Imagerie tomographique et topographique par microscopie

n3
Imagerie
tomographique
topographique
et
par
Microscopie
interférentielle,
Tomographie
Optique
Cohérente.
microscopie
interférentielle
PAR L. VABRE*, A. DUBOIS*, E. BEAUREPARE**, J.L. STÉHLÉ*, A.C. BOCCARA*
* Laboratoired'Optique Physique, ESPCI, CNRS UPR
0005A
** Laboratoirede Physiologie,ESPCI,INSERM
EPI 00-02
*** SOPRA-SA
Un dispositif
Tomography)
synchrone
basé
sur
associée
multiplexée
permet
d'obtenir
des
d'un tissu biologique
1.
la technique
à une
sur
OCT
caméra
l'ensemble
(Optical Coherence
CCD et une
des
images
tomographiques
sans balayage.
Introduction
Les techniques d'imagerie tridimensionnelle non invasive sont d'un grand intérêt dans les domaines industriel
et biomédical. En effet, la possibilité d'obtenir des informations locales, dans les 3 dimensions, sans altérer l'objet observé est d'un grand intérêt en particulier pour les
contrôles de qualité et en biologie. En 1990 est apparue
une nouvelle technique appelée OCT (Optical Coherence
Tolnography) [Il capable de fournir des images en profondeur à l'intérieur d'un tissu biologique de manière
totalement non invasive. Cette technique est basée sur un
système interférométrique utilisant une source de faible
longueur de cohérence. La résolution en profondeur est
de l'ordre de la demi-longueur de cohérence de la source,
soit une dizaine de microns en utilisant une diode électroluminescente (LED) ou superradiante. Récemment [2],
l'utilisation
d'un laser à impulsions ultra-courtes
. Un dispositif de microscopie interférentielle utilisant une
sourcede faible longueurde cohérencebasésur un interféromètrede Michelsonest associéà une caméra CCDqui fournit
les imagesd'interférenceà hautecadence.
. Enutilisantun systèmede détectionsynchroneparallèlesur
l'ensembledes pixels de la caméra, on obtient des images
d'intensité(correspondantà des imagestomographiques)ou
de phase(proportionnelleà la topographie)de l'objet observé.
pixels
détection
de la caméra,
et topographiques
(quelques femtosecondes) a permis d'obtenir une résolution de l'ordre du micromètre. Ces systèmes" classiques"
d'OCT utilisent un unique détecteur, ce qui implique un
balayage pour obtenir une image complète.
2.
Dispositif
expérimental
Nous avons développé un microscope interférentiel
associé à une caméra CCD (256x256 pixels, 8 bits,
200 Hz) et une détection synchrone multiplexée sur l'ensemble des pixels de la caméra. Ce système permet d'obtenir des images tomographiques ou topographiques à
haute cadence sans balayage.
2.1
Configuration optique
Notre microscope est un interféromètre de Michelson
en lumière polarisée dont on a modifié les bras pour y
ajouter des objectifs de microscope (voir figure 1). Cette
. An interferencemicroscopeusing a low coherencesource,
basedon a Michelson interferometer, is coupled with
a CCD
cameraacquiringinterferenceimagesat highfrequency.
e Usinga parallel lock-in detectionon all thepixelsof the CCD
array, we obtain intensity images (tomographic images) or
phase images(proportionalto the topography)of the observed object.
REE
1
" `..saa,.,
MULTIPLES
a... :
FACETTES
configuration
porte le nom de microscope de Linnik.
On forme sur la caméra CCD l'image d'interférence des
ondes provenant de l'objet et du miroir plan de référence.
DE L'INSTRUMENTATION
Le signal d'interférence
pendant
les
quatre quarts de la période de modulation.
On enregistre ainsi 4 images :
La source lumineuse utilisée est une LED infrarouge
(.= 840 nm) de 15 pm de longueur de cohérence environ. Cette faible longueur de cohérence permet de n'obtenir des interférences que pour les photons provenant
d'une " tranche " particulière de l'objet d'une épaisseur de
l'ordre de la demi-longueur de cohérence, soit environ
7 lim autour du plan de mise au point de l'objectif.
L'extraction
de l'amplitude
du signal d'interférence
donne une image tomographique correspondant à cette
tranche de l'échantillon.
1 (t) et intégré
P+l
T
=4
I
T4
T
(2)
(p=0,1,2,3)
(t) dt
On montre [3] que, par développement
de Bessel, on a les relations suivantes :
de I (t) en séries
n J2.+I (W) - [ (2n + I) aj
-SO+ SI +S2 -S3 ---AsinE
(-I)
--sin
n
71
p 2n
0
+1 (3)
2n+1
(3)
*
-S +SI -S2 +SI = " 7r
A cos
(W) >,,in [ (2n + I) OEL
0 Y, J4,+2
4n+2
A partir des combinaisons
obtient A et 9.
i
.
linéaires
d'images
(3) on
m
i 1
I, \
t
hC
elwtroniqu.
',
etcctronquc - I-- 'A)
J
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So
\
Ob-ioctifs
Ohjectifsdede
microx ope
microscope
i
',,
Echtnttillon
,,,
52
1. Dispositif expérimental.
:
2.2
0
:
Système de détection
s
S3
En sortie de l'interféromètre, chaque pixel de la caméra CCD détecte un signal de la forme :
2. Acquisition des 4 images d'interférences.
1= = î + A cos (p
où A est l'amplitude du signal d'interférence provenant
d'une tranche au voisinage du plan de mise au point et q>
la phase de ce signal d'interférence. Le but est d'extraire
Les 4 images d'interférence S psont obtenues au moyen
d'un éclairage stroboscopique (modulation de la LED à
50 kHz) synchronisé avec le signal de modulation de
indépendamment A et q>.La mesure de A correspondra à
une image tomographique
et la mesure de q> donnera
biréfringence
fonctionnant
accès, dans le cas d'une surface, à sa topographie.
On introduit
d'amplitude
une modulation
de phase sinusoïdale,
\)/. On a alors :
1 (t) = 1 + A cos [ (p + y sin (û) t + u)]
images à un taux de répétition de 50 Hz.
Cette méthode est assimilable à un détection synchrone réalisée simultanément sur l'ensemble des pixels de la
caméra.
(1)
3.
Cette modulation est réalisée à f = o)/21t = 50 kHz par
un modulateur de biréfringence photoélastique qui introduit un déphasage périodique entre les 2 composantes de
polarisation
REE
N°1
1
comme indiqué sur la figure 2. La caméra
à 200 Hz, on acquiert les séries de quatre
issues des 2 bras de l'interféromètre.
Résolutions
La résolution
et sensibilité
latérale
est déterminée
numérique ON des objectifs
varie comme ==k/2 ON.
par l'ouverture
de microscope
utilisés
et
La résolution axiale (suivant z) est déterminée par la lon-
Imagerie tomographique
et topographique
gueur de cohérence de la source lumineuse employée.
avons toutefois montré qu'il était possible d'améliorer
résolution
jusqu'à
un micron
en utilisant
Nous
cette
des objectifs
de
grandes ouvertures numériques
[3, 4]. C'est alors la profondeur de champ de l'objectif
qui fixe la résolution en profondeur. Pour notre configuration
verture
commence
cohérence
à supplanter
lorsque
l'ouverture
La sensibilité
particulier
surfaces.
niveau
expérimentale,
verticale
de bruit
l'effet
dû à la longueur
numérique
dépasse 0,3.
est un paramètre
présent
dans les images.
correspondant
au cas d'un
La
4.
figure
masque
4 montre
pour
circuit
la topographie
intégré
d'un
(chrome
détail
déposé
sur
de
du
quartz).
Le temps de pose est d'une seconde et le temps
de calcul
total (image
de phase + topographie)
est du
même
ordre.
La résolution
latérale
est de 2 y m.
de
important
en
On obtient
bruit
de
le
une
de photons
40
(évolution
en (temps)'').
Pour des temps de pose de
l'ordre
de la seconde, une sensibilité
meilleure
que 100
picomètres
microscopie interférentielle
cet effet d'ou-
lors de la reconstruction
de topographies
Nous avons évalué ce paramètre en mesurant
évolution
par
N
a été mesurée.
0
250 --- 2m
200 --- 150
Résultats
100
100
4.1
50
Imagerie tomographique
4. Reconstruction tridimensionnelle d'une surface
d'un détail d'un mas9ue pour circuits intégrés.
Ternps de pose = 1 s. Champ =200
5.
1
11
lisant
If'-.
avons développé
une source
et une caméra
hi.
1
chrone
1/'
= 0,25.
Conclusion
Nous
Il
lm. ON
parallèle,
un microscope
de faible
CC, qui,
fournit
longueur
par le biais
des images
interférentiel
uti-
de cohérence
d'une
(LED)
détection
syn-
tomographiques
et
topographiques
à la cadence de plusieurs hertz. Des applications pour l'imagerie
des tissus biologiques
et des com3. Image tomographique
70,um sous sa surface. Temps
Nous
avons
phiques
animaux.
cherché
posants
d'un embryon de drosophile
à obtenir
des images
Références
tomograet
un
[1]
objectif
de 0,4 d'ouverture
numérique
offrant une résolution latérale de 2,u m. La résolution
axiale est ici imposée
coupe
milieu.
distingue
4.2
avons
intégrés
image
représente
optical coherence tomography' ; Optics
1999, p. 1221-1223.
types
importantes
égal à ./2
et doit
1,3 pour
de surfaces
optiques
ou plus généralement
utilise
Letters,
vol. 24,
f3l Dubois A.,
Lebec M, Boccara A.C. " Real-time reflectivity
and topography imagery of depth-resolved microscopic sur-
différents
le cas où l'on
[21 DrexlerVV.,
Morgner U.. Kartner FX, Pitris C, Boppart S.A.
Li X.D. Ippen E.F Fujimoto J.G,
" In vivo ultrahigh-resolution
de l'embryon.
topographique
étudié
Huan D.. Swanson E.A.. Lin c.p, Schuman JS, Stinson WG,
Chang W, Hee M.R. Flotte T, Gregory K., Puliafito C.A,
Fujimoto J.G. " Optical coherence tomography' ; Science, vol.
254, 1991, p. 1178.
une
(Drosophile)
prise en son
entre lame et lamelle.
On
les membranes
numériques
atteignant
Cette
ou de composants
ver la rugosité
Dans
de mouche
est placé
clairement
Imagerie
Nous
cuits
de cohérence.
d'embryon
L'embryon
ont été démontrées.
de pose = 6 s. ON = 0,4.
de différents
types d'échantillons
végétaux
L'image
de la figure 3 a été obtenue avec
par la longueur
micro-électroniques
l'état
pour
(>0,5),
une ouverture
facteur
de 0,95
n'est
plus
multiplicatif
[4, 51.
Letters, vol. 24, 1999, p. 309-311.
[4]
Dubois A., Selb J, Vabre L, Boccara AC, " Phase measurement with wide-aperture interferometers' ; Applied Optics,
vol. 39, 2000, p. 2326-1331.
[5]
Creath K, " Calibration of numerical effect in interferometric
microscope objectives','Appiied Optics, vol. 28,
1989, p.
3333-3338
d'ouvertures
l'interfrange
d'un
en obser-
de surface.
des objectifs
être corrigé
face','Optics
de cir-
REE
1
MULTIPLES
FACETTES
DE
L'INSTRUMENTATION
Les auteurs
Laurent
VABRE,
Ingénieur
diplômé
de la Nouvelle
Formation
d'Ingénieurs en Optronique INFIOI de l'Université Paris XI, Au cours de
son DEA, il a rejoint le groupe d'imagerie à faible longueur de cohérence
du Laboratoire d'Optique de i'ESPCi (Eco ! e Supérieure de Physique et
Chimie Industrielles de la Ville de Paris) Il y prépare depuis son doctorat,
sous la direction
microscopes
biologiques
de A, C. Boccara et A.Dubois,
à hautes résolutions
sur le développement
pour l'imagerie
de
non invasive d'objets
ou du domaine de ! a micro-éiectronque.
Arnaud
DUBOIS,
l'Ecole Supérieure
au laboratoire
de neurophysiologie
lièrement à la microscopie
ESPCI,INSERM et s'intéresse
particu-
en profondeur des tissus.
Jean-Louis
STÉHLÉ.
DUT Mécanique
et licence de Physique Directeur Général, a rejoint SOPRA des 1971. Il est le créateur Inventif et le
père de plusieurs activités de la société, dont la dernlère et principale : !'eilipsométrie spectroscopique.
Il est considéré dans ce domaine comme
une référence internationale. Il est à l'origine de nombreuses publications.
après avoir obtenu son diplôme d'ingénieur
de
d'Optique,
a préparé son doctorat
à l'institut
Albert-Claude
BOCCARA,
Ingénieur, Docteur d'Etat, responsable du
laboratoire d'optique
de l'Ecole Supérieure
de Physique et Chimie
d'Optique
à Orsay dans le domaine de l'optique non-iinéaire. sur les
Osclllateurs Paramétriques Optique (OPO). A l'issue de sa thèse, il est
Industrielles
de la Ville de Paris et de l'UPR A0005 du CNRS, est
Professeur
à l'ESPCI Il
est à l'origine
de nombreux
systèmes
de
mesures utilisant des méthodes optiques travaillant aux limites phy-
entré au Laboratoire
d'Optique
de l'ESPCI en tant que Maître de
Conférences. II travaille depuis sur la microscopie à faible longueur de
cohérence
appliquée
à la biologie,
et au contrôle
de composants
d'op-
tique et de microélectronique.
Emmanuel
BEAUREPAIRE,
docteur ingénieur physicien, a travaillé au
développement
de techniques de microscopie biologique à l'ESPCI, à
Linstitut Curie et à l'Université Cornell. Il est actue ! iement post-doctorant
siques de leur sensibilité. Ces outils ont été utilisés aussi bien pour des
recherches à caractère fondamental (étude des Ions dans les cristaux,
diffusion anormale de la chaleur, localisation dAnderson etc), qu'appliqué (contrôle non destructif, microscopie en champ proche, imagerie
tomographique
des tissus biologiques, etc. !. Son laboratoire possède un
potentiel expérimental important
pour tout ce qui concerne l'instrumentation, la mesure et les images