Régulation post-transcriptionnelle de l`expression des gènes du
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revue Virologie 2013, 17 (2) : 96-110 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes du cycle productif des herpesvirus : rôle de la protéine EB2 du virus d’Epstein-Barr et de ses analogues Franceline Juillard1 , 2 , 3 , 4 , 5 Fabrice Mure1 , 2 , 3 , 4 , 5 Quentin Bazot1 , 2 , 3 , 4 , 5 Évelyne Manet1 , 2 , 3 , 4 , 5 Henri Gruffat1 , 2 , 3 , 4 , 5 1 CIRI, International Center for Infectiology Research, Université de Lyon, Lyon, France 2 Inserm, U1111, Lyon, France 3 École normale supérieure de Lyon, Lyon, France 4 Université Lyon-I, Centre international de recherche en infectiologie, Lyon, France 5 CNRS, UMR5308, Lyon, France <[email protected]> Résumé. Le niveau d’expression des ARNm lors d’une infection virale productive n’est pas uniquement le reflet du taux de transcription des gènes viraux. La stabilité des ARNm viraux et l’efficacité de leur export nucléocytoplasmique sont aussi très importants pour une expression optimale des gènes lors du cycle viral productif. Il est maintenant bien établi que tous les herpesvirus expriment un facteur nécessaire à l’accumulation cytoplasmique d’ARNm viraux issus de gènes dépourvus d’intron. Cette famille de protéines comprend le facteur EB2 du virus d’Epstein-Barr (EBV) et ses analogues : la protéine ICP27 d’HSV, la protéine UL69 du cytomégalovirus (CMV), la protéine ORF57 du virus de la maladie de Kaposi (KSHV) ou encore la protéine IE4 du virus Varicelle Zona (VZV). Ces protéines sont capables de stabiliser leurs ARNm cibles dans le noyau et en interagissant avec divers facteurs cellulaires comme les protéines TAP/NXF1, SR, RBM15, de favoriser l’accumulation de ces ARNm dans le cytoplasme où elles stimulent leur traduction en protéines. La compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs multifonctionnels est un enjeu important pour les recherches d’antiviraux spécifiques. Mots clés : herpesvirus, cycle productif, régulation post-transcriptionnelle, ARNm export Abstract. During viral infection, the amount of viral mRNAs expressed is not only a reflection of the viral gene transcription level: mRNA stability and nucleocytoplasmic export are also important for optimal viral gene expression during the productive cycle. It is now well established that herpesviruses express a protein absolutely required for the cytoplasmic accumulation of some viral mRNAs transcribed from intronless genes. This family of proteins comprises the EB2 factor from Epstein-Barr virus (EBV), and its similar proteins: ICP27 from HSV-1, UL69 from cytomegalovirus (CMV), ORF57 from KSHV and IE4 from VZV. These proteins are able to stabilize their target mRNAs in the nucleus and, by interacting with various cellular factors (TAP/NXF1, SR proteins, RBM15 etc), promote mRNA export to the cytoplasm, where they are also involved in the translation efficiency of these viral mRNAs. On the basis of their essential role in the viral productive cycle, these multifunctional viral factors should be considered as important targets for therapeutic approaches. Tirés à part : H. Gruffat 96 Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 Pour citer cet article : Juillard F, Mure F, Bazot Q, Manet É, Gruffat H. Régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes du cycle productif des herpesvirus : rôle de la protéine EB2 du virus d’Epstein-Barr et de ses analogues. Virologie 2013; 17(2) : 96-110 doi:10.1684/vir.2013.0483 doi:10.1684/vir.2013.0483 Key words: herpesvirus, productive cycle, post-transcriptional regulation, mRNA export revue TAP/p15 ne présente que peu d’affinité pour l’ARNm et son recrutement est dépendant d’autres facteurs cellulaires, comme le facteur REF/Aly ou les protéines SR, qui sont recrutés plus précocement sur l’ARNm, en particulier au cours de l’étape d’épissage des introns. Lors de cette étape d’épissage, deux complexes multiprotéiques sont ajoutés sur l’ARNm : le complexe de jonction exonexon (EJC), qui est déposé 20-24 nucléotides en amont de la jonction exon-exon, et le complexe de transcription/export humain (hTREX). hTREX est composé du complexe hTHO (lui même composé des protéines hHpr1, hTho2, fSAP79, fSAP35 et fSAP24), de l’ARN hélicase UAP56 et des protéines REF et Thoc3. Des études récentes ont montré que la protéine CBP80 qui est associée à la coiffe et les facteurs déposés sur la première jonction exon-exon coopérent pour recruter hTREX. Il existe donc un couplage entre les différentes étapes de maturation des ARNm et l’étape d’épissage s’avère cruciale pour un export ainsi qu’une traduction efficace des ARNm cellulaires (figure 1). Et, en effet, il a été montré que les ARNm produits à partir de gènes contenant Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Introduction Le génome cellulaire a la particularité d’être extrêmement morcelé. La très grande majorité des gènes, principalement ceux codant des protéines mais aussi certains gènes non codants comme ceux des ARNt, est constituée d’une suite alternée d’exons et d’introns dont la taille et le nombre peuvent être très variables. Au cours de la transcription des gènes codant des protéines, un pré-ARNm est synthétisé et est simultanément coiffé, épissé (élimination des introns) et polyadénylé dans le noyau de la cellule pour donner lieu à l’ARNm dit mature. Cet ARNm mature, constitué des seuls exons, est alors exporté vers le cytoplasme pour être traduit en protéine. La translocation de l’ARNm mature à travers le pore nucléaire nécessite la présence sur l’ARNm d’un hétérodimère composé des protéines TAP (aussi appelée NXF1) et p15 (aussi appelée NXT1). L’hétérodimère TAP/p15 permet le passage de l’ARNm à travers le pore nucléaire en interagissant directement avec les nucléoporines qui le composent. Cependant, Noyau pol pol pol hTREX SR UAP56 hTREX REF hTHO Cytoplasme Complexe d’épisage Complexe de coupure/ polyadénylation EJC PABP SR AAAAA UAP56 hTREX REF hTHO EJC hTREX TAP PABP AAAAA EJC SR TREX REF TAP TAP Transcrition Initiation Élongation Coupure/Polyadénylation Export Maturation de l’ARN Figure 1. Représentation schématique de l’export des ARNm issus de gènes avec introns. Dès le début de la transcription par l’ARN polymérase II, le complexe hTREX est recruté en 5 de l’ARNm. Le complexe TREX est composé des protéines REF et UAP56 associées au complexe hTHO, il est recruté sur l’ARNm grâce à l’interaction des protéines REF et UAP56 avec le complexe protéique interagissant avec la coiffe (CBC). Au cours de l’élongation, le complexe d’épissage, qui est composé de nombreuses protéines dont des protéines SR, supprime l’intron. Il subsiste au niveau de la jonction des deux exons un complexe nommé EJC (pour complexe de la jonction exon-exon). Lorsque l’ARN polymérase rencontre un signal de coupure-polyadénylation, l’ARNm est coupé et polyadénylé. Puis le facteur d’export TAP est recruté sur l’ARNm, grâce notamment à certaines protéines SR et à la protéine REF. Ce facteur TAP permet le franchissement du pore nucléaire en interagissant directement avec certaines nucléoporines. Ce franchissement est probablement polarisé grâce à la présence du complexe hTREX en 5 de l’ARNm. Puis dans le cytoplasme, l’ARNm exporté est traduit en protéine. Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 97 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue au moins un intron sont plus stables et s’accumulent plus efficacement dans le cytoplasme que les mêmes ARNm produits à partir de leurs ADNc. Chez les mammifères, seulement 5 % des gènes codant des protéines ne contiennent pas de séquence intronique. Parmi ces gènes, certains codent des protéines ayant un rôle très important dans la cellule comme les histones, le facteur c-Jun du complexe AP1, la protéine de choc thermique HSPB3, ou les protéines IFN à effet antiviral. Les ARNm produits à partir de ces gènes dépourvus d’intron sont stables et s’accumulent aussi efficacement que les autres ARNm. Ils utilisent en fait des voies d’export spécifiques, impliquant également les protéines SRp20, REF et TAP/p15 mais de façon indépendante de l’épissage. Ces voies sont peu décrites. On pense cependant qu’elles permettraient une régulation plus rapide et plus efficace de l’expression de ces protéines. Contrairement aux gènes cellulaires, la majorité des gènes des herpesvirus ne contient pas d’intron. Les différents herpesvirus (tableau 1) ont en commun de posséder un génome à ADN double-brin linéaire de 150 à 230 kpb dont la réplication a lieu dans le noyau de la cellule hôte. Si peu de gènes sont exprimés lors de la latence de ces virus, la majorité des gènes est exprimée pendant la phase de production de nouveaux virions. Ce cycle productif se décompose en quatre phases (figure 2) : après réactivation du cycle, les gènes dits immédiats précoces qui codent pour des facteurs de transcription sont exprimés. Il y en a deux dans le cas d’EBV, appelés EB1 et Rta. Ces protéines transactivatrices sont nécessaires pour induire l’expression des gènes dits précoces dont les produits sont requis soit pour la réplication de l’ADN viral, qui dépend d’un complexe de réplication codé par le virus, soit pour l’expression des gènes dits tardifs. Après réplication de l’ADN viral, les gènes dits tardifs sont exprimés. Les produits de ces gènes sont soit des protéines de structure du virus, soit des protéines impliquées dans la modulation de la réponse cellulaire comme l’IL10 virale. Pour l’EBV, les dix gènes exprimés pendant la phase de latence ainsi que les gènes très précoces du cycle productif sont des gènes avec introns, mais la majorité des gènes précoces ainsi que la quasi-totalité des gènes tardifs sont dépourvus d’intron (figure 2). Chez les herpès simplex de type I (HSV-1), sur environ 80 gènes exprimés au cours de l’infection virale, seuls cinq contiennent des introns. L’accumulation cytoplasmique de ces ARNm viraux issus de gènes dépourvus Tableau 1. Principales caractéristiques des herpesvirus humains. Ces virus sont classés dans trois sous-familles en fonction : (i) de leur tropisme cellulaire in vivo, (ii) de la durée de leur cycle de réplication et (iii) de leur classification phylogénique. Les alphaherpesvirus peuvent infecter un large spectre de types cellulaires, ont un cycle productif très rapide et une latence dans les ganglions nerveux. Les betaherpesvirus ont un spectre d’hôte intermédiaire, un cycle productif lent et une latence dans les leucocytes. Les gammaherpesvirus peuvent infecter un spectre de types cellulaires restreint, ont un cycle productif d’une durée intermédiaire et une latence principalement dans les lymphocytes B. Nom commun Nom formel Genre Sous-famille Pathologie en primoinfection Autres pathologies associées Taille du génome (kpb) Facteur d’export des ARNm HSV-1 HHV-1 Simplexvirus alphaherpesvirus Aphtes, pharyngite Herpès orofacial, encéphalite 152 ICP27 HSV-2 HHV-2 Simplexvirus alphaherpesvirus Herpès génital Herpès génital 156 ICP27 VZV HHV-3 Vaticellovirus alphaherpesvirus Varicelle Zona 125 IE4 EBV HHV-4 Lymphocryptovirus gammaherpesvirus Mononucléose infectieuse Nombreux cancers 172 EB2 CMV HHV-5 Cytomegalovirus 248 UL69 HHV-6 HHV-6A Roseolovirus et B HHV-7 HHV-7 KSHV HHV-8 betaherpesvirus Syndrome mimant la mononucléose infectieuse Hépatite, rétinite, pneumonie betaherpesvirus Roséole Roséole, Encéphalite. 160 Myocardites. Hoseolovirus betaherpesvirus Roséole Rhadinovirus gammaherpesvirus U42 Roséole 145 U42 Sarcome de Kaposi, maladie de Castelman, souvent associé au sida 170 ORF57 HSV : herpes simplex virus ; HHV-3 : human herpesvirus ; VZV : Varicella Zona virus ; EBV : Epstein-Barr virus ; CMV : human cytomegalovirus ; KSHV : Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. 98 Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 revue LATENCE Infection LCL Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Production de particules virales infectieuses CYCLE PRODUCTIF In vitro, induction par des agents chimiques (TPA/BA) ARNm issus de gènes avec introns Expression des gènes immediats précoces Expression des gènes tardifs (EB1, R) ARNm issus de gènes sans intron Réplication du génome viral Expression des gènes précoces ... EB2 ... Figure 2. Cycle viral productif d’Epstein-Barr virus (EBV) dans les cellules in vitro. Suite à l’infection, le virus EBV entre en phase de latence durant laquelle il n’y a pas de production de virion mais des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien du génome viral et l’immortalisation des cellules sont exprimés. De cette phase de latence, il peut y avoir activation du cycle productif. In vitro, le cycle productif peut être induit par des agents chimiques comme le TPA/BA ou biologiques comme le TGF-ß. L’activation est suivie d’une expression séquentielle des gènes viraux : les protéines immédiates précoces permettent l’expression des gènes précoces, des produits des gènes précoces sont impliqués dans la réplication de l’ADN viral qui est suivie par l’expression des gènes tardifs, lesquels codent pour les protéines de structure du virus. LCL : lymphoblastoide cell line. d’intron ne devrait pas poser de problème étant donné que de tels ARNm existent dans la cellule et qu’ils sont efficacement exportés dans le cytoplasme où ils sont traduits en protéine. Cependant, cela n’est vrai que pour un petit nombre d’ARNm viraux issus de gènes dépourvus d’intron. Les autres requièrent la présence d’une protéine virale pour s’accumuler efficacement dans le cytoplasme de la cellule hôte. Ces protéines sont EB2 chez EBV, ICP27 chez HSV-1, IE4 chez le virus Varicelle et Zona (VZV), ORF57 chez le virus du sarcome de Kaposi (KSHV) et UL69 chez le cytomégalovirus (CMV) (tableau 1). Cette revue a pour objectif, à travers notamment l’exemple de la protéine Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 EB2 du virus EBV, de décrire ces facteurs et de montrer leur implication dans l’expression de certaines protéines virales. EB2 est indispensable à la production de virions La protéine EB2 (aussi appelée Mta ou SM) a initialement été identifiée comme un facteur nécessaire à la transcription des gènes viraux précoces et tardifs du virus. Ce n’est que 99 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue plus tard qu’il a été montré qu’EB2 n’agit pas au niveau de l’initiation de la transcription des gènes viraux, mais durant les étapes post-transcriptionnelles [1]. Afin d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine dans le cycle viral productif, un virus EBV recombinant amputé du gène codant pour la protéine EB2 a été généré [2]. Ainsi, il a pu être montré que, suite à l’induction du cycle viral productif, les cellules infectées par un EBV recombinant n’exprimant pas EB2 ne produisent pas de particules virales. Lorsque ce déficit est trans-complémenté par l’expression ectopique d’EB2, des virions sont de nouveau efficacement produits [2]. De manière intéressante, les protéines analogues des autres herpesvirus (ICP27 de HSV1, ORF57 de KSHV et IE4 de VZV) sont également indispensables à la production de nouvelles particules virales dans leurs modèles d’infection respectifs. Seule la protéine UL69 du virus CMV ne semble pas indispensable à la production de virions, mais la cinétique de production est beaucoup plus lente qu’avec le virus sauvage [3]. Cependant, si ces protéines semblent avoir des fonctions équivalentes, elles ne sont pas interchangeables. Ainsi, le remplacement de la séquence codante d’ICP27 par la séquence d’EB2 dans un virus HSV-1 restaure en partie la production de particules virales, mais uniquement lorsque l’infection est réalisée avec une très grande quantité de virus [4]. ICP27, UL69, et ORF57 ne restaurent pas la production de virions à partir de cellules infectées par un EBV recombinant amputé du gène codant la protéine EB2 [2]. Réciproquement, EB2 est incapable de trans-complémenter un virus KSHV recombinant amputé du gène codant ORF57 [5]. La caractérisation plus précise du recombinant EBV n’exprimant pas la protéine EB2 a permis de mieux comprendre le rôle d’EB2 dans la production de nouveaux virions et notamment de confirmer le rôle majeur de ce facteur dans l’accumulation cytoplasmique de certains ARNm viraux. Ces ARNm ont la particularité d’être produits à partir de gènes dépourvus d’intron. En absence de la protéine EB2, ils sont soit complètement absents, soit présents en quantité bien inférieure, et cela tant dans le noyau que dans le cytoplasme de la cellule hôte. Il est cependant à noter que tous les ARNm d’EBV produits à partir de gènes dépourvus d’intron ne requièrent pas la protéine EB2 pour s’accumuler efficacement dans le cytoplasme cellulaire [2, 6]. Ainsi, une étude transcriptomique a permis de montrer qu’environ la moitié des ARNm du cycle productif d’EBV sont dépendants d’EB2 pour leur accumulation cytoplasmique [7]. La protéine EB2 n’a, par ailleurs, pas d’effet significatif sur les quelques ARNm viraux issus de gènes avec introns. Ainsi, la protéine EB2 est nécessaire à la production de nouveaux virions car elle permet l’accumulation cytoplasmique d’une proportion importante des ARNm viraux produits au cours du cycle productif. 100 Structure du facteur viral EB2 et de ses analogues La protéine virale EB2 est codée par le gène BSLF2/BMLF1 qui contient un intron et est exprimée précocement au cours du cycle productif du virus EBV (figure 2). C’est une phosphoprotéine nucléaire de 479 acides aminés (60 kDa). Sa structure n’a pour l’instant pas été élucidée mais certains domaines importants pour sa fonction ont néanmoins été mis en évidence : elle contient, dans sa partie N-terminale, un signal d’export nucléaire (NES) atypique et deux signaux de localisation nucléaire (NLS). Par ailleurs, elle renferme dans sa partie centrale un domaine d’interaction avec l’ARNm (RBD) et interagit directement avec de nombreuses protéines cellulaires (figure 3). Comme EB2, ICP27, ORF57, UL69 et IE4 sont des phosphoprotéines issues de gènes précoces. Plusieurs motifs NLS, un NES ainsi qu’un domaine d’interaction avec l’ARN ont été caractérisés dans chacune de ces protéines et il a été montré qu’elles interagissent avec certains partenaires cellulaires communs, dont REF et TAP/NXF1 (figure 3). Cependant, malgré leurs fonctions analogues, ces protéines ne présentent que très peu de similarité de séquence et comme vu précédemment, elles ne sont pas interchangeables. Ainsi, bien que ces protéines virales aient des propriétés communes, elles possèdent également des caractéristiques spécifiques qui les distinguent les unes des autres. EB2, comme ses analogues, a des propriétés de facteur d’export des ARNm EB2 possède certaines caractéristiques des facteurs d’export des ARNm. La première de ces caractéristiques est sa capacité à faire la navette entre le noyau et le cytoplasme de la cellule [8] grâce à deux séquences NLS et à un motif NES [9]. L’analyse simple de la localisation cellulaire d’EB2 par immunofluorescence révèle une présence d’EB2 dans le seul noyau des cellules. Sa propriété de navette n’a pu être démontrée que par l’utilisation de la technique des hétérocaryons interespèces. Cette technique consiste à faire fusionner une cellule exprimant la protéine EB2 avec une autre cellule ne l’exprimant pas en présence d’inhibiteur de synthèse protéique. Si après la fusion, la protéine est retrouvée dans les deux noyaux de l’hétérocaryon, on peut alors conclure que la protéine, bien que nucléaire, peut sortir du noyau et y rentrer à nouveau (figure 4). Il est intéressant de noter que le domaine NES d’EB2 ne présente Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 revue REF EB2 RBD NLS1 NLS2 NES 1 TAP TAP RBD NLS REF NES ICP27 479 TAP KH1 KH2 KH3 512 1 2 3 RBD putatif 1 NoLS REF 455 9G8, SRp20, ASF/SF2, TAP, REF NLS IE4 Ra 1 Rb Rc 452 UAP56 Dimérisation NLS RBD UL69 1 hSPT6-BD NES Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. NLS 1 ORF57 744 Figure 3. Organisation fonctionnelle d’EB2 et de ses analogues. NES : signal d’export nucléaire ; NLS : signal de localisation nucléaire ; KH : domaines présentant une forte homologie avec les domaines de liaison à l’ARN de la protéine hnRNP-K ; TAP : domaine d’interaction avec le facteur d’export TAP/NXF1 ; REF : domaine d’interaction avec le facteur d’export REF ; 9G8, SRp20, ASF/SF2 : domaine d’interaction avec les facteurs 9G8, SRp20 et ASF/SF2 ; RBD : domaine de liaison à l’ARN ; NoLS : domaine de localisation nucléolaire ; UAP56 : domaine d’interaction avec le facteur UAP56 ; hSPT6-BD : domaine de liaison à la protéine SPT6 ; Ra, Rb, Rc : domaines riches en arginines ; RBD : RNA-binding domain. aucune similarité de séquence avec d’autres motifs NES précédemment caractérisés dans d’autres facteurs comme la protéine Rev du virus HIV-1 ou la protéine cellulaire REF [9, 10]. Une deuxième caractéristique d’EB2 est sa capacité à interagir directement avec l’ARNm in vitro et in vivo, grâce à un domaine d’interaction à l’ARN non conventionnel [11]. Ce domaine contient un motif TRKQAR qui ressemble aux domaines d’interaction avec l’ARN des protéines Rev et Tat du virus HIV-1. Cependant, la liaison d’EB2 avec l’ARN nécessite également les séquences riches en arginines en amont et en aval du motif TRKQAR [11]. La suppression de ce domaine d’interaction à l’ARN empêche la protéine EB2 d’assurer sa fonction dans l’accumulation cytoplasmique des ARNm cibles mais n’empêche pas la protéine de sortir du noyau [11]. In vitro, EB2 peut se fixer sur n’importe quelle séquence d’ARN. Il semble qu’elle puisse couvrir complètement un ARN, à raison d’environ une molécule par 20 nucléotides [11]. Au contraire, in vivo, EB2 pourrait avoir une préférence pour certaines Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 régions des ARN. Elle semble en effet se fixer préférentiellement dans les régions 5 -UTR de ses ARNm cibles [12]. La dernière caractéristique faisant d’EB2 un facteur d’export est sa capacité à favoriser l’accumulation dans le cytoplasme d’ARNm issus de gènes dépourvus d’intron [2, 6] ainsi que de certains ARNm issus de gènes contenant des sites d’épissage non canoniques. Ce dernier effet a été démontré grâce à l’analyse d’une construction issue du gène de la ß-globine humaine portant la mutation responsable de l’apparition de la ß-thalassémie (ß-thal) chez les individus homozygotes. La mutation touche le site 5 donneur d’épissage du premier intron du gène avec pour conséquence l’inhibition de l’épissage de ce site et l’utilisation de l’un ou l’autre de trois sites cryptiques d’épissage présents dans le premier exon du gène (figure 5A). En absence de la protéine EB2, les trois formes d’ARNm épissé sont produites et s’accumulent dans le cytoplasme. En revanche, lorsqu’EB2 est exprimée, elle favorise fortement l’accumulation dans le cytoplasme de la forme non épissée 101 revue cellule HeLa Transfection cellule NIH3T3 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Blocage de la synthèse protéique (cycloheximide) Fusion Hétérocaryon HeLa-NIH3T3 DAPI @Flag DAPI @Flag noyau NIH3T3 noyau NIH3T3 noyau HeLa noyau HeLa La protéine Flag.EB2 fait la navette La protéine Flag.EB2Cter ne fait pas la navette Figure 4. Technique d’hétérocaryons interespèces. Les cellules HeLa sont transfectées avec le plasmide permettant l’expression de la protéine d’intérêt. Puis elles sont mises en culture avec des cellules NIH3T3, reconnaissables après marquage au DAPI par la ponctuation qui apparaît dans le noyau. La synthèse protéique est bloquée par l’ajout de cycloheximide et la fusion des cellules est induite par traitement au PEG. Lorsque la protéine d’intérêt est observée uniquement dans les noyaux des cellules HeLa, elle ne fait pas la navette entre le noyau et le cytoplasme. Lorsqu’elle est observée à la fois dans des noyaux de cellules HeLa et de cellule NIH3T3, elle fait la navette. Flag.EB2 contient le signal d’export nucléaire (NES), contrairement à EB2Cter. de l’ARNm ß-thal [1]. Ce résultat a ensuite été confirmé par l’utilisation d’un autre système rapporteur basé sur la construction pDM128, qui contient un gène constitué de deux exons et d’un intron bordé de sites d’épissages faibles (figure 5B). Dans l’intron se trouve la séquence codante pour la protéine rapportrice chloramphénicol acétyl transférase (CAT). La protéine CAT, dont la quantité est mesurée par test ELISA, ne s’exprime donc que si l’ARNm est exporté sans être épissé. En absence de la protéine EB2, la quasi-totalité de l’ARNm issu de pDM128 est épissé et exporté et la protéine CAT est exprimée à un niveau basal très faible. Au contraire, en présence d’EB2, la protéine CAT est détectée en plus grande quantité, ce qui montre à nouveau la capacité d’EB2 à favoriser l’accumulation cytoplasmique d’ARNm non épissés [8]. Comme EB2, ses analogues ont été initialement décrits comme des facteurs de transcription. Ainsi, ORF57 peut 102 agir de manière directe sur l’efficacité de la transcription en interagissant avec ORF50, un facteur de transcription viral majeur du cycle productif de KSHV [13]. Le même type de résultats a été obtenu avec IE4 de VZV qui interagit avec IE62, le facteur de transcription majeur du virus VZV [14]. UL69 a été relié au remodelage de la chromatine par la mise en évidence d’une interaction avec le facteur d’élongation de la transcription hSpt6 [15]. ICP27 comme EB2 ne semble pas avoir d’effet significatif sur la transcription, bien qu’ICP27 soit capable d’interagir directement avec le domaine carboxyle terminal (CTD) de l’ARN polymérase II cellulaire [16]. Bien que quelques-uns de ces facteurs semblent avoir des effets plus ou moins importants sur l’activation de la transcription, des résultats plus récents suggèrent qu’ils agissent aussi et surtout au niveau post-transcriptionnel. Comme EB2, ils possèdent les principales caractéristiques des facteurs d’export des ARNm. Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 revue A β-globine SE pSV40 SE exon 1 SE SE exon 3 exon 2 - EB2 + EB2 β-thalassémie SE pSV40 exon 1 SE SE exon 2 exon 3 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. - EB2 + EB2 B SE pSMV pDM128 exon 1 SE CAT exon 2 - EB2 + EB2 Figure 5. Définition des différents systèmes rapporteurs utilisés pour l’étude du rôle de EB2 dans l’export des ARNm. A) Les vecteurs rapporteurs contiennent le gène de la -globine et l’allèle de la -thalassémie dans lequel le site 3 d’épissage du premier exon est muté, laissant apparaître trois sites cryptiques d’épissage. B) Le vecteur pDM128 contient dans un intron les séquences codantes pour la protéine rapportrice CAT. En absence d’EB2, l’intron est épissé, la protéine CAT n’est pas exprimée. En présence d’EB2, un certain nombre d’ARNm est exporté sans épissage et la protéine CAT est exprimée. SE : site d’épissage. Tous sont capables de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme grâce à des séquences NLS et NES [17-19] (figure 3). ORF57 possède en plus un signal de localisation nucléolaire (NoLS) qui semble nécessaire à son effet sur les ARNm viraux bien que le rôle précis du passage à travers le nucléole reste à déterminer [20]. Ensuite, comme EB2, ils interagissent directement avec l’ARN par l’intermédiaire de séquences riches en arginines (en particulier grâce à une boîte RGG pour ICP27) [21-24]. Là encore, bien que ces protéines ne semblent pas reconnaître de séquence ARN spécifique, elles n’interagissent pas avec tous les ARNm in vivo. Ainsi, ICP27 et UL69 s’associeraient préférentiellement à des ARNm issus de gènes dépourvus d’intron [22]. De manière intéressante, ORF57 perd son interaction avec l’ARNm issu du gène viral ORF59 en absence d’extrait cellulaire. Ces résultats laissent supposer un rôle important des protéines cellulaires pour cibler l’interaction avec l’ARN [24]. Enfin, de même qu’EB2, ses analogues favorisent l’accumulation cytoplasmique des ARNm issus de gènes sans intron [13, 23, 25, 26]. Cette capacité nécessite l’interaction avec l’ARNm sauf dans le cas d’UL69. En effet, un mutant d’UL69 incapable d’interagir avec l’ARN, mais qui interagit toujours avec la protéine cellulaire UAP56, favorise l’accumulation cytoplasmique d’un ARNm rapporteur non épissé avec la même efficacité que la protéine sauvage [22]. Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 EB2 et ses analogues requièrent de nombreuses interactions avec des protéines cellulaires pour assurer leurs fonctions Dans la cellule, l’import et l’export des protéines nucléaires nécessitent différentes protéines appelées respectivement importines et exportines. Celles-ci, seules ou en association avec des partenaires, servent de transporteurs de protéines à travers le pore nucléaire. Les premiers travaux visant à comprendre comment EB2 ou ses analogues pouvaient sortir du noyau ont suspecté l’implication de CRM1, une exportine connue notamment pour son rôle dans l’export de la protéine Rev du HIV-1. Cependant, la capacité à faire la navette d’EB2 et de ses analogues n’est pas affectée par l’utilisation de leptomycine B, un inhibiteur spécifique de CRM1, démontrant ainsi que ces protéines utilisent un autre transporteur [9, 18, 19, 23, 25]. Des résultats plus récents montrent que l’export d’EB2 et de ses analogues est dépendant du facteur cellulaire TAP/NXF1, qui a été largement caractérisé pour son rôle primordial dans l’export des ARNm cellulaires du noyau vers le cytoplasme. EB2 interagit directement, par l’intermédiaire de son domaine NES, avec TAP/NXF1 et cette interaction permet l’export d’EB2 indépendamment de l’interaction avec 103 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue l’ARN [9, 10]. Cela suggère qu’en plus de son rôle d’export des ARNm, TAP/NXF1 pourrait favoriser l’export de protéines qui ne sont pas directement liées à l’ARNm. De même, ICP27, IE4 et ORF57 interagissent directement avec le facteur TAP/NXF1 qui est indispensable à l’export de chacune d’elles [19, 23, 25]. UL69 est la seule pour laquelle une interaction avec TAP/NXF1 n’a pas été trouvée. La protéine TAP/NXF1 permet l’export des ARNm en interagissant, d’une part, avec les nucléoporines du pore nucléaire et, d’autre part, avec l’ARNm. Cependant, TAP/NXF1 ne présente que peu d’affinité intrinsèque pour les ARN, sauf s’ils contiennent un motif spécifique (constitutive transport element [CTE]) décrit chez certains ARNm du virus de singe Mason-Pfizer (MPMV). Le recrutement de TAP/NXF1 se fait donc par l’intermédiaire de protéines dites adaptatrices qui vont permettre l’interaction entre TAP/NXF1 et l’ARNm. Plusieurs protéines jouant ce rôle ont été caractérisées, parmi lesquelles les trois protéines SR : SRp20, 9G8 et SF2/ASF et les protéines REF, UIF, RBM15 et OTT3 (RBM15b). Il est intéressant de constater que chacune de ces protéines a été impliquée dans l’accumulation cytoplasmique de certains ARNm issus de gènes sans intron par EB2 ou ses analogues. Ainsi, ICP27 est capable d’interagir avec SRp20 ainsi qu’avec d’autres membres de la famille SR, et dans des cellules infectées par HSV-1, la déplétion par siRNA de SRp20 ou de 9G8 entraîne une accumulation dans le noyau des ARNm viraux polyadénylés, ainsi qu’une diminution de la production de virions, sans pour autant affecter la viabilité cellulaire [27, 28]. EB2, comme IE4, interagit aussi directement avec SRp20, 9G8 et SF2/ASF [23, 29, 30]. Pour EB2, cette interaction se fait par l’intermédiaire de son domaine central. De manière intéressante, en absence d’EB2, la déplétion de la protéine SRp20 par siRNA augmente l’accumulation dans le cytoplasme des ARNm cibles d’EB2, suggérant que la protéine SRp20 aurait un effet délétère sur certains ARNm issus de gènes sans intron. Ainsi, SRp20 pourrait induire des épissages indus dans ces ARNm, conduisant à leur déstabilisation et à leur destruction. Par ailleurs, il semble qu’EB2 favorise le recrutement de SRp20 sur l’ARN [30]. Ainsi, la protéine EB2 serait capable de contrecarrer l’effet de SRp20 en détournant son activité dans l’épissage au profit de l’export. De même, la déplétion de 9G8 par siRNA entraîne une diminution de l’accumulation cytoplasmique de certains ARNm cibles de la protéine EB2 en l’absence de cette dernière [30]. La protéine REF appartient au complexe cellulaire hTREX. Ce complexe protéique est conservé de la levure à l’homme et joue un rôle important dans l’export des ARNm. Chez les eucaryotes supérieurs, hTREX est recruté de manière spécifique en 5 des ARNm par les protéines associées à la 104 coiffe et il a été suggéré que cette position sur l’ARNm pourrait faciliter l’export nucléaire polarisé de l’ARNm épissé (figure 1). Le complexe hTREX humain est composé des protéines REF, UAP56 et Thoc3 ainsi que du complexe hTHO (qui comprend les protéines hHpr1, hTho2, fSAP79, fSAP35 et fSAP24). Plus récemment, l’analyse protéomique des composants du complexe hTREX a permis l’identification d’une nouvelle protéine : CIP29/Tho1. Le complexe se forme en deux étapes : les protéines REF et UAP56 sont d’abord recrutées sur l’ARNm grâce à des interactions avec les protéines associées à la coiffe, puis le complexe hTHO est recruté par REF et UAP56. La protéine EB2 interagit directement avec REF et cette interaction semble importante pour l’action d’EB2 sur les ARNm [9]. Des interactions ont également été démontrées entre REF et ORF57 [19], ICP27 [25, 31] ou IE4 [23]. Par ailleurs, des complexes associant UL69, UAP56 et REF ont été identifiés dans des cellules infectées par CMV. Cependant, bien que REF ait d’abord été considérée comme importante pour l’accumulation cytoplasmique des ARNm viraux, ces résultats sont à nuancer. En effet, un mutant de la protéine ORF57 n’interagissant plus avec REF a toujours un effet sur l’expression de la protéine virale ORF59 issue d’un gène dépourvu d’intron et cible d’ORF57. De plus, un siRNA qui diminue de 40 % l’expression de REF n’a aucun effet sur l’export de l’ARNm d’ORF59 [24]. L’interaction entre REF et ORF57 n’aurait donc qu’un rôle limité dans l’accumulation cytoplasmique des ARNm ORF59 et de ses autres ARNm cibles. De même, la déplétion de REF par siRNA n’a que peu d’effet sur l’export des ARNm de HSV1 par ICP27 [32]. Contrairement à REF, la protéine UAP56 semble particulièrement importante pour l’export des ARNm viraux, notamment dans le cas d’UL69. En effet, un mutant de la protéine UL69 qui n’interagit plus avec UAP56 fait toujours la navette entre le noyau et le cytoplasme [33] mais n’est plus capable de stimuler l’accumulation cytoplasmique de ses ARNm cibles au cours de l’infection virale [26]. UAP56 interagit aussi directement avec les protéines ORF57 et ICP27 [25, 31, 33, 34]. Par ailleurs, d’autres travaux récents ont montré que la protéine ORF57 interagit directement avec une autre protéine adaptatrice de TAP nommée UIF. Cette interaction permet le recrutement du complexe hTREX et de TAP/NXF1 sur les ARNm indépendamment de REF [35]. Il semble donc qu’il y ait une certaine redondance dans les modes de recrutement de facteurs d’export par EB2 et ses analogues. Enfin, EB2 ainsi que tous ses analogues interagissent avec les protéine cellulaires RBM15 et RBM15B/OTT3 [36, 37], deux protéines apparentées impliquées dans l’export des ARNm et dans la régulation de l’épissage. Ainsi, RBM15 semble jouer un rôle dans l’export des Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue ARNm cellulaires en interagissant, d’une part, avec TAP/NXF1, d’autre part, avec la protéine DBP5/DDX19, une hélicase à boite DEAD qui favoriserait la translocation des mRNP à travers le pore nucléaire [38]. De même, RBM15B/OTT3 s’associe à TAP/NXF1 et à DBP5, quoique moins efficacement que RBM15, et peut promouvoir l’export d’ARNm. Plus récemment, il a été montré que RBM15B/OTT3 était capable d’inhiber l’épissage en agissant comme compétiteur fonctionnel des protéines SR, 9G8 et SF2/ASF [39]. Le rôle exact de l’interaction de ces deux facteurs avec les protéines virales est loin d’être compris. Il est cependant intéressant de noter que comme RBM15B/OTT3, EB2 interfère avec la fonction des protéines SR, SRp20, 9G8 et SF2/ASF [30]. Enfin, ORF57 de KSHV inhibe la capacité de RBM15 à interagir avec l’ARN viral ORF59 et de cette manière empêche l’accumulation nucléaire de ce messager sous forme hyperpolyadénylée induite par RBM15 [37]. Ainsi, EB2, comme ses analogues, peut favoriser le recrutement de plusieurs facteurs d’export sur leurs ARNm cibles (TAP/NXF1 ; UAP56 ; REF. . .) mais ils peuvent aussi modifier l’activité de certains facteurs (SRp20) contrôlant ainsi le devenir de leurs ARNm cibles. EB2 et ses analogues agissent à différentes étapes du métabolisme des ARNm L’épissage Différents résultats laissent penser qu’EB2 et ses analogues pourraient interférer dans la réaction d’épissage de leurs ARNm cibles. Ainsi, il a été observé qu’en présence d’EB2, des ARNm épissés à partir de sites cryptiques ne sont plus retrouvés dans le cytoplasme, alors que la forme non épissée est elle augmentée [1]. Un rôle direct de la protéine EB2 sur STAT1 SE 5’ SE 5’ cryptique l’épissage d’un ARNm cellulaire a été clairement décrit dans le cas d’une construction contenant les exons 23 et 24 du gène cellulaire STAT1 ainsi que l’intron séparant ces deux exons (figure 6). En absence d’EB2, la forme parfaitement épissée de cet ARNm s’accumule dans le cytoplasme de la cellule, mais en présence d’EB2 on retrouve dans le cytoplasme une nouvelle forme d’ARNm, épissée à partir d’un site 5 cryptique présent dans l’intron. EB2 favoriserait donc l’utilisation de ce site cryptique à la place du site habituel d’épissage. Cet effet d’EB2 sur l’épissage de l’intron séparant les exons 23 et 24 du gène STAT1 est dépendant de l’interaction entre EB2 et la protéine SRp20 [29]. Ces résultats suggèrent que les interactions entre EB2 et des protéines cellulaires impliquées dans l’épissage pourraient modifier le profil d’expression de certains gènes cellulaires. Cette observation est particulièrement intéressante dans le cas du gène STAT1 car la production par épissage alternatif des deux isoformes de STAT1 (STAT1alpha et STAT1bêta ) pourrait moduler la réponse cellulaire antivirale. La protéine EB2 en augmentant le niveau d’expression de la forme STAT1bêta qui est considérée comme un dominant négatif de la forme STAT1alpha pourrait ainsi induire une diminution de la réponse IFN. L’effet sur l’épissage le mieux décrit est celui d’ICP27. En effet, l’expression d’ICP27 s’accompagne d’une chute globale de l’expression des ARNm cellulaires, qui n’est pas observée lorsque les cellules sont infectées par un virus mutant n’exprimant pas la protéine ICP27. Cette répression cible les gènes possédant des introns [28] et son mécanisme a été en partie élucidé. ICP27 est capable de bloquer l’assemblage du complexe d’épissage en influant sur l’état de phosphorylation de certaines protéines SR. Le niveau de phosphorylation de ces protéines est primordial pour la formation du complexe d’épissage, or en présence d’ICP27, il est fortement diminué car ICP27 délocalise du cytoplasme vers le noyau la kinase SRPK1 responsable de la phosphorylation des protéines SR. L’interaction directe entre SE 3’ exon 23 1 exon 24 76 266 955 1058 - EB2 + EB2 Figure 6. Représentation schématique de la construction STAT1. La construction STAT1 est constituée des exons 23 et 24 du gène cellulaire STAT séparés par leur intron. En absence d’EB2, on observe dans la cellule le messager épissé à partir des sites d’épissages 5 en position 76 et 3 en position 955. En présence d’EB2, on observe également ce messager mais un autre ARNm épissé à partir d’un site cryptique 5 contenu dans l’intron (position 266) est aussi produit. SE : site d’épissage. Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 105 revue Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. ICP27 et SRPK1 empêche donc la phosphorylation des protéines cibles de SRPK1 et la formation du complexe d’épissage [27]. La stabilité La capacité d’EB2 à favoriser l’accumulation cytoplasmique de ses ARNm cibles peut être le résultat d’un effet direct de la protéine sur l’export nucléaire de l’ARNm mais pourrait également résulter d’une stabilisation de ces ARNm, ces deux effets étant certainement liés. Plusieurs travaux suggèrent en effet que la protéine EB2 est impliquée dans la stabilité des ARNm dans le noyau. Cet aspect n’a cependant été que peu étudié jusqu’à présent. Récemment, grâce à l’utilisation d’un système inductible permettant de bloquer la transcription des gènes (système Tetoff ), nous avons pu clairement démontrer que la protéine EB2 permet d’augmenter la demi-vie nucléaire et cytoplasmique de ses ARNm cibles (résultats non publiés). Cela suggère qu’en absence de la protéine EB2, ses ARNm cibles instables sont rapidement dégradés dans le noyau de la cellule. Le mécanisme impliqué n’a pour l’instant pas été élucidé mais l’effet de la protéine SRp20 sur certains ARNm cibles de EB2 décrit précédemment laisse supposer que l’interaction entre EB2 et SRp20 pourrait être impliquée dans ce mécanisme. La protéine ORF57 a également été impliquée dans la stabilité de l’ARN PAN, un ARN viral nucléaire polyadénylé et non codant dont la fonction n’est pas connue. Un virus KSHV recombinant n’exprimant pas ORF57 ne produit qu’une quantité minimale d’ARN PAN. Cette quantité est accrue de 20 à 30 fois lorsqu’ORF57 est réintroduit. Cette accumulation est dépendante de la présence d’une séquence d’ARN structurée de 9b située en 5 de l’ARN PAN et qui fixe ORF57 [40]. L’export Les étapes de maturation des ARNm étant très liées et interdépendantes, il est très difficile de démontrer un rôle direct des protéines virales dans l’export des ARNm et le sujet reste largement controversé. Dans le cas d’EB2 par exemple, on observe, en son absence, une chute drastique de la quantité de ses ARNm cibles présents dans le cytoplasme, sans qu’il y ait en contrepartie une accumulation des ARNm dans le noyau. Ce résultat n’est cependant pas surprenant puisqu’EB2 joue aussi un rôle majeur dans la stabilisation de ces mêmes ARNm. On sait par ailleurs qu’EB2 accompagne les mRNP dans le cytoplasme où on retrouve la protéine associée aux polysomes, et qu’elle interagit directement avec des facteurs d’exports cellulaires, dont TAP/NXF1. Il est donc très probable qu’en recrutant (ou stabilisant) des facteurs d’exports cellulaires sur 106 les mRNP auxquelles il est associé, EB2 participe aussi à leur export vers le cytoplasme, ce qui a de fait pu être démontré de manière directe en utilisant certains domaines de la protéine EB2 [10]. Un effet direct dans l’export est à l’opposé fortement remis en cause pour ORF57, essentiellement à cause de son rôle dans l’accumulation d’un petit ARN polyadénylé spécifique de KSHV, l’ARN PAN, dont la localisation est strictement nucléaire [40]. Ainsi l’impact respectif des protéines virales sur les différentes étapes de maturation des ARNm viraux est probablement très variable d’un modèle viral à l’autre. La traduction EB2 stabilise et favorise l’accumulation cytoplasmique de ses ARNm cibles et il est maintenant clair qu’EB2 reste associée à ces derniers dans le cytoplasme de la cellule et favorise leur traduction. La protéine EB2 est en effet retrouvée spécifiquement associée aux polysomes dans le cytoplasme où elle permet une augmentation très importante de l’efficacité de traduction des ARNm auxquels elle est liée [41]. Cet effet d’EB2 sur la traduction n’est visible que si l’ARNm ne subit pas au préalable de réaction d’épissage. En effet, si un intron est introduit artificiellement dans le gène analysé, alors l’ARN correspondant est efficacement traduit même en absence de la protéine EB2. Par ailleurs, EB2 n’affecte pas la traduction globale des ARNm cellulaires. Le mécanisme permettant à EB2 d’augmenter la traduction de ses ARNm cibles n’est pour l’instant pas connu. UL69 est aussi capable de stimuler la traduction des ARNm issus de gènes dépourvus d’intron en excluant du complexe de traduction la protéine 4EBP1 qui inhibe l’étape d’initiation de la traduction [42]. Les protéines ICP27 et ORF57 favorisent également la traduction de leurs ARNm cibles mais semblent avoir un mode d’action encore différent. Ainsi, il a été montré qu’ICP27 interagit directement avec la protéine PABP et les facteurs d’initiation de la traduction eIF3 et eIF4G [43]. Dans le cas d’ORF57, des travaux récents ont montré qu’elle stimule la traduction des ARNm issus de gènes sans intron en interagissant avec la protéine cellulaire PYM qui favorise le recrutement sur l’ARNm du complexe 48S de pré-initiation de la traduction [44]. Les mécanismes de régulation d’EB2 et de ses analogues L’activité des protéines virales EB2, ICP27, ORF57, UL69 et IE4 est régulée par phosphorylation. Ces phosphorylations peuvent être le fait soit de protéines kinases Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. revue cellulaires, soit de protéines kinases d’origine virale. Ainsi, la protéine kinase cellulaire caseine kinase 2 (CK2) qui est connue pour phosphoryler plus de 300 protéines différentes dans la cellule interagit directement avec EB2, par l’intermédiaire à la fois de sa sous-unité catalytique ␣ et de sa sous-unité régulatrice . CK2 phosphoryle EB2 sur plusieurs résidus localisés dans le domaine N-terminal de la protéine. Cependant, bien que la mutation de ces sites diminue significativement la production de particules virales, ces mutations ne semblent pas affecter la capacité d’EB2 à faire la navette, et l’accumulation cytoplasmique de ses ARNm cibles n’est que très faiblement affectée [45]. On peut supposer que cette régulation influe sur d’autres étapes que celle de l’export comme par exemple sur la traduction dépendante d’EB2. Comme EB2, la protéine ICP27 est phosphorylée par la kinase CK2. Le blocage de cette phosphorylation par des inhibiteurs spécifiques de la CK2 conduit à une nette diminution de l’accumulation cytoplasmique d’ICP27. ICP27 est aussi phosphorylée par la PKA (Protein Kinase A) et lorsque l’un des sites de phosphorylation d’ICP27 (par la CK2 ou la PKA) est muté, la production de virions est fortement diminuée et la protéine ne co-localise plus ni avec l’ARN polymérase II ni avec la protéine REF. Par RMN (résonance magnétique nucléaire), il a été montré que le mutant de phosphorylation d’ICP27 ne présente pas la même conformation que la protéine ICP27 sauvage. La partie N-terminale d’ICP27 est flexible mais celle du mutant semble encore plus flexible, ce qui pourrait expliquer les changements observés [46]. La protéine ORF57 est phosphorylée in vitro par la CK2 mais aussi par d’autres kinases, notamment par les cyclin dependant kinase (CDK) comme CDK1. Le rôle de ces phosphorylations n’a pour lors pas encore été étudié. La phosphorylation par des protéines kinase virales a principalement été décrite pour UL69 qui est phosphorylée par la sérine/thréonine kinase virale UL97. L’utilisation d’un inhibiteur spécifique d’UL97 induit l’agrégation d’UL69 dans des structures nucléaires et diminue en partie son action sur des ARNm issus de gènes dépourvus d’intron [47]. La phosphorylation n’est cependant pas le seul mécanisme de régulation de l’activité de ces protéines. Ainsi, la protéine ICP27 peut être méthylée dans son domaine RGG par la protéine méthylase PRMT1. La mutation des résidus méthylés empêche la liaison d’ICP27 à l’ARN et l’amputation de ce domaine augmente fortement la rapidité d’export de la protéine [48]. De plus, un défaut de méthylation d’ICP27 inhibe la réplication du génome viral ainsi que l’interaction entre ICP27 et REF et l’interaction entre ICP27 et la protéine kinase SRPK1 [31, 48]. L’étude de la régulation par la méthylation n’en est qu’à ses débuts mais il a été émis Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 l’hypothèse que la méthylation pourrait ralentir l’import d’ICP27, lui permettant ainsi d’interagir correctement avec ses partenaires nucléaires [48]. On peut également supposer que d’autres modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la sumoylation pourraient jouer un rôle important dans la régulation de la fonction d’EB2 et de ses analogues mais cela n’a pour l’instant pas encore été recherché. Les protéines d’export des herpesvirus comme cibles thérapeutiques Les herpesvirus humains sont responsables de nombreuses pathologies et leur étude a aussi pour but à long terme de développer des stratégies pour bloquer ces virus. La majorité des anti-herpétiques est basée sur des analogues des nucléosides comme l’acyclovir et le gancyclovir. Ces molécules s’incorporent dans l’ADN viral et bloquent l’ADN polymérase virale ce qui inhibe spécifiquement la réplication du virus. Mais l’utilisation récurrente de ces agents conduit souvent à l’apparition de virus résistants. Le développement d’autres stratégies est donc important. L’une de ces stratégies consisterait à cibler directement les protéines indispensables à l’accumulation cytoplasmique des ARNm viraux, puisqu’elles sont nécessaires à la production de virions infectieux. C’est ce qui a été fait récemment pour ICP27. En effet, des peptideconjugated phosphorodiamidate morpholino oligomers (PPMO) ciblant ICP27 ont été développés et ils se sont montrés efficaces pour inhiber la réplication virale in vitro ainsi qu’in vivo dans des cas d’infection oculaire chez la souris [49]. Cette nouvelle technologie doit encore être développée, mais pourrait à terme être utilisée comme thérapie. Une autre stratégie consisterait à cibler les protéines indispensables au fonctionnement des protéines virales comme EB2 ou UL69 et notamment celles impliquées dans la régulation de ces facteurs. Ainsi, le maribavir, un inhibiteur spécifique de la protéine kinase virale UL97 responsable d’une partie des phosphorylations de la protéine UL69, a été testé pour traiter les infections au CMV [50]. Le mode d’action de cet inhibiteur n’a pas encore été déterminé, mais s’il ne semble pas bloquer l’ADN polymérase virale, l’expression de certaines protéines virales tardives est diminuée. Cela pourrait concorder avec un effet de cet inhibiteur sur l’activité de la protéine UL69. Le maribavir n’a pas dépassé la phase d’essai clinique III, mais l’idée de bloquer par des substances UL69 ou des protéines virales impliquées dans sa régulation reste une stratégie intéressante à développer. La détermination de la structure de la protéine 107 revue virale EB2 et de ses analogues serait certainement une aide précieuse pour rechercher des inhibiteurs spécifiques de ces facteurs. L’expression efficace des ARNm viraux issus de gènes sans intron chez les herpesvirus est dépendante d’une protéine multifonctionnelle codée par chacun de ces virus. EB2 et ses analogues ont d’abord été décrits comme des facteurs de transcription puis comme des facteurs d’export, mais ces protéines semblent avoir un rôle beaucoup plus large, prenant en charge les ARNm viraux dans le noyau après leur transcription jusque dans le cytoplasme ou elles favorisent leur traduction (figure 7). EB2 a notamment un rôle clairement démontré dans l’accumulation cytoplasmique de ses ARNm cibles, grâce au recrutement du facteur TAP/NXF1 et de certaines protéines qui lui sont associées comme les protéines SR, REF et UAP56. Mais EB2 semble aussi pouvoir protéger ses ARNm cibles d’un épissage Noyau ADN viral Cytoplasme pol DÉGRADATION CBC AAA PABP TRADUCTION Sans EB2 AAAAA ÉPISSAGE ABERRANT PABP PABP PABP AAAAA Complexe d’épissage AAA AA AAAAA PABP RBM15 AAAAA SR PABP EB2 EB2 DBP5 TAP NPC AAAAA EB2 PABP AAAAA EXPORT RBM15 SR EB2 REF Avec EB2 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Conclusion non spécifique sur des sites qui seraient reconnus par la machinerie cellulaire comme des sites d’épissage cryptiques. Enfin, EB2 stabilise ses ARNm cibles et favorise leur traduction dans le cytoplasme. Même si le rôle général d’EB2 et de ses analogues a été bien caractérisé ces dernières années, de nombreux points restent à éclaircir. On peut notamment se demander ce qui fait d’un messager une cible ou non d’EB2. Contrairement aux études in vitro, les études in vivo suggèrent en effet qu’il y a une spécificité de reconnaissance de l’ARN par EB2. Les déterminants de cette spécificité n’ont pour l’instant pas été caractérisés malgré de nombreuses recherches. On peut cependant envisager que cette spécificité soit apportée par un facteur extérieur à EB2 comme un partenaire cellulaire. Enfin, de manière plus large pour la compréhension de l’export des ARNm viraux, il serait intéressant de savoir pourquoi certains ARNm viraux issus de gènes sans intron sont exportés efficacement dans le cytoplasme en l’absence d’EB2 et quels sont les mécanismes mis en jeu. L’ensemble de ces travaux destinés à mieux comprendre les mécanismes de maturation et d’export des ARNm TAP Figure 7. Représentation schématique de l’export des ARNm issus de gènes viraux sans intron. En absence d’EB2, l’ARNm viral issu d’un gène sans intron est dégradé ou est épissé de manière aberrante puis dégradé. En présence d’EB2, cet ARNm n’est ni dégradé, ni épissé et il est exporté efficacement dans le cytoplasme grâce au recrutement de différentes protéines cellulaires comme les facteurs TAP/NXF1, SRp20 et RBM15. Dans le cytoplasme, l’ARNm est traduit par la machinerie cellulaire. La présence d’EB2 augmente fortement l’efficacité de cette traduction. NPC : complexe du pore nucléaire. 108 Virologie, Vol 17, n◦ 2, mars-avril 2013 revue viraux sera ensuite d’un grand intérêt dans la lutte contre les herpesvirus mais aussi pour permettre de mieux cerner les mécanismes d’export des ARNm par la machinerie cellulaire. Conflits d’intérêts : aucun. Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017. Références 1. Buisson M, Hans F, Kusters I, Duran N, Sergeant A. The C-terminal region but not the Arg-X-Pro repeat of Epstein-Barr virus protein EB2 is required for its effect on RNA splicing and transport. J Virol 1999 ; 73 : 4090-100. 2. 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