire qu'une moins grande quantité d'antigène est requise pour les activer. Finalement, le CD28 participe à la formation de radeaux lipidiques qui sont impliqués dans le regroupement des TCR, ce qui favorise l'activation des lymphocytes T8,264. CTLA-4 a les mêmes ligands que CD28. Cependant, au lieu d’augmenter l’activation des lymphocytes T, CTLA-4 inhibe les signaux induits par le TCR à l’aide des phosphatases SHP-2 et PP2A qui vont déphosphoryler le CD3 et d’autres molécules importantes pour la signalisation du TCR tel que LAT265,268. Puisque l’expression de CTLA-4 est induite suite à l’activation des lymphocytes T, cette molécule de costimulation représente un mécanisme de régulation et de contrôle de l’activité des lymphocytes T et contribue au maintien de l’homéostasie immunitaire. Le ligand principal d’ICOS est B7H2. ICOS joue un rôle semblable au CD28. Cependant, bien qu’il puisse costimuler les lymphocytes T naïfs, il semblerait qu’il soit particulièrement important pour la régulation des fonctions des lymphocytes T effecteurs269. PD-1 possède deux ligands, PD-L1 et PDL2 qui font tous deux parties de la famille B7270. Semblablement à CTLA-4, PD-1 inhibe la production de cytokines ainsi que la prolifération des lymphocytes T271,272. En plus de leur rôle dans l’activation des lymphocytes T, les molécules de costimulation vont influencer la différenciation de ces cellules. Le CD28 favorise la différenciation des Th1 et Th2273 en fonction de la force du signal TCR associé. En présence d’un faible signal, le CD28 favorisera les Th2 alors qu’en présence d’un fort signal, il favorisera les Th1274. De plus, le CD28 est requis pour la différenciation des Th17275. Toutefois, cette costimulation doit être contrôlée, car une stimulation prolongée peut inhiber les Th17276. Le rôle de CD28 chez les Tregs est également ambivalent. Cette molécule est importante pour 41 la différenciation des Tregs dans le thymus alors qu’une trop grande activation de CD28 inhibe les iTregs277. De son côté, CTLA-4 inhibe la différenciation en Th1, Th2 et Th17, mais est nécessaire aux fonctions des Tregs278 alors qu’ICOS favorise la différenciation des Th1, Th2 et Th17,275,279,280 mais semble être particulièrement importante pour l’activation des Th2281–283. Finalement, PD-1 inhibe la réponse des Th1, Th2 et Th17,284–286 mais favorise la différenciation et les fonctions des Tregs287 De façon très générale, on peut en conclure que les molécules de costimulation activatrices, CD28 et ICOS, favorisent les lymphocytes Th1, Th2 et Th17 alors que les molécules de régulation inhibitrices, CTLA-4 et PD-1, favorisent les lymphocytes Tregs. 1.7.1.1 Signalisation du CD28 La liaison de B7-1 ou 2 avec le CD28 va induire la phosphorylation du motif tyrosine de la queue cytoplasmique de CD28. Cependant, le domaine intracellulaire de CD28 ne possède pas d’activité enzymatique intrinsèque. Sa phosphorylation va plutôt créer un site d’ancrage pour des molécules de signalisation comme Grb-2, Vav et PI3-Kinase (PI3-K). Les fonctions de Grb-2 issu de l’activation de CD28 sont les mêmes que celles de Grb-2 issu du TCR, c’est-à-dire qu’il s’agit d’une molécule adaptatrice qui mènera à l’activation des MAP kinases ERK. CD28 peut également activer de façon indépendante Vav et ainsi mener à l’activation des MAP kinases JNK et p38. Le CD28 peut donc augmenter la signalisation provenant de LAT et SLP-76 issu du TCR et contribue à l’activation de toutes les MAP kinases288. La phosphorylation de CD28 permet également le recrutement de PI3K. Cette kinase produit du phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphate (PIP3) en phosphorylant les phosphatidylinositols, des phospholipides de la membrane plasmique289. Le PIP3 activera ensuite la protéine kinase B (PKB) également connue sous le nom d’AKT. AKT est une sérine-thréonine kinase qui peut activer IKK qui est nécessaire pour l’activation du facteur de transcription NF-κB. Il est à noter que cette activation est plus efficace que celle induite par la PKCΘ et le TCR. Ainsi, on peut constater que le CD28 renforce l’activation des voies de signalisation par le TCR et contribue ainsi à atteindre le seuil nécessaire à l’activation des lymphocytes T. Toutefois, la contribution spécifique du CD28 à l’activation des lymphocytes T se fait via l’activation d’AKT et de NF-κB. 42 1.7.2 Les récepteurs de la famille du TNF Plusieurs récepteurs de la famille du facteur de nécrose des tumeurs (TNF) peuvent modifier l’activation, la différenciation ainsi que la survie des lymphocytes T en activant les MAP kinases ainsi que NF-κB. Cette famille de récepteurs comprend de nombreux membres, mais trois parmi ceux-ci sont plus intéressants du point de vue de la costimulation. Ce sont les récepteurs 4-1BB, OX40 et CD2710,290. Les récepteurs de la famille du TNF (TNFR) se divisent en trois groupes : les récepteurs contentant un domaine de mort, les récepteurs leurres et les récepteurs liant des facteurs associés aux TNFR (TRAF)10. Les récepteurs contenant un domaine de mort tel que TNFR1 et Fas sont impliqués dans l’apoptose et non pas dans la costimulation. Leur mécanisme d’action passe par le recrutement de molécules telles que TRADD et FADD qui mèneront éventuellement à l’activation des caspases. Les récepteurs leurres sont des récepteurs solubles comme on en retrouve pour de nombreuses cytokines. Leur rôle est de lier le ligand naturel et ainsi empêcher l’activation du récepteur membranaire. Finalement, le groupe qui nous intéresse, les récepteurs liant TRAF sont ceux qui peuvent costimuler les lymphocytes T. Tel que mentionné plus haut, je me limiterai à 4-1BB, OX40 et CD2710,291,292. Ces trois récepteurs sont des hétérotrimères et possèdent certaines caractéristiques similaires. Premièrement, leur partie extracellulaire contient plusieurs domaines riches en cystéine. Deuxièmement, leur domaine intracellulaire possède un motif de 4 à 6 acides aminés servant à la liaison de TRAF. TRAF est en fait une famille de molécules dont six membres, de 1 à 6, ont été identifiés jusqu’à présent. Troisièmement, les trois récepteurs peuvent lier TRAF2, bien que l’affinité de ce dernier varie selon les récepteurs. Chacun des récepteurs peut lier un ou plusieurs autres TRAFs. L’affinité variable pour TRAF2 ainsi que la capacité de lier différents autres TRAFs permettent d’expliquer les différents effets de ces récepteurs10,290. 4-1BB (CD137) est exprimé chez les lymphocytes T activés. Son expression est plus importante chez les lymphocytes T CD8 que chez les CD4 et ne semble pas être associée avec un phénotype de CD4 en particulier290. Son ligand, 4-1BBL, est exprimé par les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques. La partie cytoplasmique de 41BB peut lier TRAF1, 2 et 3 qui activera un signal de costimulation pour l’expression de 43 l’IL-2 induite par le TCR. À ce niveau, 4-1BB semble être aussi efficace que le CD2810,290. 4-1BB favorise également la survie des lymphocytes T en augmentant l’expression de BclxL291. Bien qu’il ne soit associé à aucun phénotype en particulier, 4-1BB peut augmenter l’expression des cytokines chez les lymphocytes T CD4, particulièrement les lymphocytes Th110,290. OX40 (CD134) est exprimé chez les lymphocytes T activés mais contrairement à 4-1BB, son expression est plus importante chez les CD4 que les CD8. Son ligand, OX40L, est exprimé principalement chez les cellules dendritiques10,290. La région cytoplasmique d’OX40 peut lier TRAF2, 3 et 510,290. Comme pour 4-1BB, la liaison d’OX40 avec son ligand augmente l’expression d’IL-2, mais à un niveau moindre que ce qui est obtenu avec CD28. OX40 favorise également la survie des lymphocytes T en soutenant l’expression de Bcl-2 et Bcl-xL10,290. De plus, il semble pouvoir favoriser le développement des lymphocytes Th1 et Th2 avec un effet plus marqué chez les Th2293,294. OX40 inhibe également la différenciation et les fonctions des Tregs295,296. Toutefois, une étude récente a démontré qu’OX40 était nécessaire pour le recrutement et le fonctionnement des Tregs que l’on retrouve au niveau de l’intestin297. Finalement, CD27 est lui aussi exprimé chez les lymphocytes T activés10,290. Cependant, son expression diminue rapidement après quelques cycles de division cellulaire. Le ligand de CD27 est CD70 qui est exprimé chez les lymphocytes T, les lymphocytes B et les cellules dendritiques. Le domaine intracellulaire de CD27 peut lier TRAF2, 3 et 510,290. Contrairement aux deux récepteurs précédents, la liaison de CD27 avec son ligand n’augmente pas l’expression d’IL-2, mais augmente l’expression de TNF induite par le TCR10,290. 1.8 Intégrines Les intégrines sont des molécules d’adhésion qui permettent les interactions entre les cellules ainsi que l’adhésion des cellules aux protéines de la matrice extracellulaire. Certaines intégrines, comme les intégrines de la famille β2 (LFA-1, etc.)298,299 et les intégrines de la famille β1 (VLA-1, VLA-2, etc.)300 sont particulièrement importantes chez 44 les lymphocytes T. Ces intégrines contribuent à l’activation des lymphocytes T et leur permettent de migrer jusqu’aux différents sites inflammatoires. De plus, grâce aux récentes études, il s’est révélé que les intégrines peuvent également agir comme molécules de costimulation et sont impliquées dans différentes fonctions des lymphocytes T 11,301,302 . Plusieurs intégrines sont connues sous l’acronyme VLA (Very Late Antigen), tel que VLA1 pour α1β1. Ce nom est dû à l’expression tardive, lors de l’activation cellulaire, des premières intégrines découvertes. Cette dénomination est toutefois de moins en moins utilisée. On préfère maintenant la dénomination αxβx. Lorsque l’on se réfère seulement à l’une des deux sous-unités, il est fréquent d’utiliser les « clusters of differentiation » tel que CD49a et CD49b pour α1 et α2 respectivement (Tableau 2). 1.8.1 Structure et expression des intégrines Les intégrines sont des hétérodimères membranaires composées d’une sous-unité alpha (α) et d’une sous-unité beta (β). Jusqu'à présent, 18 sous-unités α et 8 sous-unités β ont été identifiées302 (Schéma 8). Les intégrines sont classées selon la sous-unité β. La spécificité du ligand de l’intégrine est déterminée par la combinaison αβ. Cependant, une intégrine peut avoir plusieurs ligands et un même ligand peut être lié par plus d’une intégrine. Par exemple, l’intégrine α2β1 peut lier plusieurs types de collagène ainsi que la laminine alors que l’intégrine αLβ2 (LFA-1) peut lier les molécules d’adhésion de la famille ICAM (ICAM-1 à 5). De son côté, la laminine, une molécule de la matrice extracellulaire, est un ligand pour les intégrines α1β1, α2β1, α6β1, α7β1, α6β4 et αvβ3303 (Tableau 3). L’expression des intégrines est ubiquitaire. Les intégrines de la famille β2 se retrouvent uniquement chez les leucocytes et participent aux interactions cellules-cellules alors que les intégrines de la famille β1 et β3 sont plus largement exprimées et participent aux interactions avec la matrice extracellulaire. L’interaction entre l’intégrine et son ligand est contrôlée par deux facteurs soit l’affinité et l’avidité de l’intégrine. 45 Tableau 2 : Sous unités des intégrines selon la classification CD Sous unité Équivalent Sous unité Équivalent α1 α2 α3 α4 α5 α6 α7 α8 α9 α10 α11 αL αM αX αD αE αV αIIb CD49a CD49b CD49c CD49d CD49e CD49f ----------CD11a CD11b CD11c Cd11d CD103 CD51 --- β1 β2 β3 β4 β5 β6 β7 β8 CD29 CD18 CD61 CD104 --------- Inspiré de : Site web du Human Cell Differentiation Molecules. http://www.hcdm.org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx 46 Schéma 7 : Combinaison des différentes sous-unités α et β des intégrines Tiré de : Intracellular signalling controlling integrin activation in lymphocytes304 47 Tableau 3 : Les intégrines et leurs ligands Ligands adenovirus penton base proteinsialoprotein Bone Borrelia burgdorferi Candida albicans Collagens Denatured collagen Cytotactin/tenascin-C Decorsin Disintegrins E cadherin Echovirus 1 Epiligrin Factor X Fibronectin Fibrinogen HIV Tat protein iC3b ICAM-1 ICAM-2,3,4,5 Invasin Laminin MAdCAM-1 Matrix metalloproteinase-2 Neutrophil inhibitory factor Osteopontin Plasminogen Prothrombin Sperm fertilin Thrombospondin VCAM-1 Vitronectin von Willebrand factor Intégrines αvβ3 αvβ5 αvβ3 αvβ5 αIIbβ3 αMβ2 α1β1 α2β1 α11β1 αIbβ3 α5β1 αvβ3 αIIbβ3 α8β1 α9β1 αvβ3 αvβ6 αIIbβ3 αvβ3 αIIbβ3 αEβ7 α2β1 α3β1 αMβ2 α2β1 α3β1 α4β1 α4β7 α5β1 α8β1 αvβ1 αvβ3 αvβ5 αvβ6 αvβ8 αIIbβ3 α5β1 αMβ2 αvβ3 αxβ2 αIIbβ3 αvβ3 αvβ5 αMβ2 αxβ2 αLβ2 αMβ2 αLβ2 α3β1 α4β1 α5β1 α6β1 α1β1 α2β1 α6β1 α7β1 α6β4 αvβ3 α4β7 αvβ3 αMβ2 αvβ3 αIIbβ3 αvβ3 αIIbβ3 α6β1 α3β1 αvβ3 αIIbβ3 α4β1 α4β7 αvβ1 αvβ3 αvβ5 αIIbβ3 αvβ3 αIIbβ3 Tiré de : Ligand binding to integrins303 48 1.8.2 Activation des intégrines Les intégrines sont incapables de lier leur ligand si elles ne sont pas dans un état actif. Elles peuvent exister sous trois états soit inactif, partiellement actif et pleinement actif, qu’on appelle habituellement simplement actif305. Chez les cellules dites adhérentes comme les cellules épithéliales ou les fibroblastes, les intégrines sont souvent dans un état actif. Par contre, chez les leucocytes, que l’on retrouve dans la circulation et qui ne sont pas considérés comme des cellules adhérentes, les intégrines se trouvent dans un état inactif. Cependant, lors de la réponse immunitaire, l’activation des lymphocytes va engendrer l’activation de ces intégrines, ce qui leur permettra de lier leurs ligands et permettra également les interactions cellulaires nécessaires au déroulement de la réponse immune. L’induction de cet état d’activation est la conséquence de signaux intracellulaires qui vont modifier la conformation des intégrines pour les rendre capables de lier leurs ligands. C’est ce que l’on appelle la signalisation « inside-out »306. Ce phénomène a été le plus souvent étudié avec les intégrines de la famille β2 chez les leucocytes. L’activation des leucocytes par les chimiokines ou celle des lymphocytes T par le TCR permet d’augmenter l’affinité des intégrines β2 en induisant une augmentation de l’affinité et de l’avidité des intégrines. L’avidité se définit par la capacité des intégrines à se regrouper et s’agréger dans une même région membranaire307. L’activation par le TCR ou par les chimiokines active la PLCγ1 qui va engendrer l’activation de la protéine G RAP1 et de son effecteur RAPL308. Le complexe RAP1/RAPL va se lier à la partie cytoplasmique de la chaine β2 et induire un changement de conformation de l’intégrine309,310. Par ailleurs, la taline, une protéine du cytosquelette, interagie avec RAPL, ce qui permet le déplacement et l’agrégation des intégrines β2 au niveau de la membrane plasmique311 (Schéma 8). La taline peut également réguler l’activité des intégrines en se liant à la partie cytoplasmique de la chaine α et permet de faire le lien entre l’intégrine et le cytosquelette en recrutant plusieurs protéines du cytosquelette, telles que la vinculine, l’actine et la paxilline311. Le site d’agrégation des intégrines, permis par l’avidité, est appelé le site d’adhésion focal. D’autres molécules sont également nécessaires à la formation du site d’adhésion focal dont le complexe Src/FAK306,312. 49 Schéma 8 : Liaison des intégrines avec le cytosquelette Les intégrines inactivent sont repliées sur elles-mêmes, ce qui bloque l'accès au site de liaison (Inactive closed integrin). Suite aux stimuli activateurs provenant du TCR ou d’autres récepteurs, RAPL et la taline se lieront à la partie intracellulaire de l’intégrine, ce induira un changement de conformation de la partie extracellulaire. Ce changement de conformation rend accessible le site de liaison et l’intégrine est alors activé (Activated open integrin). Inspiré de : The Ins and Outs of Leukocyte Integrin Signaling313 50 1.8.3 Signalisation des intégrines À l'origine, on croyait que seule la sous-unité β était importante pour la signalisation. On sait maintenant que la sous-unité α peut induire un signal intracellulaire qui lui est propre ou modifier le signal induit par la sous-unité β314. Bien que la principale fonction des intégrines soit l’adhésion cellulaire, elles peuvent avoir différentes fonctions supplémentaires selon le type cellulaire comme il a été mentionné plus haut. Pour induire ces différentes fonctions, les intégrines activent plusieurs voies de signalisation intracellulaires. La signalisation des intégrines nécessite tout d’abord leur agrégation. Ces agrégats (ou cluster) vont permettre le recrutement de différentes molécules de signalisation au niveau de la partie intracellulaire des intégrines. Ces molécules adaptatrices sont absolument nécessaires, car la partie cytoplasmique des intégrines ne possède pas d’activité enzymatique. Le complexe formé lors de l’agrégation des intégrines est appelé plaque d’adhésion focale. Parmi les kinases impliquées dans la signalisation des intégrines, on retrouve la kinase d’adhésion focale (FAK), la kinase liée aux intégrines (ILK), la tyrosine kinase riche en proline 2 (PYK2) ainsi que les kinases de la famille Src comme c-Src et Fyn. Le recrutement de FAK au site d’adhésion focale permet son autophosphorylation. S’ensuit alors l’induction de signaux. FAK peut recruter et activer plusieurs molécules de signalisation impliquées dans la réorganisation des filaments d’actine comme la paxilline et la tensine315–317 (Schéma 9). FAK peut également activer les kinases Src. La formation de ce complexe permet l’activation de nombreuses voies de signalisation. Premièrement, le complexe FAK/Src permet le recrutement de Grb2 et de Sos, ce qui mène à l’activation de Ras et de MAP kinase ERK. FAK peut également activer Grb2 et Sos par l’intermédiaire d’autres kinases de la famille de Src telle que Fyn. Deuxièmement, il peut activer la PLCγ, ce qui mènera à l’activation de la PKC et de la voie de la MAP kinase ERK. Troisièmement, il peut recruter Cas et Crk, des molécules adaptatrices, qui vont activer Rac-1 et la voie de MAP kinase JNK. De plus, FAK peut activer directement la voie de PI3-K et mener à l’activation de AKT. De son côté, ILK peut activer directement AKT sans passer pas PI3-K318 (Schéma 9). L’activation de ces voies permet la migration, la prolifération et la différenciation. Il est cependant à noter que toutes ces voies ne sont pas activées par toutes les intégrines et que la spécificité de la fonction d’une intégrine dépend de la signalisation activée. 51 Schéma 9 : Signalisation des intégrines Inspiré de : Vascular integrins in tumor angiogenesis: mediators and therapeutic targets319 52 1.8.4 Fonctions des intégrines Les premières fonctions que l’on a attribuées aux intégrines sont l’adhésion et la migration. Cependant, depuis plusieurs années déjà, de nombreuses études ont montré que les intégrines sont plus que des molécules d’adhésion. L’interaction entre les intégrines et leurs ligands peuvent modifier plusieurs aspects, tant morphologiques que fonctionnels, des cellules qui les expriment315,320,321. Parmi ces aspects fonctionnels, on retrouve la migration, mais également la régulation de la prolifération et de l’apoptose298,302,322. 1.8.4.1 Migration La migration cellulaire nécessite la réorganisation du cytosquelette de la cellule et se divise en quatre étapes soit l’extension des lamellipodes, la formation de plaques d’adhésion, la contraction du corps cellulaire et le détachement de la queue323. Les intégrines participent à la migration lors de la formation des plaques d’adhésion324. De plus, elles peuvent favoriser la réorganisation du cytosquelette en activant des GTPases de la famille Rho qui sont impliquées dans l'organisation des filaments d’actine et de myosine325. Parmi ces GTPases, on compte Rac, Cdc42 et Rho. Rac et Cdc42 ont un rôle dans la formation de structures cellulaires comme les lamellipodes et les filopodes. Pour sa part, Rho a été impliquée dans la formation des fibres de stress qui sont des regroupements de fibres d'actine et sont impliquées dans le système contractile basé sur l'actine et la myosine326. 1.8.4.2 Prolifération et survie Les intégrines sont également importantes pour la prolifération cellulaire. Il a été démontré que chez plusieurs types de cellules adhérentes dites dépendantes de l’ancrage telles que les cellules épithéliales, les intégrines et les récepteurs de facteurs de croissance interagissent ensemble327. D’ailleurs, de nombreux récepteurs de facteurs de croissance ont besoin de la signalisation induite par les intégrines afin d’induire leurs effets. Lorsque l’on empêche les cellules d’adhérer, aucune prolifération n’est observée, même en présence de facteurs de croissance316. Entre autres, une étude a montré que la liaison de la vitronectine par l’intégrine αvβ3 est requise pour l’activation complète du récepteur 2 du VEGF chez les cellules endothéliales328. Parallèlement à la prolifération, les intégrines sont également importantes pour la survie cellulaire. Chez certaines cellules, l’adhésion à la matrice extracellulaire ne permet pas seulement leur prolifération, mais est nécessaire à leur survie. 53 Par exemple, les cellules épithéliales et les cellules endothéliales entrent en apoptose lorsqu’elles perdent l’adhérence à la matrice extracellulaire. Cette apoptose, que l’on nomme anoïkose, est dépendante de la voie de Fas329,330. De façon plus spécifique, le rôle des intégrines dans la survie et la prolifération des cellules adhérentes passe par l’augmentation de la phosphorylation des MAP kinases ERK et JNK qui activeront le facteur de transcription AP-1. Celui-ci régule entre autres les cyclines qui permettent la progression du cycle cellulaire327. Également, les intégrines bloquent l’expression des protéines p21 et p27 qui sont des inhibiteurs de la croissance cellulaire331. Inversement, chez les cellules endothéliales, la perte du signal provenant des intégrines sensibilise à l’anoïkose en activant la voie de Fas/Fas Ligand et en diminuant l’expression de c-Flip, un inhibiteur de l’activation de caspase-8 par la voie de Fas330. 1.9 Intégrines et lymphocytes T Les lymphocytes T expriment de nombreuses intégrines dont LFA-1 (αLβ2) ainsi que plusieurs intégrines de la famille β1298. Les intégrines qui m’intéressent particulièrement sont les intégrines de la famille β1 qui lient le collagène. Cependant, chez les lymphocytes T, l’expression des intégrines est très variable selon le phénotype et l’état d’activation de la cellule332–334. 1.9.1 Expression des intégrines chez les lymphocytes T Au cours de leur vie, les lymphocytes T interagissent avec plusieurs types cellulaires ainsi qu’avec la matrice extracellulaire (MEC). Les deux intégrines les plus exprimées chez les lymphocytes T naïfs sont les intégrines LFA-1 qui lie ICAM-1 et α4β1 qui lie VCAM-1 et la fibronectine. L’interaction entre LFA-1 et ICAM-1 est importante pour la reconnaissance antigénique en favorisant la formation de la synapse immunologique335,336. LFA-1 et α4β1 jouent également un rôle important dans la migration transendothéliale337. De plus, les lymphocytes T expriment plusieurs autres intégrines de la famille β1 qui permettent l’adhésion aux protéines de la MEC. Cependant, à l’exception d’α5β1, les lymphocytes T naïfs, qui sont activés dans les ganglions lymphatiques, expriment peu ces intégrines302,338. Au niveau des ganglions lymphatiques, la MEC n’est pas accessible puisqu’elle est recouverte de cellules, particulièrement les fibroblastes réticulaires338. Le faible niveau 54 d’expression des intégrines β1 et l’absence de contact avec la MEC pourraient favoriser les interactions cellules-cellules et donc la reconnaissance antigénique et l’activation primaire des lymphocytes T. Suite à l’activation, des lymphocytes T, les intégrines liant la MEC commencent à être exprimées321,339–341, ce qui coïncide avec la migration de ces lymphocytes T effecteurs vers les sites inflammatoires où différentes composantes de la MEC sont présentes et accessibles. Les intégrines qui nous intéressent, soit celles liant le collagène, ne sont exprimées que tardivement suite à l’activation lymphocytaire341. 1.9.2 Fonctions des intégrines chez les lymphocytes T Les intégrines ont été également impliquées dans la régulation des fonctions des lymphocytes T effecteurs. Cependant, contrairement aux cellules adhérentes, la prolifération des lymphocytes T n’est pas dépendante de l’ancrage et ils ne sont pas non plus sensibles à l’anoïkose. Les fonctions des intégrines chez ces cellules concernent la migration, la survie ainsi que la costimulation. 1.9.2.1 Fonctions des intégrines β2 L’une des intégrines les plus étudiées chez les lymphocytes T est LFA-1. Il est connu depuis longtemps que LFA-1 est important pour la migration transendothéliale lorsque le lymphocyte T passe de la circulation vers le site inflammatoire. Comme il a été mentionné plus haut, LFA-1 est également impliqué dans la formation de la synapse immunologique298. Cependant, le rôle de LFA-1 chez les lymphocytes T ne s’arrête pas là. La liaison de LFA-1 avec ICAM-1 peut induire un signal de costimulation pour les lymphocytes T. Toutefois, contrairement au CD28, elle agirait en augmentant directement la signalisation induite par le TCR plutôt que d’activer des voies parallèles qui diminuent le seuil d’activation290. Il a été démontré que l’activation de LFA-1 par ICAM-1 augmente la production d’IL-2 ce qui permet d’accroître la prolifération des lymphocytes T290,342. De son côté, ICAM-1 est également exprimé chez les lymphocytes T et il a été montré qu’il peut aussi augmenter la production d’IL-2342. Cependant, puisque son effet se manifeste plus tardivement, il a été proposé que le rôle d’ICAM-1 soit de prolonger l’apport d’un signal de costimulation lorsque le signal du CD28 s’est estompé. Ainsi donc, LFA-1 et ICAM-1 peuvent contribuer au développement de la réponse des lymphocytes T en favorisant leur activation et leur prolifération, en augmentant leur production de cytokines 55 et en permettant leur migration au site inflammatoire. 1.9.2.2 Fonctions des intégrines β1 Comme il a été mentionné plus haut, les lymphocytes T effecteurs expriment plusieurs intégrines de la famille β1. Ces intégrines sont impliquées dans la migration transendothéliale (α4β1) ou permettent l’adhésion et la migration dans la matrice extracellulaire et permettent également la rétention des lymphocytes T aux sites inflammatoires341. De plus, les intégrines β1 protègent les lymphocytes T intestinaux de l’apoptose343. Les intégrines liant la fibronectine, α4β1 et α5β1, sont les premières intégrines dont la capacité de costimulation a été démontrée. Ces deux intégrines peuvent augmenter la prolifération ainsi que la production d’IL-2 suite à une stimulation par le TCR344,345. Par ailleurs, l’intégrine α3β1 liant la laminine augmente la production d’IL-2, mais également l’apoptose dépendant de l’activation (AICD)346. Il a également été démontré que l’effet protecteur du TGF-β contre l’apoptose des lymphocytes T CD8+ induite par la voie de Fas/FasL dépend de l’intégrine α5β1347. Une étude a toutefois suggéré que ces deux intégrines ne soient pas de réelles molécules de costimulation et que l’effet observé sur la prolifération et la production d’IL-2 ne soit dû qu’à une augmentation des contacts entre les lymphocytes T et l’anticorps anti-CD3 utilisé pour les stimuler348. Cette même étude suggère que le collagène est la protéine de la matrice extracellulaire dont l’effet costimulateur est le plus important chez les lymphocytes T. 1.9.3 Intégrines liant le collagène Les lymphocytes T expriment deux intégrines liant le collagène soit α1β1 et α2β1. L’intégrine α1β1 peut lier le collagène de type I, mais a une plus grande affinité pour le collagène de type IV et l’intégrine α2β1 peut lier le collagène de type II et IV, mais a une plus grande affinité pour le collagène de type I341,349. Ces intégrines ne sont toutefois pas exprimées chez les lymphocytes T naïfs et n’apparaissent que quelques jours après leur activation341. Suite à l’activation, les lymphocytes T effecteurs vont migrer vers les sites inflammatoires. Pour ce faire, ils doivent traverser la membrane basale composée de diverses protéines de la matrice extracellulaire, telles que la fibronectine, la laminine et le collagène de type IV. Par la suite, ils devront migrer au travers du tissu interstitiel, composé en grande partie de collagène de type I. De plus, les sites inflammatoires sont riches en 56 diverses protéines de la matrice extracellulaire, dont le collagène, où les intégrines pourront servir de molécules d’ancrage et permettre la rétention des lymphocytes T au niveau du site inflammatoire. De plus, les niveaux d’expression de protéines de la MEC augmentent avec l’inflammation menant à un épaississement de la membrane basale dû au collagène de type IV350 et de la fibrose due aux niveaux élevés de collagène et de fibronectine351–353. Par ailleurs, le collagène fait aussi parti des structures lymphoïdes que l’on retrouve dans les tissus inflammatoires et où il peut aussi y avoir reconnaissance antigénique et réactivation des lymphocytes T effecteurs354. 1.9.3.1 Expression des intégrines liant le collagène Les premières études concernant l’expression de ces intégrines ont été faites il y a plus de vingt ans341. Cette étude a montré que les intégrines liant le collagène peuvent être exprimées sur des lymphocytes T du sang périphérique activés par la phytohémagglutinine (PHA) et l’IL-2 pendant une à deux semaines. Il a également été montré que ces intégrines sont exprimées sur les lymphocytes T arthritiques isolés du liquide synovial355. D’autres études ont par la suite montré que l’activation des lymphocytes T du sang périphérique par la PHA ou via le CD3/CD28 en présence d’IL-2 induisait l’expression de ces intégrines, tant sur les CD4+ que sur les CD8+ et que cette expression était associée à un phénotype effecteur / mémoire34,356. Il semblerait que l’intégrine α1β1 soit beaucoup plus exprimée chez les lymphocytes T CD8+ que CD4+. Ceci a été confirmé in vivo dans un modèle d’infection au LCMV où durant la phase aiguë, les intégrines α1β1 et α2β1 peuvent se retrouver aussi bien chez les CD4+ que les CD8+, mais que cette expression, particulièrement celle de α1β1, est légèrement plus importante chez les CD8+357. De plus, une étude récente a montré que un modèle d’infection à l’influenza, α1β1 était principalement exprimée chez les lymphocytes T CD8+ et que α2β1 était exprimée chez les CD4+332. Cependant, il existerait une faible proportion de lymphocytes T CD4+ qui exprimerait α1β1358. Ce patron d’expression est aussi corrélé avec la localisation des lymphocytes T dans les poumons, les CD4+ se retrouvent dans le parenchyme riche en collagène de type I alors que la majorité des CD8+ se retrouvent à proximité des bronches et des vaisseaux associés au niveau de la membrane basale riche en collagène de type IV332. Par ailleurs, l’intégrine α2β1 serait associée avec la différenciation des lymphocytes Th1, 57 mais pas avec les Th2 chez la souris333. Nous avons aussi montré que l’intégrine α2β1 mais pas α1β1 peut augmenter la production d’IFN-γ suggérant une association entre α2β1 et le phénotype Th1. Cependant, l’intégrine α1β1 a également été associée avec une souspopulation de lymphocytes T CD4+ mémoires polarisés en Th1359. L’intégrine α2β1 a été rapportée chez les lymphocytes Treg, générés par l’injection de cellules dendritiques chez la souris360. Par contre, α1β1 ne serait pas exprimé sur les Tregs du sang périphérique361. 1.9.3.2 Fonctions des intégrines liant le collagène Les études des dernières années ont permis de montrer que l’intégrine α1β1 était nécessaire à la réponse antivirale. En effet, l’utilisation d’anticorps bloquant ou de souris KO ont montré que α1β1 était nécessaire à la réponse CD8+, aussi bien dans la phase aiguë que chronique362. Cette intégrine semble favorisée la survie des lymphocytes T CD8+ mémoires et ne semble pas affecté leur migration362. En effet, l’intégrine α1β1 et le TNFRII peuvent favoriser la protection des lymphocytes T antiinfluenza contre l’apoptose induite par Fas363. Le rôle de l’intégrine α2β1 est cependant moins clair. Par contre, une étude a montré, grâce aux transferts adoptifs, que dans le modèle de l’influenza, l’intégrine α2β1 n’est pas requise pour la réponse antivirale des lymphocytes T effecteurs364. En fait, les lymphocytes T exprimant α2β1 seraient associés à l’immunopathologie dans la maladie, car ils produiraient plus de TNF alors que ceux qui n’expriment pas α2β1 produiraient de l’IL10364. Par contre, cette même étude propose que les lymphocytes T exprimant α2β1 puissent favoriser la réponse des macrophages en augmentant la production d’oxyde nitrique, ce qui serait important pour la réponse antibactérienne. Notre laboratoire a également contribué à démontrer l’importance des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes T. Nous avons montré que l’intégrine α2β1, dont le ligand principal est le collagène de type I, protège les lymphocytes T effecteurs de l’apoptose dépendante de Fas lors d’une stimulation par le TCR365,366. L’effet protecteur de l’intégrine α2β1 requiert la présence de FAK pour activer la signalisation. Cet effet passe par l’inhibition de l’expression de FasL induite par le TCR ainsi que par l’activation de la voie MAP Kinase ERK qui inhibe 58 l’activation de caspase-8. Nous avons également démontré que l’activation de la voie MAP kinase ERK par l’intégrine α2β1 et des effets protecteurs qui en découlent passe par l’activation de la cascade Ras-Raf1-MEK et implique également la phosphatase PP2A367. De plus, l'intégrine α2β1 augmente l'expression de l'IFN-γ chez les lymphocytes T CD4+ effecteurs lors de l’activation par le TCR en présence de collagène de type I11. Cette augmentation requiert l’activation des voies de signalisation MAP kinases ERK, JNK et la voie PI3-K/AKT par l’intégrine α2β1. Par la même occasion, en utilisant du collagène sous forme soluble, nous avons confirmé que la costimulation par l’intégrine α2β1 était liée à la signalisation intracellulaire induite par l’intégrine et non pas à une augmentation de contact entre l’anti-CD3 et les lymphocytes T. Par contre, le collagène de type IV, qui lie l’intégrine α1β1, n’augmente pas la production d’IFN-γ. Ceci pourrait être dû au fait qu’il n’y a pas de costimulation, contrairement à α2β1, de la voie JNK par α1β1. Nous avons également montré que l’intégrine α2β1 inhibe l’apoptose des lymphocytes T leucémiques induite par la doxorubicine en inhibant l’expression de RANKL, une cytokine de la famille du TNF368. De son côté, la liaison du collagène de type IV par l’intégrine α1β1 induit l’expression de RANKL chez les lymphocytes T CD4+ et augmente de façon importante l’expression de RANKL induite par l’IL-7369. Par ailleurs, l’interaction entre le collagène de type IV et α1β1 augmente significativement l’effet protecteur de l’IL-7 par rapport à l’apoptose. Il est à noter que le collagène de type I augmente également l’expression de RANKL induite par l’IL-7. Le collagène est également associé aux fonctions ostéoclastogéniques des lymphocytes T car en plus d’augmenter l’expression de RANKL, les lymphocytes T activés par le collagène seul, l’IL-17 ou la combinaison des deux ne produisent pas d’IFN-γ qui est un inhibiteur des ostéoclastes. Certaines fonctions des intégrines liant le collagène seront également discutées dans la section suivante. 59 1.10 Rôles des intégrines dans le développement des maladies auto-immunes. Bien que le rôle des intégrines n’ait pas été étudié de façon aussi intensive que celui des lymphocytes T auxiliaires dans le développement des maladies auto-immunes, plusieurs évidences montrent leur implication dans l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et les IBDs. 1.10.1 Arthrite rhumatoïde L’intégrine LFA-1 est importante pour le développement de l’arthrite rhumatoïde. Une étude a montré qu’une petite molécule inhibitrice pour LFA-1, BMS-587101, bloque l’adhésion des lymphocytes T aux cellules endothéliales, diminue leur prolifération ainsi que la production de cytokines de type Th1370. La même étude a montré que l’administration orale de cette petite molécule diminue également les symptômes de la maladie dans l’arthrite induite par antigènes et l’arthrite induite par le collagène. Les intégrines de la famille β1, particulièrement celles qui lient le collagène, jouent un rôle important dans le développement de la maladie. L’intégrine α6β1, lors de l’adhésion à la laminine, augmente l’expression de MMP-3 par les fibroblastes synoviaux suite à une stimulation par le TGF-β371. L’angiogenèse est un phénomène important pour le développement du pannus observé lors de l’arthrite rhumatoïde372. Les intégrines liant le collagène, α1β1 et α2β1, sont impliquées dans la néovascularisation et il a été démontré que l’utilisation d’anticorps bloquant contre ces intégrines diminue l’angiogenèse sans affecter les vaisseaux sanguins déjà existants lors d’essais d’angiogenèse chez la souris373. Une autre étude a montré que les souris knock-out pour α2β1 développent une arthrite beaucoup moins sévère dans le modèle de l’arthrite induite par antigènes374. Cette étude s’est attardée sur l’effet du knock-out chez les cellules synoviales. L’absence d’α2β1 diminue la prolifération des synoviocytes ainsi que leur adhésion au collagène du cartilage. Ces synoviocytes produisent significativement moins de MMP-3. Il en résulte que chez les souris knock-out pour α2β1, la dégradation du cartilage et la formation du pannus sont beaucoup moins importantes que chez les souris normales. Par ailleurs, les lymphocytes T arthritiques expriment les intégrines α1β1 et α2β1341. Ces 60 cellules se trouvent dans un environnement riche en collagène de type I que l’on retrouve au niveau du pannus et de l’os ainsi qu’en collagène de type II présent dans le cartilage375– 377 . Parallèlement, une autre étude a montré que les intégrines α1β1 et α2β1 sont importantes pour le développement de l’arthrite chez la souris301. En injectant des anticorps anti-collagène II suivis d’injections de LPS, les souris développent des symptômes semblables à ceux de l’arthrite. On nomme ce modèle AIA pour arthrite induite par anticorps. Dans cette étude, l’injection d’anticorps anti-α1 ou anti-α2 diminue grandement le développement de la maladie, particulièrement dans le cas d’anti-α1. Toutefois, ce modèle d’arthrite est connu comme étant dépendant des monocytes et non pas des lymphocytes T. Le rôle des intégrines liant le collagène dans la régulation des fonctions des lymphocytes T, en particulier chez les lymphocytes Th17, au niveau des articulations arthritiques est encore mal connu. Une étude a toutefois démontré que les lymphocytes T isolés de liquide synovial arthritique qui expriment α1β1 produisent de l’IFN-γ mais pas d’IL-17378. 1.10.2 Sclérose en plaques Les intégrines de la famille β2 ont principalement été étudiées dans le modèle murin de la maladie, l’EAE379. Les souris knock-out pour LFA-1 et Mac-1 développent beaucoup moins la maladie, sans être complètement protégées. En général, l’utilisation d’anticorps bloquant contre ces intégrines a le même effet, mais une étude a montré une exacerbation de la maladie suite au blocage de LFA-1380. Les mécanismes impliqués n’ont pas été étudiés, mais on peut penser que l’activation des lymphocytes T et la migration transendothéliale sont impliquées. Cependant, il semblerait que les anticorps bloquant contre les intégrines β2 aient beaucoup d’effets secondaires, principalement le risque de développement de leuco-encéphalopathie multifocale progressive, une infection du cerveau qui est habituellement fatale. À cause de cette possibilité, ces anticorps ont été retirés du marché381. Les intégrines de la famille β1 ont été peu étudiées dans le cadre de la sclérose en plaques, à l’exception d’α4β1. Il est connu depuis longtemps que l’interaction entre α4β1 et VCAM1 est importante pour le recrutement et la migration des lymphocytes T au 61 cerveau382. Depuis, de nombreuses études ont évalué la possibilité de bloquer α4β1 pour traiter la sclérose en plaques383. Cependant, comme pour les anticorps anti-β2, il semblerait que le traitement comporte certains risques de développer une leuco-encéphalopathie multifocale progressive. Le natalizumab, un anticorps bloquant spécifique pour α4 est malgré tout utilisé comme traitement de deuxième ligne pour les patients souffrant de sclérose en plaques de type rémittente-récurrente384. De leur côté, les intégrines liant le collagène ont fait l’objet de quelques études. Chez la souris, il a été démontré que l’utilisation d’anticorps bloquant dirigé contre α2β1 diminue l’inflammation du SNC ainsi que les signes cliniques associés à l’EAE si l’anticorps est injecté lors du développement de la maladie385. Les mécanismes régulant cet effet n’ont pas été étudiés, mais les auteurs suggèrent une diminution de la migration et de la rétention des lymphocytes T, macrophages et neutrophiles. Il est également possible que l’anticorps puisse bloquer la costimulation des lymphocytes T par α2β1. Le SNC ne contient toutefois pas de collagène, excepté dans les vaisseaux sanguins. La costimulation proviendrait plutôt de l’interaction entre α2β1 et la laminine mais cela reste à être démontré. Une autre étude a montré qu’un anticorps bloquant contre α1β1, et à moindre échelle α2β1, bloque l’adhésion des lymphocytes T au collagène IV ainsi que la migration de ces cellules dans un gel de collagène IV386. Ces lymphocytes T sont issus de patients atteints de sclérose en plaque, ce qui laisse penser que l’interaction entre α1β1 et le collagène IV peut être importante pour le recrutement des lymphocytes T vers le SNC. Toutefois, aucune étude n’a encore évalué le risque de développer une leuco-encéphalopathie multifocale progressive suite à l’utilisation de ces anticorps. 1.10.3 Maladies inflammatoires des intestins (IBD) Différentes intégrines ont été impliquées dans le développement de la maladie de Crohn et de la colite ulcéreuse. L’intégrine la plus étudiée dans ces maladies, l’intégrine α4β7 et son ligand MadCAM-1 sont importants pour la migration des lymphocytes T vers les intestins. Il a été démontré que le natalizumab, anticorps anti-α4, est efficace pour traiter la maladie de Crohn387. Toutefois, vu les risques qui y sont associés, le natalizumab n’est prescrit qu’à un nombre restreint de patients et ceux-ci font l’objet d’un suivi serré. LFA-1 semble également être impliqué dans la maladie. Une étude a montré que l’expression de LFA-1 et ICAM-1 est augmentée dans les muqueuses inflammées de ces maladies388. On ne sait 62 toutefois pas s’il s’agit d’une cause ou d’une conséquence. En ce qui concerne les intégrines liant le collagène, une étude a montré que l’intégrine α2β1 est importante pour le recrutement et l’activation des neutrophiles dans un modèle de colite chez la souris 389. Une autre étude a démontré que l’adhésion de cellules épithéliales aux collagènes de type I ou IV via l’intégrine α2β1 augmente l’expression de COX-2 et contribue ainsi au développement de l’inflammation390. 1.11 Récepteurs à domaine discoïdine En plus des intégrines de la famille β1, il existe d’autres récepteurs pour le collagène, dont les récepteurs à domaine discoïdine (DDR). Cette famille comprend deux membres soit DDR1 et DDR2. Ils sont également connus sous le nom CD167a et CD167b respectivement391. Ce sont des récepteurs tyrosine kinase qui possèdent un domaine extracellulaire semblable à celui de la discoïdine, une lectine que l’on retrouve chez l’amibe Dictyostelium discoideum392. DDR1 est exprimé sous 5 isoformes différentes, de a à e, alors qu’il n’existe pas d’isoforme pour DDR2. DDR1a, DDR1b et DDR1c sont les trois isoformes ayant le plus de similarités, ne variant que de quelques acides aminés, alors que DDR1d ne possède pas de domaine kinase et que DDR1e possède un domaine kinase inactif393. On retrouve ces récepteurs dans plusieurs types cellulaires tel que les fibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales ainsi que dans de nombreux cancers392,394–397. Dans les cellules cancéreuses, DDR permet la croissance de la tumeur et la formation de métastase en favorisant la migration des cellules et l’invasion des tissus398. Il a été démontré que DDR1 est exprimé chez les leucocytes et que sa surexpression augmente la migration des cellules THP1, une lignée cellulaire de monocytes, dans le collagène tridimensionnel399. Des travaux dans notre laboratoire ont montré que l’activation des lymphocytes T induit l’expression de DDR1 et qu’il est impliqué lors de leur migration dans le collagène tridimensionnel400. L’expression de DDR1 suite à l’activation du TCR se fait via PKCΘ et la MAP Kinase ERK alors que les voies MAP Kinase JNK et p38, ainsi que la voie du calcium, ne sont pas nécessaire401. Nous avons également montré que DDR1 n’est pas requis pour l’adhésion ferme des lymphocytes T ce qui suggère que la migration 63 dépendante de DDR1 est de type amiboïde et ne requiert pas d’interactions fortes avec le collagène401,402. Une autre étude a montré que les lymphocytes T humains expriment DDR1 et DDR2 lorsqu’ils sont activés391. Les lymphocytes T CD8+ ont une expression légèrement plus forte des deux récepteurs que les CD4+. Les auteurs n’ont pas évalué l’expression des récepteurs chez tous les phénotypes de lymphocytes T CD4+, mais ont noté que l’activation de DDR1 augmente la production d’IFN-γ et d’IL-4 alors que DDR2 n’augmente que la production d’IFN-γ ce qui suggère que l’expression de DDR peut varier selon les phénotypes. Ceci démontre également que DDR peut agir comme molécule de costimulation chez les lymphocytes T. De plus, DDR2 a été impliqué dans le développement de l’arthrite rhumatoïde. Il a été associé à la dégradation du cartilage, car il favorise la production de MMP-1 chez les fibroblastes403. Pour l’instant, aucune étude n’a démontré de rôle pour DDR1 dans le développement de la maladie. Bien que le rôle de DDR1 chez les lymphocytes T ne soit pas encore totalement caractérisé, les quelques études à ce sujet démontrent que ce récepteur peut être important pour le développement de la réponse inflammatoire en contribuant à leur migration et recrutement au site inflammatoire ainsi qu’en tant que molécule de costimulation. 1.12 Problématique et hypothèse Plusieurs études ont montré que les lymphocytes Th17 sont importants pour le développement de l’arthrite rhumatoïde et autres maladies inflammatoires. La différenciation des Th17 est bien connue, mais les mécanismes qui régulent leur activation et leur fonction au niveau du site inflammatoire sont très peu étudiés. Des études ont montré que les intégrines liant le collagène sont impliquées dans le développement de maladies inflammatoires tel que l’arthrite rhumatoïde. Nous avons nousmêmes établi que les intégrines liant le collagène favorisent la survie des lymphocytes Th1 et augmentent leur production de cytokines. 64 Par ailleurs, le collagène est une matrice très abondante dans les sites inflammatoires. C’est le cas des articulations atteintes lors de l’arthrite rhumatoïde375–377. Ces articulations comportent une grande partie de collagène type I qui compose l’os et le tissu interstitiel, de collagène de type II qui compose le cartilage et de collagène de type IV retrouvé dans la membrane basale. Notre hypothèse est que l’interaction des lymphocytes Th17 avec le collagène via les intégrines α1β1 et α2β1 peut augmenter leur activation lors de réponse inflammatoire et ainsi contribuer au développement de l’arthrite rhumatoïde. 1.13 Buts Le but de mon projet est d’élucider le rôle des intégrines liant le collagène dans la régulation des fonctions effectrices des lymphocytes Th17. Pour atteindre ce but, je me suis fixé les objectifs suivants : Premièrement, évaluer l’expression des intégrines liant le collagène α1β1 et α2β1 sur les lymphocytes Th17 et mesurer la capacité des lymphocytes Th17 d’adhérer à différents collagènes (type I, II et IV) puis déterminer le rôle des intégrines liant le collagène sur les fonctions des lymphocytes Th17, soit la production de cytokines (IL-17A, IL-17F, IL-22 et IFN-γ) lors d’une stimulation par le TCR. Ensuite, déterminer les voies de signalisation activées par les intégrines liant le collagène affectant la production de cytokines chez les lymphocytes Th17 lors d’une stimulation par le TCR. Finalement, caractériser l’expression des DDR chez les lymphocytes T et déterminer s’ils peuvent être associés aux lymphocytes Th17. Ces travaux ont été réalisés dans le modèle humain des Th17. 65 Chapitre II : L’intégrine alpha2beta1 est la principale intégrine liant le collagène chez les lymphocytes Th17 2.1 Résumé Des études récentes indiquent que les intégrines liant le collagène peuvent être des molécules de costimulation pour les lymphocytes T effecteurs. Dans cette étude, nous démontrons que la plus importante intégrine liant le collagène exprimée par les lymphocytes Th17 est α2β1 (VLA-2), aussi connue pour être le récepteur pour le collagène de type I chez les lymphocytes T. Nos résultats montrent que les lymphocytes T CD4+ naïfs humains mis en culture dans des conditions induisant la polarisation Th17 augmentent préférentiellement l’expression de l’intégrine α2β1 alors que l’intégrine α1β1, le récepteur pour le collagène de type IV, n’est que peu exprimée. L’analyse en double marquage des intégrines et de l’IL-17 intracellulaire montre que la sous-unité α2, mais pas la sous-unité α1, est associée aux lymphocytes Th17. Les expériences d’adhésion cellulaire démontrent que les lymphocytes Th17 adhèrent aux collagènes de type I et de type II via l’intégrine α2β1 mais n’adhèrent pas au collagène de type IV. Les études fonctionnelles révèlent que les collagènes de type I et de type II costimulent la production d’IL-17A et d’IL-17F ainsi que l’IFN-γ par les lymphocytes Th17 humains activés par un anticorps anti-CD3. Ces résultats identifient l’intégrine α2β1 comme étant le principal récepteur pour le collagène exprimé par les lymphocytes Th17 humains et suggèrent qu’il s’agisse d’une importante molécule de costimulation de la réponse Th17. 67 Alpha2beta1 integrin is the major collagen-binding integrin expressed on human Th17 cells Marc Boisvert, Nizar Chetoui, Steve Gendron and Fawzi Aoudjit Centre de Recherche en Rhumatologie/Immunologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Pavillon CHUL, and Faculté de Médecine, Université Laval Key Words: VLA-2 signaling, Human Th17, Co-stimulation, Collagen Abbreviations: α1β1 (alpha1beta1), α2β1 (alpha2beta1), ECM (extracellular matrix), IL23R (IL-23 receptor), P+I (PMA and ionomycin), NP (nonpolarizing). Corresponding Author: Dr. Fawzi Aoudjit, Centre de Recherche en Rhumatologie et Immunologie, CHUQ. Pavillon CHUL, 2705 Blvd Laurier, local T1-49, Ste-Foy, Québec, G1V 4G2 Canada Fax: 1-418-654-2765 e-mail: [email protected] 69 2.2 Abstract Growing evidence indicates that collagen-binding integrins are important costimulatory molecules of effector T cells. In this study, we demonstrate that the major collagen-binding integrin expressed by human Th17 cells is alpha2beta1 (α2β1) or VLA-2, also known as the receptor for collagen I on T cells. Our results show that human naïve CD4+ T cells cultured under Th17 polarization conditions preferentially upregulate α2β1 integrin rather than α1β1 integrin, which is the receptor for collagen IV on T cells. Double staining analysis for integrin receptors and intracellular IL17 showed that α2 integrin but not α1 integrin is associated with Th17 cells. Cell adhesion experiments demonstrated that Th17 cells attach to collagen I and collagen II using α2β1 integrin but did not attach to collagen IV. Functional studies revealed that collagen I and II but not collagen IV costimulate the production of IL-17A, IL-17F and IFN-γ by human Th17 cells activated with anti-CD3. These results identify α2β1 integrin as the major collagen receptor expressed on human Th17 cells and suggest that it can be an important costimulatory molecule of Th17 cell responses. 71 2.3 Introduction Integrins are α/β heterodimeric membrane proteins that mediate cell-cell interactions and cell adhesion to the surrounding extracellular matrix (ECM). They also elicit a wide variety of intracellular signals that modulate cell growth, proliferation and apoptosis [1, 2]. T cells express several members of the β1 integrin family, which following cellular activation mediates their attachment to ECM [3, 4]. In lymphoid organs, T cells interact poorly with ECM since in these compartments the majority of ECM is not accessible to T cells as it is surrounded by reticular fibroblastic cells [5]. However, effector/memory T cells that migrate to inflammatory sites attach and interact with several proteins of the ECM particularly with collagens. Effector/memory T cells infiltrating the tissues express two major collagen-binding integrins; α1β1 and α2β1 also known as VLA-1 and VLA-2 respectively [3, 6]. Both integrins can recognize several types of collagens, although α1β1 integrin can interact with both collagen I and IV, α2β1 integrin has collagen I as a preferred ligand [7-9]. Growing evidence indicates that these collagen binding-integrins are important regulatory molecules of T cell responses. They have been involved in the costimulatory effect of collagen on the proliferation of human effector cells [10] and we and others have shown that they also protect effector T cells from apoptosis [11, 12]. We have also demonstrated that α2β1 integrin costimulates the production of interferon-γ (IFNγ) in human effector T cells [13]. Furthermore, evidence from animal models of inflammation indicates that α1β1 and α2β1 integrins are also involved in the development of inflammatory diseases [14, 15]. Th17 cells are a recently described T cell subset specialized in the production of IL-17. They are highly proinflammatory and have been associated with the pathogenesis of several autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus, inflammatory bowel disease and multiple sclerosis (reviewed in [16]). High levels of IL-17 have been found in patients affected by these diseases [17-19] and evidence from animal models suggests that Th17 cells are crucial effector cells in driving the inflammatory response and tissue damage associated with autoimmune diseases [20-22]. Th17 cells and their effector cytokines participate to the pathogenesis of inflammation by upregulating the production of proinflammatory cytokines such as IL-1, TNF, RANKL and IL-6, as well as chemokines, 73 which facilitate the recruitment of proinflammatory cells such as neutrophils and monocytes to the inflamed tissue sites (reviewed in [16]). Despite these findings, the regulatory mechanisms of Th17 cell responses are less explored. Given that effector T cells at inflammatory sites function within a microenvironment enriched with collagens, we considered the role of collagen-binding integrins in the regulation of Th17 cell responses. We investigated the expression and function of α1β1 and α2β1 integrins in human Th17 cells and found that α2β1 integrin is the major collagenbinding integrin expressed on human Th17 cells. As such, we report that Th17 cells attach to collagen I and II through α2β1 integrin but do not attach to collagen IV and that ligation of α2β1 integrin with collagen I and II costimulates the production of IL-17. Together, our results indicate that α2β1 integrin can be a major regulatory molecule of Th17 cell functions and therefore may represent a therapeutic target for Th17 cell-dependent inflammatory diseases. 74 2.4Results 2.4.1 Th17 cells differentiation preferentially upregulate α2β1 integrin. In agreement with previous studies [23, 24], we found that naive CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions express higher mRNA levels of the specific Th17 cell transcription factor RORc and IL-23 receptor (IL-23R), which also marks Th17 cells, than those cultured under non-polarizing (NP) conditions (Fig 1A&B). Furthermore, cells cultured under Th17-polarizing conditions also produce higher amounts of IL-17A and IL17F than non-polarized T cells (Fig 1C&D). In addition and as previously reported for human Th17 cells [24], we found that cells cultured under Th17-polarizing conditions also produce IFN-γ (Fig 1E). Together these results indicate that the culture of naïve CD4+ T cells under Th17 polarization conditions did lead to the differentiation of cells along the Th17 pathway. T cells are known to attach to collagen matrices through α1β1 and α2β1 integrin receptors. We therefore investigated the expression of these integrins on the surface of Th17 cells by examining the expression levels of α1 and α2 integrin chains. A representative flow cytometry profile shows that a significant number of the cells (65%) cultured under Th17polarizing conditions express α2 integrin chain, whereas only a small fraction of these cells (6%) express α1 integrin chain (Fig. 2B). Expression analysis from 5 different blood samples indicates that 64 to 87.8% of the total cells cultured under Th17-polarizing conditions express α2 integrin, whereas only 1.5 to 5.3% of these cells express α1 integrin (Fig. 2C). The expression levels of α1 and α2 integrins did not change on long-term cultured cells (12 days) (data not shown). As expected, virtually all the cells cultured under Th17-cell-polarizing conditions express the β1 integrin chain (Fig 2B). These results indicate that human naïve CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions preferentially upregulated α2β1 integrin. We then examined the relationship of α1 and especially α2 integrin expression with the production of IL-17 by costaining the cells cultured under Th17-polarizing conditions for integrin receptors and IL-17. As shown in Fig. 3A, activation of T cells cultured under Th17-polarizing conditions with PMA+ionomycin led to the generation of IL-17-positive T cells (5.54% in middle panel and 6.08% in lower panel). As expected the expression of α1 integrin is detected only on a total of 2.54% of the cells and only 0.11 % out of 5.54% of 75 the Th17 cells are positive for α1 integrin (Fig 3A; middle panel). However, α2 integrin is detected on 70.32% of the cells and the majority of Th17 cells (4.97% out of 6.08%) also express α2 integrin (Fig 3A; lower panel). Costaining of the cells with control Ab did not led to any significant staining for integrin receptors and intracellular staining (Fig 3A; upper panel). Expression analysis from 5 different blood samples indicates that 52 to 90% of the total Th17 cells (IL-17+) express α2 integrin whereas only 2 to 5% of these cells express α1 integrin (Fig. 3C). As a control, effector CD4+ T cells generated from peripheral blood T cells (non-polarized Th) did not express IL-17 upon reactivation with PMA+ionomycin but did express both α1 and α2 integrins (Fig 3B), which is in agreement with previous studies [10, 25]. Altogether, these results indicate that α2β1 integrin is the major collagen-binding integrin expressed on human Th17 cells. 2.4.2 Th17 cell adhesion to collagens is dependent on α2β1 integrin. To determine the role of collagen-binding integrins in the adhesion of Th17 cells to collagens, we tested their capacity to attach to three different types of collagens, which could be important in regulating the inflammatory response of Th17 cells in injured tissues. The collagen matrices used are collagen I, which is largely found in the interstitial spaces of the tissue, collagen IV, a major component of basement membrane and collagen II, which is a major constituent of cartilage. Since non-activated T cells attach poorly to ECM proteins, the cells were activated with PMA or with anti-CD3; two stimuli known to increase the activated state of integrins and to induce T cell adhesion to ECM. The results in Fig. 4A indicate that Th17 cells have a low capacity to attach to collagens and their activation with PMA led to a comparable increase in cell adhesion to collagen I and II but not to collagen IV. Adhesion of Th17 cells to collagen I and II is mediated by α2β1 integrin as a blocking anti-α2 integrin Ab blocked cell adhesion to these matrices. However, a blocking anti-α1 integrin Ab had no effect on cell adhesion and did not enhance the effect of the blocking anti-α2 Ab. Similar results were also obtained when the cells were stimulated with anti-CD3 (Fig. 4B). As expected, adhesion of Th17 cells to collagen I and II is completely blocked by a blocking anti-β1 integrin Ab (Fig. 4C). Together, these results indicate that Th17 cells attach to collagen matrices by using α2β1 integrin. 76 2.4.3 α2β1 enhances the production of Th17 cytokines. We then investigated the potential role of collagen matrices in the costimulation of Th17 cell responses. As shown in figure 5A, activation of Th17 cells with collagen I and II or with collagen IV had no effect on the production of IL-17A. However, collagens I and II but not collagen IV significantly increased by approximately a 2.5 to 3 fold the production of IL-17A induced upon CD3 activation. The presence of BSA used as a control had no effect on the production of IL-17A. The costimulatory effects of collagen I and II were not due to changes in cell proliferation or apoptosis as comparable cell numbers with similar viability were recovered after 24 hours of stimulation under all experimental conditions (data not shown). To rule out that the effect of collagens is due to cell adhesion that may result in the enhancement of contacts of Th17 cells to immobilized anti-CD3 Ab, we examined whether collagens still have the capacity to increase Th17 cell response when added in soluble forms. Addition of soluble collagen I and II but not collagen IV significantly increased antiCD3-induced IL-17A (Fig. 5B) indicating that the costimulatory effect of collagens is likely due to their signaling function. As a control, we found that the costimulatory effect of collagen I and II on IL-17A production was abrogated by the anti-α2 but not anti-α1 integrin blocking Ab indicating that similar to the cell adhesion results, the costimulatory effects of collagen I and collagen II is also mediated via α2β1 integrin (Fig. 5C). We then examined if α2β1 integrin also costimulates the production of other cytokines associated with Th17 cells. In particular, we examined IL-17F and IFN-γ since α2β1 integrin has been associated with IFN-γ-producing effector T cells and promoted costimulation of IFN-γ production [13, 26]. The results show that collagen I and II but not collagen IV also significantly increases anti-CD3-induced production of IL-17F (Fig. 6A) and IFN-γ (Fig. 6B) from Th17 polarized cells. Together these results indicate that in addition to cell adhesion to collagens, α2β1 integrin also costimulates Th17 cell responses. 77 2.5 Discussion Growing evidence indicates that T cell interactions with extracellular matrix proteins in perivascular tissues are important in the regulation of inflammation and autoimmunity. In this study, we show that human Th17 cells interact with collagen matrices through α2β1 integrin. Our results show that human Th17 cells express differentially α1β1 and α2β1 integrins; the two major collagen-binding integrins known to be expressed on T cells. Th17 cells upregulate preferentially α2β1 integrin rather than α1β1 integrin. This differential expression of collagen binding integrins is not due to a lack in the capacity of the CD4 lineage to express α1β1 integrin. Although naive T cells express no or weak levels of α1β1 and α2β1 integrins, both integrins are significantly expressed on human CD4+ and CD8+ effector T cells generated after in vitro activation of peripheral blood T cells [3, 6, 10, 12, 25] (Fig. 3) as well as on virus-activated mouse CD4+ and CD8+ T cells [27, 28]. Furthermore, α1β1 integrin has also been detected on human CD4+ T cells infiltrating the inflamed synovium [29, 30] and other tissues such as the gut (reviewed in [31]). The expression of α1β1 and α2β1 integrins has also been associated with human and mouse Th1 cells respectively [26, 29, 32] whereas α2β1 integrin is not expressed on mouse Th2 cells [26]. In agreement with our findings is the recent report showing that the expression of α1β1 integrin is associated with synovial Th1 cells but not Th17 cells that have been isolated from patients with rheumatoid arthritis [29]. Altogether, these studies suggest that the absence or the weak levels of α1β1 integrin on human Th17 cells can serve as an additional mean to distinguish between Th1 and Th17 effector T cell subsets. Currently, the mechanisms regulating the expression of α1β1 and α2β1 integrins on Th1 and Th17 cell subsets are unknown but it is likely that the Th1- and Th17- polarizing cytokines and the cytokines produced by these T cell subsets could play an important role in this process. Although the exact role and contribution of Th1 and Th17 cells to the induction of tissue inflammation and autoimmune diseases is still in debate, increasing evidence suggests that both T cell subsets are pathogenic. In this context, the differential expression of α1β1 integrin on Th1 and Th17 cells indicates that α1β1 integrin may be critical for the Th1 response but not for the Th17 cell response. The fact that α2β1 integrin can be expressed on both Th1 and Th17 cells also suggest that α2β1 integrin may have a predominant role over 78 α1β1 integrin in T cell-mediated pathogenesis. Recent studies suggested that Th17 cells control the initial phase whereas Th1 cells control the late phase of tissue inflammatory response [33-35] suggesting that α1β1 integrin may be involved only in the late phase of the inflammatory disease. Accordingly, putative pharmacological targeting of α1β1 and α2β1 integrins in inflammatory diseases should take into consideration the specific Th response involved and the stage of the disease. Functional blocking experiments demonstrated that α2β1 integrin is the major integrin by which Th17 cells attach to collagen matrices. We found that human Th17 cells attach to collagen I but not to collagen IV, which is consistent with the observed expression profile of α1β1 and α2β1 integrins and with previous studies demonstrating that α2β1 integrin recognizes with high affinity collagen I but not collagen IV, whereas α1β1 can recognize both collagens with high affinity [7-9]. Although α2β1 integrin contributes to the α1β1dependent adhesion of IL-2 activated T cells [14] and of colorectal cancer cells to immobilized collagen IV [36], it is not sufficient to mediate Th17 cell attachment to collagen IV likely because of the weak levels of α1β1 integrin. Although it has to be tested but our results strongly suggest that the majority of Th17 cells in inflammatory tissues are likely to be localized in the interstitial compartment of the tissue where collagen I is the major collagen type expressed rather than near the basement membranes where collagen IV is the major matrix constituent. In addition to cell adhesion, we also found that collagen I but not collagen IV costimulates Th17 cells by increasing the production of IL-17 cytokines. These observations are consistent with the data from the expression and cell adhesion experiments and further support the association of α2β1 integrin expression with Th17 cells. Our results also showed that the costimulatory function of collagen was unlikely to be due to cell adhesion but rather be due to α2β1 integrin signaling since soluble collagens are as potent in costimulating Th17 cell response. Thus, by upregulating the production of IL-17, α2β1 integrin can be one major signaling molecule contributing to the highly inflammatory nature of Th17 cells. Interestingly, our results also demonstrated that ligation of α2β1 integrin increases the production of IFN-γ from Th17 polarized cells. This is consistent with previous reports showing that α2β1 integrin was associated with IFN-γ-producing effector T cells and 79 promoted costimulation of IFN-γ production [13, 26]. Recent studies have identified a subset of Th17 cells expressing simultaneously both IL-17 and IFN-γ (Th1/Th17 cells) in human diseases like colitis and multiple sclerosis [37, 38]. We could not identify significant numbers of such double producers in our cell model (less than 0.1%), consistent with previous reports [23, 24, 39] and we found that collagen costimulation did not lead to the appearance of IL-17/IFN-γ double producer cells (data not shown). However, based on our findings that α2β1 integrin is associated with the production of IL-17 and IFN-γ, it is also possible that α2β1 integrin can costimulate the production of both cytokines from these double producers; further suggesting that α2β1 integrin can contribute to Th17 celldependent inflammation also by increasing the production of IFN-γ. Although the role of α2β1 integrin in the development of autoimmune diseases is still not well investigated, its blockade with a specific antibody reduced the development of arthritis and of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) [14, 15]. However, these studies did not examine if the antibody effect occurred at the level of Th17 cells, which are associated with both arthritis and EAE. Collagen I is the most abundant matrix in the body, and can be found in various organs including skin, synovial and connective tissues, intestine, lung and brain [40]. Therefore, our study suggests that α2β1 integrin can contribute to the pathogenesis of arthritis and EAE and probably to other diseases known to be associated with Th17 cells such as intestinal inflammation and allergic inflammation (reviewed in [16]) by costimulating Th17 cell responses. Interestingly, we report for the first time that effector T cells and in this case human Th17 cells also attach to collagen II via α2β1 integrin and that collagen II is as potent as collagen I in costimulating the production of Th17 cytokines. Although less studied, but α2β1 integrin has been reported to interact with collagen II and to mediate attachment of platelets and breast cancer cells to collagen II [41, 42]. Since collagen II is found only in the cartilage, which during rheumatoid arthritis is degraded as a result of synovial inflammation, our results also imply that costimulation of Th17 cell response by collagen II can contribute to the degradation of cartilage since this process is activated by both IFN-γ and IL-17 [43]. Besides its role in costimulation, α2β1 integrin can also promote the migration, the localization and the retention of Th17 cells in the inflamed tissues. A recent study suggested that in vitro generated mouse Th17 cells fail to induce inflammation in vivo 80 possibly due to the lack of CXCR3 expression and subsequent impaired migration into inflamed sites [44]. However, that study did not investigate the expression and the role of α2β1 integrin in the migration of Th17 cells. Understanding the mechanisms by which α2β1 integrin regulates Th17 cell functions will further our understanding of Th17 celldependent inflammation and may lead to new therapeutic avenues especially in diseases associated with matrix degradation, which are now considered for the first trials of IL-17 inhibitors [45]. 2.6 Materials and Methods 2.6.1 Antibodies and reagents TGFβ, IL-1β, IL-6, IL-23 were from R&D Systems (Minneapolis, MN). IL-2, Bovine serum albumin (BSA), Phorbol 12-Myristate 13-acetate (PMA), ionomycin, collagens and poly-l-lysine were purchased from Sigma (St-Louis, MO). CD3 and CD3/CD28 dynabeads were from Invitrogen dynal AS (Oslo, Norway). PE-conjugated anti-α1 (SR84) and anti-α2 (12F1) integrin antibodies (Ab), Alexa-fluor 647-conjugated anti-IL-17 (Clone N49- 653), anti-CD3 (OKT3) and control isotype Ab were from BD Biosciences (San Diego, CA). Blocking antibodies against α1 (FB12) and α2 (P1E6) were from Chemicon (Temecula, CA) and anti-β1 integrin Ab (4B4) was from Coulter Clone (Miami, FL). Alexa-fluor 488-conjugated anti-mouse Ab was from Molecular probes (Eugene, OR). 2.6.2 Isolation of primary T cells and T helper cell differentiation Peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy adult volunteers on Ficoll gradients. The participating volunteers signed a consent form and ethical committee of Laval University approved the study. Primary human naïve CD4+ T cells were then purified by two rounds of negative selection using magnetic beads from StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) according to the manufacturer's instructions. Th17 cells were then generated by activating naïve CD4+ T cells for 6 days with anti-CD3/CD28 dynabeads (1 bead/cell) in X-vivo medium without serum in the presence of TGFβ (10 ng/ml, IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml) and IL-23 (100 ng/ml). This protocol was recently used to differentiate human Th17 cells from naive CD4+ T cells isolated from both peripheral blood 81 and umbilical cord blood [23, 24]. To generate non-polarized T helper cells, naïve CD4+ T cells were stimulated with CD3/CD28 for 24h and then cultured for 14 days in RPMI medium supplemented with 10% of FBS, glutamine and antibiotics and containing 50 U/ml of IL-2, which was added every two days. 2.6.3 Real-Time RT-PCR analysis Total RNA was extracted with Trizol reagent according to the manufacturer’s instructions (Invitrogen, Carlsbad, CA). First strand cDNA was prepared from 1µg of total RNA using the Thermoscript system (Invitrogen, Carlsbad, CA). The nuclear orphan receptor RORc, IL-23R, and β actin transcripts were amplified by real-time RT-PCR as described [46] using previously described RORc and IL-23R primers [23] and β-actin primers [47]. Quantitative PCR reaction were done with 1 µl of cDNA in a total volume of 20 µl containing SYBR® Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA) and were carried out in a RotorGene 3000 operated with Rotor-Gene Software 9 version 6.0.19 (Corbett Research, Mortlake, NSW Australia). The amplification for each gene was measured using 30 cycles (94°C for 17 sec, 58°C for 25 sec and 72 °C for 25 sec). Reaction specificity was verified by performing the Melts® procedure (60–99°C; 1°C/4 s) at the end of the amplification according to the manufacturer’s protocol. Each sample has been normalized to the level of β-actin and fold increase was evaluated using cycle threshold (Ct) values as previously described [46]. 2.6.4 Cell surface molecule expression The expression of cell surface receptors was determined by immunostaining and flow cytometry analysis. For the detection of α1 and α2 integrin chains, the cells were incubated on ice with 10 µg/mL of PE-conjugated anti-integrin Ab or with PE-conjugated control isotype Ab for 45 minutes in PBS containing 0.1% of FBS. For the detection of β1 integrin chain, the cells were incubated on ice with 10µg/mL of anti-β1 integrin Ab (4B4) or with its isotype control for 45 minutes in PBS containing 0.1% of FBS. The cells were washed and incubated with Alexa-fluor-conjugated anti-mouse Ab (1:100) for another 45 minutes. Cells were washed in PBS and analyzed by flow cytometry using FACSCalibur (BD Biosciences). 82 2.6.5 Staining for integrin receptors and intracellular IL-17 Th17 cells were activated or not with PMA (50 ng/ml) and ionomycin (1 µM) for 6 hours in the presence of 5 µg/ml of GolgiPlug containing brefeldin A (BD Bioscicences). Subsequently, the cells were washed and first stained with PE-conjugated anti-α1 or anti-α2 integrin Ab for 45 minutes. The cells were then washed, permeabilized with a CytoFix/CytoPerm kit (BD Biosciences), and stained for intracellular IL-17 using an Alexa-fluor 647-conjugated anti-IL-17 Ab (Clone N49-653; BD Biosciences). Stained cells were then analyzed using a BD FACSCalibur. 2.6.6 Cell adhesion assays Cell adhesion assays were performed in 96-well plates as we previously described [48]. A 96-well microtiter plate (TC plate, flat bottom, Falcon) was coated with 20 µg/ml of collagen matrices in PBS overnight at 4°C. The wells were then washed with PBS and blocked for 1 hour at 37°C with 1% BSA. 105 cells in 0.1 ml of X-vivo medium containing or not PMA or anti-CD3 coated beads were added to the wells and were incubated for 1 hour at 37°C. In some cases, 10 µg/mL of blocking anti-α1, -α2 and -β1 integrin antibodies were added to the cells 1 hour before cellular activation. After incubation, the cells were washed with PBS and fixed in a PBS solution containing 1% formaldehyde for 1 hour at room temperature. The cells were washed with PBS and stained with a methanol solution containing 0.5 % crystal violet. After several washes with PBS, the cells were lysed in a 1% SDS solution and the absorbance at 600 nm determined by an Eliza plate reader. 2.6.7 T cell costimulation and IL-17 ELISA Th17 cells (2x105) in 100 ml of X-vivo medium were activated in wells coated or not with 2 µg/ml of anti-CD3 Ab, 1 µg/ml of collagen matrices or in wells coated with a combination of anti-CD3 and collagens. The anti-CD3 Ab was coated overnight at 4oC whereas collagen matrices were coated for 2 h at 37o C. The cells were also activated in wells coated with anti-CD3 in the presence or absence of 20 µg/ml of soluble collagens. After cellular activation, cell free supernatants were harvested and the production of IL-17 and IFN-γ was measured using specific ELISA kits from R&D systems (Minneapolis, MN) according to the manufacturer’s instructions. IL-17F production was measured in cell free supernatants by ELISA using plate-bound anti-huIL-17F Ab followed by detection with 83 biotinylated anti-huIL-17F Ab and streptavidin horseradish peroxidase from R&D systems (Minneapolis, MN) according to the manufacturer’s instructions using recombinant human IL-17F (R&D systems) as a standard. Statistical analysis Statistical analysis was performed by the student’s t-test. Results with p<0.05 were considered significant. Acknowledgement This work was supported by grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to FA. MB is a recipient of a scholarship from the Canadian Arthritis Network Centre of Excellence and a scholarship from the Fonds de Recherche en santé du Québec. Conflict of interest The authors declare no financial or commercial conflict of interest. 84 2.7 References 1 Giancotti, F. G. and Ruoslahti, E., Integrin signaling. Science 1999. 285: 10281032. 2 Giancotti, F. G. and Tarone, G., Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. Annu Rev Cell Dev Biol 2003. 19: 173206. 3 Pribila, J. T., Quale, A. C., Mueller, K. L. and Shimizu, Y., Integrins and T cellmediated immunity. Annu Rev Immunol 2004. 22: 157-180. 4 Hogg, N., Laschinger, M., Giles, K. and McDowall, A., T-cell integrins: more than just sticking points. J Cell Sci 2003. 116: 4695-4705. 5 Bajenoff, M., Egen, J. G., Koo, L. Y., Laugier, J. 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Data show mean SD from five independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different blood donors. 89 Figure 2 : Expression of α1, α2 and β1 integrins on human naïve CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions. Expression of α1, α2 and β1 integrins on human naïve CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions. (A) Integrin expression analysis was performed on the R1-gated cell population, which represents more than 95% of the total cells and which excludes debris and dead cells as determined by the forward scatter versus side scatter. (B) The cells were stained with specific control isotype Ab (thin line) or with Ab against integrin chains (bold line) and analyzed by flow cytometry as described in the Materials and methods section. The results are from one randomly selected donor and are representative of five experiments performed with T cells isolated from five different blood donors. (C) Comparison of α1β1 and α2β1 integrins’ expression on human naïve CD4+ T cells cultured under Th17-polarizing conditions from five different blood donors. Each pair of bars (plain and empty) represents the data from one blood donor. 90 Figure 3 : Expression of α1 and α2 integrin chains on human Th 17 cells. Costaining of CD4+ T cells cultured under (A) Th17-polarizing conditions (Th17) or under (B) NP conditions for α1 and α2 integrins and intracellular IL-17. The cells were activated with P+I for 6 h in the presence of 5 mg/mL of BD GolgiPlug (brefeldin A) and stained with control isotype Ab or with anti-α1, anti-α2 integrin Ab followed by intracellular staining with anti-IL-17 Ab as described in the Materials and methods section. The cells were then analyzed by flow cytometry and the percentage of cells in each quadrant is noted. The results are from one randomly selected donor and are representative of five different experiments performed with T cells isolated from five different blood donors. (C) Comparison of α1β1 and α2β1 integrins’ expression on human Th17 cells generated from naı¨ve T cells isolated from five different blood donors. Each pair of bars (plain and empty) represents the data from one blood donor. Similar gating strategy as described in Fig. 2 was used to analyze integrin expression in Th17 and NP cells. 91 Figure 4 : Cell adhesion of human Th17 cells to collagen matrices. The cells were activated or not with (A) PMA or (B) with anti-CD3-coated beads, seeded in wells that had been coated with collagen I (Coll I), collagen II (Col II) or with collagen IV (Coll IV) and were allowed to attach for 1 hour at 37°C. 10 µg/mL of inhibitory anti-α1 and anti-α2 integrin Ab were added to the wells as indicated in the figure. (C) Cell adhesion of human Th17 cells to collagens is β1-integrin-dependent. The cells were activated or not with PMA, seeded in wells coated with Coll I and Coll II and were allowed to attach for 1 hour at 37°C. 10 µg/ml of blocking anti-β1 integrin Ab (anti-β1) was added to the wells as indicated in the figure. Cell adhesion was quantified as described in the Materials and methods section. Data show mean SD from five independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different blood donors. *p<0.05 between PMA- or anti-CD3-treated samples and non-treated samples. 92 Figure 5 : Costimulation of human Th17 cells by collagens. (A) Cells were activated or not in wells coated with anti-CD3 Ab, BSA, collagen I (Coll I), collagen II (Coll II), collagen IV (Coll IV) and with combinations of anti-CD3 and collagens or anti-CD3 with BSA. (B) The cells were activated with 20 µg/ml of soluble Coll I, Coll II, Coll IV or BSA in wells coated or not with anti-CD3 Ab. After 24 h, cell-free supernatants were harvested and the production of IL-17A was determined by ELISA. Data show mean SD from three (B) and five (A) independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from three (B) and five (A) different blood donors. *p<0.05 between samples activated with anti-CD3+collagens (I and II) and samples activated with anti-CD3 alone or with anti-CD3+collagen IV. (C) Cells were activated or not in wells coated with anti-CD3 Ab and with combinations of anti-CD3 and collagens (Coll I and Coll II). As indicated, the cells were pretreated or not for 1 h with inhibitory anti-α1 or anti-α2 integrin Ab before their activation. After 24 h, cell-free supernatants were harvested and the production of IL-17A was determined by ELISA. Data show mean SD from three independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from three different blood donors. *p<0.05 between samples activated with anti-CD3+collagens (I and II) in the absence or presence of anti-α1 Ab and samples activated with anti-CD3 in the absence of collagens or samples activated with anti-CD3+collagens I and II in the presence of anti-α2 Ab. 93 Figure 6 : Collagen costimulation of IL-17F and IFN-γ production. Cells were activated or not in wells coated with anti-CD3 Ab, BSA, collagen I (Coll I), collagen II (Coll II), collagen IV (Coll IV) and with combinations of anti-CD3 and collagens or anti-CD3 with BSA. After 24 h, cell free supernatants were harvested and the production of (A) IL-17F and (B) IFN-γ was determined by ELISA. Data show mean SD from five independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different blood donors. *p<0.05 between samples activated with anti-CD3+collagens (I and II) and samples activated with anti-CD3 alone or with anti-CD3+collagen IV. 94 Chapitre III : L’intégrine alpha2beta1 costimule les lymphocytes Th17 par les voies de signalisation MAPKinase ERK et p38 ainsi que la voie PI3-K/AKT1 3.1 Résumé Lors d’une étude précédente, nous avons montré que l’intégrine α2β1 est le principal récepteur pour le collagène exprimé par les lymphocytes Th17 humains. Dans la présente étude, nous rapportons que les lymphocytes Th17 expriment également le récepteur à domaine discoïdine 1 (DDR1), mais pas DDR2. Cependant, l’effet costimulateur du collagène sur la production d’IL-17 provient de l’intégrine α2β1 et est indépendant de DDR1. En effet, l’effet costimulateur du collagène est bloqué par un anticorps spécifique contre l’intégrine α2β1 mais pas par la molécule DDR1:Fc. Nos résultats montrent que α2β1 costimule l’expression et la production d’IL-17 en activant la voie MAPK ERK et en augmentant l’activation de la voie MAPK p38 et de la voie PI3 kinase / AKT induite par le récepteur des cellules T (TCR). De plus, nous avons trouvé que le collagène costimule l’expression de RORc et que cela est provoqué par les voies ERK et PI3K/AKT. À l’opposé, bien que STAT3 soit activé par le TCR et l’intégrine α2β1, cette molécule ne régule pas l’expression et la production d’IL-17. Ainsi, notre étude indique l’importance des voies ERK et PI3K/AKT chez les lymphocytes Th17 et confirme l’importance de l’intégrine α2β1 pour la costimulation des lymphocytes Th17. La compréhension plus approfondie des mécanismes qui régulent la costimulation des lymphocytes Th17 par l’intégrine α2β1 pourrait mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies auto-immunes. 1 Article en préparation 95 Alpha2beta1 integrin co-stimulates Th17 cells via ERK, p38 MAPKs and PI3 Kinase/AKT signaling pathways. Marc Boisvert, Jamila Chakir and Fawzi Aoudjit* Centre de recherche en rhumatologie-immunologie, Centre de recherche du CHU de Québec, pavillon CHUL and Faculté de médecine, Université Laval. Key Words: VLA-2 signaling, MAPK, Human Th17, Co-stimulation, Collagen *Corresponding author: Fawzi Aoudjit, Ph.D Professor, Université Laval Centre de Recherche en Rhumatologie et Immunologie 2705 Blvd Laurier, local T1-49 Ste-Foy, Québec G1V 4G2 Canada Tel: (418) 656-4141 (ext. 46071) Fax: (418) 654-2765 E-mail: [email protected] 97 3.2 Abstract We have previously shown that α2β1 integrin is the major collagen-binding integrin expressed on human Th17 cells. Herein, we extend these findings by demonstrating that Th17 cells also express the collagen receptor discoidin domain receptor 1 (DDR1). However, the co-stimulatory effect of collagen is mediated via α2β1 integrin independently from DDR1. Our results show that α2β1 co-stimulates IL-17 expression and production by activating the ERK pathway and by enhancing T cell receptor (TCR)-mediated activation of p38 MAPK and PI3 kinase/AKT. In addition, we found that collagen co-stimulates the expression of RORc and this effect is mediated via ERK and PI3 kinase/AKT. In contrast, although STAT-3 is activated by TCR and α2β1 integrin engagement, it did not regulate IL-17 production. Thus, our study points to the importance of ERK and PI3 kinase/AKT pathways in Th17 cells and further emphasizes the importance of α2β1 integrin in Th17 cell co-stimulation. Further understanding how α2β1 integrin co-stimulates Th17 will likely lead to the discovery of potential therapeutic targets in autoimmune diseases. 99 3.3 Introduction Th17 cells are a novel T cell subset specialized in the production of IL-17. They have been involved in immunity against certain bacteria and fungi and have been associated with the pathogenesis of several autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus, inflammatory bowel disease and multiple sclerosis (reviewed in (1)). High levels of IL-17 have been found in patients affected by these diseases (2–4) and evidence from animal models suggests that Th17 cells are crucial effector cells in the inflammatory response and tissue damage associated with autoimmunity (5–7). Integrins are α/β heterodimeric cell surface receptors, which mediate cell adhesion to the surrounding extracellular matrix (ECM). In addition to cell adhesion, integrins elicit a variety of intracellular signals that regulate cell differentiation, migration and survival (8– 11). Integrin signalling has mainly been studied in anchorage-dependent cells where it has been linked to the activation of Src kinases, MAPK and PI3 Kinase/AKT pathways (10,12). T cells express several ECM receptors among which the very late antigens (VLA-1 to VLA-6) that constitute the β1 subfamily of integrins (13–15). Following T cell activation, these receptors coordinate T cell adhesion and migration through basement membranes and interstitial tissue to reach inflammatory tissues. The collagen-binding integrins α1β1 (VLA-1) and α2β1 (VLA-2) have recently gained more attention as putative regulators of T cell-mediated immunity and inflammation (13,14). They are expressed only on effector T cells, whereas other β1 integrins such as fibronectin and laminin receptors (α4β1 and α5β1; and α3β1 and α6β1 respectively) are also found on naïve T cells. α2β1 binds preferentially collagen I, whereas α1β1 has collagen IV as a preferred ligand (16–18). Growing evidence suggests that α2β1 can be a crucial regulator of autoimmune diseases. α2β1 is expressed on Th1 but not on Th2 cells (19,20) and we have shown that it costimulates IFN-γ production by human effector T cells (21). α2β1 has also been involved in co-stimulation of TCR-dependent proliferation of non-polarized effector T cells (22) and we and others have shown that it reduces activation-induced cell death of effector T cells (23–26). Animal studies with mutant mice and blocking antibodies demonstrated a critical role for α2β1 in the development Th17-dependent autoimmune diseases including multiple 101 sclerosis and rheumatoid arthritis. Importantly, we have recently reported that α2β1 is the major collagen-binding integrin expressed on human effector Th17 cells (27). TCRactivation of Th17 cells induces their attachment via α2β1 to collagen I and II, and both types of collagen co-stimulates TCR-dependent IL-17 production (27). The mechanisms involved in the regulation of human IL-17 are still poorly explored. Thus, based on the above studies which emphasize the importance of α2β1 in Th17 cells and autoimmunity, we sought to understand the signaling pathways by which α2β1 enhances IL-17 production. In this study, we provide evidence that α2β1 co-stimulates IL-17 production by activating the ERK and p38 MAPKs as well as PI3 Kinase / AKT. Furthermore, α2β1 also co-stimulates the expression of RORc; a master regulator of IL-17, via ERK and PI3 Kinase / AKT. These results provide further insights in the regulation of IL-17 and may lead to the identification of therapeutic targets. 102 3.4 Materials and methods 3.4.1 Antibodies and reagents TGF-β, IL-1β, IL-6, IL-23 were from R&D Systems (Minneapolis, MN). Collagen type II was purchased from Elastin Product Company, Inc (Owensville, MO). CD3 and CD3/CD28 dynabeads were from Invitrogen dynal AS (Oslo, Norway). The MEK1/2 inhibitor U0126, the JNK/MAPK inhibitor SP600125, the p38/MAPK inhibitor SB203580 and PI3K/AKT inhibitor LY294002 were from Calbiochem (San Diego, CA). The antiphospho-ERK1/2 mAb (E-4), anti-ERK2 antibody (C-14), anti-Actin (C-2) anti-DDR1 (C20) and anti-DDR2 (H-108) were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). The anti-phospho-JNK1/2 antibody (G9), anti-JNK2 antibody (#9252), anti-phospho-p38 (#9216) antibody, anti-phospho-AKT (#9271) antibody and anti-AKT (#9272) were from Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). The Alexa 488-conjugated anti-rabbit antibody was from Life Technologies. The blocking DDR1:Fc recombinant protein was purchased from R&D systems, (Minneapolis, MN). 3.4.2 Isolation of human naïve CD4 T cells and differentiation of Th17 Peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy adult volunteers on Ficoll gradients. Consent form was obtained from volunteers and the ethical committee of Laval University approved the study. Primary human naïve CD4+ T cells were then purified by negative selection using magnetic beads (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) according to the manufacturer's instructions. Th17 cells were then generated by activating naïve CD4+ T cells for 6 days with anti-CD3/CD28 dynabeads (1 bead/cell) in X-Vivo 15 medium (Lonza, Switzerland) without serum in the presence of TGF-β (10 ng/ml), IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml) and IL-23 (100 ng/ml). As we previously reported (27), the cells express the transcription RORc, the IL-23 receptor, CCR6 and produce IL-17 upon activation. 3.4.3DDR expression and IL-17 intracellular staining Expression of DDR1 and DDR2 on the surface of Th17 cells was determined by flow cytometry analysis using anti-DDR1 staining flowed by an anti-rabbit-conjugated antibody staining. For IL-17 intracellular staining, Th17 cells were activated or not with PMA (50 103 ng/ml) and ionomycin (1 µM) for 12 hours in the presence of 5 µg/ml of GolgiPlug containing brefeldin A (BD Bioscicences). The cells were then washed, permeabilized with a CytoFix/CytoPerm kit (BD Biosciences) and first stained with anti-DDR1 or anti-DDR2 Ab for 30 minutes, followed by a staining with Alexa-488-conjugated anti-rabbit antibody. After three washes, the cells were stained for intracellular IL-17 using an Alexa-647conjugated anti-IL-17 Ab (Clone N49-653; BD Biosciences). Stained cells were then analyzed by flow cytometry using a BD FACSCalibur. 3.4.4Real-Time RT-PCR analysis Total RNA was extracted with illustra RNAspin Isolation Kit according to the manufacturer’s instructions (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). First strand cDNA was prepared from 1µg of total RNA using the Thermoscript system (Invitrogen, Carlsbad, CA). The IL-17, RORc and α-actin transcripts were amplified by real-time RTPCR as described (28) using previously described IL-17 and RORc primers (29) and βactin primers (30). Quantitative PCR reaction were done with 1 µl of cDNA in a total volume of 20 µl containing SYBR® Green I (Invitrogen, Carlsbad, CA) and were carried out in a RotorGene 3000 operated with Rotor-Gene Software 9 version 6.0.19 (Corbett Research, Mortlake, NSW Australia). The amplification for each gene was measured using 30 cycles (94°C for 17 sec, 58°C for 25 sec and 72 °C for 25 sec). Reaction specificity was verified by performing the Melts® procedure (60–99°C; 1°C/4 s) at the end of the amplification according to the manufacturer’s protocol. Each sample has been normalized to the level of α-actin and fold increase was evaluated using cycle threshold (Ct) values as previously described (28). 3.4.5 Th17 cell activation experiments and IL-17 expression Th17 cells (3x106 in 2 ml of X-vivo 15 medium) were activated for 4 h in wells coated or not with 2 µg/ml of anti-CD3 mAb, 1 µg/ml of collagen matrices or in wells coated with a combination of anti-CD3 and collagens. The anti-CD3 mAb was coated overnight at 4 °C whereas collagen matrices were coated for 2 h at 37°C. As a control, the wells were also coated with BSA. For DDR1:FC studies, collagen was first incubated with DDR1:Fc or with control IgG and then coated in wells as we previously described (31). After 104 activation, the cells were then harvested and total RNA extracted. The levels of IL-17, RORc and β-actin mRNA were evaluated by Real-Time PCR. For IL-17 protein levels, Th17 cells (2,5x105 in 100µl of X-Vivo 15 medium) were activated for 24 h in wells coated with anti-CD3 mAb, collagen or anti-CD3mAb+collagen. After cellular activation, cell free supernatants were harvested and the production of IL-17 was measured using specific ELISA kits from R&D systems (Minneapolis, MN) according to the manufacturer’s instructions. 3.4.6 Immunoblotting, activation of MAPKs, AKT and STAT3 Th17 cells (2x105 in 100µl of X-Vivo 15 medium) were stimulated for 1 hour as described above. Then cells were harvested, washed in cold PBS and cell lysates were prepared in RIPA buffer containing protease and phosphatase inhibitors as we previously described (23). Activation of ERK, JNK, p38, AKT and STAT3 were determined by immunoblot analysis using specific antibodies that recognize the phosphorylated forms of human ERK1/2, JNK1/2, p38, AKT and STAT3. The blots were stripped and reprobed with control antibodies as indicated to ensure equal loading. In all experiments, immunoblots were visualized using an HRP-conjugated secondary antibody followed by enhanced chemiluminescence’s detection (Pierce, Rockford, IL). Statistical analysis Statistical analysis was performed by the student’s t-test. Results with p<0.05 were considered significant. 105 3.5 Results 3.5.1 The costimulatory effect of collagen is mediated via β1 integrin independently from the discoidin domain receptors. We have recently reported that α2β1 integrin is the major collagen-binding integrin expressed by human Th17 cells (27). We and others also demonstrated that activated human T cells can express discoidin domain receptor 1 and 2 (DDR1-2) (31,32). Thus we sought to examine if DDR is expressed in Th17 cells and if it is involved in the costimulator effect of collagen. Double staining flow cytometry analysis indicates that the majority of IL-17 producing human Th17 cells express DDR1 but not DDR2 (Fig 1A). We then examined the possible implication of DDR1 in Th17 cell costimulation by collagen. As shown in Fig 1B, collagen increases anti-CD3-induced IL-17 production by two fold. This effect is completely abolished by anti-α2β1 blocking antibody but not by the recombinant protein DR1:Fc, which has been shown to block DDR1-collagen interactions. Together these results indicate that although DDR1 is expressed on human Th17 cells but it does not participate in collagen costimulation, which dependent via α2β1 integrin. 3.5.2 α2β1 integrin co-stimulates IL-17 via ERK and p38 MAPK. Integrin signaling is known to activate the MAPK pathways and therefore we examined the implication of ERK, p38 and JNK in collagen co-stimulation of IL-17. To this end, we used specific inhibitors for each MAPK (U0126 for ERK; SB203580 for p38 and SP600125 for JNK). Treatment of Th17 cells with U0126 and SP600125 almost completely abolished anti-CD3-induced increase in IL-17 mRNA (Fig 2A) and protein levels (Fig 2B). Similarly both U0126 and SP600125 inhibitors abolished the production of IL-17 in cells activated with anti-CD3+collagen. However, treatment of cells with the SB203580 inhibitor had no effect on anti-CD3-induced IL-17 production but significantly reduced the co-stimulatory effect of collagen (Fig 2C). No differences in cell viability and cell proliferation were noticed among the different samples after 24 h of treatment (data not shown). We then examined how collagen modulates MAPK activation in human Th17 cells. We found that collagen alone increases ERK phosphorylation approximately by 3 to 4 fold (Fig 3A). It also increases ERK phosphorylation in anti-CD3 activated Th17 cells by almost two fold (Fig 3A). In contrast collagen had no effect on JNK activation and did not 106 co-stimulate anti-CD3-induced JNK phosphorylation in Th17 cells (Fig 3B). Finally, we found that CD3 is a weak inducer of p38 phosphorylation and although collagen by itself did not stimulate p38 phosphorylation it did increase by 2-3 fold activation of p38 in Th17 cells activated with anti-CD3 (Fig 3C). Together these results indicate that JNK and ERK are essential for anti-CD3 induced IL-17 production, and that α2β1 integrin co-stimulates IL-17 production by increasing the activities of ERK and p38 MAPKs. 3.5.3 α2β1 integrin weakly co-stimulates the PI3 Kinase /AKT pathway. We then examined the implication of PI3 kinase/AKT pathway in the production of human IL-17. We found that the specific inhibitor LY294002 completely blocks the production of IL17 elicited by anti-CD3 and by anti-CD3+collagen (Fig 4A&B). The levels of both IL17 mRNA and protein were impaired by the LY294002 inhibitor. We then assessed how collagen regulates AKT activation. As shown in Fig 4C, collagen did not activate AKT but it slightly increase phosphorylation of AKT in anti-CD3-activated Th17 cells indicating that collagen could also co-stimulate IL-17 production via the PI3 kinase/AKT pathway. 3.5.4 Collagen costimulates RORc in human Th17 cells. RORc is the master regulator of IL-17 gene transcription and differentiation (33). Activation of Th17 cells increases RORc expression, which then enhances IL-17 gene transcription. We therefore sought to determine how collagen regulates expression of RORc in human Th17 cells. Our results show that anti-CD3 treatment of human Th17 cells increases by the levels of RORc mRNA (Fig 5A). A significant 1.5 fold increase is observed after 2 h of treatment and reaches a two-fold increase between 4 and 8 h of treatment after 2 to 4 h of treatment (Fig 5A). The kinetic of RORc expression is consistent with that of IL-17 mRNA expression, which starts to accumulate between 4-8 h of antiCD3 treatment. Interestingly, collagen had no effect on ROrc mRNA levels but significantly co-stimulates anti-CD3 effect. The effect of collagen (2 fold) is observed at 24 h and to a less extent at 8 h of anti-CD3 treatment (Fig 5A). We then examined how MAPKs and PI3 kinase/AKT regulate the expression of RORc in human Th17 cells. The ERK and PI3 kinase/AKT inhibitors abolish the expression of RORc elicited by anti-CD3 and anti-CD3+collagen. However, the JNK inhibitor, which also blocks IL-17 expression, and the p38 inhibitor, which blocks the co-stimulatory effect of collagen on IL-17 107 expression, had no effect on the levels of RORc mRNA levels (Fig 5B). Together these studies indicate that the ERK and PI3 kinase/AKt pathways are essential for RORc expression and that collagen costimulates RORc mRNA levels likely via the ERK, AKT pathways and independently from the p38 MAPK. 3.5.5 STAT3 is not involved in IL-17 production. Since STAT3 has been involved in the differentiation of IL-17 (34,35), we sought to examine its implication in the regulation of human IL-17. We used the specific STAT3 inhibitor and found that it did not impair anti-CD3- or anti-CD3+collagen-induced IL-17 production (Fig 6A) despite the fact that anti-CD3 and collagen increases STAT3 phosphorylation (Fig 6B). As a control, the STAT3 inhibitor completely abolished phosphorylation of STAT3 elicited by IL-7 (data not shown). Together these results indicate that STAT3 is dispensable for IL-17 production downstream of the T cell receptor and integrin α2β1. 108 3.6 Discussion Growing evidence suggest that T cell interactions with extracellular matrix are critical in inflammation and tissue damage. We have previously shown that α2β1 is the major collagen-binding integrin expressed on human Th17 cells and its ligation with collagen costimulated IL-7 production. In this study we have shown that α2β1 integrin promotes Th17 co-stimulation by enhancing ERK and p38 MAPK and PI3 kinase /AKT pathways. In addition, we found that α2β1 integrin co-stimulates the expression of RORc, the transcriptional regulator of IL-17, through ERK and AKT pathways. In addition to integrins, discoidin domain receptors, which are trans-membrane tyrosine kinase receptors can also serve as collagen receptors (31,36). Herein, we show that Th17 cells express the collagen receptor DDR1 but not DDR2. However, our results indicate that the co-stimulatory effect of collagen in Th17 cells is independent from DDR1 and relies solely on α2β1 integrin. A previous study showed that DDR1 can co-stimulate primary T cells to produce interferon-γ suggesting that DDR1 can provide T cell co-stimulation in a cytokine specific-manner (37). However, we found that DDR1 did not participate in the co-stimulatory effect of collagen on the production of interferon-γ by human Th17 cells (data not shown). Thus, it is possible that DDR1 could function as a co-stimulatory molecule in primary but not in effector T cells. The signaling pathways involved in the regulation of IL-17 expression are still poorly understood. Herein, we demonstrate that ERK and JNK MAPKs are essential in TCRdependent expression of IL-17 by human Th17 cells. In addition, ERK is also involved in the increased levels of RORc, and α2β1 integrin mediated co-stimulation of RORc and IL17 is associated with increased ERK activation, further strengthening the role of ERK in human Th17 cells. These results support previous findings showing that both ERK and JNK MAPKs are involved in the activation of human IL17 promoter in Jurkat T cells activated by anti-CD3+anti-CD28 (38). In addition, osteopontin-induced IL-17 production in mice also requires activation of JNK (39). However, other studies reported that ERK could negatively regulate the production of IL-17. In this regard, it has been shown that pharmacologic inhibition of the MEK/ERK pathway enhances Th17 differentiation and IL17 production (40). Similarly, berberine, an alkaloid derivative was found to affect Th17 differentiation by activating ERK MAPK in mice, which resulted in the prevention of type 109 I diabetes in mice (41). Together these studies indicate that ERK could modulate IL-17 in a specie specific manner. Activation of p38 MAPK has been involved in the expression of mouse IL-17 and in the regulation of EAE (42). However our results indicate that it is not the case for human IL17 in response to TCR/CD3 engagement. We showed that the pharmacological inhibitor did not affect IL-17 production and also had no effect on the expression of RORc. Although we found that α2β1 integrin co-stimulates the expression of IL-17 but not of RORc by increasing p38 MAPK activation. These results suggest that p38 MAPK is likely to be important for the expression of both human and mouse IL-17. The fact that α2β1 integrin has been shown to regulate the development of EAE strongly suggest that it did so by increasing the production of IL-17 through the p38 MAPK pathway. Our results also show that the PI3 kinase/AKT pathway is necessary for the expression of human IL-17 upon TCR engagement and α2β1 integrin-mediated co-stimulation is associated with increased AKT phosphorylation. These results are in agreement with previous studies in human and mouse (43,44). We found that PI3 kinase/AKT signaling could participate in IL-17 production by increasing the levels of RORc. Kubayeshi et al showed that it does so by negatively regulating Gfi1 expression (negative regulator of IL17) and by inducing the translocation of RORγt to the nucleus (43). We have not examined in details the transcription factors that regulate IL-17 expression. The ERK, JNK and p38 can regulate several transcription factors such as AP-1 and c/EBP, c-Maf. In addition, PI3 Kinase/AKT can also regulate NFκB, which has been involved in IL-17 regulation (45). However, our study identified that ERK and PI3 kinase/AKT pathways are critical for RORc expression, which thus underlies how these pathways can regulate human IL-17 following TCR activation and α2β1 integrin co-stimulation. In contrast, although STAT3, which has been involved in IL-17 production (34,35), is activated downstream TCR and α2β1 integrin, it did not regulate human IL-17 production. Integrin mediated attachment to ECM leads to the activation of several signaling pathways including MAPK and PI3 kinase/AKT (46,47). Our results indicate that α2β1 integrin on its own activates ERK MAPK. This is in agreement with our previous studies performed in Jurkat T cells (48) and in human non-polarized effector T cells (21). However, engagement 110 α2β1 integrin did not activate JNK, p38 or AKT but significantly co-stimulated p38 and AKT activation. The α2β1 integrin can enhance TCR/CD3 signaling by promoting its localization and aggregation in lipid rafts. Interestingly, α2β1 integrin has been shown to localize in lipid rafts upon collagen stimulation of Jurkat T cells (15). It is also likely that α2β1 integrin up-regulates the activities of downstream molecules involved in TCR/CD3 signalling, leading to the synergistic activation of p38 and PI3 Kinase/AKT and in the subsequent augmentation of IL-17 production. A model by which α2β1 integrin cooperates with TCR/CD3 signalling in human Th17 cells is depicted in figure 7. A recent study showed using human Th clones that TCR/CD3 signaling is weaker in Th17 compared to Th1 cells and is correlated with the differential production of IL-2 and proliferation of the two T cell subsets (49). In addition, TCR signaling was reported as a weak inducer of IL-17 suggesting the need for co-stimulation (49). Thus, our results further underscore the importance of α2β1 signaling in Th17 cell activation. Along these lines, α2β1 integrin has been involved in the development of Th17-mediated inflammatory diseases such as EAE (50) and rheumatoid arthritis (51,52). Further understanding of α2β1 integrin signaling in Th17 cells is likely to lead to the discovery of potential therapeutic targets in autoimmune diseases. Acknowledgements This work was supported by research grants from the NSERC and the Arthritis Society of Canada to FA. 111 3.7 Figure and legends Figure 1 : Collagen co-stimulatory effect does not require DDR1 or DDR2. (A) Expression of DDR1 and DDR2 on human Th17 cells was determined by immunostaining and FACS analysis. Th17 cells were stimulated for 12 hours by CD3/CD28 dynabeads in presence of 5µg/ml of brefeldin A. The cells were then fixed and permeabilized using the cytofix/cytoperm kit from BD biosciences according to manufacturer’s instructions. The cells were then stained with isotypic antibodies or with antibodies against DDR1 or DDR2 followed by IL-17 staining and analyzed by flow cytometry as described in the “Materiel and Methods” section. (B) The cells were stimulated with anti-CD3 mAb in presence or absence of collagen. As indicated, the cells were preincubated for 1 h with isotypic antibody or anti-α2β1 blocking antibody. For DDR1:Fc experiments, the cells were activated with coated anti-CD3 mAb (CD3) in wells coated with collagen (CII) that has been pre-incubated with DDR1:Fc (50 µg/ml). After 24h of stimulation, cell supernatants were harvested and IL-17 production was evaluated by ELISA assay. The results in (A) are representative of five experiments performed with T cells isolated from five different blood donors. The results in (B) are presented as mean values ( SD) from five independent experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different blood donors. * p<0.05 as indicated. 112 Figure 2 : Collagen costimulates IL-17 expression via ERK and p38 MAPK. Th17 cells were stimulated with 1 µg/ml of coated anti-CD3 in presence or absence of 2 µg/ml of coated collagen (CII). Specific inhibitors of MAP kinases (U0126 (U) for the ERK inhibitor; SP600125 (SP) for the JNK inhibitor and SB203580 (SB) for the p38 inhibitor) were added at 20 µM for 1 h prior to cell stimulation. (A) IL-17 mRNA levels were determined by qRT-PCR and the results are presented as fold increase normalized with β-actin. (B) The levels of IL-17 were determined by ELISA assay. The results in (A) and (B) represent mean values ( SD) from five different experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different donors. * p<0.05 as indicated. 113 Figure 3 : Collagen activation of ERK, JNK and p38 MAPKs. The cells were activated with coated anti-CD3, collagen (CII) or with anti-CD3+collagen for 1h. The cells were lysed and activation of ERK (A), JNK (B) and p38 (C) was determined by immunoblot analysis using sepcifi antibodies recognizing the phosphorylated forms. The blots were stripped and reprobed with anti-ERK-2 or with anti-β-actin antibody as indicated to ensure equal loading. Representative immunoblots from three independent experiments are shown in the left panels. The right panels represent densitometric quantification of relative increase in ERK, JNK and p38 phosphorylation. The results are mean values from three independent experiments ( SD) and are expressed as fold increase of the ratio between total phospho-ERK1/2 and ERK2, phosphoJNK1/2 and β-actin, and phospho-p38 and β-actin. * p<0.05 as indicated. 114 Figure 4 : Collagen co-stimulation of IL-17 involves the PI3 Kinase/AKT pathway. Th17 cells were stimulated with 1 µg/ml of coated anti-CD3 (CD3) in presence or absence of 2 µg/ml of coated collagen (CII). The LY294002 (LY) a specific inhibitor for PI3 Kinase/AKT was added at 20 µM 1h prior cell stimulation. (A) IL-17 expression was determined by qRT-PCR. (B) IL-17 production was determined by ELISA assay. (C) AKT activation was evaluated by immunoblot analysis using an antibody recognizing the phosporylated form of AKT. The membrane was stripped and reprobed with anti- directed against total AKT to ensure equal loading. The lower panel represent densitometric quantification of relative increase in AKT phosphorylation. The results in (A) and (B) represent mean values ( SD) from five different experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different donors. The results in (C) are mean values from three independent experiments ( SD) and are expressed as fold increase of the ratio between total phospho-AKT and total AKT. * p<0.05 as indicated. 115 Figure 5 : Collagen co-stimulates the expression of RORc via MAPK/ERK and PI3 kinase/AKT. (A) Th17 cells were stimulated for 1, 2, 4 and 8 hours with or without anti-CD3 antibody (CD3) in presence or absence of collagen (CII). Cells were harvested and total RNA was amplified as described in the materials and methods section. RORc expression was evaluated by qRT-PCR normalized to β-actin expression. (B) Th17 cells were stimulated for 4 h with anti-CD3, collagen or with anti-CD3+collagen in the presence or absence of specific inhibitors for MAP Kinases or PI3 Kinase/AKT as indicated. The results represent mean values ( SD) of fold increase from five different experiments performed in triplicates with T cells isolated from five different blood donors. * p<0.05 as indicated. 116 Figure 6 : STAT3 activation is not required for IL-17 co-stimulation by collagen. (A) Th17 cells were stimulated with 1 µg/ml of coated anti-CD3 (CD3) in presence or absence of 2 µg/ml of coated collagen (CII). Specific STAT3 inhibitor (S31-201) was added 1 h prior of stimulation as indicated. The production of IL-17 was determined by ELISA and results are presented as pg/ml for the production of the cytokine. (B) Activation of STAT3 was evaluated by immunoblot analysis using an antibody against the phosphorylated form of STAT3. The membrane was stripped and reprobed with anti-β-actin antibody to ensure equal loadings. The lower panel represent densitometric quantification of relative increase in STAT3 phosphorylation. The results in (A) are presented as mean values from three independent experiments performed in triplicates with T cells from three different blood donors.The results in (B) are mean values from three independent experiments ( SD) and are expressed as fold increase of the ratio between phosphoSTAT3 and β-actin. * p<0.05 as indicated 117 Figure 7 : Model of cooperation between α2β1 integrin and TCR/CD3 signalling in human Th17 cells. 118 3.8 References 1. Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 2009;27:485‑517. 2. Crispín JC, Oukka M, Bayliss G, Cohen RA, Van Beek CA, Stillman IE, et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol Baltim Md 1950. 15 déc 2008;181(12):8761‑8766. 3. Lock C, Hermans G, Pedotti R, Brendolan A, Schadt E, Garren H, et al. 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Toutefois, l’expression et la fonction du récepteur à domaine discoïdine 1 (DDR1) chez les lymphocytes T sont encore mal connues. Nous avons récemment montré que l’activation de lymphocytes T primaires via le récepteur des cellules T (TCR) mène à une augmentation de l’expression de DDR1, qui favorise alors leur migration dans le collagène tridimensionnel. Dans la présente étude, nous faisons la preuve que les lymphocytes T activés lient le collagène grâce à DDR1. Nous avons trouvé que la molécule chimérique bloquante DDR1:Fc réduit significativement la capacité des lymphocytes T activés de lier le collagène biotinylé soluble. Cependant, DDR1:Fc n’a aucun effet sur l’adhésion au collagène des lymphocytes T activés et la surexpression de DDR1 chez les cellules Jurkat n’augmente pas leur adhésion. Ces résultats indiquent que DDR1 peut favoriser la migration des lymphocytes T sans augmenter leur adhésion au collagène, ce qui suggère qu’il puisse contribuer au mouvement amiboïde des lymphocytes T activés dans les matrices de collagène. Nos résultats montrent également que le CD28, contrairement à l’expression d’IL-2, ne costimule pas l’expression de DDR1 chez les lymphocytes T primaires. À l’aide d’inhibiteurs chimiques spécifiques, nous avons démontré que l’expression de DDR1 induite par le TCR est régulée par la voie Ras/Raf/ERK MAP Kinase ainsi que PKC mais pas par la voie du calcium ni par les MAP Kinases JNK and p38. Ainsi, notre étude propose de nouvelles perspectives sur la physiologie de DDR1 chez les lymphocytes T et contribue à approfondir notre compréhension des mécanismes qui régulent la migration des lymphocytes T. 123 Discoidin domain receptor 1 expression in activated T cells is regulated by the ERK MAP kinase signaling pathway Nizar Chetoui, Mohammed-Amine El azreq, Marc Boisvert, Marie-Ève Bergeron and Fawzi Aoudjit* Centre de Recherche en Rhumatologie-Immunologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Pavillon CHUL, and Faculté de Médecine, Université Laval 2705 Blvd Laurier, Local T1-49, Québec, QC, Canada G1V 4G2 *Corresponding Author: Fawzi Aoudjit, Ph.D Centre de Recherche en Rhumatologie et Immunologie CHUQ, Pavillon CHUL 2705 Blvd Laurier, local T1-49 Ste-Foy, Quebec G1V 4G2 Canada Tel: 1- (418) 656-4141 (ext. 46071) Fax: 1- (418) 654-2765 E-mail: [email protected] Running head: ERK MAPK regulates DDR1 expression in T cells. Key words: T cell, discoidin domain receptor, cell signaling, ERK MAPK, Collagen I binding. Grant support: This work was supported by grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) to FA. MB holds a scholarship from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ). 125 4.2 Abstract The expression and function of discoidin domain receptor 1 (DDR1) in T cells are still poorly explored. We have recently shown that activation of primary human T cells via their T cell receptor leads to increased expression of DDR1, which promoted their migration in three-dimensional collagen. In the present study, we provide evidence that activated T cells bind collagen through DDR1. We found that the DDR1:Fc blocking molecule significantly reduced the ability of activated T cells to bind soluble biotinylated collagen. However, DDR1:Fc had no impact on the adhesion of activated T cells to collagen and overexpression of DDR1 in Jurkat T cells did not enhance their adhesion. Together, our results indicate that DDR1 can promote T cell migration without enhancing adhesion to collagen, suggesting that it can contribute to the previously described amoeboid movement of activated T cells in collagen matrices. Our results also show that CD28, in contrast to IL2 expression, did not costimulate the expression of DDR1 in primary human T cells. Using specific inhibitors, we demonstrated that TCR-induced expression of DDR1 in T cells is regulated by the Ras/Raf/ERK MAP Kinase and PKC pathways but not by calcium/calcineurin signaling pathway or the JNK and P38 MAP Kinases. Thus, our study provides additional insights into the physiology of DDR1 in T cells and may therefore further our understanding of the regulatory mechanisms of T cell migration. 127 4.3 Introduction Cell migration is essential for development, wound healing and immune response and surveillance. After transendothelial migration, activated T lymphocytes reach target inflammatory sites by migrating through the extracellular matrix (ECM) of the basement membrane and the interstitial tissue that are rich in collagens. Beta1 (β1) integrins are major receptors in mediating cellular interactions with ECM components [Barreiro et al., 2010; von Andrian and Mackay, 2000]. Recent studies have shown that lymphocytes migrate in three-dimensional (3D) collagen using the amoeboid movement resembling that of amoeba dictyostelium Discoideum and zebrafish germ lines independently from β1 integrins and strong adhesive forces [Friedl et al., 1998; Nourshargh et al., 2010; Schmidt and Friedl, 2010]. This amoeboid movement also applies to other leukocytes as integrin blockade with antibodies or genetic ablation of integrin subunits did not affect migration of dendritic cells and monocytes in 3D collagen and in interstitial tissues [Lammermann et al., 2008]. In addition to β1 integrins, mammalian cells also express additional collagen receptors. Discoidin domain receptors (DDR1 and DDR2) are non-integrin tyrosine kinase transmembrane receptors that bind different types of collagen [Heino et al., 2009; Vogel et al., 2006]. DDR1 is expressed as five isoforms (a-e) and is found in many epithelial and carcinoma cells, whereas DDR2 (no isoform) is found in cells with mesenchymal origin such as fibroblasts and smooth muscle cells. DDRs have been reported to control cell adhesion to collagen, ECM remodelling, proliferation and development. With regard to cell migration, DDR1a/b have been shown to enhance the haptotactic response of vascular smooth muscle cells towards collagen and the motility of NIH3T3 and MCF-7 cells in 2D collagen [Hou et al., 2002; Huang et al., 2009; Lu et al., 2010]. The expression and function of DDRs are still poorly explored especially in leukocytes. In this regard, we have recently shown that DDR1 is induced in T cell receptor (TCR)- activated human T cells and that it participated in their migration in 3D collagen [Hachehouche et al., 2010]. Furthermore, a previous study also reported that overexpression of DDR1 in the monocytic cell line THP-1 enhanced their migration in 3D collagen [Kamohara et al., 2001]. Despite these findings, it remains unknown how DDR1 promotes T cell interactions with collagen. In addition, although TCR-engagement [Hachehouche et al., 2010] or phytohemagglutinin A [Dang et 129 al., 2009; Kamohara et al., 2001] enhance DDR1 expression in human primary T cells, the signaling pathways that regulate DDR1 expression in T cells have not yet been identified. The engagement of TCR/CD3 complex activates several proximal signaling events that culminate into the activation of intracellular pathways that regulate cytokine gene expression and T cell activation [Lin and Weiss, 2001]. TCR/CD3 engagement activates phospholipase Cγ1 (PLCγ1) which leads to the synthesis of second messengers such as diacylglycerol (DAG) and inositol 1,4,5-triphosphate (Ins(1,4,5)P3). DAG activates various isoforms of Protein Kinase C (PKC), while Ins(1,4,5)P3 contributes to the elevation of the intracellular calcium (Ca2+) levels by releasing Ca2+ stores from the endoplasmic reticulum and by stimulating the opening of plasmic membrane Ca2+ pores leading to the calcium extracellular influx. Calcineurin, a phosphatase activated by intracellular Ca2+, dephosphorylates the transcription factor NF-AT, which subsequently translocates to the nucleus where it stimulates the transcription of several genes implicated in the immune response. Both PKC and DAG activate the small GTPase Ras, which leads to the activation of ERK, JNK and P38 MAP kinases, resulting in the activation of several transcriptional factors involved in gene expression [Lin and Weiss, 2001]. Optimal T cell activation also requires signals delivered by costimulatory molecules. CD28 is a crucial costimulatory molecule and its engagement enhances TCR signaling and activates the PI3 kinase/AKT pathway, which is important for the activation of the transcription factor NF-kappaB (NFκB) [Lin and Weiss, 2001]. In the present study, we demonstrate that activated T cells bind collagen type I (collagen I) in a DDR1-dependent fashion. Cell adhesion assays indicate that DDR1 does not promote T cell adhesion to collagen I suggesting that DDR1 regulates T cell migration by promoting the amoeboid movement. We also show that TCR-induced DDR1 expression in activated T cells depends on the ERK/MAP Kinase signaling pathway and requires the activation of PKC. Other signaling pathways such as JNK and P38 MAP kinases, or Ca2+/Calcineurin pathway seem not to be essential. Together, these results provide new insights into the expression and function of DDR1 in activated T cells and may therefore further our understanding of T cell migration. 130 4.4 Materials and Methods 4.4.1 Antibodies and reagents The anti-CD3 Antibody (Ab) (OKT3), anti-CD28 (clone CD28.2) and control immunoglobulin (IgG) were from BD Biosciences (San Diego, CA). The anti-DDR1 (c-20) and anti-actin (C-2) Abs were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). The MEK1/2 inhibitor U0126, the p38 inhibitor SB 203580, the JNK inhibitor SP600125, the PKC broad range inhibitor GF109203X (Bisindolylmaleimide I) and the calcineurin specific inhibitor cyclosporine-A were from EMD biosciences (San Diego, CA). Collagen type I was purchased from Sigma (St-Louis, Mo). The blocking DDR1:Fc recombinant protein was purchased from R&D systems, (Minneapolis, MN). 4.4.2 T cell isolation and activation Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy adult volunteers were isolated on Ficoll gradients. T cells were then purified using T cell enrichment columns (R&D systems) according to the manufacturer's instructions. The participating volunteers signed a consent form and the ethical committee of Laval University approved the study. Staining with anti-CD3 and flow cytometry analysis indicated that more than 97% of the isolated cells were CD3-positive T cells. Primary T cells (106/ml) in RPMI containing 2.5% FBS were stimulated in 6 well-plates with 5 µg/ml of coated anti-CD3 Ab or with a combination of 5 µg/ml of anti-CD3 and 10 µg/ml of soluble anti-CD28 Abs. 4.4.3 Collagen I binding analysis Collagen I was biotinylated as previously described [Holleran et al., 2003]. T cells (5x105) were cultured with 20 µg/ml of soluble biotinylated collagen I at 37 oC. Where indicated, biotinylated collagen I was preincubated with 20 µg/ml of DDR1:Fc recombinant protein (R&D systems, Minneapolis, MN) or with control IgG for 4 h at 4°C before adding it to the cells. After 1 h of incubation with collagen I, the cells were pelleted, washed three times with PBS and incubated for 40 min at room temperature with phycoerythrin (PE)conjugated streptavidin. After washing with PBS, labeled cells were analyzed by flow cytometry using FACScan (BD Biosciences). 131 4.4.4 Cell adhesion assay Cell adhesion assays were performed in 96-well plates as we previously described [Boisvert et al., 2010]. A 96-well microtiter plate (TC plate, flat bottom, Falcon) was coated with 20 µg/ml of collagen I in PBS overnight at 4°C. The wells were then washed with PBS and non specific sites were blocked for 1 hour at 37°C with 1% BSA. Where indicated, collagen I was incubated for 4 hours with DDR1:Fc or control IgG at 4 °C before being coated in wells. 105 cells in 100 µl of RPMI were added to the wells and were incubated for 1 hour at 37°C. After their attachment, the cells were washed with PBS and fixed in a PBS solution containing 1% formaldehyde for 1 hour at room temperature. The cells were then washed with PBS and stained with a methanol solution containing 0.5 % crystal violet. After several washes with PBS, the cells were lysed in a 1% SDS solution and the absorbance at 650 nm determined by an ELISA plate reader. 4.4.5 Plasmids and Jurkat T Cell transfection The human Jurkat T-cell line E6.1 was obtained from ATCC (Manhasset, VA) and maintained in complete RPMI 1640 medium containing 10% FBS, 2 mM glutamine and 100 units/ml penicillin and streptomycin. The plasmid encoding the kinase dead form of DDR1a in which a lysine was mutated to alanine in the catalytic domain (K618A plasmid) was a gift from Dr Wolfgang Vogel (Toronto University) [Vogel et al., 2000]. DDR1K618A plasmid or empty control plasmid were transfected in Jurkat T cells by electroporation at 250 V and 960 µF settings using a Bio-Rad electroporator as we previously described [Gendron et al., 2003]. One day after transfection, dead cells were removed by a ficoll/hypaque gradient and the remaining cells cultured for another day before being used in subsequent experiments. 4.4.6 Immunoblot analysis After stimulation, the cells were washed in cold PBS and lysed in RIPA buffer containing protease and phosphatase inhibitors. Cell lysates were subjected to SDS-PAGE and analyzed by immunoblot using specific antibodies. The blots were stripped and reprobed with control anti-actin Ab to ensure equal loading. In all experiments, immunoblots were visualized using an HRP-conjugated secondary antibody followed by enhanced chemiluminescence’s detection (Pierce, Rockford, IL). 132 4.4.7 RT-PCR analysis Total RNA was extracted with Trizol reagent according to the manufacturer’s instructions (Invitrogen, Carlsbad, CA). First strand cDNA was prepared from 1 µg of total RNA using the Thermoscript RT-PCR system from Invitrogen (Carlsbad, CA). IL-2 and β-actin transcripts were amplified by PCR using specific primers previously described [Gendron et al., 2005]. PCR reactions were done with 1U Taq polymerase in a total volume of 50 µl, and amplifications were carried out in a Peltier Thermal Cycler from MJ Research. 10 µl from the reaction mixture was size-separated on a 2% agarose gel, and specifically amplified products were detected by ethidium bromide and UV illumination. Statistical analysis Statistical analysis was performed using paired Student’s t-test. Results with P < 0.05 were considered significant. 133 4.5 Results 4.5.1 DDR1 expressed by activated T cells binds collagen I. We have recently shown that activation of human primary T cells through T cell receptor (TCR/CD3) induced the expression of DDR1, which enhanced their migration in 3D collagen [Hachehouche et al., 2010]. As cell contact with ECM is necessary for cell movement, we examined if activated T cells bind collagen I through DDR1. To this end, we assessed the role of DDR1 in the ability of T cells to bind biotinylated collagen I. Our preliminary studies showed that maximal collagen binding is observed after 48 h activation with anti-CD3 and therefore, analysis of collagen binding to activated T cells was examined at this time. Flow cytometry analysis (Figure 1A left panel) revealed that activated T cells, compared to non-activated cells binds biotinylated collagen I. Quantification of collagen binding indicates that between 20 to 25% of anti-CD3-activated T cells bind collagen I whereas less than 5% of non-activated T cells display collagen I binding (Fig.1A, right panel). Pretreatment of biotinylated collagen I with non-labeled DDR1:Fc chimera protein, which has been shown to block DDR1-collagen interactions [Bhatt et al., 2000; Kim et al., 2007] and to reduce T cell migration in 3D collagen I [Hachehouche et al., 2010], reduced the capacity of collagen I to bind to activated T cells compared to collagen I pretreated with control IgG (Fig.1B, left panel). Quantification analysis indicates that DDR1:Fc reduced by half the binding of collagen I to activated T cells (Fig.1B, right panel). DDR1:Fc molecule did not block collagen binding to nonactivated T cells (data not shown), consistent with the fact that these cells do not express significant levels of DDR1 and also with the fact that DDR1:Fc did not block basal migration of non-activated T cells in 3D collagen [Hachehouche et al., 2010]. This suggests that the observed blocking effect of DDR1:Fc on collagen binding to activated T cells occurs at the level of DDR1-collagen interaction. Together these results indicate that DDR1 contributes to the ligation of collagen I by activated T cells. 4.5.2 DDR1 doesn’t enhance T cell adhesion to collagen I. To determine if DDR1 on activated T cells promotes their adhesion to collagen I, we studied the effect of DDR1:Fc. To this end, primary human T cells were first activated with anti-CD3 Ab for 48 h to induce DDR1 expression and were subsequently examined for 134 their ability to attach to collagen I. As shown in Fig.2A, anti-CD3-activated T cells show weak adhesion to collagen I, which is not affected by DDR1:Fc. Since adhesion of T cells can be enhanced upon PMA stimulation, which activates β1 integrins thereby mediating stronger T cell interactions with collagens, we also assessed the role of DDR1 in this setting. As expected, PMA increased adhesion of anti-CD3-activated T cells to collagen I but the presence of DDR1:Fc did not inhibit the observed increased cell adhesion (Fig.2A). The effect of DDR1:Fc on cell adhesion is similar to that of the IgG, which was used as a control. The form of DDR1 that was detected in activated T cells is likely to correspond to the DDR1e isoform, which represents a kinase-dead form of DDR1 [Hachehouche et al., 2010]. Thus, to further study the role of DDR1 in T cell adhesion to collagen I, we tested the effect of over-expressing a kinase-dead form of DDR1 (K618A) on Jurkat T cell adhesion to collagen I. Upon transfection, Jurkat T cells express the K618A form of DDR1 (Fig.2B, left panel). Interestingly, these cells activated or not with PMA did not show an enhancement of adhesion in comparison to control cells (Fig.2B; right panel). Together, our results demonstrate that while DDR1 on activated T cells binds collagen I, it did not promote their adhesion to collagen I. 4.5.3 CD28 costimulation does not upregulate DDR1 expression. To get insights into the regulation of DDR1 expression in T cells, we have first assessed if CD28 costimulation enhances TCR-induced DDR1 expression. As shown in figure 3A, coengagement of CD28 and CD3 molecules with antibodies led to similar expression levels of DDR1 after 24 to 72 h of stimulation as did engagement of CD3 alone. However and as expected, CD28 costimulation significantly enhanced anti-CD3-induced IL-2 gene expression (Fig.3B). CD28 engagement alone had no effect on DDR1 or IL-2 expression. 4.5.4 TCR-induced DDR1 expression is not regulated by the Ca2+ signaling cascade. TCR/CD3 engagement leads to T cell activation by inducing several signaling cascades, among which is the Ca2+/calcineurin pathway [Lin and Weiss, 2001]. We thus investigated whether the inhibition of Ca2+-dependent signaling using cyclosporin-A (cyc-A), a specific inhibitor of calcineurin, could affect anti-CD3-induced DDR1 expression in activated T 135 cells. The results show that cyc-A at 100 and 200 nM did not affect the expression levels of DDR1 (Fig.4A). As a control, cyc-A significantly inhibited anti-CD3-induced IL-2 mRNA expression by T cells (Fig.4B). Our results thus exclude a significant role for the Ca2+/calcineurin signaling pathway in TCR-induced DDR1 expression. 4.5.5 TCR-induced DDR1 expression is regulated by the Ras/Raf/ERK MAPK signaling pathway. ERK1/2, p38 and JNK MAP Kinases are activated by TCR engagement and play a central role in T cell activation [Lin and Weiss, 2001]. To determine whether DDR1 expression depends on the activation of MAPK signals, freshly isolated T cells were activated with anti-CD3 in the presence of specific MAPK inhibitors; U0126 for the ERK1/2 pathway, SB203580 for the p38 pathway or SP600125 for JNK pathway and the expression of DDR1 was evaluated. As shown in Fig.5A (left panel), anti-CD3-induced DDR1 expression is strongly inhibited by the ERK MAPK signaling inhibitor U0126. However, the p38 (SB203580) or the JNK (SP600125) inhibitors had no effects. These two inhibitors, used at the same concentration, impaired IL-2 mRNA expression by activated T cells (Data not shown). Quantification analysis shows that the U0126 inhibitor almost completely abrogates anti-CD3-induced expression of DDR1 (Fig.5A, right panel). Together these results indicate that the expression of DDR1 is regulated by the ERK MAPK pathway. To further characterize the upstream signaling pathway leading to ERK-dependent DDR1 expression upon TCR engagement, we studied the implication of Ras and c-Raf, which are upstream of MEK-1 and ERK. To this end, we used the specific pharmacological inhibitors for Raf (GW5074) and Ras (Manumycin-A). We found that manumycin and GW5074 drastically reduced anti-CD3-induced DDR1 expression (Fig.5B, left panel). Quantification analysis indicates that GW5074 and manumycin have the same inhibitory potential on DDR1 expression as did the U0126 inhibitor (Fig.5B, right panel). Taken together, our results demonstrate that expression of DDR1 in activated T cells is regulated by the Ras/Raf/ERK signaling pathway but not by the P38 and JNK MAPKs. 4.5.6 TCR- induced DDR1 expression is dependent on PKC pathway. TCR engagement in T cells leads also to PKC activation, which has been involved in TCRmediated activation of ERK MAPK pathway [Lin and Weiss, 2001]. Therefore, we 136 investigated the potential implication of the PKC pathway in the anti-CD3-induced DDR1 expression using the broad range PKC inhibitor GF109203x (GFx). Similar to U0126, treatment with GFx also inhibits anti-CD3-induced DDR1 expression (Fig.6A). Since both ERK MAPK and PKC are major pathways activated by PMA, we examined if PMA could induce the expression of DDR1 in T cells. We found that PMA also induces DDR1 expression and both U0126 and GFx abrogated this expression. Quantification analysis indicates that GFx has similar inhibitory potential as U0126 (Fig.6B). These results further support the implication of ERK MAPK and PKC in TCR-induced DDR1 expression in human T cells. 4.5.7 Inhibition of ERK MAPK and PKC reduces the ability of activated T cells to bind collagen I. The results above indicate that ERK MAPK and PKC are critical signaling molecules in the expression of DDR1. To further support these results, we have evaluated the effects of the MEK-1 and PKC inhibitors (U0126 and Gfx) on the ability of activated T cells to bind collagen I. As shown in Fig.7, both inhibitors significantly reduce the abililty of activated T cells to bind biotinylated collagen. However, the JNK (SP600125) and p38 (SB203580) inhibitors had no effect; consistent with the fact that these MAPKs do not upregulate DDR1 expression. 137 4.6 Discussion We have recently shown that DDR1 is implicated in the migration of activated T cells in 3D collagen [Hachehouche et al., 2010]. In this study, we further show that DDR1 binds collagen I but does not promote adhesion of activated T cells to collagen I. We further show that TCR-induced DDR1 expression is regulated by PKC and ERK signaling pathways. β1 integrins are the major high affinity receptors for collagen. Activated human T cells are known to express two collagen-binding integrin namely α1β1 and α2β1, which promote T cell adhesion to collagens [Pribila et al., 2004]. In addition to collagen-binding integrins, we and others have reported that activated T cells can also express DDR1 [Dang et al., 2009; Hachehouche et al., 2010; Kamohara et al., 2001], a non-integrin collagen receptor [Heino et al., 2009; Vogel et al., 2006]. In this study, we show that activated T cells bind collagen I in a DDR1-dependent manner but that DDR1 did not enhance their adhesion to collagen I, which is dependent on β1 integrins [Boisvert et al., 2007] and (data not shown). This is in contrast to the reports showing that DDR1 promotes attachment of adherent cells to collagen [Curat and Vogel, 2002; Hou et al., 2001; Hou et al., 2002; Song et al., 2011]. One possible explanation for this discrepancy could be the nature of the cells. In contrast to adherent cells, activated T cells do not attach strongly to ECM especially to collagen but are very motile cells compared to adherent cells [Friedl and Wolf, 2010; Lammermann and Sixt, 2009]. In addition, DDR1 a/b are the major isoforms that have been shown to promote adhesion of adherent cells to collagen I. However, based on the molecular weight, the DDR1 isoform that we detected in activated T cells corresponds to DDR1e [Hachehouche et al., 2010], which is a kinase-dead isoform of DDR1. Along these lines, we also show that overexpression of a kinase-dead form of DDR1 did not enhance adhesion of Jurkat T cells to collagen. Together these results suggest that DDR1 can regulate cell adhesion in an isoform-dependent manner. The fact that DDR1 expressed on activated T cells binds collagen without promoting adhesion is in line with its implication in the migration of activated T cells in 3D collagen [Hachehouche et al., 2010] and with the reports showing that these cells migrate in 3D collagen independently from integrins, strong adhesive forces and stress fibers [Friedl et al., 1998; Friedl and Wolf, 2010; Lammermann and Sixt, 2009]. These observations suggest that the contact between activated T cells with collagen I 138 through DDR1 could be a pathway that contributes to the amoeboid movement of T cells in 3D collagen. Interestingly, recent reports indicated that kinase-dead forms of DDR1 regulate fibrillogenesis with similar capacity as did tyrosine kinase DDR1 [Agarwal et al., 2007; Flynn et al., 2010]. In addition, the tyrosine activity of DDR1 is not required in DDR1-mediated collective migration of cancer cells [Hidalgo-Carcedo et al., 2011]. These studies indicate that the tyrosine kinase activity of DDRs could be dispensable for DDR1 signaling. Thus, it is likely that DDR1 kinase-dead receptors can associate with membrane receptors and signaling molecules to induce cell signaling and thereby regulate cell migration. Our results show that induction of DDR1 expression upon T cell receptor activation does not require CD28 costimulation. It is not yet clear whether other costimulatory molecules such as CD2, LFA-1 or costimulatory molecules of the TNF family could regulate the expression of DDR1 in T cells. However, the fact that CD28 did not influence DDR1 expression suggests that DDR1 expression might be regulated differently than cytokine expression, which requires costimulation for optimal expression. The regulatory pathways involved in the expression of DDRs are largely unknown. We show here that TCR-induced expression of DDR1 is regulated by the ERK MAP Kinase and the PKC pathways, while the P38 and JNK MAP Kinases and the Ca2+/calcineurin pathways were not involved. Using chemical inhibitors, we showed that DDR1 expression is regulated by the Ras/Raf/MEK/ERK signaling cascade and by PKC, which during T cell activation contributes to the activation of Ras and thereby MAPKs as well as it contributes to the activation of NF-κB pathway [Lin and Weiss, 2001]. The fact that CD28 did not upregulate DDR1 expression argues against the implication of PI3 kinase/AKT and NF-κB pathways, which are downstream of CD28. Indeed, we found that NF-κB inhibitors did not affect TCR-induced DDR1 expression (data not shown). Therefore, our results suggest that PKC regulates TCR-induced DDR1 expression likely by promoting activation of ERK MAPK pathway. These observations are also supported by our results showing that PMA, which in T cells activates ERK MAPK through PKC [Bradshaw et al., 1996; Morley, 1997], induces DDR1 expression by a mechanism involving both PKC and ERK MAPK pathways. Our findings are in concordance with a recent study demonstrating the involvement of ERK MAP Kinase in the expression of DDR1 by primary lung fibroblasts [Ruiz and Jarai, 2011]. 139 In contrast to our results, p38 MAPK has recently been involved in the expression of DDR2 in vascular smooth muscle cells in response to hypoxia [Chen et al., 2008; Shyu et al., 2009]. Whether DDR1 isoforms and DDR2 are regulated in a cell specific-manner or by different signaling pathways remain to be determined. Little is known about the potential transcriptional factors involved in DDR1/2 expression. However, some transcriptional factors such as p53 [Ongusaha et al., 2003] and ATF-4 [Lin et al., 2010] were identified as regulators of DDR expression in different cell types. The promoter region of DDR1 gene contains potential binding sites for p53 [Sakuma et al., 1996], AP-1, PEA3 [Ruiz and Jarai, 2011], and NF-κB [Kamohara et al., 2001] transcriptional factors. The fact that our results showed that JNK is dispensable to TCRinduced DDR1 expression argues against the implication of AP-1 in the expression of DDR1 in activated T cells. AP-1 transcription factors are composed of jun/Fos or Jun/Jun heterodimers and Jun factors are activated by JNK. Activation of ERK can regulate the activation of several transcription factors in T cells including Fos, Elk-1 and members of the Ets family [Dong et al., 2002]. A recent study showed that in bronchial lung fibroblasts, ERK regulates DDR1 expression by activating the PEA3 transcription factor [Ruiz and Jarai, 2011]. Whether PEA3 or other transcription factors regulate DDR1 expression in activated T cells is not determined. The transcriptional regulation of DDR1 in activated T cells is currently underway in our laboratory. A model by which DDR1 is regulated in T cells is presented in Fig 9. Based on our previous study showing the role of DDR1 in T cell migration [Hachehouche et al., 2010] and the findings herein, we propose that activation of PKC and ERK MAPK signaling pathways during T cell activation upregulate the expression of DDR1. Subsequently, T cells attach to collagen I through DDR1, which then promotes the migration of activated T cells in collagen-rich peripheral tissues. Thus, our study suggests that blocking the PKC/MAPK/ERK/DDR1 pathway could interfere with T cell migration in peripheral tissues and subsequently be beneficial for the treatment of inflammatory diseases. 140 4.7 Figures and legends Figure 1 : DDR1 expressed by activated T cells binds to collagen I. (A) Peripheral blood T cells were treated or not (NT) with anti-CD3 (10 µg/ml) for 48 h. The cells were then incubated in the presence of biotinylated collagen I (25 µg/ml) for 1h at 37°C and bound collagen I was revealed with phycoerythrin-conjugated streptavidin and detected by flow cytometry. A representative flow cytometric profile of collagen I binding is shown (left panel). Quantification of collagen I-binding cells and comparison between activated (anti-CD3) and non-activated (NT) cells is shown (right panel). The results represent mean values (± SD) from five independent experiments performed with T cells isolated from different blood donors and are expressed as the percentage of cells that attached biotinylated collagen I. * p<0.01 between anti-CD3- and nontreated (NT) samples. (B) DDR1:Fc chimera impaired the attachment of biotinylated collagen I to activated T cells. Anti-CD3-activated T cells or non-treated (NT) cells were cultured for 1h with biotinylated collagen I. Activated T cells were incubated with biotinylated collagen I that had been preincubated with DDR1:Fc recombinant protein or with control IgG. Collagen I bound to T cells was revealed with phycoerythrin-conjugated streptavidin and detected by flow cytometry. A representative flow cytometric profile of collagen I binding in the presence or absence of DDR1:Fc is shown (left panel). Quantification of collagen I bound to activated T cells in the presence or absence of DDR1:Fc or control IgG (right panel). The results represent mean values (± SD) from five independent experiments performed with T cells isolated from different blood donors and are expressed as the percentage of cells that attached biotinylated collagen I. * p= 0.025 between control (-) or IgG-treated samples and DDR1:Fc-treated samples. 141 Figure 2 : DDR1 does not enhance T cell adhesion to collagen I. (A) DDR1:Fc chimera does not reduce adhesion of activated T cells to collagen I. Human peripheral blood T cells were activated with anti-CD3 Ab for 48h, then activated or not with PMA and allowed to attach to collagen I-coated wells for 2 h at 37°C in the presence or absence of DDR1:Fc or control IgG. Cell adhesion was quantified as described in Materials and Methods. The results are expressed as mean values (± SD) from three independent experiments performed with T cells isolated from three diferent blood donors. * p= 0.03 between PMA-treated and non-treated samples (Medium). (B) DDR1 kinase-dead over-expression in Jurkat T cells does not enhance cell adhesion to collagen I. A representative immunoblot analysis of DDR1 expression in Jurkat T cells transfected with control plasmid (pCDNA) or with DDR1-kinase dead plasmid (K618A) (left panel). Actin was used as a loading control. Control and K618A-DDR1-expressing Jurkat T cells activated or not with PMA were tested for adhesion to collagen (right panel). The results are presented as mean values (± SD) from three independent experiments. * p<0.01 between PMAtreated and non-treated samples (Medium). 142 Figure 3 : CD28 costimulation does not upregulate DDR1 expression. (A) T cells were activated or not (-) with coated anti-CD3 in the presence or absence of soluble antiCD28 mAb as indicated. DDR1 and β-actin expression levels were detected by immunoblot analysis. (B) CD28 upregulates IL-2 mRNA levels. T cells were activated or not (-) for 6 h with anti-CD3, anti-CD28 or with anti-CD3+anti-CD28. Expression of IL-2 and β-actin mRNA were determined by RT-PCR analysis. The results (A and B) are representative of three different experiments performed with T cells isolated from different blood donors. 143 Figure 4 : The Ca2+/calcineurin-signaling pathway is not involved in DDR1 expression. (A) T cells were pretreated or not for 1h with the calcineurin inhibitor cyclosporine-A (cyc.A) at the indicated concentration and then activated or not (-) with immobilized anti-CD3 Ab (10 µg/ml) for 48 h. DDR1 and β-actin expression levels were detected by immunoblot analysis. (B) T cells were pretreated or not with cyc-A (100 nM) for 1h and then activated or not with anti-CD3 Ab for 6 h. The mRNA expression levels of IL-2 and β-actin were then determined by RT-PCR analysis. The results (A and B) are representative of three different experiments performed with T cells isolated from different blood donors. 144 Figure 5 : TCR-induced DDR1 expression is regulated by the Ras/Raf/ERK pathway but not by the p38 or the JNK MAP Kinases. (A) T cells were pretreated or not for 1h with the MEK1 inhibitor U0126 (20 µM), the p38 inhibitor SB203580 (20 µM), or with the JNK inhibitor SP600125 (10 µM). The cells were then activated or not for 48 h with anti-CD3 Ab. The levels of DDR1 and β-actin proteins were determined by immunoblot analysis (left panel). (B) Peripheral T cells were pretreated or not for 1h either with the MEK1-inhibitor U0126 (20 µM), the Raf inhibitor GW5074 (5 µM), or with the Ras inhibitor Manumycin (50 nM). The cells were then activated or not for 48 h with anti-CD3 Ab. The levels of DDR1 and β-actin proteins were determined by immunoblot analysis (left panel). The immunoblot data shown in (A) and (B) are representative of at least three different experiments performed with T cells isolated from different blood donors. The densitometric quantification in (A) and (B) represents mean values (± SD) from at least three different experiments performed with T cells isolated from different blood donors and are expressed as the ratio between DDR1 values and βactin values. * p<0.01 between anti-CD3-treated samples and other samples as indicated. 145 Figure 6 : PKC is involved in TCR- and PMA-induced DDR1 expression in T cells. (A) T cells were pretreated or not with the broad range PKC inhibitor GFx (5 µM) or with the MEK1 inhibitor U0126 (20 µM) for 1h. The cells were then activated or not (-) with immobilized anti-CD3 Ab (10 µg/ml) or with PMA (50 ng/ml) for 48 h. DDR1 and β-actin expression levels were detected by immunoblot analysis. The immunoblot data shown are representative of three different experiments performed with T cells isolated from different blood donors. (B) Densitometric quantification of relative increase of DDR1 proteins in activated T cells in the presence of different inhibitors as indicated. The results represent mean values (± SD) from three independent experiments performed with T cells isolated from different blood donors and are expressed as the ratio between DDR1 values and β-actin values. * p<0.01 between anti-CD3-treated samples and anti-CD3+U0126 or anti-CD3+GFx-treated samples. ** p<0.01 between PMA-treated samples and PMA+U0126 or PMA+GFx-treated samples. 146 Figure 7 : Inhbition of ERK MAPK and PKC reduces the ability of activated T cells to bind collagen I. T cells were preincubated or not for 1 h with the MEK-1 inhibitor (U0126), the PKC inhibitor (Gfx), the JNK inhibitor (SP600125) or with the p38 inhibitor (SB203580) before being activated with anti-CD3 mAb. After 48 h of activation, the cells were washed and tested for their capacity to bind biotinylated collagen I as described under the “Materiel and Methods” section. The results represent mean values (± SD) from two independent experiments performed with T cells isolated from different blood donors and are expressed as the percentage of cells that attached biotinylated collagen I. * p<0.01 between anti-CD3- and anti-CD3+U0126 or anti-CD3+Gfx samples. 147 Figure 8 : A model by which TCR/CD3 signaling induces the expression of DDR1 in human T cells. 148 4.8 References Agarwal G, Mihai C, Iscru DF (2007): Interaction of discoidin domain receptor 1 with collagen type 1. J Mol Biol 367:443-55. Barreiro O, Martin P, Gonzalez-Amaro R, Sanchez-Madrid F (2010): Molecular cues guiding inflammatory responses. Cardiovasc Res 86:174-82. Bhatt RS, Tomoda T, Fang Y, Hatten ME (2000): Discoidin domain receptor 1 functions in axon extension of cerebellar granule neurons. Genes Dev 14:2216-28. 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Sachant que les sites inflammatoires sont riches en collagène et que les intégrines liant le collagène ont été impliquées dans le développement de l’inflammation301,355,385 et qu’elles régulent les fonctions des lymphocytes T11,362,404, nous avons émis l’hypothèse que les intégrines liant le collagène pourraient réguler les fonctions des lymphocytes Th17. Nos résultats montrent que les lymphocytes Th17 expriment l’intégrine α2β1 et que cette intégrine costimule l’expression et la production de l’IL-17 en augmentant l’activation des voies de signalisation MAPK ERK et p38 ainsi que la voie PI3K/AKT. De plus, nous avons montré que les voies de signalisation ERK et PI3-K/AKT régulent l’IL-17 en augmentant l’activation du facteur de transcription RORc. Nous avons aussi montré que les Th17 expriment DDR1, un autre récepteur du collagène, mais que ce dernier n’était pas impliqué dans la costimulation par le collagène, mais plutôt dans la migration des lymphocytes T dans le collagène tridimensionnel. Finalement, nous avons montré que le collagène de type II est aussi efficace que le collagène de type I pour costimuler les lymphocytes T, particulièrement les Th17, ce qui peut s’avérer très important pour le développement de l’arthrite rhumatoïde. Ainsi, nous avons montré que l’intégrine α1β1 est très faiblement exprimée par les Th17 alors que l’intégrine α2β1 est plus fortement exprimée. On constate également que les lymphocytes T activés mais non polarisés expriment les deux intégrines à des niveaux similaires, comme chez les Th1333,359. L’expression différentielle des intégrines liant le collagène est également en accord avec une étude qui a montré que l’expression de l’intégrine α1β1 est exprimée chez les Th1, mais pas les Th17 issus de patients atteints d’arthrite378. On peut donc penser que l’expression des intégrines liant le collagène puisse 153 servir de marqueurs de différenciation entre les phénotypes de lymphocytes T, puisque les Th1 expriment α1β1 et α2β1333,359, les Th2 n’expriment pas α2β1333 et les Th17 n’expriment fortement que α2β1. Il serait intéressant d’étudier l’expression des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes T régulateurs afin de compléter cette analyse et éventuellement pouvoir dresser un portrait global de l’expression des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes T CD4+. Pour l’instant, les mécanismes qui régulent l’expression de ces intégrines chez les différents phénotypes de lymphocytes T sont peu connus. Toutefois, les cytokines requises pour la différenciation ainsi que les cytokines produites par les différents phénotypes sont certainement importantes pour ce phénomène puisqu’il a été démontré que l’absence de l’intégrine α2β1 chez les Th2 est due à l’activation de STAT6 par le récepteur de l’IL-4333. Nos résultats ont permis d’identifier plusieurs voies de signalisation activées par le TCR impliquées dans l’expression et la production de l’IL-17. Dans la littérature, la différence entre la différenciation des lymphocytes T CD4+ en Th17 et la production d’IL-17 en tant que tel est souvent confuse. Ainsi, les signaux activés par le TCR menant à l’expression et la production de l’IL-17 par les lymphocytes Th17 déjà différenciés ne sont pas très bien décrits. Nous avons identifié trois voies de signalisation requises pour la production de l’IL-17 suite à la stimulation par le TCR, soit les MAPK ERK, JNK et la voie PI3-K/AKT. Parmi celles-ci, la voie de ERK et de PI3-K/AKT semble être particulièrement intéressantes du point de vue de la costimulation. L’activation de ces deux voies est augmentée en présence de collagène. Nous avons également montré que ces deux voies induisent l’expression de l’IL-17 en augmentant l’activation du facteur de transcription RORc. Ainsi, l’intégrine α2β1 costimule l’expression et la production de l’IL-17 en augmentant l’activation des voies ERK et PI3-K/AKT qui à leur tour augmenteront l’activation de RORc. Puisqu’il existe un lien entre l’intégrine α2β1 et RORc, on peut penser qu’il existe un lien entre l’intégrine α2β1 et la différenciation des Th17. Nous ne l’avons pas encore testé, mais il serait intéressant de voir si la présence de collagène pourrait favoriser le maintien du phénotype Th17. En effet, il s’agirait plutôt d’un rôle de maintien que de différenciation, car les lymphocytes T naïfs n’expriment pas l’intégrine α2β1. Un rôle dans le maintien du phénotype serait toutefois très important, car comme il a été mentionné précédemment, les lymphocytes Th17 sont particulièrement plastiques et sensibles aux 154 changements de cytokines dans le milieu. Le collagène pourrait également contribuer au développement des lymphocytes Th1/Th17, en présence d’IL-12, en maintenant l’expression de RORc alors que l’expression de t-bet est induite par l’IL-12. Une autre voie de signalisation que nous avons identifiée est la voie MAPK p38. Nous avons trouvé que cette voie n’était pas nécessaire à la production de l’IL-17 par le TCR, mais était requise pour la costimulation par le collagène. Par ailleurs, nous avons précédemment démontré que la voie p38 n’était pas requise pour la production et la costimulation d’IFN-γ par le collagène11. Ainsi, cibler cette voie de signalisation pourrait être une avenue intéressante pour le traitement de maladies dépendantes des Th17 puisque l’on pourrait diminuer la quantité d’IL-17 produite sans bloquer complètement la réponse immunitaire dépendante des lymphocytes T. D’ailleurs, une étude utilisant un inhibiteur chimique de p38 a montré que celui-ci réduisait la sévérité de l’encéphalomyélite auto-immune114 en diminuant la production d’IL-17. Il est probable que cette diminution de l’IL-17 soit due à une inhibition de la costimulation par le collagène. Des travaux précédents de notre laboratoire ont montré que les lymphocytes T primaires humains expriment DDR1 à la suite de l’activation par le TCR et que ce récepteur permet la migration dans le collagène tridimensionnel400. Le récepteur DDR1 fait partie des récepteurs liant le collagène, mais n’appartient pas à la famille des intégrines. Nous avons également montré que DDR1 ne permettait pas l’adhésion ferme des lymphocytes T suggérant que DDR1 pourrait favoriser la migration de type amiboïde des lymphocytes T, un type de migration qui ne nécessite pas d’attachement fort au collagène 405. Nous avons également montré que les lymphocytes Th17 expriment DDR1, mais pas DDR2. Cependant, DDR1 ne costimule pas l’expression de cytokines chez les Th17. Il est probable que cela soit dû aux contacts transitoires entre DDR1 et le collagène. En effet, pour pouvoir induire la migration, DDR1 ne doit pas lier fortement le collagène. Il est donc possible que ces contacts fréquents, mais de courtes durées, ne soient pas suffisants pour induire un signal intracellulaire pouvant costimuler l’expression de cytokines. Ceci pourrait s’accorder malgré tout avec une étude qui a montré que DDR1 costimule la production d’IFN-γ et d’IL-4 par les lymphocytes T naïfs, car cette étude a utilisé des anticorps spécifiques pour DDR1 afin de simuler l’interaction avec le collagène391. Ce choix semble étrange, car les auteurs ont démontré dans le même article que le collagène est aussi efficace que les 155 anticorps pour induire la prolifération cellulaire. Ainsi le rôle de DDR1 dans la costimulation des lymphocytes T n’est pas définitif. Il se pourrait que son rôle puisse varier d’un phénotype à l’autre. Tout comme l’expression des intégrines liant le collagène pourrait être un marqueur de différenciation des lymphocytes T CD4+, l’expression de DDR1 et DDR2 pourrait également servir à mieux identifier les différentes populations. Il a été démontré que DDR1 costimule la production de l’IFN-γ et de l’IL-4 alors que DDR2 ne costimule que la production de l’IFN-γ391. On pourrait donc penser que les lymphocytes Th1 exprimeraient DDR1 et DDR2 alors que les Th2 n’exprimeraient que DDR1. De notre côté, nous avons montré, par un marquage direct des cellules, que les lymphocytes Th17 expriment DDR1, mais pas DDR2. Il serait particulièrement intéressant d’étudier spécifiquement l’expression de DDR chez les Th1, car la confirmation de la présence de DDR1 et de DDR2 chez les Th1 pourrait permettre de discriminer entre les Th1 et Th17 que l’on retrouve au niveau des sites inflammatoires. Il serait éventuellement possible d’identifier les sous-types de lymphocytes T en fonction de l’expression des récepteurs pour le collagène soit les intégrines α1β1 et α2β1 ainsi que DDR1 et DDR2. Ces éléments pourraient permettre l’identification de sous-populations lymphocytaires qui seraient plus pathogéniques. Nous avons montré que les lymphocytes Th17 effecteurs expriment deux récepteurs pour le collagène soit l’intégrine α2β1 et le récepteur DDR1. Il existe d’autres récepteurs pour le collagène, telles que les intégrines α10β1 et α11β1 mais celle-ci sont connus pour être exprimées chez les fibroblastes et chondrocytes plutôt que chez les lymphocytes T406,407. Les résultats que nous avons obtenus montrent que l’intégrine α2β1 permet l’adhésion des lymphocytes Th17 aux collagènes de type I et II et costimule l’expression d’IL-17 et d’IFN-γ en présence de ces collagènes alors que DDR1 permet la migration des lymphocytes T dans le collagène tridimensionnel, mais n’est pas impliqué dans la costimulation des lymphocytes Th17 par le collagène. Ceci suggère que les deux récepteurs ont des fonctions bien différentes. Bien que nous ne l’ayons pas testé spécifiquement, on peut penser que l’expression de DDR1 permet aux Th17 de migrer dans les matrices de collagène pour atteindre le site inflammatoire alors que l’intégrine α2β1 permet leur rétention au niveau du site inflammatoire et y favorise l’activation des fonctions des Th17. Cette hypothèse semble d’autant plus valide lorsque l’on s’attarde à l’expression de ces 156 récepteurs dans le temps. En effet, nous avons observé lors d’expérimentations préliminaires, que DDR1 était exprimé rapidement et que cette expression était maximale après environ 24h400. Il s’agit donc d’une expression précoce si on la compare à l’expression des intégrines liant le collagène, qui sont exprimées quatre à sept jours suivant l’activation lymphocytaire341. L’expression rapide de DDR1 permettrait aux lymphocytes Th17 de migrer des nœuds lymphatiques vers les tissus interstitiels riches en collagène. Dans les tissus, l’expression de l’intégrine α2β1 est augmentée, ce qui permettrait d’ancrer les Th17 dans le site inflammatoire et favoriserait la réponse immunitaire en augmentant la production de cytokines telles que l’IL-17 et l’IFN-γ. L’expression différentielle des intégrines α1β1 et α2β1 que nous avons démontrées pourrait également permettre d’associer ces intégrines à des fonctions particulières. Comme il a été mentionné, les lymphocytes Th17 ont été impliqués dans le développement de nombreuses maladies auto-immunes. On pourrait donc penser que l’intégrine α2β1 soit associée aux lymphocytes T pathogéniques. Il est vrai que les Th17 sont importants pour certaines réponses immunitaires protectives mais il n’en reste pas moins que leur rôle dans l’autoimmunité est, pour l’instant du moins, prédominant. Le rôle de l’intégrine α2β1 dans l’immunité protective semble être mineur. En effet, l’expression de α2β1 est transitoire chez les lymphocytes T CD8+ dirigés contre le virus de l’influenza362. Dans ce modèle animal, il a été démontré que l’intégrine α1β1 est nécessaire à la réponse antivirale des lymphocytes T CD8+, autant pendant la phase aiguë de la maladie que pour la réponse mémoire. Par ailleurs, une sous-population de lymphocytes T CD4+ antivirale qui se localise dans les poumons lors de l’infection à l’influenza exprime également α1β1332. Une autre étude a montré que l’intégrine α2β1 n’était pas nécessaire pour la réponse des lymphocytes T mémoires358. Cependant, il a été suggéré que α2β1 puisse favoriser la réponse des lymphocytes T contre les bactéries, mais ceci reste à démontrer. Ces études n’excluent toutefois pas un rôle pathogénique pour l’intégrine α1β1 car cette intégrine est connue pour être exprimée chez les monocytes/macrophages et un anticorps contre α1β1 diminue l’arthrite le développement de l’arthrite dans un modèle dépendant des monocytes301. De plus, une étude de notre laboratoire a montré que cette intégrine augmente l’expression de RANKL induite par l’IL-7, ce qui contribue à leur fonction ostéoclastogénique tel qu’observé dans l’arthrite rhumatoïde369. 157 Comme il a été mentionné précédemment, l’intégrine α2β1 a été impliquée dans le développement de maladies auto-immunes incluant l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et la colite ulcéreuse301,355,385,389 mais ces études n’ont pas investigué le rôle de α2β1 dans les fonctions des lymphocytes Th17. Nos résultats suggèrent qu’un des rôles de l’intégrine α2β1 dans le développement de l’inflammation soit la costimulation des lymphocytes Th17. De plus, d’autres études de notre laboratoire ont montré que l’intégrine α2β1 pourrait agir à plusieurs niveaux dans le développement de ces maladies. Tout d’abord, nous avons montré que cette intégrine augmente l’expression d’IFN-γ11. Nous avons aussi montré que l’intégrine α2β1 protège les lymphocytes T de l’apoptose induite par l’activation des cellules (AICD) dépendante de Fas366. Ainsi, l’intégrine permettrait une augmentation de l’expression de cytokines pro-inflammatoires, mais favoriserait également la survie des cellules qui les produisent. Ces résultats indiquent que l’intégrine α2β1 pourrait être une cible particulièrement intéressante pour le traitement de maladies autoimmunes. L’expression de α2β1 a été précédemment impliquée dans l’activation des plaquettes, mais l’utilisation de souris KO a permis de montrer que cette intégrine jouait un rôle mineur dans les fonctions des plaquettes408. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs contre α2β1 a également montré que cette intégrine n’était pas requise pour l’homéostasie des plaquettes409,410 et que le blocage de α2β1 résultait en un temps de coagulation un peu plus long chez la souris traitée qui serait comparable à l’effet de l’aspirine410. Le rôle de l’intégrine α2β1 dans le développement de l’arthrite rhumatoïde est particulièrement intéressant à cause de la richesse en collagène de la jointure. Nos travaux ont montré que le collagène de type II qui se retrouve au niveau du cartilage est très efficace pour moduler l’activation des lymphocytes Th17411. Cet effet est similaire qu’il soit utilisé sous forme immobilisée que sous forme soluble. Également, l’utilisation de souris KO pour α2β1 a montré une baisse de la dégradation du cartilage dans un modèle animal d’arthrite374. Les interactions avec le collagène semblent particulièrement importantes pour le développement de l’arthrite car une autre étude a montré que le récepteur GPVI, un récepteur du collagène exprimé par les plaquettes, permet la production de microparticules inflammatoires165. 158 Toutes ces études nous permettent de proposer le modèle suivant (Figure 10) du rôle de l’intégrine α2β1 et du collagène de type II dans les dommages articulaires et dans le développement de la chronicité de l’inflammation observée lors de l’arthrite rhumatoïde. 159 Schéma 10 : Modèle de fonction de l’intégrine α2β1dans l’arthrite rhumatoïde Ainsi, le cartilage est dégradé lors de l’invasion de l’articulation par le pannus, ce qui mène à la relâche de fragments de collagène de type II. Ces fragments lieront les intégrines α2β1 des lymphocytes Th1 et Th17 présents au site inflammatoire. Il en résultera l’augmentation de cytokines proinflammatoires qui, entre autres, induiront l’expression d’oxyde nitrique et de métalloprotéinases par les synoviocytes (MMP-1) et les chondrocytes (MMP-3 et MMP13). L’invasion du pannus est également favorisée par l’augmentation de la production de l’IL-22 chez les Th17, ce qui contribue aussi à augmenter la destruction du cartilage articulaire. La dégradation du cartilage s’en trouve aggravée et crée une boucle d’amplification de l’inflammation par les lymphocytes T. 160 5.1 Perspective Les perspectives à court terme de ce projet sont au moins au nombre de deux. Premièrement, il est impératif de tester l’effet du blocage de l’intégrine α2β1 dans un modèle animal d’arthrite rhumatoïde afin d’évaluer le rôle in vivo de l’intégrine chez les lymphocytes Th17. Ceci nous permettra de confirmer si les observations précédentes du rôle de cette intégrine dans le développement de maladies auto-immunes passe par la régulation des fonctions des Th17. Deuxièmement, il sera important de déterminer quelles sont les molécules de signalisation activées par l’intégrine qui permettent la régulation des voies de signalisation MAPK ERK et p38 ainsi que PI3-K/AKT. Le but de cette étude sera d’identifier des molécules de signalisation spécifiques aux lymphocytes T, voir même aux lymphocytes Th17, qui pourraient être ciblées afin de contrer la costimulation par l’intégrine sans bloquer l’intégrine de façon systémique et ainsi diminuer le risque d’effets secondaires jusqu’à maintenant inconnus. 161 Bibliographie 1. Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science 248, 1349–1356 (1990). 2. Knight, S. C. & Stagg, A. J. Antigen-presenting cell types. Curr. Opin. Immunol. 5, 374–382 (1993). 3. Abi Abdallah, D. S., Egan, C. 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RUNNING TITLE: VLA-2 signaling on T cells *Corresponding author: Fawzi Aoudjit, Ph.D Assistant Professor, Université Laval Centre de Recherche en Rhumatologie et Immunologie CHUQ Pavillon CHUL 2705 Blvd Laurier, local T1-49 Ste-Foy, Québec G1V 4G2 Canada Tel: (418) 656-4141 (ext. 46071) Fax: (418) 654-2765 E-mail: [email protected] 1: SG and MB contributed equally to this work. 189 A.1 Abstract The alpha2beta1 integrin also known as VLA-2 is expressed during the late stages of T cell activation and is specifically found on effector T cells. VLA-2 serves as a receptor for collagen type I and has been involved in the adhesive interactions of effector T cells with collagen in extravascular tissues. In addition to its role in cell adhesion, recent evidence indicates that VLA-2 also regulates T cell functions and responses. Indeed, VLA-2 signaling on T cells increases cell proliferation and effector cytokine production as well as promotes cell survival. Furthermore, VLA-2 has also been implicated in T cell-dependent inflammatory diseases in animal models. In this review, we discuss the findings on the role of VLA-2 in the regulation of T cell functions and T cell-mediated immunity with a focus on the intracellular signaling mechanisms activated through VLA-2. 191 A.2 Introduction The alpha2beta1 (α2β1) integrin also known as very late antigen 2 (VLA-2) belongs to the β1 integrin family of adhesion molecules that mediate cell interactions with extracellular matrix (ECM) proteins. It is expressed on the cell surface as a heterodimer composed of the α2 integrin chain (CD49b) and the β1 integrin chain (CD29). As discussed herein, VLA-2 on T cells functions as a receptor for collagen type I (Coll I) [1], which was initially identified on fibrosarcoma and platelets [2-4]. Early studies by Hemler’s group showed that consistent with its description as very late antigen; VLA-2 expression is associated with late stages of T cell activation [5]. Indeed, VLA-2 has been detected on peripheral blood T cells only after one to two weeks of in vitro activation with interleukin-2 (IL-2) [5, 6]. The same group has also reported that VLA-2 is expressed on a subset of T cells infiltrating the inflamed synovium of patients with rheumatoid arthritis [7]. It is now established that high levels of VLA-2 are associated with activated/effector T cells found in extravascular tissues and were not found on naive T cells [6, 8-10]. This differential regulation is also true for VLA-1; the recepor of Collagen type IV (Col IV) and for the Laminin (Lam) receptor VLA-3. Other β1 integrins such as the fibronectin (Fbn)-receptors α4β1 and α5β1 and the other Lam-receptor α6β1 are also expressed at high levels on effector T cells despite that these integrins are also found on naive T cells. The expression pattern of β1 integrins is consistent with the importance that T cell interactions with ECM proteins can have in the regulation of T cell-mediated immunity and autoimmune disorders. Naïve T cells encounter antigens in lymph nodes in the absence of ECM proteins, since in these tissues the ECM is not accessible to T cells as it is sheathed by a layer of reticular fibroblasts [9, 10]. In contrast, activated/effector T cells found in extravascular tissues are in continuous contact with different components of ECM. Peripheral tissues are bound by epithelium with basement membranes rich in ECM particularly Coll IV and the intercellular spaces are largely filled with abundant ECM produced by local fibroblasts and other stromal cells [9, 10]. After trans-endothelial migration, effector T cells migrate through interstitial ECM composed mainly of Coll I [11]. Lymphoid resembling structures, in which antigen presentation can take place, are 193 also formed in extravascular inflamed tissues [12-14]. The levels of several components of the ECM increase during chronic inflammatory diseases, which are characterized by basement membrane thickening and fibrosis due to the increased production of interstitial collagens and Fbn by stromal cells [15-18]. Hence, in the tissues, activated/effector T cells function in the context of their interactions with ECM. In this review, we will discuss the functions of VLA-2 in T cell-mediated immunity and the mechanisms of VLA-2-mediated intracellular signaling. A.3 Expression of VLA-2 on T cells Being the receptor for Coll I, VLA-2 is expected to be expressed on T cells infiltrating inflamed tissues rich in Coll I, which is the most abundant type of collagen and widely distributed throughout the body [11]. VLA-2 is equally expressed on activated CD4 and CD8 T cells as determined in in vivo studies [19] and in in vitro studies using human effector T cells generated upon in vitro activation [6, 20]. However, data on the specific association of its expression with specific tissue effector T cells and T cell subsets are still limited. VLA-2 has been detected on effector CD45RO T cells isolated from the intestinal lamina propria [6, 21]. Moreover, VLA-2 is also expressed along with VLA-1 on both CD4 and CD8 effector T cells during influenza infection [19, 22]. Further analysis showed that VLA-2 is mainly associated with CD4 T cells that enter the parenchyma of the lungs whereas VLA-1 was associated with a subset of CD8 T cells that are found near the basement membranes of the blood vessels and the airways [22]. The expression of VLA-2 is also associated with autoimmune diseases as it is significantly expressed on a subset of synovial CD4 T cells isolated from the synovium of patients with rheumatoid arthritis [7]. Thus, the expression of VLA-2 can be one mechanism by which effector T cells maintain residency in the tissues, which is likely to contribute to their proper functioning in Coll I rich microenvironments. The group of Nishimura has recently proposed VLA-2 as a novel marker for Th1 cells. They have demonstrated using ovalbumin-specific T cell receptor (TCR) transgenic (DO11.10) mice that VLA-2 is expressed at higher levels on Th1 than on Th2 cells [23]. The expression of VLA-2 increases until 6 days after activation on both Th1 and Th2 cells remains elevated on Th1 but gradually disappears on Th2 cells thereafter. The 194 downregulation of VLA-2 on Th2 cells was attributed to IL-4/STAT6 signaling pathway. However, the increase in VLA-2 on Th1 was shown to be independent from Th1 cytokines such as interferon-γ (IFNγ) and IL-12. The expression of VLA-2 on Th1 cells is consistent with its role in Th1 diseases, which will be discussed later in this review. It is still unclear if the expression of VLA-2 is associated with T cell memory. In the mouse model of influenza, only virus-activated effector T cells expressing VLA-1 expand and differentiate into memory T cells [19, 24], whereas virus-activated effector T cells expressing VLA-2 were short-lived and are not associated with the development of memory T cells [19, 25]. This is consistent with the observations made by Hemler’s group indicating that high levels of VLA-2 are associated with highly proliferating post-activated T cells whereas high levels of VLA-1 are associated with less proliferating post-activated T cells [7, 26]. A.4 VLA-2-mediated T cell adhesion to collagen A number of studies using the lymphoblastoid Jurkat T cell line, which constitutively expresses VLA-2, and activated human and murine T cells have shown in cell adhesion assays that VLA-2 mediates T cell adhesion to Coll I [1, 6, 27-31]. Attachment of these cells to Coll I is weak, which is probably due a lower activated state of VLA-2. This attachment can however be strongly enhanced upon TCR stimulation, with divalent cations or phorbol esters such as PMA, which enhance the activation state of VLA-2 through inside-out signaling. Specific activating antibodies such as the anti-α2 integrin JBS2 mAb also enhance the affinity of α2 integrin to its ligand and the attachment of T cells to Coll I. The mechanisms regulating the activation state of VLA-2 and the subsequent attachment of effector T cells to Coll I are largely unknown. Dedhar and colleagues have demonstrated that protein-phosphatase 2A (PP2A) can play an essential role in this process [32]. They showed that inhibition of PP2A with okadaic-acid inhibits the attachment of Jurkat T cells to Coll I induced by the JBS2 mAb. The role of PP2A in this process was attributed to the recruitment of calreticulin to VLA-2 integrin adhesion complexes. Calreticulin has been shown to interact with VLA-2 integrin after activation with JBS2 mAb and this interaction correlates with integrin-mediated adhesion of Jurkat T cells [33]. The role of PP2A in cell adhesion to other ECM proteins has been reported and does not seem to be specific to Coll 195 I [32, 34]. However, we found that treatment of Jurkat T cells with okadaic acid does not prevent the binding of soluble Coll I to VLA-2 [35] and does not interfere with PMAinduced adhesion to Coll I-coated surfaces (unpublished results). PP2A is also not required for the adhesion of α2 integrin-expressing osteosarcoma to three dimensional Coll I [36]. Together, these studies suggest that the role of PP2A in T cell adhesion to Coll I may be dependent on the physical structure of Coll I and on the agents used to activate VLA-2. A recent study revealed the existence of two functional active conformations of VLA-2, which are dependent on the cell type and on the way these cells are activated [37]. In Jurkat T cells, both stimulation by inside-out (peptides) and outside-in manipulation (divalent cations) led to one fully active conformation, which strongly binds to Coll I and to an antibody directed against α2 integrin chain that binds only after inside-out signaling in platelets. It is not clear if this active conformation of VLA-2 occurs in response to physiological stimuli and if it has relevance in vivo, i.e. if it is found on tissue effector T cells, which possess a higher ability to attach to Coll I. A.5 Role of VLA-2 in T cell survival The role of integrin-mediated cell adhesion to ECM in cell survival came from studies on epithelial and endothelial cells, which upon disruption of their interactions with the ECM underwent a form of apoptosis called anoikis [38-40]. Previous studies have also suggested that β1 integrin signaling can protect T cells from apoptosis [41, 42]. Survival of T cells is important for productive immune responses and can also contribute to T cell-dependent inflammation and autoimmunity [43-45]. In this section, we will discuss the role of VLA-2 in promoting the survival of effector T cells focusing in particular on the regulation of activation-induced cell death (AICD), which is an important death signaling pathway in T cells and on the potential of VLA-2 to regulate additional forms of T cell apoptosis. A.5.1 Regulation of activation-induced cell death (AICD) in T cells AICD is a major death pathway by which T cells undergo apoptosis and involves the activation of the Fas-Ligand (Fas-L)/Fas death pathway [46, 47]. Fas-induced apoptosis is critical to maintain T cell homeostasis at the end of the immune response and resistance to Fas-mediated death can contribute to inflammatory diseases and autoimmunity as seen in Lpr and Gld mutant mice, which are deficient for the expression of Fas and Fas-L 196 respectively [48, 49]. On the other hand, T cells must be protected during their activation for effector T cell functions. Activation of the Fas-L/Fas pathway occurs in response to TCR-dependent stimulation. Restimulation of activated T cells via the TCR, results in the transcriptional activation of Fas-L and Fas genes. Ligation of Fas receptor with Fas-L induces receptor aggregation and recruitment of the adapter protein FADD, which in turn recruits procaspase-8 to form the death inducing signaling complex (DISC), leading to the processing and activation of caspase-8. Activated caspase-8 will in turn lead to the subsequent activation of downstream executioners caspases and apoptosis [50]. A.5.2 Inhibition of Fas-L expression Using the Jurkat T cell line, which is sensitive to AICD and constitutively express several β1 integrin members, we have demonstrated that VLA-2 inhibits AICD [27]. Indeed, ligation of VLA-2 with Coll I or with an activating anti-α2 integrin mAb (JBS2) significantly reduces TCR-dependent apoptosis as well as PMA+Ionomycine (ION)induced apoptosis, which is also partially mediated by the FasL/Fas death pathway. However, other matrix proteins such as Fbn and Lam had no effect. Activation of Jurkat T cells with Coll I did not affect the expression of Fas receptor, which is expressed constitutively at high levels but significantly reduces the transcriptional activation of the Fas-L gene upon TCR stimulation. This reduction is likely to contribute to the protective effect of Coll I since in cytotoxic assays, Jurkat T cells activated with anti-CD3 mAb+Coll I are less efficient than Jurkat T cells activated via TCR alone in killing the Fas-sensitive Hut78 lymphoma used as target cells [27]. We have also confirmed the role of VLA-2 in human effector T cells generated from isolated peripheral blood T cells activated in vitro with PHA and IL-2 [51]. Coll I did reduce both TCR-dependent apoptosis in these cells as well as the expression of membrane Fas-L (unpublished result). Focal adhesion kinase (FAK) has been shown to be central in intgerin-mediated signaling and cell survival [52]. We have found that FAK is activated by both anti-CD3 mAb and Coll I and expression of a dominant-negative form of FAK, known as FAK-related non kinase (FRNK), abrogated the protective effect of Coll I on AICD in 85% of the cells that had been transfected with FRNK plasmid. These studies indicated that VLA-2-mediated inhibition of AICD is dependent on the activation of FAK. VLA-2-dependent inhibition of TCR- or PMA+ION-induced Fas-L gene transcription also requires FAK [27]. Currently 197 the mechanisms by which VLA-2 controls the transcription of Fas-L gene are unknown. Activation-induced Fas-L gene transcription is complex and depends on several -Myc [53-59]. The potential role of integrin-mediated adhesion in the regulation of death ligands of the TNF family is also underscored in studies performed with adherent cells and may also be one mechanism that regulates anoikis. We and others have demonstrated that the culture of endothelial cells and intestinal epithelial cells in suspension, which induces anoikis of the cells, resulted in the transcriptional increase of death receptor ligands such as Fas-L and TRAIL, which subsequently trigger the activation of death receptor apoptotic cascades thus contributing to the execution of anoikis [39, 60, 61]. Thus, effector T cells in the tissues could escape apoptosis by maintaining low levels of Fas-L and VLA-2 signaling could be one mechanism contributing to this effect. These conclusions are supported by the findings that effector T cells recovered from the lungs, which express collagen-binding integrins, are less sensitive to AICD than those from lymphoid organs and have less Fas-L on their surface [62]. A.5.3 Inhibition of Fas-induced signaling Protection from apoptosis is likely to be the result of the inhibition of several death signals. Therefore, activation of VLA-2 with Coll I can directly regulate Fas signaling thereby contributing to the inhibition of AICD. This was investigated mainly in Jurkat T cells stimulated with the agonistic anti-Fas antibody CH11 to induce apoptosis directly through Fas receptor independently from TCR stimulation [51]. In these conditions, we have found that preincubation of Jurkat T cells with Coll I significanlty reduced Fas-induced apoptosis and this effect was not due to the interference of Coll I with the binding of CH11 to the cell surface. Interestingly, matrix proteins such as Fbn and Lam that did not inhibit TCRdependent apoptosis [27] also had no effect on Fas-induced apoptosis. The regulatory effect of Coll I on Fas-induced apoptosis was also observed in human effector T cells [51]. Furthermore, inhibition studies with dominant negative forms and chemical inhibitors demonstrated that VLA-2-mediated inhibition of Fas-induced apoptosis proceeds through activation of the MAPK/ERK survival pathway and inhibition of caspase-8 activation. The protective effect of Coll I is not dependent on de novo gene expression since it is not abrogated in cells treated with cycloheximide, thus excluding the possibility that VLA-2 198 might inhibit Fas-induced apoptosis by augmenting the expression of anti-apoptotic proteins [51]. Therefore, it is likely that posttranslational mechanisms may account for the observed reduction of caspase-8 activation. However, it is still unclear whether the inhibition of caspase-8 was due to a reduction in DISC formation or to the reduction of proteolytic cleavage of procaspase-8. These two possibilities are not excluded as Eriksson’s group demonstrated that activation of MAPK/ERK can block Fas-induced apoptosis by inhibiting the autoproteolytic activation of procaspase-8 [63] whereas Kaufmann’s group showed that FADD, which is essential for DISC formation and caspase-8 activation, can be phosphorylated by MAPK/ERK, which may contribute to the inhibition of DISC formation [64]. Coll I may also modulate the localization of c-Flip, an endogenous inhibitor of caspase-8 activation at the DISC. This mechanism has been proposed to be downstream of α4β1 integrin in the inhibition of Fas-induced apoptosis in monocytic U937 cells [65]. In summary, VLA-2 signaling contributes to the protection of T cells from AICD at least by two mechanisms. By reducing the expression of Fas-L, and by activating the MAPK/ERK, which inhibits the activation of caspase-8. A model by which VLA-2 signaling reduces AICD is depicted in Figure 1. The inability of other ECM proteins such as Fbn and Lam to inhibit Fas-induced apoptosis may be due to their failure to sustain significant ERK activation [51]. The mechanisms by which different ECM proteins regulate activation of MAPK/ERK pathway in T cells will be discussed later in this review. Similarly to VLA-2/Coll I interaction, it has recently been reported that the Coll IVreceptor VLA-1 also protects effector CD8 T cells from Fas-induced apoptosis [66]. Together these studies point to the unique function of collagen-binding integrins in T cell survival. Therefore, effector T cells in extravascular tissues can be protected from Fasinduced apoptosis whether they are localized near basement membranes where Coll IV is abundant or whether they enter the parenchyma where it is Coll I that is abundant. 199 Figure 1 : Model for Coll I/ VLA-2-dependent inhibition of AICD in T cells. Ligation of VLA-2 in the context of TCR engagement leads to the synergistic activation of FAK, which leads to the reduction of TCR-induced Fas-L expression. Ligation of VLA-2 with Coll I also induces activation of ERK/MAPK through the activation of Ras, Raf-1 and PP2A. Active ERK inhibits Fas-induced signaling cascade and apoptosis by inhibiting caspase-8 processing and activation. 200 A.5.4 Modulation of other forms of apoptosis T cell apoptosis has also been studied in leukemia T cell lines in response to chemotherapeutic drugs. Understanding the mechanisms of drug-induced apoptosis can help circumvent the development of drug resistance, which is one major obstacle to chemotherapy. Since these drugs exert their cytotoxic effects by inducing apoptosis of tumor cells, it was hypothesized that one mechanism by which tumor cells acquire drug resistance is by acquiring resistance to apoptosis. In this regard, integrins also seem to protect tumor cells from chemotherapy [67, 68]. Given the functional role of VLA-2 on AICD, we have also studied if Coll I/VLA-2 signaling modulates drug-induced apoptosis in Jurkat T cells. We have shown that ligation of VLA-2 with Coll I did not inhibit etoposideand staurosporine-induced apoptosis [51] but significantly reduces doxorubicin-induced apoptosis [69]. We demonstrated that Coll I inhibits doxorubicin-induced apoptosis by inhibiting the expression of the receptor-activator of NF-κB-ligand (RANKL) [69]. This latter is a cytokine of the TNF family, which binds to its receptor RANK initially described on osteoclasts precursors and dendritic cells [70]. RANKL is expressed on osteoblasts and other mesenchymal cells as well as on activated T cells. During cognate cell-cell interactions, RANKL expressed on activated T cells induces the activation and survival of dendritic cells and osteoclast precursors [70]. Although RANK does not possess death domains [71] and thus is not coupled to DISC formation and caspase-8 activation, it has nevertheless been implicated in cell apoptosis [72]. Indeed, activation of the RANK signaling in the absence of serum induces apoptosis of RAW macrophages [73]. Moreover, we and others have also shown that RANKL is implicated in doxorubicin-induced apoptosis of leukemia T cell lines including Jurkat and CEM [69, 74]. However, other drugs such as staurosporine and etoposide did not induce the expression of RANKL and their cytotoxic effects were shown to be independent from RANKL [74]. These studies indicate that the ability of Coll I to protect from doxorubicin but not from staurosporine or etoposide is at least due to the inhibition of RANKL. We also found that Coll I does not modulate the expression of RANK receptor, which is expressed on leukemic T cells [69] [74]. The contribution of RANKL to doxorubicin-induced apoptosis is still unclear but was suggested to contribute to the release of cytochrome c from the mitochondria [74]. Ligation of different β1 integrins members with ECM proteins including Coll I and Fbn 201 were also shown to confer resistance to Ara-C- and radiation-induced apoptosis [75]. This was demonstrated upon overexpression of β1 integrins in several leukemia cell lines including Jurkat T cells. The mechanism accounting for Fbn/β1 integrin dependent survival involves activation of the PI3 Kinase/AKT pathway, which inhibits procaspase-8 activation. However, the protective effect of Coll I has not been investigated. In our studies, we found that Coll I did not activate AKT in Jurkat T cells [51]. Although it is still unclear how Coll I inhibits drug-induced apoptosis, these studies suggest that VLA-2 signaling may contribute to the generation of resistant leukemic T cells. In this context, Coll I is an abundant matrix protein of the bone marrow, which is a favorable site for leukemia growth and development [68, 76]. The mechanisms by which these drugs induce apoptosis are complex and while they can activate death receptors, it is clear that the main pathway by which they induce apoptosis is through the activation of mitochondrial death pathway, which is modulated by the balance between pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins leading to cytochrome c release and activation of caspase-9 and downstream caspases [77, 78]. A recent study also showed that Coll I reduces apoptosis of Jurkat T cells upon serum-starvation [79]. The mechanisms by which Coll I did so have not been investigated. This form of apoptosis is generally believed to result from the activation of the mitochondria death pathway independently from death receptors. Therefore, it appears that VLA-2 signaling on T cells can block both death receptor-induced apoptosis and mitochondria-dependent apoptosis. While the mechanisms accounting for the inhibition of the former were in part clarified, additional work is needed to understand how Coll I modulates mitochondria-dependent apoptosis in T cells. Given the ability of VLA-2 to activate the MAPK/ERK pathway, it is possible that VLA-2 signaling affects the function of the Bcl-2 proteins and/or of inhibitor of apoptotsis proteins (inhibitors of caspase-9 and executioner caspases), which are known to be regulated by MAPK/ERK [80-82]. A.6 Role of VLA-2 signaling in T cell costimulation (cytokine production and proliferation) In addition of providing survival signals, VLA-2 also enhances the proliferation of effector T cells and the production of cytokines. The β1 integrin molecules have been known for quite sometime to provide costimulatory signals for TCR-dependent activation [42, 83]. 202 Indeed, matrix proteins such as Fbn and Lam have been shown to augment TCR-dependent proliferation and IL-2 production [84, 85]. However, contradictory studies were reported regarding the role of Coll I in T cell costimulation. It is noteworthy that most of these studies were conducted with freshly isolated naive T cells from peripheral blood, which do not mimic the extravascular/effector T cells found in inflamed tissues likely to encounter the ECM proteins. Moreover, initially the activation of naive T cells occurs in lymphoid organs such as the spleen and lymph nodes where matrix proteins are not accessible to T cells [6, 10], raising the issue on the physiological significance of β1 integrin/ECM interaction in T cell costimulation. The costimulatory effect of Coll I was demonstrated by Rao et al. who reported that Coll I co-immobilized with anti-CD3 mAb can effectively provide a potent costimulatory signal for TCR-dependent proliferation of human effector T cells [20]. The effect of Coll I was mediated through both VLA-1 and VLA-2 and was stronger to that of Fbn. In this regard, a recent study demonstrated that the costimulatory effect of Fbn on T cell proliferation might be due to its effects on cell spreading, which may augment the surface of contact of T cells with co-immobilized anti-CD3 mAb [21]. This is supported by the fact that the effect of Fbn is lost when anti-CD3 mAb were used in soluble form. In contrast, the cells that bind to the Coll I-coated wells tend to form aggregates and not to spread and the costimulatory effect of Coll I is preserved when anti-CD3 mAb were used in soluble form [21]. We have also shown that soluble collagen can costimulate human effector T cells plated on immobilized anti-CD3 mAb [28] and it was found that Coll I alone enhances Jurkat T cell proliferation [79]. Although additional studies are required to sortintegrins in T cell costimulation, the studies above indicate that collagen–binding integrins including VLA-2 can be considered as true costimulatory molecules. In addition to T cell proliferation, VLA-2 signaling also regulates cytokine production. Coll I enhances TCR-dependent production of TNFα by murine T cells [86] and we have recently demonstrated that VLA-2 ligation with Coll I enhances TCR-dependent production of IFNγ by human effector T cells [28]. The costimulatory effect of Coll I is not a consequence of cell adhesion or an indirect effect on TCR signaling since Coll I also costimulates PMA+ION-induced IFNγ production and soluble Coll I also costimulated TCR-dependent IFNγ production. Coll I alone was also shown to induce IFNγ production 203 in isolated IL-2-responsive T cell clones from the human arthritic synovium [87]. VLA-2 enhances TCR-dependent IFNγ production in human effector T cells by enhancing TCR-dependent activation of ERK and JNK MAPKs and of PI3 Kinase/AKT signaling pathways, which were all involved in the regulation of IFNγ production [28, 88, 89]. Coll I alone increases the phosphorylation of ERK similar to what was found in Jurkat T cells but had no effect on the phosphorylation of JNK and Akt [28, 51]. It is difficult from our studies to assess the contribution of each of these signaling pathways to Coll I-mediated costimulation. However, the fact that Coll IV, which did not augment TCR-dependent IFNγ production, was less potent than Coll I in augmenting TCR-dependent activation of JNK but was comparable to Coll I in enhancing TCR-dependent activation of ERK and AKT strongly suggests that Coll I-mediated enhancement of TCR-dependent JNK activation is a critical pathway in VLA-2-mediated T cell costimulation leading to IFNγ production [28]. Besides IFNγ and TNFα, Coll I can also activate the IL-2 gene promoter [79] and augments TCR-dependent increase in IL-2 mRNA levels in Jurkat T cells [69]. Thus, consistent with the expression of VLA-2 on Th1 cells, it is likely that VLA-2 provides costimulatory signals that enhance the production of Th1 cytokines by effector T cells. A.7 VLA-2 signal transduction Our studies have demonstrated that VLA-2 protects T cells from Fas-induced apoptosis by activating the MAPK/ERK signaling pathway [35, 51] and augments the production of IFNγ by enhancing the TCR-dependent activation of ERK and JNK MAPKs as well as the PI3 Kinase/AKT signaling pathways [28]. In this section we will discuss the findings on how VLA-2 activates the MAPK/ERK pathway and enhances TCR signaling. A.7.1 VLA-2-mediated activation of the MAPK/ERK signaling pathway The first study that suggested that VLA-2 can be connected to the activation of the MAPK/ERK pathway in Jurkat T cells came from the Dedhar’s group. They have shown that activation of VLA-2 with the activating antibody (JBS2) stimulates tyrosine phosphorylation and accumulation of activated Ras, which is upstream in the MAPK/ERK signaling cascade [90]. Along these lines, we found that stimulation of Jurkat T cells or effector human T cells with Coll I increases ERK phosphorylation [51]. The kinetic of ERK activation is slower than that observed in mesenchymal cells upon integrin activation. The 204 phosphorylation of ERK starts between 1 and 2 h and lasts up to 24 h with a maximum reached after 4 h of stimulation. Similar results were recently reported in an independent study [79]. In contrast, we found that Fbn and Lam, which bind to different β1 integrins were only weak inducers of MAPK/ERK in Jurkat T cells suggesting a differential signaling between β1 integrins molecules in T cells [51]. Although the activation of the MAPK/ERK signaling pathway is complex, it is believed that it emanates from a signaling cascade that starts with the activation of Ras, which activates Raf-1, then phosphorylates Mek-1, which in turn phosphorylates ERK. In this context, we have demonstrated that in Jurkat T cells, engagement of VLA-2 with Coll I leads to the activation of the small GTPase Ras, the kinase Raf-1 and the protein phosphatase PP2A, and that these events were all implicated in VLA-2-mediated ERK phosphorylation [35]. Activation of Ras is necessary for that of Raf-1 and inhibitors of both Raf-1 and Ras abrogated the VLA-2-mediated ERK phosphorylation [35]. We have further described a positive role of PP2A in VLA-2-mediated ERK phosphorylation. Coll I activates PP2A in Jurkat T cells and the use of the PP2A inhibitor okadaic-acid abolishes ERK phosphorylation induced by Coll I [35]. PP2A can have both positive and negative effects on activation of the MAPK/ERK siganling cascade [91-95]. On one hand, ERK is known to be dephosphorylated by PP2A, on the other hand PP2A can positively activate Raf-1. Inhibition studies using the PP2A inhibitor indicated that Coll I-mediated PP2A activation is necessary for Coll I-mediated Raf-1 activation. The process by which PP2A activates Raf-1 seems to be exerted at the level of Ser 259 inhibitory site [96, 97]. Dephosphorylation of this site by PP2A contributes to release Raf-1 from 14-3-3 inhibitory proteins and facilitates its translocation to the membrane and interaction with active Ras leading to its activation [97]. Similar to ERK, we found that Coll I-mediated inhibition of Fas-mediated apoptosis is also abrogated in the presence of Ras, PP2A and Raf-1 inhibitors [35]. This can be explained by the fact that these three signaling molecules are important for Coll I-mediated ERK phosphorylation. However, it cannot be excluded that these molecules also contribute independently from ERK to Coll I-mediated survival. In contrast to Coll I, Fbn is a weak inducer of ERK phosphorylation and did not protect Jurkat T cells from Fas-induced apoptosis [35, 51]. Interestingly, Fbn also activates Ras but 205 in contrast to Coll I, failed to activate Raf-1. This could be due to the inability of Fbn to activate PP2A. Therefore, the differential activation of PP2A and Raf-1 can contribute to explain the observed differential capacity of different β1 integrins to activate the MAPK/ERK pathway in T cells. However, additional mechanisms known to be involved in Raf-1 activation such as phosphorylation of Ser 338 and Tyr 340 and 341 [98, 99] can also be differentially regulated by different β1 integrins in T cells. Coll I also activates FAK tyrosine phosphorylation in Jurkat T cells [27] and Coll Idependent signaling involves the CD45 phosphatase, which has been shown to be essential for Coll I-dependent phosphorylation of FAK and ERK [79]. FAK has a central role in connecting integrins to intracellular signaling molecules. Activation of FAK is known to activate Ras, thus providing a link between VLA-2 and Ras activation in Jurkat T cells. Upon integrin engagement, FAK becomes activated by autophosphorylation and by Src kinases. The fully activated FAK then recruits Grb2/SOS, which then lead to the activation of Ras [100]. Activation of FAK and Src kinases has been implicated in Coll I-dependent activation of ERK phosphorylation in Caco-2 colorectal cells [101]. The use of specific Src inhibitors and dominant-negative form of FAK also abolished Coll I-mediated ERK phosphorylation in Jurkat T cells (unpublished results). Thus, VLA-2-mediated activation of FAK/Src kinases is likely to be essential for the observed activation of Ras in Jurkat T cells. The role of CD45 in that process has not been investigated but it was suggested that CD45 might be acting through activation of Src kinases [79]. A.7.2 VLA-2 signaling in the context of TCR In addition of activating intracellular signaling on its own, VLA-2 also enhances TCRdependent signaling. We have shown that coengagement of TCR and VLA-2 led to enhanced tyrosine phosphorylation of FAK [27] and enhanced activation of ERK and JNK MAPKS and PI3 Kinase /AKT signaling pathways [28]. The enhancement of TCRdependent activation of ERK and FAK by VLA-2 can be explained by the ability of Coll I to activate ERK, and FAK on its own. However, Coll I by itself does not activate JNK and AKT in effector T cells [28]. The mechanisms by which VLA-2 enhances TCR signaling are not identified. However, two non- exclusive possibilities can account for the costimulatory effect of Coll I. It is possible that VLA-2 influences the aggregation and localization of TCR within lipid rafts. Interestingly, VLA-2 also localizes within lipid rafts 206 in Jurkat T cells [102] and the use of lipid rafts disrupting agents such as β-methyl cyclodextrin and Nystatin abrogate Coll-I-induced ERK phosphorylation (unpublished results). It is also possible that VLA-2 enhances TCR signaling by enhancing the activation of signaling molecules involved in the activation of MAPK/JNK and PI3 Kinase/AKT signaling cascades. The exact signaling molecules susceptible to be regulated by VLA-2 are unidentified yet. A model by which VLA-2 signaling contributes to T cell costimulation is depicted in Figure 2. 207 Figure 2 : Model for VLA-2-mediated costimulation in T cells. VLA-2 augments the MAP kinases ERK and JNK and the PI3K/AKT signaling cascade initiated by TCR activation. Pathways that have been shown to be activated in T cells (solid arrows) or presumed (dashed arrows) to be coordinately activated by VLA-2 and TCR. These pathways lead to the activation of transcriptional factors like AP-1, NF-AT and NFkB, which in the nucleus control gene expression leading to cell proliferation and survival as well as cytokine production. 208 A.8 Role of VLA-2 in inflammatory diseases Only few studies have addressed the implication of VLA-2 in the development of inflammation and autoimmunity. The first study in that regard came from a group at Biogen-Idec who showed that blockade of VLA-2 with monoclonal antibodies can reduce the development of Th1 diseases including rheumatoid arthritis, delayed type hypersensitivity and contact hypersensitivity [103]. A recent study also reported that treatment of mice with VLA-2 antibody suppressed clinical signs and inflammation of the central nervous system in a model of experimental autoimmune encephalomyelitis when the antibody was given immediately after disease onset [104]. Together, these studies strongly suggest that VLA-2 is an important signaling pathway regulating T cell-dependent immune diseases. Although, the mechanisms contributing to VLA-2 dependent autoimmunity have not been described, it is likely that VLA-2 promotes inflammation by protecting effector T cells from apoptosis, enhancing their proliferation and their production of proinflammatory cytokines such as IFNγ. Effector T cells can also use VLA2 to migrate through intersticial Coll I to reach the inflammatory sites. Although the mechanisms governing T cell migration in Coll I are complex and can be independent from β1 integrins [105]. Therefore, the studies above suggest that VLA-2 can be essential for the development of autoimmunity. However, it is still unclear if it is required for protective immunity. A recent study by the group of Stockinger [106] showed that during infection, two effector/memory T cells can be generated as defined by the expression of VLA-2. It was shown that VLA-2-positive memory Th cells are protective against intracellular bacterial infection and viral infection. However, VLA-2-positive memory Th cells are associated with immunopathology during viral infection and VLA-2-negative memory Th cells can be as protective as VLA-2-positive effector Th cells [106]. Thus VLA-2 can be selectively involved in protective immunity. Additional studies are required to examine the in vivo function of VLA-2 in both autoimmunity and protective immunity. 209 A.9 Concluding remarks T cell costimulation is a critical process in the regulation of T cell-dependent immunity and occurs during different stages of T cell activation and on different subsets of T cells. The molecules of the CD28 and TNF/TNFR families are known as costimulatory molecules. The studies reviewed herein strongly suggest that VLA-2 can be added to the list of T cell costimulatory molecules. As discussed, VLA-2 promotes the proliferation and the survival of effector T cells and enhances the production of proinflammatory cytokines. Animal models of inflammation have also implicated VLA-2 in T cell-dependent autoimmunity. Furthermore, VLA-2 may also play a role in the progression of lymphoid tumour T cells. VLA-2 deficient mice have been generated and seem to be normal except for a defect in the adhesion of platelets to collagen [107]. Future studies examining the function of VLA-2 in vivo as well as the mechanisms of VLA-2 signaling will certainly bring new insights into the function of VLA-2 in T cell-dependent immunity. These studies will likely determine if VLA-2 can constitute a molecular target in autoimmune diseases and/or if it can be used for future design of vaccines. 210 A.10 References 1. Goldman, R., Harvey, J. and Hogg, N. 1992, Eur. J. Immunol., 22, 1109. 2. Santoro, S. A. 1986, Cell, 46, 913. 3. Santoro, S. A., Rajpara, S. M., Staatz, W. D. and Woods, V. L., Jr. 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 217. 4. Wayner, E. A. and Carter, W. G. 1987, J. Cell Biol., 105, 1873. 5. Hemler, M. E. 1990, Annu. Rev. Immunol., 8, 365. 6. Krivacic, K. A. and Levine, A. D. 2003, J. Immunol., 170, 5034. 7. Hemler, M. E., Glass, D., Coblyn, J. S. and Jacobson, J. G. 1986, J. Clin. Invest., 78, 696. 8. Pribila, J. T., Quale, A. C., Mueller, K. L. and Shimizu, Y. 2004, Annu. Rev. Immunol., 22, 157. 9. 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