Imagerie tomographique et topographique par microscopie

Imagerie tomographique et
topographique par microscopie
interférentielle
n3
Microscopie
interférentielle,
Tomographie
Optique
Cohérente.
PAR L. VABRE*, A. DUBOIS*, E. BEAUREPARE**, J.L. STÉHLÉ*, A.C. BOCCARA*
* Laboratoire d'Optique Physique, ESPCI, CNRS UPR A 0005
** Laboratoire de Physiologie, ESPCI,INSERM EPI 00-02
*** SOPRA-SA
Un dispositif basé sur la technique OCT (Optical Coherence
Tomography) associée à une caméra CCD et une détection
synchrone multiplexée sur l'ensemble des pixels de la caméra,
permet d'obtenir des images tomographiques et topographiques
d'un tissu biologique sans balayage.
1. Introduction
Les techniques d'imagerie tridimensionnelle non inva-
sive sont d'un grand intérêt dans les domaines industriel
et biomédical. En effet, la possibilité d'obtenir des infor-
mations locales, dans les 3 dimensions, sans altérer l'ob-
jet observé est d'un grand intérêt en particulier pour les
contrôles de qualité et en biologie. En 1990 est apparue
une nouvelle technique appelée OCT (Optical Coherence
Tolnography) [Il capable de fournir des images en pro-
fondeur à l'intérieur d'un tissu biologique de manière
totalement non invasive. Cette technique est basée sur un
système interférométrique utilisant une source de faible
longueur de cohérence. La résolution en profondeur est
de l'ordre de la demi-longueur de cohérence de la source,
soit une dizaine de microns en utilisant une diode électro-
luminescente (LED) ou superradiante. Récemment [2],
l'utilisation d'un laser à impulsions ultra-courtes
(quelques femtosecondes) a permis d'obtenir une résolu-
tion de l'ordre du micromètre. Ces systèmes " classiques "
d'OCT utilisent un unique détecteur, ce qui implique un
balayage pour obtenir une image complète.
2. Dispositif expérimental
Nous avons développé un microscope interférentiel
associé à une caméra CCD (256x256 pixels, 8 bits,
200 Hz) et une détection synchrone multiplexée sur l'en-
semble des pixels de la caméra. Ce système permet d'ob-
tenir des images tomographiques ou topographiques à
haute cadence sans balayage.
2.1 Configuration optique
Notre microscope est un interféromètre de Michelson
en lumière polarisée dont on a modifié les bras pour y
ajouter des objectifs de microscope (voir figure 1). Cette
. Un dispositif de microscopie interférentielle utilisant une
source de faible longueur de cohérence basé sur un interféro-
mètre de Michelson est associé à une caméra CCD qui fournit
les images d'interférence à haute cadence.
. En utilisant un système de détection synchrone parallèle sur
l'ensemble des pixels de la caméra, on obtient des images
d'intensité (correspondant à des images tomographiques) ou
de phase (proportionnelle à la topographie) de l'objet observé.
. An interference microscope using a low coherence source,
based on a Michelson interferometer, is coupled with a CCD
camera acquiring interference images at high frequency.
e Using a parallel lock-in detection on all the pixels of the CCD
array, we obtain intensity images (tomographic images) or
phase images (proportional to the topography) of the obser-
ved object.
REE
1

" `..s aa,., a... : MULTIPLES FACETTES DE L'INSTRUMENTATION
configuration porte le nom de microscope de Linnik.
On forme sur la caméra CCD l'image d'interférence des
ondes provenant de l'objet et du miroir plan de référence.
La source lumineuse utilisée est une LED infrarouge
(.= 840 nm) de 15 pm de longueur de cohérence envi-
ron. Cette faible longueur de cohérence permet de n'ob-
tenir des interférences que pour les photons provenant
d'une " tranche " particulière de l'objet d'une épaisseur de
l'ordre de la demi-longueur de cohérence, soit environ
7 lim autour du plan de mise au point de l'objectif.
L'extraction de l'amplitude du signal d'interférence
donne une image tomographique correspondant à cette
tranche de l'échantillon.
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Echtnttillon
1. Dispositif expérimental.
2.2 Système de détection
En sortie de l'interféromètre, chaque pixel de la camé-
ra CCD détecte un signal de la forme :
1= = î + A cos (p
où A est l'amplitude du signal d'interférence provenant
d'une tranche au voisinage du plan de mise au point et q>
la phase de ce signal d'interférence. Le but est d'extraire
indépendamment A et q>. La mesure de A correspondra à
une image tomographique et la mesure de q> donnera
accès, dans le cas d'une surface, à sa topographie.
On introduit une modulation de phase sinusoïdale,
d'amplitude \)/. On a alors :
1 (t) = 1 + A cos [ (p + y sin (û) t + u)] (1)
Cette modulation est réalisée à f = o)/21t = 50 kHz par
un modulateur de biréfringence photoélastique qui intro-
duit un déphasage périodique entre les 2 composantes de
polarisation issues des 2 bras de l'interféromètre.
1
REE
N° 1
Le signal d'interférence 1 (t) et intégré pendant les
quatre quarts de la période de modulation.
On enregistre ainsi 4 images :
P+l
= 4T
T
4 I (t) dt
T(p=0,1,2,3) (2)
On montre [3] que, par développement de I (t) en séries
de Bessel, on a les relations suivantes :
(3)
n J2.+I (W) - [ (2n + I) aj
-SO+ SI +S2 -S3 ---AsinE (-I) --sin
n p 2n+171 0 2n +1 (3)
*
-S +SI -S2 +SI = " A cos Y, J4,+2 (W) >,,in [ (2n + I) OEL
7r 0 4n+2
A partir des combinaisons linéaires d'images (3) on
obtient A et 9.
m
So
',,
n ^W
i
,,,
: 0 : s
52
S3
2. Acquisition des 4 images d'interférences.
Les 4 images d'interférence S psont obtenues au moyen
d'un éclairage stroboscopique (modulation de la LED à
50 kHz) synchronisé avec le signal de modulation de
biréfringence comme indiqué sur la figure 2. La caméra
fonctionnant à 200 Hz, on acquiert les séries de quatre
images à un taux de répétition de 50 Hz.
Cette méthode est assimilable à un détection synchro-
ne réalisée simultanément sur l'ensemble des pixels de la
caméra.
3. Résolutions et sensibilité
La résolution latérale est déterminée par l'ouverture
numérique ON des objectifs de microscope utilisés et
varie comme == k/2 ON.
La résolution axiale (suivant z) est déterminée par la lon-

Imagerie tomographique et topographique par microscopie interférentielle
gueur de cohérence de la source lumineuse employée. Nous
avons toutefois montré qu'il était possible d'améliorer cette
résolution jusqu'à un micron en utilisant des objectifs de
grandes ouvertures numériques [3, 4]. C'est alors la profon-
deur de champ de l'objectif qui fixe la résolution en profon-
deur. Pour notre configuration expérimentale, cet effet d'ou-
verture commence à supplanter l'effet dû à la longueur de
cohérence lorsque l'ouverture numérique dépasse 0,3.
La sensibilité verticale est un paramètre important en
particulier lors de la reconstruction de topographies de
surfaces. Nous avons évalué ce paramètre en mesurant le
niveau de bruit présent dans les images. On obtient une
évolution correspondant au cas d'un bruit de photons
(évolution en (temps)''). Pour des temps de pose de
l'ordre de la seconde, une sensibilité meilleure que 100
picomètres a été mesurée.
4. Résultats
4.1 Imagerie tomographique
1
1 1
If'-.
Il
hi. 1 1/'
La figure 4 montre la topographie d'un détail de
masque pour circuit intégré (chrome déposé sur du
quartz). Le temps de pose est d'une seconde et le temps
de calcul total (image de phase + topographie) est du
même ordre. La résolution latérale est de 2 y m.
40
N0250 --- 2m
200 --- 150 100
100 50
3. Image tomographique d'un embryon de drosophile
70,um sous sa surface. Temps de pose = 6 s. ON = 0,4.
4. Reconstruction tridimensionnelle d'une surface
d'un détail d'un mas9ue pour circuits intégrés.
Ternps de pose = 1 s. Champ =200 lm. ON = 0,25.
5. Conclusion
Nous avons développé un microscope interférentiel uti-
lisant une source de faible longueur de cohérence (LED)
et une caméra CC, qui, par le biais d'une détection syn-
chrone parallèle, fournit des images tomographiques et
topographiques à la cadence de plusieurs hertz. Des appli-
cations pour l'imagerie des tissus biologiques et des com-
posants micro-électroniques ont été démontrées.
Nous avons cherché à obtenir des images tomogra-
phiques de différents types d'échantillons végétaux et
animaux. L'image de la figure 3 a été obtenue avec un
objectif de 0,4 d'ouverture numérique offrant une résolu-
tion latérale de 2,u m. La résolution axiale est ici imposée
par la longueur de cohérence. Cette image représente une
coupe d'embryon de mouche (Drosophile) prise en son
milieu. L'embryon est placé entre lame et lamelle. On
distingue clairement les membranes de l'embryon.
4.2 Imagerie topographique
Nous avons étudié différents types de surfaces de cir-
cuits intégrés ou de composants optiques pour en obser-
ver la rugosité ou plus généralement l'état de surface.
Dans le cas où l'on utilise des objectifs d'ouvertures
numériques importantes (>0,5), l'interfrange n'est plus
égal à ./2 et doit être corrigé d'un facteur multiplicatif
atteignant 1,3 pour une ouverture de 0,95 [4, 51.
Références
[1] Huan D.. Swanson E.A.. Lin c.p, Schuman JS, Stinson WG,
Chang W, Hee M.R. Flotte T, Gregory K., Puliafito C.A,
Fujimoto J.G. " Optical coherence tomography' ; Science, vol.
254, 1991, p. 1178.
[21 DrexlerVV., Morgner U.. Kartner FX, Pitris C, Boppart S.A.
Li X.D. Ippen E.F Fujimoto J.G, " In vivo ultrahigh-resolution
optical coherence tomography' ; Optics Letters, vol. 24,
1999, p. 1221-1223.
f3l Dubois A., Lebec M, Boccara A.C. " Real-time reflectivity
and topography imagery of depth-resolved microscopic sur-
face','Optics Letters, vol. 24, 1999, p. 309-311.
[4] Dubois A., Selb J, Vabre L, Boccara AC, " Phase measure-
ment with wide-aperture interferometers' ; Applied Optics,
vol. 39, 2000, p. 2326-1331.
[5] Creath K, " Calibration of numerical effect in interferometric
microscope objectives','Appiied Optics, vol. 28, 1989, p.
3333-3338
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1

MULTIPLES FACETTES DE L'INSTRUMENTATION
Les auteurs
Laurent VABRE, Ingénieur diplômé de la Nouvelle Formation
d'Ingénieurs en Optronique INFIOI de l'Université Paris XI, Au cours de
son DEA, il a rejoint le groupe d'imagerie à faible longueur de cohérence
du Laboratoire d'Optique de i'ESPCi (Eco ! e Supérieure de Physique et
Chimie Industrielles de la Ville de Paris) Il y prépare depuis son doctorat,
sous la direction de A, C. Boccara et A.Dubois, sur le développement de
microscopes à hautes résolutions pour l'imagerie non invasive d'objets
biologiques ou du domaine de ! a micro-éiectronque.
Arnaud DUBOIS, après avoir obtenu son diplôme d'ingénieur de
l'Ecole Supérieure d'Optique, a préparé son doctorat à l'institut
d'Optique à Orsay dans le domaine de l'optique non-iinéaire. sur les
Osclllateurs Paramétriques Optique (OPO). A l'issue de sa thèse, il est
entré au Laboratoire d'Optique de l'ESPCI en tant que Maître de
Conférences. II travaille depuis sur la microscopie à faible longueur de
cohérence appliquée à la biologie, et au contrôle de composants d'op-
tique et de microélectronique.
Emmanuel BEAUREPAIRE, docteur ingénieur physicien, a travaillé au
développement de techniques de microscopie biologique à l'ESPCI, à
Linstitut Curie et à l'Université Cornell. Il est actue ! iement post-doctorant
au laboratoire de neurophysiologie ESPCI,INSERM et s'intéresse particu-
lièrement à la microscopie en profondeur des tissus.
Jean-Louis STÉHLÉ. DUT Mécanique et licence de Physique -
Directeur Général, a rejoint SOPRA des 1971. Il est le créateur Inventif et le
père de plusieurs activités de la société, dont la dernlère et principale : !'ei-
lipsométrie spectroscopique. Il est considéré dans ce domaine comme
une référence internationale. Il est à l'origine de nombreuses publications.
Albert-Claude BOCCARA, Ingénieur, Docteur d'Etat, responsable du
laboratoire d'optique de l'Ecole Supérieure de Physique et Chimie
Industrielles de la Ville de Paris et de l'UPR A0005 du CNRS, est
Professeur à l'ESPCI Il est à l'origine de nombreux systèmes de
mesures utilisant des méthodes optiques travaillant aux limites phy-
siques de leur sensibilité. Ces outils ont été utilisés aussi bien pour des
recherches à caractère fondamental (étude des Ions dans les cristaux,
diffusion anormale de la chaleur, localisation dAnderson etc), qu'appli-
qué (contrôle non destructif, microscopie en champ proche, imagerie
tomographique des tissus biologiques, etc. !. Son laboratoire possède un
potentiel expérimental important pour tout ce qui concerne l'instrumen-
tation, la mesure et les images