Analyses urinaires (suite)

EDE Biotechnologie Séance 9 Lycée Margueritte
Analyses urinaires (suite)
Objectifs :
- réalisation d'un gram
- orienter l'identification d'une bactérie
- ensemencer une galerie d'identification
- réaliser un isolement
L'incubation de la mise en culture de l'urine de Mme SISTITE est terminée. La photographie ci dessous
représente le résultat l'ensemencement de l'urine de la patiente :
1 – En utilisant l'annexe 1, conclure sur la concentration microbienne de l'urine de la patiente.
2 – Reprendre les différents résultats de l'ECBU et conclure sur une éventuelle infection urinaire chez
Mme SISTITE en vous appuyant sur l'annexe 2.
3 – Il convient maintenant d'identifier la bactérie responsable de l'infection urinaire chez notre patiente.
Pour cela, vous devez d'abord orienter le genre microbien en effectuant :
➢Un gram qui permettra de donner le type de bactérie.
→ Déjà réalisé lors des 1ères analyses de l'urine mais en refaire un pour contrôle (protocole en annexe de
la séance 8)
➢Un test enzymatique qui permettra d'orienter vers un ou plusieurs genres bactériens.
→ Choisir le test enzymatique à effectuer à l'aide de l'annexe 3. Faire vérifier votre choix à l'enseignant
avant sa mise en œuvre (protocoles des tests enzymatiques en annexes 4 et 5).
L'orientation de l'identification bactérienne maintenant réalisée, l'identification précise de la bactérie
responsable de l'infection urinaire de Mme SISTITE doit être effectuée. Pour cela, on utilise des galeries
miniatures appelées galeries API®. Ces galeries permettent de mettre en évidence différents caractères
biochimiques des bactéries. Par exemple, la bactérie est-elle capable d'utiliser, de fermenter le glucose ?
Ainsi, après inoculation des galeries, les bactéries utiliseront certains nutriments.
Chaque espèce bactérienne possède un profil biochimique qui lui est propre. Ainsi, la lecture des
résultats de la galerie API® permettra d'identifier précisément une bactérie par son genre et son espèce
grâce à son profil biochimique.
Il existe plusieurs galeries API. On compte notamment :
•la galerie API® 20 A pour les bactéries anaérobies
•la galerie API® 20 E pour les entérobactéries (bacilles gram -, oxydase -)
•la galerie API® Staph pour les staphylocoques
•la galerie API® 20 NE pour les Non entérobactéries (bacille gram -, oxydase +)
•la galerie API® Candida pour les levures
•etc …
4 – Choisir la galerie API® adaptée à l'identification de la bactérie de l'urine de Mme SISTITE.
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5 – A l'aide de la notice d'utilisation de la galerie API® choisie et de la présentation faite par l'enseignant,
réaliser l'inoculation de votre galerie API®. (Réaliser une galerie par binôme).
En parallèle de la galerie API® , il est nécessaire de réaliser un isolement de l'inoculum bactérien afin de
vérifier après 24h d'incubation si celui-ci était bien pur lors de son utilisation. C'est à dire si un seul type
de bactérie a été inoculé dans la galerie. En effet, si plusieurs types bactériens sont présents dans la
galerie les résultats ne pourront pas être interprétés et il faudra recommencer l'analyse.
Afin de vérifier la pureté de l'inoculum, il convient donc de réaliser un isolement de celui-ci sur une
gélose nutritive.
6 – Réaliser l'isolement de votre inoculum selon la technique de l'isolement en quadrant (protocole en
annexe du TP précédent). (Un isolement par élève sera effectué).
ANNEXES
Annexe 1 : Numération bactérienne pour l'ensemencement d'une urine
Annexe 2 : Interprétation des résultats d'une ECBU
Leucocytes/ mL UCF/ mL Interprétation
< 10 000 0 Stérile – absence d'infection
< 10 000 < 103 *
> 10 000 0 Plusieurs causes possibles:
traitement antibiotique avant
prélèvement,
tuberculose,
infection génitale, …
→ A recontrôler
> 10 000 > 103 * Infection urinaire
* : dans le cas d'une culture monomicrobienne. Une culture polymicrobienne peut éventuellement faire penser à
une contamination du prélèvement (par bactéries commensales). Le prélèvement sera à refaire.
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Annexe 3 : Orientation de l'identification des bactéries
Annexe 4 : Réalisation du test Oxydase
1 – Placer un disque (ou un morceau de papier filtre) sur une lame.
2 – Déposer une goutte de réactif oxydase sur le disque.
3 – A l'aide d'une pipette pasteur, prélever une colonie bactérienne et la déposer sur le disque imprégné
de réactif. (Remarque : ne pas utiliser l'oese en fer car le résultat pourrait être faussé).
4 – Attendre environ 20 à 30 secondes et observer le résultat.
Une coloration violette indique un résultat positif. La bactérie possède une oxydase, elle est donc
« oxydase + ».
Une absence de coloration indique un résultat négatif. La bactérie ne possède pas d'oxydase. Elle est
donc « oxydase - ».
Annexe 5 : Réalisation du test Catalase
1 – Déposer sur une lame une goutte d'eau oxygénée (H2O2).
2 – Prélever une colonie bactérienne à l'aide d'une oese stérilisée.
3 – Déposer la colonie dans la goutte d'eau oxygénée.
4 – Observer la réaction : La présence de bulles traduit la présence d'une catalase, la bactérie est donc
« catalase + ». L'absence de bulle indique que la bactérie ne possède pas de catalase, elle est donc
« catalase - ».
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Bacilles Gram -
Cultivant en aérobiose
Sur milieu ordinaire
Oxydase + Oxydase -
Aéro-anaérobie
facultatif :
Vibrio,
Aeromonas,
Plesiomonas
Aérobie strict :
Pseudomonas,
Alcaligenes
Aéro-anaérobie
facultatif :
Entérobactéries
Aérobie strict :
Acinetobacter,
Stenotrophomonas,
Maltophilia
Bacilles Gram +
Catalase - Catalase +
Lactobacillus
Erysipelotrix Corynebacterium
Listeria
Bacillus
(production de
spores)
Coques Gram +
Coques Gram -
Cocobacilles
Oxydase + Oxydase -
Neisseria
Branhamella
Moraxella Acinetobacter
Catalase -
Catalase +
Oxydase + Oxydase -
Micrococcus
Stomatococcus
Staphylococcus
Enterococcus
(résitant NaCl 6,5%)
Streptococcus
Lactococcus
Pediococcus
Leuconostoc