Prédisposition Génétique au Paludisme

Master BBSG P Rihet
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Contrôle génétique de l’infection,des
formes simples et des formes graves
De l’approche gène candidat au
clonage positionnel
Prédisposition Génétique au Paludisme
• Objectif: Identifier, chez l’homme, des
Gènes et leurs Variants Impliqués dans le
Contrôle de la Résistance au Paludisme
– Études dans une population humaine vivant
dans une zone endémique
– Études dans un modèle animal de la maladie
humaine
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Différences de Séquence d’ADN expliquant des Différences de Résistance
Individu
Résistant
Gène X
Met A
T
G
Val G
T
C
Ser T
C
A
Leu C
T
G
Gln C
A
A
Pro C
G
G
Cys T
G
T
Individu
Sensible
A Met
T
G
G Val
T
C
T Ser
C
A
C Leu
T
G
T*
A
A
C
G
G
T
G
T
Polymorphisme
Associé à la
Susceptibilité
Change qualitativement/quantitativement
L’expression du gène
=>Modifie la séquence protéique
=>Modifie la quantité de la protéine
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Des Souris et des Hommes
• 1.Données du problème
– Phénotypes pertinents
– Composante génétique
• 2. Approche gène candidat
– Etude d’association chez l’homme
– Ciblage génique chez la souris
• 3. Clonage positionnel
–
–
–
–
Outils moléculaires et concepts
Analyses de liaison génétique/génome humain
Analyses de liaison génétique/génome de la souris
Identification des gènes et génomique fonctionnelle
Résistance/Susceptibilité de
l ’Hôte au Paludisme….Une
Notion Complexe
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Quels sont les Phénotypes Pertinents?
Formes Simples
(symptomes cliniques dont la
fièvre)
Stades
Sanguins
Asexués
Formes sévères
-anémie sévère
-neuropaludisme
(convulsions generalisées, coma)
-Détresse respiratoire sévère
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Quels sont les Phénotypes Pertinents?
Phenotypes 2
Accès Palustre
-présence/absence
-risque
Phenotypes 1
Parasitémie
Phenotypes 3
Anémie sévère
Neuropaludisme
Détresse respiratoire
-présence/absence
-risque
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Quels sont les Phénotypes Pertinents ?
Phenotypes 1
Parasitémie
Moyenne ou Maximale
Parasitémie
Accès
Seuil clinique
dépendant de
l’âge
temps
Phenotypes 2
Accès Palustre
Phenotypes 3
Formes sévères
AS, NP et DRS
Prédisposition Génétique au Paludisme:
De l’infection à la maladie
Piqûres infestantes de moustiques
400 enfants
Infections asymptomatiques
200
Accès palustre
Paludisme sévère 1
100
Prédisposition Génétique au Paludisme?
Parasite
- Taux de multiplication
- Cytoadhérence
- Variations antigéniques
- Résistance aux
thérapeutiques
Hôte
- Age
Devenir de l’infection
- Immunité
- Immunopathologie
- Facteurs génétiques
Phénotypes liés à l’infection par
P.falciparum
Vecteur
Exposition
- Dose inoculum
- Résistance aux insecticides
-
Facteurs socioéconomiques
- Stabilité
politique
- Facteurs culturels
- Lutte anti-vectorielle
- Accès au traitement
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Y-a-t-il un contrôle génétique des Phénotypes Pertinents?
• Quelles approches pour évaluer l’existence
d’une composante génétique?
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Y-a-t-il un contrôle génétique des Phénotypes Pertinents?
• Aggrégation familiale des formes sévères (Ranque
2005), des formes simples (Traoré 1999), des
hauts niveaux d’infection (Abel 1992), des taux
d’anticorps (Aucan 2001)
• Etude de jumeaux monozygotes vs dizygotes:
formes simples (Jepson 1995), des taux
d’anticorps (Sjoberg 1992)
• Etude de populations sympatriques: formes
simples (Modiano 1996), des hauts niveaux
d’infection (Modiano 1996), des taux d’anticorps
(Modiano 1998)
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Si oui, le modèle génétique des Phénotypes Pertinents est simple?
• Analyses de ségrégation=>modèle
génétique plutôt complexe
• Parasitémie (Abel 1992, Garcia 1998, Rihet 1998)
• Taux d’anticorps (Stirnadel 1999)
=>plusieurs gènes contrôlent les phénotypes
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Le paludisme, une maladie multifactorielle
Maladie monogénique/1 gène
Maladie/un gène majeur
Maladie oligogénique/qq gènes
Maladie multifactorielle
Maladie polygénique/
De nombreux gènes
Environnement/
0 gène
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Le paludisme, une maladie multifactorielle
• De nombreuses inconnues:
–
–
–
–
–
–
Nombre de gènes et d’allèles impliqués
Impact de chacun des gènes et allèles (héritabilité)
Mode héréditaire
Fréquences des allèles morbides
Localisation sur le génome
Identité des gènes et allèles
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Etude de populations humaines
• Objectif: Identifier, chez l’homme, des Gènes et
leurs Variants Impliqués dans le Contrôle de la
Résistance au Paludisme
– Contrôle de la Parasitémie
• phénotypes 1: parasitémie
– Prédisposition aux formes Simples
• phénotypes 2: fièvre
– Prédisposition aux formes Sévères
• phénotypes 3: AS, NP, DRS
Prédisposition Génétique au Paludisme:
De l’infection à la maladie
Piqûres infestantes de moustiques
400 enfants
Gènes contrôlant la parasitémie
Infections asymptomatiques
200
Gènes contrôlant la survenue d’accès palustres simples
Accès palustre
100
Gènes contrôlant la survenue d’accès palustres sévères
Paludisme sévère 1
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Des Souris et des Hommes
• 1.Données du problème
– Phénotypes pertinents
– Composante génétique
• 2. Approche gène candidat
– Etude d’association chez l’homme
– Ciblage génique chez la souris
• 3. Clonage positionnel
–
–
–
–
Outils moléculaires et concepts
Analyses de liaison génétique/génome humain
Analyses de liaison génétique/génome de la souris
Identification des gènes et génomique fonctionnelle
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
• Hypothèse: le Gène/Variant est Impliqué
dans le Contrôle du Phénotype/Maladie
• 2 méthodes d’analyse chez l’homme:
– Cas-contrôle (comparaison des fréquences alléliques)
– Etude familiale (Transmission/Disequilibrium Tests)
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
• Comment choisir le gène/variant candidat?
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
• L’hypothèse (le Gène/Variant est Impliqué dans le
Paludisme) est basée sur:
– La fonction du gène:
• Gène impliqué dans le système immunitaire et potentiellement
impliqué dans la défense de l’hôte ou dans la physiopathologie
• Gène impliqué dans la cytoadhérence potentiellement impliqué
dans la physiopathologie
• Gène impliqué dans la physiologie du globule rouge,
« habitat » des stades sanguins
– La présence de déficiences fréquentes au niveau de
gènes du globule rouge (ie hémoglobinopathies) dans
des zones d’endémie palustre
• Hémoglobines S et C=>gène de la β-globine
• Thalassémies=> gènes des β-globine et α-globine
Approche Gène Candidat:
Un cas d’école, l’hémoglobine
• Gène codant pour la β-globine (chromosome
11p15.5)
• les mutations S et C concernent deux bases
voisines dans le 6ème codon:
HbS: GAG->GTG (glu->val)
HbC: GAG->AAG (glu->lys)
Approche Gène Candidat: un cas d’école
L’effet Protecteur de l’Hémoglobine S contre le
Paludisme Sévère en Gambie
AA
AA
AS
AS
Approche Gène Candidat: un cas d’école
L’effet Protecteur de l’Hémoglobine S contre
le Paludisme Sévère en Gambie
AS
AS
Odds ratio
OR=0,11
OR<1: allèle associé à la protection
OR>1: allèle associé à la susceptibilité
Prédisposition Génétique au Paludisme
Comment expliquer l’effet protecteur des Hb S et C?
• Limitation de la croissance du parasite dans certaines
conditions
• Elimination favorisée des globules rouges infectés
• Exposition modifiée des antigènes à la surface des
parasites
• Stimulation de la réponse immunitaire
• Diminution de la cytoadhérence des globules rouges
infectés à la surface des cellules endothéliales
Prédisposition Génétique au Paludisme
L’effet protecteur des Hb S et C, en résumé
• L’effet est confirmé par de nombreuses études
• L’effet est important (Odds ratio jusqu’à 0,07)
• L’Hb S et l’HBC protègent contre le paludisme
simple et sévère
• MAIS l’effet ne concerne qu’une petite fraction de
la population qui présente une résistance au
paludisme
• Globalement, l’effet de l’Hb ne représenterait que
2% de l’incidence des accès palustres simples
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
• L’hypothèse (le Gène/Variant est Impliqué
dans le Paludisme)
est basée
sur:
Diapositive
0
– La fonction du gène:
• Gène impliqué dans le système immunitaire et
potentiellement impliqué dans la défense de l’hôte
ou dans la physiopathologie
• =>QUELS MÉCANISMES IMMUNITAIRES?
Prédisposition Génétique au Paludisme
Principaux mécanismes immunitaires anti-Plasmodium
Anticorps bloquant l’invasion
Immunité cellulaire
Anticorps bloquant l’invasion
Anticorps anti-toxines
Anticorps bloquant la séquestration
Dans les organes profonds
Phagocytose et ADCC
Immunité cellulaire
Prédisposition Génétique au Paludisme
Immunité cellulaire au niveau du foie
D’après Doolan and Hoffman
Prédisposition Génétique au Paludisme
Phagocytose et ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity),
Mécanismes effecteurs anti-stades sanguins
Infected Red Cells
FcγRIIA
TNF
Mérozoïte
Effector Cells
Ac non cytophile vs cytophile
Prédisposition Génétique au Paludisme
Neuropaludisme
Système immunitaire, cytoadhérence et neuropaludisme
IL6
IL1
ICAM-1
CD36
pRBC: globule rouge infecté
T
CD8
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat/Etudes Cas-Contrôle
Gènes associés au Paludisme Sévère
type de
molécules
molécules
érythrocytaires
molécules
d'adhésion
molécules
immunologiques
gènes
localisation
HBA1 et HBA2 (!-globine)
16pter-p13.3
"-globine
11p15.5
groupes sanguins ABO
9q34
haptoglobine
16q22.1
G6PD
Xq28
Band3 (SLC4A1)
17q21-q22
ICAM-1
19p13.3-p13.2
CD36
7q11.2
NOS2
17cen-q11.2
HLAB
6p21.3
HLADRB1-DQB1
6p21.3
TNF
6p21.3
IL12B
5q31.1-q33.1
IL13
5q31
IL1B
2q14
IFNRA1
21q22.1
IFNRG
6q23-q24
CD40L
Xq26
FcgRIIA et FcgRIIB
1q21-q23
Gènes associés au Paludisme Simple
type de
molécules
molécules
érythrocytaires
molécules
immunologiques
gènes
chromosomes
!-globine
11p
HBA1 et HBA2 ("-globine)
16p
G6PD
7q
NOS2
17cen-q
IL1A
2q14
Odds ratio
0,07<OR<9
Excepté Hb:
0,3<OR<5
Rappel:
OR<1: allèle associé à la protection
OR>1: allèle associé à la susceptibilité
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
Gènes du Système
Immunitaire et Molécules
d’Adhésion
Gènes codant pour
Molecules Erythrocytaires
thalassemias
G6PD
HbS
HbC
Case-control
ASSOCIATION
Case-control
ASSOCIATION
Anémie sévère
Neuropaludisme
*CD40L,γIFNR
ICAM1, IL12B
TNF, HLAB,
HLADRB1-DQB1
iNOS
Accès Palustre
Parasitémie
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat/Etudes Cas-Contrôle
• Biais possible dans les études cas-contrôle dû à
des fonds génétiques différent dans les
populations cas et contrôle
– Différence de fréquence allélique entre les deux
populations au niveau de nombreux loci répartis sur le
génome (rien à voir avec la maladie étudié)
• Solution: contrôle à l’intérieur des familles
– Association de la transmission d’un allèle donné des
parents aux enfants
Prédisposition Génétique au Paludisme
Etude de gènes candidats: Etude familiale ie TDT
(Transmission Disequilibrium Test)
1 Parent Hétérozygote
M1M2
2 Allèles
1 Enfant Atteint
-Comparaison des allèles transmis par les parents hétérozygotes
à l ’enfant atteint avec les allèles non transmis (Spielman 1993)
-Développement de nouveaux tests TDT
. Parents manquants
. Marqueurs multialléliques
. Plusieurs enfants par famille
. Phénotypes quantitatifs
. Analyse multipoint
Prédisposition Génétique au Paludisme
Etude familiale ie TDT
• Un étude en Gambie montre l’effet protecteur de
l’hémoglobine S contre le paludisme sévère (Ackermann et
al 2005)
• Une étude au Burkina Faso montre l’effet protecteur de
l’hémoglobine C contre le paludisme simple (Rihet et al
2004)
• Une étude en Gambie et une autre au Mali montre
l’influence de polymorphismes du gène IFNγ et de son
récepteur IFNγRI sur le paludisme sévère (Cabantous et al
2005; Koch et al 2003)
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche gène candidat et contribution des modèles murins
• Démonstration directe du rôle d’un gène par
ciblage génique (KO) ou transgénèse:
– Ex: le gène X est-il impliqué dans la résistance
à une maladie?
• KO d’un gène chez une souris R
• Transgénèse du gène (provenant d’une souris R)
chez une souris S
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Gène Candidat
• Hypothèse: le Gène/Variant est Impliqué
dans le Contrôle du Phénotype/Maladie
• Plusieurs gènes et variants prédisposant au
paludisme ainsi identifiés
• Limite: faible nombre de gènes testés et
gènes testés nécessairement connus
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Des Souris et des Hommes
• 1.Données du problème
– Phénotypes pertinents
– Composante génétique
• 2. Approche gène candidat
– Etude d’association chez l’homme
– Ciblage génique chez la souris
• 3. Clonage positionnel
–
–
–
–
Outils moléculaires et concepts
Analyses de liaison génétique/génome humain
Analyses de liaison génétique/génome de la souris
Identification des gènes et génomique fonctionnelle
Génétique classique vs Clonage positionnel
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Clonage Positionnel
• Etapes:
– Localiser les Gènes de Prédisposition sur le
Génome Humain ou Murin (Liaison Génétique)
– Identifier les Gènes Associés à la
Résistance/Susceptibilité au Paludisme
– Identifier les Variants Impliqués dans la
Résistance/Susceptibilité au Paludisme
Positional Cloning
Genomic Candidate
sequences
genes
The Human Genome Project
Family
studies
Chromosome
interval
Segregation and Linkage
Analyses
Fine Genetic
Mapping
Disease
mutation
Met A
T
G
Val G
T
C
Ser T
C
A
Leu C
T
G
Gln C
A
A
Pro C
G
G
Cys T
G
T
A Met
T
G
G Val
T
C
T Ser
C
A
C Leu
T
G
T*
A
A
C
G
G
T
G
T
Identification of
Genes
Causing the Disease
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche Clonage Positionnel
• Etape de localisation des gènes de
prédisposition basée sur une analyse de
liaison génétique
• =>comment définir une liaison génétique?
• =>quels outils moléculaires utiliser?
• =>des scores de liaison génétique?
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique
• Liaison génétique (Linkage): coségrégation
de deux ou plusieurs allèles au cours des
générations en raison de la proximité de leur
locus sur le génome/sur le même
chromosome.
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique
• Liaison génétique d’un marqueur génétique
avec un phénotype (trait qualitatif ou
quantitatif): coségrégation d’allèles du
marqueur génétique avec (l’allèle de
prédisposition à) la maladie au cours des
générations (en raison de la proximité de
leur locus sur le génome/sur le même
chromosome).
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique:
Le Lodscore basé sur un
Rapport de vraisemblance
(Hypot liaison génétique vs
Hypot non liaison génétique)
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique: les outils moléculaires
Les marqueurs microsatellites:
– allèles identifiés par leur taille
– répartis sur l’ensemble du génome
Les SNPs:
-substitution/délétion-insertion d’une seule bp
-de nombreuses techniques pour les typer/identifier
-répartis sur l’ensemble du génome
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique: les outils moléculaires
Les marqueurs microsatellites:
–allèles identifiés par leur taille/ nb de répétitions
de tetra, tri ou dinucléotides: ex= (CA)n
–répartis sur l’ensemble du génome: carte 1996 du généthon
5264 microsatellites
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique: les microsatellites
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique: les SNPs
Les SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms):
-substitution/délétion-insertion d’une seule bp
TTGTCCC allèle -590C/ promoteurIL4
TTGTTCC
allèle -590T/ promoteurIL4
-de nombreuses techniques pour les typer/identifier
(RFLP, SSCP, DHPLC, séquençage)
-répartis sur l’ensemble du génome: 1ère carte publiée
en 2001: 1.42 millions SNPs sur le génome humain
Clonage positionnel
Analyse de liaison génétique: les SNPs
Typage par PCR-RFLP
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Deux régions chromosomiques contenant des gènes de prédisposition
OMIM
Online Mendelian Inhritance in Man
MIM248310
PLASMODIUM FALCIPARUM BLOOD INFECTION LEVELS, PFBI
Gene map locus 5q31-q33
Rihet et al. (1998) provided evidence for linkage of the level of blood infection with Plasmodium
falciparum and the chromosome region 5q31-q33, which contains numerous candidate genes
encoding immunologic molecules. They performed a sib-pair linkage analysis on 153 sibs from 34
families. The results, obtained by means of a 2-point Haseman-Elston method and a nonparametric
approach, showed linkage of parasitemia to D5S393 (P = 0.002) and D5S658 (P = 0.0004).
Multipoint analyses confirmed linkage, with a peak close to D5S658. The heritability of the locus
was 0.48, according to the 2-point results, and 0.43, according to the multipoint results; this
indicated that its variation accounted for approximately 45% of the variance of blood infection levels
and that the locus plays a central role in the control of parasitemia. Garcia et al. (1998) and Flori et al.
(2003) also found association between P. falciparum blood infection levels and 5q31-q33.
Hernandez-Valladares et al. (2004) used an F(11) advance intercross line in a population of mice
infected with Plasmodium chabaudi to identify mouse quantitative trait loci (QTLs) for control of
parasitemia on mouse chromosomes 11 and 18, which carry regions homologous to human 5q31q33. They identified a novel QTL for parasitemia control on mouse chromosome 11, linked to
marker D11Mit242, and involved in the clearance stages of the parasites from the bloodstream.
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Deux régions chromosomiques contenant des gènes de prédisposition
OMIM
Online Mendelian Inhritance in Man
MIM609148
MALARIA, MILD, SUSCEPTIBILITY, MALS
Gene map locus 6p21.3
Tumor necrosis factor-alpha (TNF; 191160) is thought to be a critical mediator of malaria
fever, and mild malaria was previously reported to be linked to the MHC region containing
the TNF gene (Jepson et al., 1997). Flori et al. (2003) analyzed 34 families from Burkina Faso
to test for linkage between polymorphisms within the MHC region and mild malaria. Twopoint analysis indicated linkage of mild malaria to TNFd (lod = 3.27), a highly polymorphic
marker in the MHC region. Multipoint analysis also indicated evidence for linkage of mild
malaria to the MHC region, with a peak close to TNF (lod = 3.86). The authors proposed that
genetic variation within TNF may influence susceptibility to mild malaria, but TNF alleles
associated with resistance to severe malaria, including the TNF-308 (191160.0004)
polymorphism, are unlikely to explain linkage of mild malaria to the MHC region.
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Chromosome 5q31-q33
Candidate Genes
5q
cM
3
q31.1
q31.2
q31.3
q32
q33.1
q33.2
q33.3
q34
q35.1
q35.2
q35.3
3.5
1.8
D5S642
IL13
IL4
IL5
IRF1
IL3
CSF2
D5S2117
IL9
D5S393, D5S399
D5S658
CD14
Markers
4.6
2.7
2.9
3.2
1.6
D5S436
ADRB2
D5S2090
C SF1R
D5S636
D5S2012
D5S487
IL12B
Chromosome 5q31-33
24
D5S487
D5S2012
D5S636
D5S2090
D5S436
D5S658
D5S399
p=0.0008
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
2
D5S393
2.5
8
D5S642
3
7
6
5
4
D5S2117
0.5
3
2
1
1
0
Multipoint Z-score
Score de liaison génétique
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Chromosome 5q31-q33
3.5
B
1.5
0
cM
Analyse de Liaison Génétique entre le Chromosome
5q31-q33 et la Parasitémie
Zone urbaine Zone rurale
Zone rurale
(Burkina faso) (Burkina faso) (Cameroun)
Rihet et al 1998
Familles
(Pedigres)
Germains
Paires de
(demi)germains
P (Liaison Génétique)
P (Liaison-Association)
Héritabilité
Flori et al 2003
Garcia et al 1998
34
44(84)
9
153
285
195
337
25
26
0.0008
0.00001
0.48
0.007
0.00006
0.46
<0.05
(ND)
-
Rihet et al., Am J Hum Genet, 1998, 63(2):498
Garcia et al, Am J Trop Med Hyg, 1998, 58(6):705
Flori et al Genes Immunity, 4, 265
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Le chromosome 5q31-q33 est lié à d’autres maladies
•
IGES (IMMUNOGLOBULIN E CONCENTRATION)
• Marsh et al. (1994), Meyers et al. (1994)
•
BHR1 (BRONCHIAL HYPERRESPONSIVENESS, ASTHMA)
• Postma et al. (1995), The Collaborative Study on Genetics of Asthma (1997),
•
EOS (EOSINOPHILIA, FAMILIAL)
• Lin et al. (1997), Rioux et al. (1998)
•
SM1 (S MANSONI INFECTION,SUSCEPTIBILITY/RESISTANCE)
• Marquet et al. (1996), Muller-Myhsok et al. (1997).
•
PFBI (P FALCIPARUM BLOOD INFECTION LEVELS)
• Rihet et al (1998), Garcia et al (1998), Flori et al (2003)
Prédisposition Génétique au Paludisme:Analyse de liaison génétique
Le chromosome 5q31-q33 contient de nombreux gènes du système immunitaire
Monocytes
IL-2
CPA
IRF1
IFN-γ
Th1
IL-12
CPA
IL-4
IFN-γ
Th0
IL-3
GM-CSF
Elimination
of Parasites
- Phagocytosis
- ADCC
- ADCI
IL-10
IL-4
Th2
Eosinophils
Neutrophils
IL-5
cytophilic IgG
CPA
IL-2
IL-4
IL-4
IL-5
IL-9
IL-13
IL-6
IL-10
LB
IgG4
B Lymphocytes
Prédisposition Génétique au Paludisme et chromosome 5q31-q33 :Hypothèse
Gènes contrôlant la réponse immunitaire protectrice et la parasitémie
Gènes (chromosome 5q31-q33)
Balance Th1/Th2
Prolifération,
différenciation et
activation des
cellules effectrices
Production des
anticorps cytophiles
et non cytophiles
Réponse immunitaire protectrice
Parasitémie
Une Région chromosomique d’intérêt:
la région 6p21-p23
Chr 6
6p21.3
Classe II
CMH
Classe III
TNF
Classe I
Gènes codant pour des molécules immunologiques
Une Étude Familiale Longitudinale au Bukina faso:
Chromosome 6p21-p23 et Accès Palustre Simple
Phénotypes:
-Accès: oui/non
-Risque d’accès
(effet de l’âge inclus)
-Parasitémie maximale
(effet de l’âge inclus)
Parasitémie
Accès
Parasitémie maximale
Temps
(2 ans)
Analyse de Liaison Génétique entre le Chromosome
6p21-p23 et le Risque d ’Accès Palustre
Flori et al (2003), Hum Mol Genet,12(4): 375
TNF
4,5
4
3,5
LOD score = 3,86
P= 1,22.10-5
3
2
MHC
class I
0,5
A
0
CB
1cM
DR DQ DP
TNFb
TNF-308, -244, -238
TNFd
1
MHC
Class II
1 cM
D6S291
1,5
D6S276
Lod score
2,5
Analyse de Liaison Génétique entre le Chromosome
6p21-p23 et la Parasitémie Maximale
TNF
3
2
1,5
1
cMH classe I
CMH classe II
1 cM
0,5
A
CB
DRDQ DP
Carte génétique
D6S291
TNFb
TNF-308, -244, -238
TNFd
0
D6S276
Lod score
2,5
LOD score = 3,55
P= 0,0002
Recherche systématique des mutations présentes dans le
gène TNF dans la population d ’étude
 Analyse de 16 fragments du gène TNF (3,6Kb).
 Recherche des mutations dans le promoteur, les exons et les
introns par DHPLC (Denaturing High Performance Chromatography)
et Séquençage.
 Test d’association entre les mutations dont la fréquence est
supérieure à 0,01 et la parasitémie maximale et le risque d’accès
palustre.
Mutations détectées dans le gène TNF
4
2395
3 ’
2053
3
1304
851
732ins
610ins
420
472, 489
2
267
1
-308
-244, -238
-163
-863, -857
-1031
-376*
Promoteur
5 ’
100pb
exon
intron
* Mutation non détectée
Fréquence supérieure à 0,01
SNPs du TNF associés avec les accès palustres simples
4
2395
3 ’
2053
3
1304
851
732ins
610ins
420
472, 489
238
-163
-244, -
2
267
1
-308
-863, -857
-1031
-376*
Promoteur
5 ’
100pb
exon
intron
* Mutation non détectée
SNPs du TNF associés avec les accès palustres
simples et/ou sévères
SNPs du TNF associés au paludisme sévère
4
2395
3 ’
2053
3
1304
851
732ins
610ins
420
472, 489
238
-163
-244, -
2
267
1
-308
-863, -857
-1031
-376*
Promoteur
5 ’
100pb
exon
intron
* Mutation non détectée
Rôle de TNF dans la survenue
d ’accès simples
• Pic de liaison génétique au niveau du gène TNF
• Plusieurs SNPs associés aux accès simples
– Les polymorphismes du TNF expliquent pour partie les
différences de risque d ’accès palustre entre les
individus
• Injection d’Ac anti-TNF inhibe la fièvre chez des
sujets infectés par P.falciparum
– le TNF est impliqué
Rôle de TNF dans la survenue
d ’accès sévères
• Taux élevés de TNF associés au paludisme sévère
et à une mortalité plus élevée (Grau 1989;
Kwiatkowski 1990)
• Modèle souris(P. berghei ANKA):
– Injection d ’Ac anti-TNF protège des souris
– Souris TNFR2 KO protégées
– (Grau et al 1987 ; Lucas et al 1997)
• Plusieurs SNPs associés au paludisme sévère (pas
d’étude systématique)
Des Gènes de Prédisposition sont Localisés…Et Après???
Chromosome 5
6p21-p23
TNF
700 genes Autre?
5q31-q33
400 genes
Chromosome 6
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et contribution des modèles murins
– Localiser les Gènes de Prédisposition sur le
Génome Humain (Liaison Génétique)
• Localisation 1: Liaison Génétique
• Localisation plus fine: déséquilibre de liaison (ie
augmenter la densité des marqueurs/analyses TDT)
• Localisation plus fine: comparaison des génomes
homme-souris…à condition que les régions liées à
la résistance au paludisme chez l’homme et chez
la souris contiennent des gènes orthologues
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et contribution des modèles murins
• De nombreuses similitudes sur les plans
génomiques, physiologiques et
physiopathologiques entre l’homme et la souris
• Séquence complète des deux génomes
• Conservation de la synténie
• De nombreuses lignées consanguines disponibles
avec des phénotypes contrastés
• Des croisements entre 2 lignées consanguines
ayant des phénotypes différents
• Démonstration directe du rôle d’un gène par KO
ou transgenèse
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et contribution des modèles murins
• Des croisements entre 2 lignées
– résistante au neuropaludisme (R)
– Sensible au neuropaludisme (S)
– =>obtention des souris F2
– =>association entre le génotype des souris F2 et un trait
QUALITATIF, le neuropaludisme:
– => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN
SIMPLE X2
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et contribution des modèles murins
• Des croisements entre 2 lignées
– L’une contrôlant bien l’infection par P.chabaudi
(résistante R)
– L’une contrôlant mal l’infection par P.chabaudi
(sensible S)
– =>obtention des souris F2
– =>association entre le génotype des souris F2 et un trait
QUANTITATIF, la parasitémie
– => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN
SIMPLE t-test ou test de Mann-whitney
Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme
Ou comment exploiter la conservation de la synténie homme-souris
Chromosomes
6p21-p23 region
linked
to mild malaria
Linked to
P.chabaudi+
P berghei
Resistance/
susceptibility
Burt et al, 1999
Hernandez et al, 2004
Ohno et al, 2004
Human
chromosome 6
1
4
8
9
10
13
17
Mouse syntenic
chromosomal region
Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme
Ou comment exploiter la conservation de la synténie homme-souris
6p21-p23 region
linked to mild malaria
TNF: SNPs associés
Aux formes simples
Human
chromosome 6
Linked to
P.chabaudi
resistance
Chromosomes
TNF: rôle démontré
par KO et transgénèse
1
4
8
9
10
13
17
Mouse syntenic
chromosomal region
Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme:
ET LA REGION MURINE CORRESPONDANT AU
CHROMOSOME 5q31-q33?
Hernandez-Valladares M, Rihet P, ole-MoiYoi OK, Iraqi FA. Mapping of a new quantitative
trait locus for resistance to malaria in mice by a comparative mapping approach with human
Chromosome 5q31-q33. Immunogenetics. 2004 May;56(2):115-7.
Régions chromosomiques Homme et Souris liées au Paludisme
Human
chromosome 5
10 cM
Mouse syntenic
chromosomal region
1
11
13
15
5q31-q33 region
linked
to parasitemia
Linked to
P. chabaudi
resistance
Hernandez et al, 2004
17
18
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et contribution des modèles murins
• Les régions liées à la résistance au paludisme chez l’homme
et chez la souris contiennent des gènes orthologues.
Homme
6p21-p23
5q31-q33
Souris
chr17
chr 11
• =>Le modèle souris peut faciliter la cartographie puis
l’identification du gène de prédisposition. Le rôle du gène est
démontré in vivo chez la souris….A SUIVRE pour les
chromosomes 5q31-q33 et 6p21-p23
Prédisposition Génétique au Paludisme:
Approche clonage positionnel et génomique fonctionnelle
Identification de gènes et variants impliqués
• Existence de différences génétiques entre les
individus expliquant les différences de résistance
au paludisme (corrélation phénotype-génotype
chez l’homme et la souris)
• =>HYPOTHÈSE: certains polymorphismes
affectent l’expression des gènes
• =>Gènes sur (ou sous) exprimés chez les individus
sensibles.
• D’où l’intérêt d’études de transcriptome
Etude du contrôle
génétique des
phénotypes de
résistance au
paludisme chez
l’homme
Cartographie génétique
chez la souris
Mise en évidence d’une
composante génétique
Analyse de liaison
Localisation des régions
chromosomiques impliquées
(10-20cM)
5q31-q33
6p21-p23
Tests familiaux
d’association
Localisation fine des régions
chromosomiques impliquées
(1-5cM)
Analyse du transcriptome
chez la souris et l’homme
Etude de polymorphismes
de gènes candidats
Identification des gènes et
des variants associés
TNF
Etudes fonctionnelles
Souris KO
Identification des gènes et
des variants impliqués
Prédisposition Génétique au Paludisme
Approche Clonage Positionnel
• De nombreuses études chez la souris, modèle du
contrôle de la parasitémie et modèle du
neuropaludisme=>de nombreux loci, et quelques
gènes identifiés (Pklr, Vnn1 ou Vnn3, Tnf)
• Chez l’homme, 2 loci confirmés à ce jour
(chromosomes 5q31-q33 et 6p21.3) contrôlant la
parasitémie ou les accès palustres simples et
correspondant à des loci identifiés chez la souris
Prédisposition Génétique au Paludisme
Approche Clonage Positionnel
• D’autres loci/gènes à identifier par criblage
de l’ensemble du génome humain: plusieurs
nouveaux locus sur les chromosomes 5p15,
10p15, 12q21, 13q13
A Sakuntabhai, R Ndiaye, I Casade´mont et al Plos one 2008
A Sakuntabhai, R Ndiaye, I Casade´mont et al Plos one 2008
12
Prédisposition Génétique au Paludisme
Conclusion
• Approches « gène candidat » et « clonage
positionnel » complémentaires
• Plusieurs gènes dont les polymorphismes sont
associés au paludisme sont des gènes codant pour
des molécules de cytoadhérence et/ou du système
immunitaire=>gènes impliqués directement dans
un mécanisme effecteur ou dans sa régulation
• Les polymorphismes au niveau de ces gènes
expliquent en partie les différences de
résistance/susceptibilité au paludisme
Gènes associés au paludisme en action:
Elimination des stades hépatiques
HLA-B
D’après Doolan and Hoffman
Gènes associés au paludisme en action:
Elimination des stades sanguins
+NKNCR3
NCR3
IL-18
NK
+
IFNγ
Th1
IL-12
+
Th0
IL-4
IFNγ
_
_
CPA
IL-10
HLA-DR
IL-4
Th2
IL-4
IRF1
Phagocytose
Cytotoxicité
Neutrophiles
Eosinophiles
IL-3
GM-CSF
IgG1
(IgG2)
IgG cytophiles IgG3
IL-5
IL-4 IL-6
IL-5 IL-10
IL-13 IL-9
+
Érythrocyte
parasité
TNF
Monocytes
Elimination des
stades sanguins:
LB FcgRIIA
IgG non cytophiles (IgG2)
IgG4
Gènes situés dans la région 5q31-q33/6p21.3
Neuropaludisme
Gènes associés au paludisme en action:
Rôle dans le neuropaludisme
IL6
IL1
ICAM-1
CD36
D’après Grau et al
pRBC: globule rouge infecté
T
CD8