I. Introduction
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Introduction I. Introduction I.1 Choix du modèle animal : le xénope Dans le cadre de cette thèse, nous utilisons le modèle Xenopus laevis (Daudin, 1802) également appelé "grenouille à griffes" et "claw-toed frog" en anglais (cf. Fig.1). Originaire d'Afrique australe, cette espèce appartient à la famille des Pipidae et à l'ordre des anoures. Les embryons de cet amphibien offrent notamment des avantages complémentaires aux autres modèles de vertébrés utilisés en laboratoire. Ces embryons sont de grandes tailles (1 à 2mm), disponibles en grand nombre (300 à 1000 œufs par femelle) et se développent en milieu externe ce qui permet une observation macroscopique des diverses étapes de l'embryogenèse et facilite leur manipulation. Ces embryons peuvent être obtenus toute l'année en stimulant les femelles par de l'hormone chorionique gonadotropine humaine (HGC). Les œufs ainsi obtenus peuvent être fécondés in vitro et donc se développer de manière synchronisée. Nombre de techniques sont utilisées afin d'étudier l'expression, la fonction et la régulation des gènes. Par exemple, la micro-injection d'ARN messager codant pour des protéines sauvages, chimériques, inductibles par dexaméthasone permet de réaliser des expériences de gain de fonction. Parallèlement, la micro-injection d'ARNm codant pour des dominants négatifs, des oligonucléotides antisens de type morpholinos permet de réaliser des expériences de perte de fonction. Ces expériences de surexpression et de sous-expression de gènes peuvent également être réalisées par électroporation (Haas et al., 2001) ou par lipofection (Holt et al., 1990). Des hybridations in situ sur embryons complets ou sur des calottes animales permettent de visualiser le profil d'expression de gènes. Des expériences de criblage différentiel de bibliothèques d'ADNc permettent d'identifier divers gènes régulés par un gène d'intérêt. La technique de transgenèse qui consiste à incorporer in vitro de l ’ADN dans des noyaux de spermatozoïdes et à injecter ces noyaux dans des oeufs non fécondés (Kroll and Amaya, 1996). Récemment, une nouvelle technique de 1 Introduction transgenèse a été mise au point et consiste en l'injection dans un œuf fécondé d'une solution contenant la méganucléase I-SceI et l'ADN plasmidique linéarisé par cette méganucléase (Pan et al., 2005). Les embryons de xénope permettent aussi d'effectuer des expériences de micromanipulations telles que dissections et greffes. Ce modèle animal dispose d'outils génomiques tels que des banques d'EST (Expressed Sequence Tagged) et de biopuces à ADN. Xenopus laevis comporte certains désavantages à savoir son génome, constitué de 36 chromosomes, qui est tétraploïde et son long temps de génération (1 à 2 ans) freinant ainsi les approches génétiques. Ces deux aspects sont contournés grâce à l'utilisation du Xenopus tropicalis. Cette espèce, originaire d'Afrique occidentale, a un temps de génération plus court (inférieur à 6 mois) et est diploïde (Hirsch et al., 2002). Son génome, constitué de 20 chromosomes, a été récemment séquencé et est disponible sur www.ensembl.org. De plus, la femelle pond entre 1000 et 3000 œufs mais de plus petite taille (0,7 à 0,8mm). I.2 Embryogenèse – Aperçu général Les œufs des vertébrés sont classés en deux catégories. Ceux de grande taille riches en réserves nutritives (amphibiens, poissons et oiseaux) et ceux de petite taille dépourvus de réserves nutritives (mammifères). Après fécondation, leur développement précoce diffère fortement notamment au niveau de la formation des axes. Mais tous les vertébrés se développent à travers un stade commun phylotypique dans lequel se distinguent la tête, le tube neural le long de la ligne dorso-médiane et la notochorde flanquée de chaque côté de somites (cf. Fig.2). Chez Xenopus laevis, l'œuf est radialement symétrique et possède un pôle animal riche en pigments et un pôle végétal riche en réserves nutritives. Suite à la fécondation, le cortex (couche située en dessous de la membrane cellulaire) effectue une rotation corticale de 30° aussi appelée rotation de symétrisation (cf. Fig.3). La rotation corticale est l'événement fondateur dans l'acquisition de la polarité dorsoventrale. Environ 1 heure après la pénétration du spermatozoïde, la calotte 2 Introduction pigmentaire de l'hémisphère animal se contracte vers le point d'entrée du spermatozoïde. Il en résulte la formation d'une zone plus claire située à l'opposé du point d'entrée du spermatozoïde, appelée "croissant dépigmenté" ou "croissant gris". Cette structure marque la future face dorsale de l'embryon. Cette rotation permet la formation d'un centre de signalisation appelé "centre de Nieuwkoop". Le zygote subit une série de clivages jusqu'à former la blastula. S'en suit la gastrulation où l'on assiste à une migration cellulaire permettant la mise en place de trois feuillets embryonnaires primordiaux : l'ectoderme, le mésoderme et l'endoderme. Ces trois feuillets donnent respectivement naissance à l'épiderme et au tissu nerveux; au tissu conjonctif, squelette, muscles et certains organes (cœur, reins); au système digestif et autres organes (foie, poumons). Au stade gastrula, le neurectoderme est situé dans la partie dorsale de l'embryon, au-dessus de la notochorde. Il est induit par le mésoderme dorsal et constitue l'ébauche du tissu neural. Au stade neurula, l’ectoderme s’épaissit et se constitue de deux tissus distincts. Le premier, décrit au stade gastrula, est constitué de cellules précurseurs neurales (neuroblastes) et formera le système nerveux. Le second est constitué de cellules précurseurs épidermiques (épiblastes) et formera la peau. Dans la partie dorsale de l'embryon apparaît une zone en forme de poire, la plaque neurale. En grandissant, elle se rallonge et prend l’apparence d’une raquette. La plaque neurale est d’abord largement ouverte puis elle s’enfonce en gouttière délimitée par deux bourrelets. Ceux-ci constituent, au niveau de leur partie antérieure, les crêtes neurales et se rapprochent peu à peu de part et d’autre de la ligne dorsale. Ils finissent par se souder en donnant naissance au tube neural. Celui-ci se recouvre d’épiderme et finit par disparaître à l’intérieur de l’embryon (cf. Fig.4). La suite du développement embryonnaire va permettre la création de la colonne vertébrale, de la moelle épinière et de la partie antérieure qui après diverses transformations devient le cerveau. Les crêtes neurales seront en partie à l'origine du système nerveux périphérique. L'embryon forme par la suite un têtard où s'opère l'organogenèse. Suivie d'un stade de métamorphose, on assiste au développement des membres antéro-postérieurs et à la résorption de la queue afin de former une grenouille adulte (cf. Fig.5). 3 Introduction I.3 Induction neurale La formation du système nerveux, qui commence au stade neurula, est initiée par un événement appelé l'induction neurale. Des expériences de transplantations ont démontré que des signaux induisent la plaque neurale durant la gastrulation et que l'origine de ces signaux provient du "centre organisateur" ou "organisateur de Spemann" situé dans le mésoderme dorsal. La greffe de cet organisateur au stade gastrula précoce provoque la formation d'une structure antérieure complète constituée d'un axe secondaire et d'un tube neural (Spemann et Mangold, 1924; cf. Fig.6). Conjointement, l'excision de cet organisateur au stade blastula tardif empêche la formation de la plaque neurale (Stevart and Gerhart, 1990). On retrouve cette même fonction exercée par l'organisateur de Spemann parmi les autres modèles de laboratoire à savoir "le bouclier" chez le poisson zèbre (Shih and Fraser, 1996), "le nœud d'Hensen" chez le poulet (Storey et al., 1992) et "le nœud" chez la souris (Beddington et al.,1994). Les mécanismes moléculaires qui entrent en jeu sont multiples. D'une part, la famille des Bone morphogenetic protein (BMP), appartenant à la super-famille des Transforming Growth Factor-β (TGF-β), induit la différenciation de l'ectoderme en épiderme et ventralise le mésoderme. Des expériences de surexpression de dominants négatifs de récepteurs BMP induisent le développement neural (Cowan et al., 1995). D'autre part, des molécules neuralisantes produites par l'organisateur de Spemann telles que Noggin, Chordin et Follistatin agissent comme antagonistes des BMP. Cette dernière fonction peut être directe. Par exemple, Noggin se lie aux ligands BMP2 et BMP4 les empêchant ainsi de se fixer à leurs récepteurs (Zimmerman et al., 1996). L'inhibition de l'expression des BMP se fait également par d'autres mécanismes tels que l'inhibition de la transcription du gène BMP lui-même et l'inhibition de la signalisation intracellulaire des protéines Smad (Munoz-Sanjuan et al., 2002; De Robertis and Kuroda, 2004; Linker and Stern, 2004; Stern, 2005; van Grunsven et al., 2006 en soumission). Afin d'expliquer les mécanismes d'induction neurale, un modèle appelé "induction/modèle par défaut" a été établi. Ce modèle soutient l'idée selon laquelle les 4 Introduction cellules issues de la calotte animale de l'embryon adoptent par défaut une destinée neurale. En effet, l'expérience montre qu'en les cultivant plusieurs heures en milieu dépourvu de calcium et magnésium, ce qui dissocie les cellules et leur fait donc perdre leurs connexions, elles forment du tissu neural. Inversement, elles forment du tissu épidermique si elles ne sont pas dissociées ou si elles sont réagrégées immédiatement après dissociation (Grunz and Tacke, 1989). Le modèle par défaut reste une approche incomplète. Les cellules situées endehors des territoires neuraux peuvent aussi adopter une identité neurale suggérant l'intervention de facteurs neuralisants (Streit and Stern, 1999). L'organisateur de Spemann n'engendre pas d'induction neurale si l'activité du récepteur Fibroblast growth factor (FGFR) est bloquée même si la greffe exprime correctement Chordin (Streit et al., 2000). FGFR est essentiel dans le devenir neural postérieur de l'embryon (Munoz-Sanjuan and Brivanlu, 2002). Des cellules BMP-déficientes et qui surexpriment faiblement le facteur de croissance FGF, deviennent des précurseurs neuraux ce qui montre la nécessité des deux événements pour leur développement neural (Delaune et al., 2005). La voie de signalisation Wnt est également impliquée dans les processus d'induction neurale (Parr and McMahon, 1994). Des recherches en embryons de xénope ont montré que la voie de signalisation Wnt est capable de réprimer l'expression du gène BMP4 et qu'elle serait également nécessaire à l'expression des antagonistes des BMP (Noggin, Chordin et follistatin) au stade blastula précoce dans les cellules progénitrices du neurectoderme (Baker et al., 1999). Sur base de l’ensemble de ces données, un nouveau modèle d’induction neurale chez le xénope a été proposé, réconciliant les voies de signalisation BMP, FGF et Wnt (Delaune et al., 2005; cf. Fig.7). Selon ce modèle, la polarité dorso-ventrale établie au moment de la fécondation de l’oeuf suite à l’établissement d’un gradient de βcaténine, un médiateur essentiel de la voie de signalisation Wnt, décroît du côté dorsal vers le côté ventral. Le facteur de transcription maternel VegT localisé au pôle végétal de l’oeuf active l’expression à la mid blastula transition (MBT; stade 7) de plusieurs membres de la famille des TGF-ß, y compris ceux codant pour les protéines apparentées au facteur nodal, ainsi que de membres des FGF. Il apparaît ainsi à la MBT un gradient de concentration de nodal avec un maximum au pôle végétal qui détermine la position des cellules progénitrices de l’endoderme, du mésoderme et de 5 Introduction l’ectoderme. La combinaison de ces deux gradients de signaux permet l’établissement du centre de Nieuwkoop qui induit la région organisatrice de Spemann dans la région marginale dorsale de l’embryon. Le neurectoderme apparaît à partir de l’ectoderme dorsal où un signal FGF faible est présent. Cette différenciation de l’ectoderme en tissu neural requiert, au stade blastula, l’activation de la ß-catenin qui inhibe la transcription des BMP et active l’expression des antagonistes extracellulaires des BMP Chordin et Noggin. Le signal FGF en faible quantité serait lui nécessaire pour bloquer complètement la transcription et l’activité des BMP, condition indispensable à la neuralisation. En aval de l'induction neurale, de nombreux effecteurs ont été identifiés tels que Geminin (Kroll et al., 1998), Zic 1 à 3 (Nakata et al., 1997; Kuo et al., 1998), Sox1 à 3 (Penzel et al., 1997; Kishi et al., 2000; Graham et al., 2003), SoxD (Mizuseki et al., 1998) et la protéine Smad-interacting protein (SIP1; Eisaki et al., 2000; van Grunsven et al., 2000; Sheng et al., 2003). I.4 Régionalisation du tissu neural La régionalisation antéro-postérieure du tissu neural a lieu en même temps que l’induction neurale. De nombreux résultats supportent l’idée que la formation du cerveau antérieur dépend de la combinaison de l’inhibition des facteurs BMPs, Wnts et nodal (Niehrs, 1999). Le tissu neural initialement formé, de nature télencéphalique, serait transformé en structures neurales plus postérieures par des signaux postériorisant Wnt. En effet, la surexpression d'ARN messager Wnt réprime l'expression de marqueurs antérieurs induits par Noggin et induit l'expression de marqueurs du cerveau moyen et postérieur (Mc Grew et al., 1995). Les facteurs FGF et l’acide rétinoique joueraient également un rôle dans l’identité des structures formées, en particulier au niveau du cerveau moyen et postérieur (Kudoh et al., 2002). La régionalisation dorso-ventrale du tube neural implique des signaux ventralisants produits par le mésoderme préchordal et la notochorde (nodals, shh) et des signaux dorsalisants produits par l’ectoderme (BMPs), qui génèrent une information de 6 Introduction position permettant la différenciation à des endroits précis du tube neural des différents types de neurones. Plus tard, au cours du développement, d’autres centres inducteurs apparaissent dans le tissu neural qui raffinent et complexifient cette régionalisation initiale. Ce sont notamment l’ANB (anterior neural boundary), qui correspond à la rangée de cellules la plus antérieure du neurectoderme, la ZLI (zona limitans intrathalamica) située entre les prosomères 2 et 3 au niveau du thalamus, et l’isthme, qui se situe entre les régions correspondant aux futurs cerveaux moyen et postérieur. I.5 Le système nerveux Le neurectoderme constitue chez l'embryon le tissu qui est à l'origine du futur système nerveux. Le cerveau est constitué de deux types majeurs de cellules : les neurones et les cellules gliales. Ces dernières constituent la glie qui forme près de 80% du volume du système nerveux et comprennent essentiellement des astrocytes et des oligodendrocytes. Les neurones forment un réseau complexe servant à véhiculer l'information. Le fonctionnement de ce réseau nécessite l'intervention des cellules gliales. Le rôle des oligodendrocytes consiste à isoler les tissus nerveux en s'enroulant au niveau des axones tandis que les astrocytes servent à soutenir le tissu nerveux et à remplir diverses fonctions métaboliques. Le système nerveux est scindé en deux parties. La première partie est le système nerveux central (SNC) qui comprend l'encéphale et la moelle épinière. L'encéphale est constitué du bulbe rachidien, du tronc cérébral, du cervelet, du diencéphale et du télencéphale. Le bulbe rachidien contrôle les fonctions autonomes du corps et transmet les informations des nerfs au cerveau via la moelle épinière. Le tronc cérébral est responsable de plusieurs fonctions, dont la respiration, la régulation du rythme cardiaque, la localisation des sons. Le cervelet est impliqué dans le calcul des mouvements, la mesure du temps, et diverses autres fonctions motrices et cognitives. Le diencéphale est constitué du thalamus et de l'hypothalamus. D'une part le thalamus joue un rôle essentiel dans la sensibilité, la motricité, l'excitation corticale et la mémoire. D'autre part, 7 Introduction l'hypothalamus est le principal centre d'intégration du système nerveux végétatif, il intervient également dans les émotions. Il régit la soif, l'appétit et la température. Le télencéphale est le plus développé chez les primates. Il intervient dans les perceptions sensorielles et dans la motricité volontaire. La deuxième partie est le système nerveux périphérique (SNP) qui est formée de ganglions et de nerfs. Il fait circuler l'information entre les organes et le SNC. Le SNP réalise les commandes motrices de ce dernier (cf. Fig.8). Lors du développement du système nerveux, la neurogenèse précède la gliogenèse (Bayer and Altman, 1991). I.5.1 Mécanismes moléculaires de la neurogenèse primaire La neurogenèse primaire correspond à la formation des neurones primaires présents dans le développement précoce de l'embryon. Ces neurones disparaissent par la suite et laissent place à des neurones secondaires nouvellement formés qui constituent le système nerveux chez l'adulte. La différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones implique l'activation d'une cascade de facteurs de transcription, parmi lesquels les facteurs de transcription à domaine de liaison à l'ADN de type basique-hélice-boucle-hélice (bHLH) jouent un rôle essentiel (Kageyama and Nakanishi, 1997). Les facteurs bHLH se trouvant à l'origine de la différenciation neuronale sont appelés "gènes proneuraux" et initient la neurogenèse primaire qui a lieu, chez le xénope, au niveau de la plaque neurale. La position des domaines proneuraux est régulée par des molécules de signalisation sécrétées au niveau de la région médiane de la plaque neurale et dans la notochorde telles que sonic hedgehog (shh) et l'acide rétinoïque (AR). L'expression du gène shh dans la région médiane est elle-même régulée par le facteur nodal (Xnr). shh et AR contrôlent l'expression des gènes de la famille Gli/Zic (Gli1, Gli2, GLi3 et Zic2), dont l'activation et l'activité de répression aident à limiter l'expression des gènes proneuraux, gènes favorisant la différenciation neuronale, au niveau des trois bandes longitudinales correspondant aux domaines proneuraux (Franco et al., 1999). Egalement, la famille des gènes iroqois (iro), codant pour des protéines à 8 Introduction homéodomaine et évolutivement conservées, joue un rôle dans la neurogenèse (pour revue Avodeassi et al., 2001). Chez le xénope, cinq membres de la famille iro ont été identifiés (Xiro). Xiro1, Xiro2 et Xiro3 sont exprimés dans la plaque, au niveau des territoires chevauchant partiellement celui des gènes proneuraux. La surexpression des gènes Xiro active l'expression ectopique des gènes proneuraux (Bellefroid et al., 1998, Gomez-Skarmeta et al., 1998; Garriock et al., 2001). Aussi bien chez le xénope que chez les autres vertébrés, cette activation se fait de manière indirecte à savoir que Xiro1 réprime BMP4 (Gomez-Skarmeta et al., 2001) et que Ziro3, l'orthologue chez le poisson-zèbre de Xiro3, réprime également BMP4 (Kudoh and Dawid, 2001). Les gènes bHLH ont été identifiés pour la première fois chez la drosophile tels que achaete, scute, atonal et identifiés par la suite chez les vertébrés tels que neurogenin-1 et neurogenin-2. Chez le xénope, l'expression du gène orthologue à Neurogenin-2, Neurogenin related-1 (XNgnr1), commence au stade gastrula tardif (stade 10,5). Ils activent en aval d'autres facteurs bHLH tels que XAth3 s'exprimant à partir du stade neurula précoce (stade 12), XNeuroD s'exprimant au stade neurula moyen (stade 13,5), XAsh3 (Zimmerman et al., 1993; revue dans Bertrand et al., 2002) et des facteurs HLH tels que la famille B-cell factor/olfactory-1 (ebf/Olf1). Les orthologues chez le xénope sont Xebf2/XCoe2 et Xebf3 et ce dernier s'exprime au stade neurula tardif (stade 15,5; Dubois et al., 1998; Garcia-Dominguez et al., 2003). La surexpression des gènes proneuraux est suffisante pour induire la différenciation neuronale ectopique observée au stade neurula (Lee et al., 1995, Ma et al., 1996 ; Takebayashi et al., 1997; Perron et al., 1999 ; Pozzoli et al., 2001). Ces facteurs bHLH homodimérisent et hétérodimérisent (cf. Fig.9) entre eux. Ils se lient à l'ADN grâce au domaine basique positivement chargé qui reconnaît au niveau des séquences promotrices le consensus "CANNTG" appelé E-box (Gradwhol et al., 1996). Ces facteurs bHLH sont également responsables de l'inhibition de la gliogenèse. Chez la souris, des expériences de surexpression de Ngn1 montrent qu'il est capable à la fois d'induire l'expression du marqueur neuronal unique-beta-tubulin1 (TuJ1) et d'inhiber l'expression du marqueur glial Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP; Sun et al., 2001). Une expérience de surexpression de Wnt1 dans la lignée cellulaire issue de carcinome embryonnaire de souris (P19) montre d'une part 9 Introduction l'induction des marqueurs neuronaux Neurofilament (NF) et microtubule-associated protein-2 (MAP2) et d'autre part l'inhibition du marqueur glial GFAP. Cette expérience a également révélé, par une amplification RT-PCR, que Wnt1 active l'expression des gènes bHLH Ngn1 et mouse Achaete-scute homolog-1 (Mash1). Ces résultats suggèrent que Wnt1 induit la neurogenèse et bloque la gliogenèse et que les facteurs bHLH seraient impliqués dans ce processus (Tang et al., 2002). Les protéines bHLH jouent un rôle dans le positionnement spatio-temporel cellulaire et contribuent à l'identité de sous-types cellulaires neuronaux (Fode et al., 2000; Gowan et al., 2001). Les gènes proneuraux induisent aussi des facteurs non-bHLH (cf. Fig.10). D'une part, il y a des facteurs de transcription de la famille à doigts à zinc. Parmi cette famille, on retrouve les protéines de type Cys-Cys-His-His (C2H2) telles que Krüppel-Like (NKL) chez le xénope régulant positivement la neurogenèse (Lamar et al., 2001) et Sensless (SENS) chez la drosophile modulant l'activité des bHLH (Acar et al., 2006). En effet, la protéine SENS agit en synergie avec ces facteurs bHLH et régulent leur expression (Jafar-Nejad, 2003). On retrouve aussi des protéines de types Cys-Cys-His-Cys (C2HC) telles que Myelin Transcription factor-1 (XMyT1) chez le xénope. Ce dernier est également appelé Neural Zinc Finger (NZF) chez les mammifères. Enfin, on retrouve également la famille de d'oncoprotéines myeloid translocation gene (MTG/ETO) à motifs atypiques C2C2/C2HC. Le gène orthologue chez le xénope XETOR/XMTGR1 s'exprime au stade neurula précoce (stade 12,5). La surexpression de ce facteur diminue le nombre de neurones primaires et augmente le nombre de cellules neurales ce qui s'observe par une augmentation du nombre de cellules exprimant le marqueur neural XSox3 (Cao et al., 2002). Une autre étude réalisée chez le poulet montre qu'un dominant négatif de MTGR1 augmente le nombre de neurones primaires (Koyano-Kakagawa and Kintner, 2005). Les protéines MTG interagissent avec divers corépresseurs (Rossetti et al., 2004). D'autre part, il y a des facteurs à activité non transcriptionnelle. Parmi ceux-ci, nous trouvons la protéine p21-activated kinase (Xpak3) qui induit la sortie du cycle cellulaire durant la neurogenèse précoce (Souopgui et al., 2002), la protéine XSeb4R appartenant au groupe de protéines se liant à l'ARN qui induit chez le xénope à la fois la neurogenèse et la rétinogenèse (Boy et al., 2004), la protéine Cyclin-dependent kinase inhibitors (p27Xic1) qui induit la différenciation neuronale en stabilisant la 10 Introduction protéine proneurale Neurogenin (Vernon et al., 2003 ; Carruthers et al., 2003 ; Nguyen et al., 2006), la protéine growth-arrest-and-DNA-damage-induced gene gamma (XGadd45γ) qui réduit chez le xénope le nombre de cellules en prolifération, les sortant ainsi du cycle cellulaire afin d'induire la neurogenèse (de la Call-Mustienes et al., 2002). Ces facteurs jouent un rôle primordial dans la neurogenèse. En effet, l'arrêt du cycle cellulaire est nécessaire à l'initiation de la différenciation neuronale (Farah et al., 2000; Hollyday et al., 2001). Les facteurs bHLH coopèrent également avec des co-activateurs. Des expériences de gène rapporteur ont montré chez la souris que Ngn1 séquestre le complexe CBP/p300/Smad1 et le déplace du promoteur de GFAP ce qui induit la répression transcriptionnelle des gènes impliqués dans la différenciation gliale (Sun et al., 2001). Une expérience de gène rapporteur effectuée en cellules Hela utilisant la séquence promotrice (-209pb à +32pb) du gène secretin qui contient un motif E-Box, montre que NeuroD/BETA2 induit l'activation de la transcription et que celle-ci est cinq fois plus significative lorsque NeuroD/BETA2 est cotransfecté avec le coactivateur p300 (Mutoh et al., 1998). Cette stimulation transcriptionnelle se ferait grâce à une interaction directe entre NeuroD/BETA2 et p300 (Qiu et al., 1998). La voie de signalisation phosphatidylinositol 3-kinase/B kinase Protein (PI3K/Akt) régule l'activité des bHLH et coopère avec ces derniers. Nous avons décrit ci-dessus que Neurogenin active l'expression d'autres gènes proneuraux. Cette activation s'est vérifiée par des expériences de surexpression et de sous-expression de Akt et de Ngn3 effectuées sur cellules P19. En effet, il a été observé par RT-PCR que le nombre de copies d'ARNm codant pour NeuroD augmente lorsque Akt est cotransfecté avec Ngn3 par rapport à Ngn3 transfecté seul. De manière convergente, ce nombre de copies d'ARNm diminue lorsque l'expression endogène de Akt est inhibée. Finalement, une étude utilisant l'interférence à l'ARN (siRNA) dirigée contre les ARNm Akt1 et Akt2 a permis d'effectuer des expériences de perte de fonction réalisées sur cellules P19 dans lesquelles Ngn3 a été surexprimé. Cette étude montre d'une part une réduction du nombre de neurones formés et d'autre part une augmentation du nombre de cellules en apoptose. Une étude similaire utilisant un inhibiteur apoptotique a montré que le nombre de neurones formés restait réduit ce qui confirme qu'Akt n'est pas impliqué uniquement dans la survie cellulaire mais que 11 Introduction la voie de signalisation PI3K/Akt est aussi impliquée dans la neurogenèse (Vojtek et al., 2003). Par la suite, des expériences de gain et perte de fonction réalisées en embryons de xénope ont également montré que cette voie de signalisation est impliquée dans la neurogenèse et dans le développement des axes. Ces expériences ont montré que cette induction se fait par la régulation de la Glycogen synthase kinase-3β (GSK3β), un effecteur essentiel de la voie de signalisation Wnt qui réprime la neurogenèse en réprimant β-Catenin. La voie de signalisation PI3K/Akt induit donc la neurogenèse et la formation de doubles axes en passant par la voie de signalisation Wnt (Peng et al., 2004). Les gènes proneuraux sont également responsables de leur propre inhibition d'expression dans les cellules adjacentes. Ce phénomène est appelé "inhibition latérale" et consiste en l'activation de la voie de signalisation Delta/Notch par l'induction du ligand Delta (pour revue voir Kintner 2002). Ainsi, le nombre de neurones primaires formés est restreint. Ceux-ci se présentent sous forme de trois bandes longitudinales dans la plaque neurale: médiane, intermédiaire et latérale qui forment respectivement les neurones moteurs, les interneurones et les neurones sensoriels (cf. Fig.11). I.6 La voie de signalisation Notch La voie de signalisation Notch est capable de réguler les trois décisions qui affectent le destin d’une cellule : différenciation, prolifération et mort. Cette voie de signalisation permet la différenciation d’une cellule particulière à partir d’un groupe cellulaire et ce, soit par inhibition latérale, soit par induction. Le mécanisme de base de cette voie de signalisation montre une formidable conservation au cours de l'évolution. Elle intervient donc dans de très nombreux scénarios du développement et repose sur l’interaction du récepteur Notch avec des ligands dont la nature varie suivant les types cellulaires. Etant donné que la plupart des gènes de cette voie de signalisation induisent la neurogenèse lorsqu'ils sont mutés, ils sont appelés "gènes neurogéniques". 12 Introduction I.6.1 La voie de signalisation Notch intervient dans de nombreux mécanismes de développement En plus de la neurogenèse, la voie de signalisation Delta/Notch est impliquée dans différents mécanismes de développement et de tumorigenèse où elle intervient dans le processus de prolifération et de mort cellulaire (apoptose). L’implication de la voie Notch dans le cancer a pour la première fois été mise en évidence dans la leucémie des lymphocytes T chez l’homme, ce qui laissait penser qu’une signalisation Notch aberrante induisait la formation de tumeurs. Cette voie de signalisation joue également une rôle dans le développement des lymphocytes (Anderson et al., 2001). Cependant, d’autres données expérimentales ont montré que les médiateurs de la voie Notch pouvaient aussi agir comme suppresseurs de tumeur (Nicolas et al., 2003; Radtke and Raj, 2003). Des études indiquent que la voie de signalisation Notch est également impliquée dans le développement de la région médiane de la plaque neurale. En effet, des poissons-zèbres mutés pour le gène Delta montrent une réduction importante du nombre de cellules du plancher du tube neural alors que la notochorde acquiert un excès de cellules (Appel et al., 1999). Chez le xénope, des expériences de gain et de perte de fonction ont montré que Notch active l’expression de shh dans le plancher du tube neural, favorisant le développement de ce dernier au détriment de la notochorde (Lopez et al., 2003).On peut également citer le rôle de la voie de signalisation Notch dans la néphrogenèse où elle intervient dans la régionalisation du pronéphros en développement. Il a été montré que celle-ci intervient dans la sélection entre canal et tubule prospectif en inhibant la différenciation des cellules en canal dans la région dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros où les cellules sont normalement destinées à former les tubules (McLaughlin et al., 2000). La voie de signalisation Notch joue également un rôle dans la somitogenèse. Il a été montré chez les vertébrés que lors de la segmentation du mésoderme latérale le long de l'axe antéro-postérieur, les somites se divisent progressivement à partir du mésoderme présomitique suivant l'expression périodique de gènes qui sont sous le contrôle direct de la voie Notch (Conlon et al., 1995; Rida et al., 2004). Enfin, la voie de signalisation Notch joue un rôle dans la destinée 13 Introduction endothéliale (Shawber et al., 2003) et la spermatogenèse (Hayashi et al., 2001; Dirami et al., 2001; Mori et al., 2003). I.6.2 Mécanismes moléculaires de l'inhibition latérale dans le contrôle de la neurogenèse Le facteur bHLH Xenopus Neurogenin related-1 protein (XNgnr1) induit l'expression du gène neurogénique XDelta1 (Chitnis and Kintner 1996) codant pour un ligand transmembranaire qui se fixe sur les récepteurs XNotch1 des cellules voisines. Leur interaction entraîne le clivage du domaine intracellulaire de XNotch1 (Notch/ICD). Celui-ci migre dans le cytoplasme et transloque dans le noyau où il interagit avec le facteur Suppressor of Hairless, XSu(H), (Wettstein et al., 1997). Ce facteur appartient à la famille de répresseurs transcriptionnels CSL dont les orthologues sont C Promoter Binding Factor-1/Mouse Jkappa recombination signalbinding protein (CBF1/RBPjk) chez les mammifères, Su(H) chez la drosophile et LAG-1 chez le nématode. En absence d'activation de la voie, Su(H) forme un complexe transcriptionnel réprimant des cibles impliquées dans la neurogenèse. Cette répression fait intervenir diverses protéines telles que des protéines à activité déacétylase (HDAC1 et HDAC2) et de nombreux corépresseurs comme Silencing meditor of retinoid and thyroid (SMRT), nuclear hormone receptor corepressor (N-Cor), SMRT associated protein (SHARP), ski-interacting protein (SKIP), CBF1 interacting protein (CIR), C-terminal binding protein (CtBP), et la protéine Sin3α qui est un composant du complexe à activité histone déacétylase (Friedman et al., 1996; Kao et al., 1998; Zhou et al., 2000, Morel et al., 2001). Parmi les cibles activées par cette voie de signalisation se trouvent les gènes de la famille Enhancer of Split E(spl) chez la drosophile, Enhancer of Split-related chez le xénope et Hairy Enhancer of Split (HES/HER/Esr) chez les vertébrés. Chez ces derniers, l’activation de l'expression des gènes HES1, HES5, HES7, ESR1-4-5-6e-7 est sous la dépendance de la voie de signalisation Notch (Wettstein et al., 1997; de la Pompa et al., 1997; Jen et al., 1999; Deblandre et al., 14 Introduction 1999; Nakagawa et al., 2000; Iso et al., 2003). Par contre HES3, HES6 et ESR6 ne semblent pas être des effecteurs primaires de la voie Notch (Koyano-Nakagawa et al., 2000; Bae et al., 2000; Davis et Turner, 2001). Récemment, une autre voie de signalisation a été liée à la régulation de HES1 et HES5 : la voie des BMP/TGFβ (Takizawa et al., 2003; Blokzijl et al., 2003; De Jong et al., 2004a) ce qui signifie que l’expression des HES est contrôlée de manière plus complexe. Lorsque Notch/ICD interagit avec Su(H) via ses domaines ankyrin et RAM (Bailey et al., 1995), ce dernier active, comme décrit ci-dessus, les cibles E(spl) et Hairy ce qui bloque la neurogenèse. Ces protéines cibles sont des facteurs bHLH comportant dans leur partie C-terminale un motif WRPW recrutant le corépresseur groucho et son homologue chez le mammifère Transducin-like Enhancer of split (TLE; Grbavec and Stifani, 1996). Ce motif WRPW n'est pas toujours nécessaire pour la répression transcriptionnelle (Dawson et al., 1995). D'autres régions sont requises pour exercer la répression à savoir d'une part le domaine orange situé dans la partie C-terminale et qui a été conservé au cours de l'évolution et d'autre part la séquence peptidique située entre le domaine orange et le motif WRPW. En effet, chez la drosophile, des constructions codant pour des formes tronquées de protéines E(spl), dépourvues d'une de ces deux régions, ne sont plus capables de réprimer et se comportent comme dominant négatif (Giebel and Campos-Ortega, 1997). Cette famille de bHLH-WRPW empêche d'induire la différenciation neuronale en formant des hétérodimères inactifs avec les facteurs bHLH mais aussi en entrant en compétition avec les protéines bHLH pour se fixer sur les E-box au niveau des promoteurs cibles (cf. Fig.12). L'activation de la transcription des facteurs bHLHWRPW se fait par le recrutement d'un complexe co-activateur. Ce dernier comprend les protéines à activité histone acétylase (HAT) P300/CBP et P300/CBP associated factor (PCAF) qui sont recrutées par NotchICD. PCAF interagit directement avec les domaines ankyrin et TAD de NotchICD tandis que P300 semble fixer un motif de trois acides aminés dans une région appelée repression/activation (RE/AC), qui est critique pour l'activité transcriptionnelle de NotchICD (Ogryzko et al., 1996; Zhou et al., 2000; Wu et al., 2000; Petcherski et al., 2000a; Oswald et al., 2001). Le complexe co-activateur comprend également la protéine Mastermind-like 1, appelée mastermind chez la drosophile (MAML-1), qui se fixe aux domaines ankyrin de 15 Introduction NotchICD et qui stabilise le complexe NotchICD/Su(H). MAML-1 se fixe aussi sur le complexe P300/CBP (Petcherski et al., 2000b; Fryer et al., 2002). I.7 Les Facteurs de transcription à doigts à zinc Il existe différentes sortes de facteurs de transcription à doigts à zinc à savoir C2H2, C2HC, C2C2 (cf. Fig.9). Leur domaine à doigts à zinc permet notamment à la protéine de se lier à l'ADN. Ces facteurs sont impliqués dans de nombreux mécanismes de développement et peuvent se comporter comme activateur ou répresseur de la transcription. Nous développerons de manière approfondie le rôle et le mode de fonctionnement des familles de facteurs de transcription à doigts à zinc NZF/Myt et INSM1/IA1. I.7.1 Famille des gènes à doigts à zinc de type Neural Zinc Finger/Myelin Transcription Factor (NZF/Myt) Cette famille de gènes code pour des composants de la cascade de différenciation neuronale. Il s'agit de facteurs de transcription à doigts à zinc qui se lient à l'ADN dont le consensus identifié est "AAAGTTT". Les protéines de cette famille contiennent six motifs à doigts à zinc de type "C2HC" (Cys-X5-Cys-X12-HisX4-Cys ; cf. Fig.9) répartis en deux domaines. Le premier est localisé dans la partie N-terminale et le second dans la partie C-terminale (Jiang et al., 1996). Certaines protéines peuvent contenir un septième motif. Cette famille de gènes à doigts à zinc a été fortement conservée au cours de l'évolution (cf. Fig.13). A ce jour, un seul gène Myt1 a été décrit dans la littérature chez la drosophile, le nématode, l’amphibien et le poisson-zèbre. Trois gènes sont connus chez le poulet et les mammifères. Ces trois gènes sont Myt1-L, Myt1 et Myt3. Ils s’expriment dans divers types de cellules (neuronales, gliales et pancréatique). Certains ont été décrits 16 Introduction comme activateur de la transcription tandis que d'autres comme répresseur de la transcription. Concernant le gène Myt1-L, il a été montré chez la souris et l’humain qu'il s'exprime dans les neurones (Kim and Hudson, 1997). Celui-ci est également nommé postmitotic neural gene-1 (Png-1; Weiner et al., 1997). Chez le rat et la souris ce gène est également appelé dans la littérature NZF1. Concernant le gène Myt1, il est exprimé chez dans les cellules précurseurs des cellules gliales et les astrocytes (Armstrong et al., 1995; Armstrong et al., 1997). Ce facteur a pour cible, in vitro, le gène myelin Proteolipid protein (PLP). Celui-ci, impliqué dans la régulation de la myélinisation, joue un rôle dans la structure et le compactage de la gaine de myéline (Kim and Hudson, 1992). Le profil d’expression de l'orthologue de ce gène chez le xénope XMyT1, réalisé par hybridation in situ, montre qu’il est exprimé au niveau de la zone sub-ventriculaire du SNC (cf. Fig.14.). XMyT1 est exprimé à partir du stade gastrula tardif (stade 11,5) au niveau des trois bandes neuronales jusqu'au stade têtard au niveau du SNC antérieur et le long du tube neural. La surexpression de la protéine XMyT1 avec des facteurs bHLH tels que Neurogenin, XAsh3, XAth3 ou XAth5 stimule la différenciation neuronale de manière insensible à la voie de signalisation Delta-Notch. Cette insensibilisation est vérifiée lorsque l’on surexprime en embryons de xénope à la fois XMyT1, XAsh3 et un inhibiteur de la neurogenèse Notch-ICD (cf. Fig.15). La surexpression de formes mutées de XMyT1 à effet "dominants négatifs" bloque l'activité du facteur bHLH Neurogenin et inhibe la neurogenèse (Bellefroid et al., 1996). Un nouveau transcrit alternatif, appelé Myt1b qui est exprimé majoritairement par rapport à Myt1, a été identifié. Dans le système nerveux embryonnaire de souris, son expression commence au stade 9.5, au niveau des neurones nouvellement différenciés dans le système nerveux central et périphérique (Matsushita et al., 2002). Myt1b comporte un doigt à zinc supplémentaire dans la partie N-terminale. Chez le xénope, il a été montré dans une expérience de gène rapporteur que la région centrale de XMyT1 est la partie activatrice de la transcription et qu'un seul des deux domaines à doigts à zinc contenant la région centrale est suffisant pour se fixer au consensus AAAGTTT et activer la transcription (Bellefroid et al., 1996). Dans une culture cellulaire dérivée de cerveaux de rats nouveaux-nés, l'expression d'un mutant Myt1 ne contenant qu'un des 17 Introduction deux domaines à doigts à zinc inhibe la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices des oligodendrocytes (Nielsen et al., 2003). Récemment il a été montré que Myt1 est également exprimé au niveau du pancréas en développement. En effet, l'expression de Myt1 a été localisée dans les cellules impliquées dans le développement du système endocrine du pancréas, cellules qui joueront un rôle dans la régulation de l’homéostasie du glucose (Gu et al., 2003). Dernièrement, des souris invalidées pour le gène Myt1 ont été générées. Les souris présentant un génotype Myt1-/- meurent directement après la naissance et montrent une déficience dans l'expression de nombreux hormones produites par les îlots cellulaires endocrines ce qui suggère un rôle dans la différenciation endocrine au cours de l'embryogenèse. Afin d'étudier la fonction de Myt1 dans le pancréas chez des souris adultes, une invalidation conditionnelle a été générée. Il en résulte chez ces souris, l'apparition de diabète. Ainsi, il a été déterminé que Myt1 joue également un rôle dans le maintien des îlots cellulaires endocrines (Wang et al., in press). Récemment, il a été démontré chez le poulet que Myt1 est activé par Ngn3 dans les cellules endocrines en développement au niveau de l'endoderme. Ce résultat a été obtenu en bloquant la voie de signalisation Notch grâce à la surexpression de Fringe. En effet, Fringe est un médiateur de la voie Notch et bloque l'expression de Ngn3 (Xu et al., 2006). Chez le rat, dans une étude utilisant un gène rapporteur, il a été observé que les gènes Myt1-L et Myt1 se comportent comme des activateurs de la transcription. Récemment, il a été rapporté que les protéines Myt1-L et Myt1 interagissent avec le corépresseur SIN3β, une protéine régulant la répression transcriptionnelle en se liant aux histones déacétylase (HDAC1 et HDAC2; Romm et al., 2005). Concernant le gène Myt3, il est exprimé chez le rat exclusivement dans les neurones. Chez ce dernier modèle animal, Myt3 est également appelé dans la littérature NZF3. Par contre, chez l’homme et la souris, Myt3, est appelé suppression of tumorigenicity (St18). Dans une étude utilisant un gène rapporteur, la protéine Myt3 a été décrite comme répresseur de la transcription (Yee and Yu, 1998). Chez l'homme et la souris, il a été montré que Myt3 est exprimé dans les cellules épithéliales mammaires. Lorsque le facteur Myt3 est surexprimé en cellules cancéreuses de sein (MCF-7), il inhibe fortement la formation de colonies cellulaires 18 Introduction in vitro et la formation de tumeurs dans le modèle des xénogreffes de souris (Jandrig et al., 2004). 1.7.2 Famille des gènes à doigts à zinc de type Insulinoma Associated protein (INSM/IA) Le gène Insulinoma-Associated protein-1 (IA1) code pour un facteur de transcription à doigts à zinc isolé à l'origine chez l'humain et localisé sur le chromosome 20 (Goto et al., 1992). Chez la souris, le gène IA1 est également appelé dans la littérature INSM1. Son domaine de liaison à l'ADN contient cinq doigts à zinc de type Cys-Cys-His-His (C2H2) qui sont regroupés dans la partie C-terminale de la protéine. Sa structure protéique est similaire aux répresseurs de la super-famille Snail/Slug et Gfi1. Le gène IA1 est exprimé dans de nombreuses tumeurs neuronales et endocriniennes telles que insulinomes, rétinoblastomes, médulloblastomes (tumeurs cérébrales malignes de l'enfant), phéochromocytomes (tumeurs rares de la glande surrénale), adénomes de la glande pituitaire (tumeurs de l'hypophyse) et finalement dans les carcinomes thyroïdiens et les carcinomes pulmonaires (Lan et al., 1993). Il est également fortement exprimé chez l'embryon aux stades précoces du développement au niveau des cellules précurseurs du pancréas et du cerveau puis très faiblement exprimé aux stades tardifs du développement. Finalement, son expression est absente chez l'adulte. Ceci est confirmé chez la souris où IA1 s'exprime fortement chez l'embryon à partir du stade 10,5 puis commence à décroître à partir du stade 13,5 et enfin est faiblement détecté au stade 18,5 (Xie et al., 2002). La protéine IA1 est fortement conservée au cours de l'évolution et présente 83% de similitude avec la protéine IA1 humaine. IA1 comporte également des régions similaires au niveau des doigts à zinc avec les protéines Egg Laying defective-46 (EGL-46) chez le nématode (Wu et al., 2001) et Nervous Finger-1 (Nerfin1) chez la drosophile (Stivers et al., 2000). Le gène IA1 est exprimé exclusivement dans le noyau. La séquence génomique d'IA1 est dépourvue d'introns. 19 Introduction L'étude de la séquence promotrice d'IA1 (partie en amont du gène comprise entre -2097pb et +26) révèle la présence de trois motifs "E-box". Cette séquence a été utilisée pour une expérience de gène rapporteur effectuée d'une part dans une lignée cellulaire issue de glandes pituitaires (Aat-20) et d'autre part dans des cellules Hela. L'expression du gène rapporteur a été observée uniquement dans la lignée cellulaire Aat-20 démontrant ainsi une grande spécificité d'activité du promoteur d'IA1 au sein d'une population cellulaire neuroendocrinienne (Li et al., 1997). Dans une expérience de gène rapporteur utilisant une construction exprimant une protéine de fusion Gal4BDB/IA1, IA1 se comporte comme répresseur de la transcription (Breslin et al., 2002). Son domaine répresseur SNAIL/GFI (SNAG) est localisé dans la partie Nterminale de la protéine. Aussi, il a été montré que les doigts à zinc deux et trois sont suffisants pour son activité transcriptionnelle. Le consensus reconnu par IA1 est TG/TC/TC/TT/AGGGGG/TCG/A. D'autres expériences de gène rapporteur ont montré que le gène IA1 peut s'auto-réguler et également réguler le gène NeuroD/2β. La répression exercée par IA1 sur le promoteur de NeuroD/2β se fait plus efficacement par le recrutement de la protéine cylin D1, impliquée dans le cycle cellulaire, et des HDAC1 et HDAC3 (Liu et al., 2006). Grâce aux motifs E-Box présents dans son promoteur, IA1 serait une cible directe de facteurs bHLH tels que la protéine Ngn3 impliquée dans le développement des cellules endocrines pancréatiques, cellules responsables de l'homéostasie du glucose (Mellitzer et al., 2006) et NeuroD qui hétérodimérise avec le facteur HLH ubiquitaire E47 (Breslin et al., 2003). L'activité du promoteur d'IA1 a également été étudiée chez des souris transgéniques exprimant une construction de fusion contenant le gène β-galactosidase (LacZ). L'activité βgalactosidase a été observée dans le cerveau antérieur, moyen et postérieur, la moelle épinière, la rétine, le bulbe olfactif et le cervelet. Récemment, deux séquences orthologues de IA1 ont été identifiées chez le poisson-zèbre (insm1a-Like et insm1bLike) et présentent un profil d'expression chevauchant celui du marqueur proneural DeltaA et celui du marqueur neuronal elav13 (Lukowski et al., 2006). 20 Introduction I.8 Mécanismes de répression transcriptionnelle La machinerie basale n’est pas suffisante pour assurer un contrôle spatiotemporel sur l’expression des gènes. Ce sont les facteurs régulateurs de la transcription qui jouent ce rôle. Ils reconnaissent des séquences spécifiques (des consensus) dans les régions proximale et distale des promoteurs. La structure de ces protéines comporte au moins un domaine de liaison à l’ADN et un domaine de régulation de la transcription. Parfois un domaine de dimérisation est présent. A l’opposé des facteurs de transcription, certaines protéines contenant notamment des activités de modifications d’histones ne peuvent pas se lier à l’ADN. Elles sont appelées co-facteurs et sont réparties en deux classes : les co-activateurs et les corépresseurs. Nous développerons le rôle et le mode de fonctionnement du corépresseur CtBP. I.8.1 Le corépresseur CtBP La famille des protéines C-terminal Binding Protein (CtBP) a été identifiée pour la première fois chez l'humain (hCtBP1) en tant que protéine se liant à la partie C-terminale de l'oncoprotéine d'adénovirus E1a (Boyd et al., 1993, Schaeper et al. 1995). Il a été démontré que la mutation de cette partie C-terminale augmente de manière drastique l'activité tumorale de E1a suggérant ainsi que hCtPB1 régule in vivo l'activité transcriptionnelle de E1a. Par la suite, des expériences de gène rapporteur, utilisant des constructions exprimant des protéines de fusion Gal4 et E1a tronquée ne pouvant plus interagir avec CtBP, confirment la capacité de E1a tronquée à activer la transcription de manière beaucoup plus significative (Sollerbrant et al., 1996). Ces résultats suggèrent que hCtBP1 se comporte comme régulateur négatif de la transcription ce qui lui donne l'appellation de "corépresseur". Peu après, l'homologue de la protéine CtBP1 humaine a été identifiée chez la drosophile (dCtBP) en tant que partenaire protéique de nombreux répresseurs impliqués dans le développement tels que Hairy, Snail, Knirps, Krüppel et E(spl) (cf. Fig.16; Nibu et al., 21 Introduction 1998; Poortinga et al., 1998). Le recrutement du corépresseur CtBP se fait par le motif peptidique Pro-X-Asp-Leu-Ser (PXDLS). L'étude de la spécificité de ce motif à recruter CtBP a révélé que d'autres structures possèdent une forte affinité avec CtBP à savoir Pro-X-Asp/Asn-Leu-Ser/Thr (PXD/NLS/T; Molloy et al., 1998). De plus, une série de motifs dit dégénérés recrutant CtBP a été mise à jour tels que VLDLS présent dans la protéine Giant chez la drosophile (Nibu et al., 2001), ALDLS présent dans l'oncoprotéine virale EBNA3A (Hickabottom et al., 2000) et GLDLS présent dans la protéine hypermethylated in cancer (HIC1) chez la souris (Deltour et al., 2002). A ce jour un gène est connu chez la drosophile, le nématode. Deux gènes sont répertoriés chez le xénope (Brannon et al., 1999; Sewalt et al., 1999), chez le poulet (van Hateren et al., 2006) et chez les mammifères (Turner and Crossley 1998; Furusawa et al., 1999). Dans le cas du poulet, le profil d'expression des gènes Ctpp1 et Ctpb2 a été observé par hybridation in situ. Ces deux gènes s'expriment aux stades Hamburger and Hamilton (HH; Hamburger and Hamilton, 1951) compris entre 3 et 24 au niveau du SNC. Ils sont fortement exprimés dans la zone subventriculaire du tube neural. Leur profil d'expression se chevauche considérablement. Le mécanisme de répression de CtBP se fait notamment par le recrutement des enzymes histone déacétylase (HDAC). Ces dernières retirent les groupes acétyles au niveau des histones et lysines ce qui augmente la charge positive et donc leur affinité pour l'ADN permettant ainsi un effet de compactage de la chromatine. De plus, on retrouve le motif PXDLS chez HDAC4 et HDAC7 (Zhang et al., 2000). Malgré l'absence de ce motif chez les autres HDAC, CtBP interagit tout de même avec HDAC1, HDAC2 et HDAC5 (Sundqvist et al., 1998; Sundqvist et al., 2001; Zhang et al., 2001). L'activité de corépression exercée par CtBP ne nécessite pas toujours le recrutement des HDAC d'après les observations faites sur l'interaction entre CtBP et la protéine à doigts à zinc ikaros (Koipally et al., 2000). La protéine CtBP comporte de nombreuses similitudes avec l'enzyme déshydrogénase (NADH). Cette dernière comporte un site actif catalytique constitué de 15 acides aminés présent également à la fois dans CtBP1 et CtBP2. De plus, la déshydrogénase utilise le NAD+ en tant que cofacteur grâce à son site de liaison GXGGXXG que l'on retrouve aussi dans CtBP1 et CtBP2 (revue dans Turner and Crossley, 2001). 22 Introduction La protéine CtBP est présente essentiellement dans le noyau, partiellement dans le cytoplasme et dans l'appareil de Golgi (Weigert et al., 1999). L'étude du rôle de XCtBP au cours du développement embryonnaire du xénope, s'est réalisée par micro-injection au stade quatre cellules de l'ARNm codant pour la protéine XCtBP sauvage et n'a montré aucun effet. Par contre, la micro-injection d'une construction codant pour une protéine chimérique Gal4TA et XCtBP bloque le développement de la tête et des yeux, induit la formation d'un axe antéropostérieur plus court et provoque une déficience du développement neural (Brannon et al., 1999). L'invalidation du gène mCtBP1 donne des souris viables et fertiles mais de petite taille et mourant précocement. Par contre, l'invalidation du gène mCtBP2 est létale au stade E10,5. mCtBP2-/- engendre un phénotype présentant des déficiences lors de la formation des axes, dans le développement du cœur et du SNC. (Hildebrand and Soriano, 2002; Chinnadurai 2003). mCtBP1 et mCtBP2 possèdent à la fois une fonction unique et redondante. De nombreuses fonctions de CtBP ont été identifiées. Il est impliqué dans les voies de signalisation Wnt, Notch et BMP/TGFβ (Izutsu et al., 2001; Melhuish et al., 2000), dans l'adhésion cellulaire et l'apoptose (Grooteclaes et al., 2000), dans la myogenèse et la vascularisation (Lin et al., 1998, Lu et al., 2000; Dressel et al., 2001) et enfin dans la segmentation chez la drosophile (Poortiga et al., 1998; Nibu et al., 1998; Nibu et al., 2001). Chez le xénope, deux gènes CtBP ont été identifiés. Ils ont été nommés XCtBP (Brannon et al., 1999) et XCtBP1 (Sewalt et al., 1999). Récemment, leur profil d'expression a été réalisé en utilisant les techniques d'hybridation in situ et de RT-PCR (en soumission, van Grunsven et al., 2006). Il a été observé que les transcrits XCtBP et XCtBP1 sont détectés au stade maternel et après l'initiation de la transcription zygotique. La comparaison du niveau d'expression, à tous les stades, révèle que XCtBP est plus exprimé que XCtBP1. Le gène XCtBP est exprimé dans tout l'ectoderme et au stade bourgeon caudal au niveau du mésoderme. Son expression est plus forte dans la partie antérieure de la plaque neurale. L'expression de XCtBP1 n'est pas détectable par hybridation in situ durant la gastrulation. Par contre, il est faiblement exprimé dans la partie antérieure de la plaque neurale. Au stade bourgeon caudale (stade 25), les gènes XCtBP et XCtBP1 sont à la fois exprimés dans le tube neural, les yeux et les crêtes neurales. Au stade têtard (stade 23 Introduction 31), XCtBP est exprimé dans les cellules de la zone ventriculaire du tube neural tandis que XCtBP1 est exprimé dans la partie latérale du tube neural. Ainsi, il a été montré que XCtBP et XCtBP1 ont un profil d'expression similaire durant le développement précoce embryonnaire ce qui suggère q'ils exercent un rôle redondant. Par ailleurs, leur profil d'expression diffère aux stades de développement plus tardif ce qui suggère qu'ils jouent également un rôle unique durant l'embryogenèse. I.8.2 Les facteurs de transcription à activités antagonistes De nombreux facteurs ont été décrits à la fois comme répresseurs et activateurs de la transcription. Cette double activité antagoniste peut se réaliser soit par le recrutement de cofacteurs de types co-activateurs ou corépresseurs soit par un effet de dose du facteur de transcription lui-même. Parmi les exemples trouvés en littérature, le facteur à doigts à zinc SIP1 impliqué dans l'induction neurale joue un rôle essentielle dans la spécification du neurectoderme, la délimitation de la plaque neurale et la migration des cellules des crêtes neurales (Van de Putte et al., 2003). Cette protéine a été à l'origine décrite comme répresseur (Verschueren et al., 1999; Comijn et al., 2001; van Grunsven et al., 2003; Vandewalle et al., 2005). Il a été montré in vitro que la protéine Sip1 interagit avec le corépresseur CtBP ce qui augmente son activité répressive (Chinnadurai et al., 2003). Par la suite, cette protéine a été décrite également comme activateur de la transcription (Long et al., 2005; Yoshimoto et al., 2005). Récemment, il a été observé que l'orthologue de la protéine SIP1 chez le xénope (XSIP1) peut interagir, en plus de CtBP1, avec les co-activateurs p300/CBP et PCAF (van Grunsven et al., 2006). Le facteur de transcription à doigts à zinc Ecotropic viral integration site-1 (Evi1) est impliqué dans la néphrogenèse (Van Campenhout et al., 2006). Evi1 est une oncoprotéine qui peut in vitro activer ou réprimer l'expression des gènes cibles (Nucifora et al., 2006). La région centrale située entre ses deux domaines à doigts à zinc contient deux motifs de recrutement du corépresseur CtBP à savoir "PLDLS" et "PFDLT". Cette interaction avec CtBP permet à Evi1 de renforcer son activité répressive et est indispensable à ses propriétés 24 Introduction oncogéniques. En effet, le surexpression de Evi1 peut induire la transformation de fibroblastes de rats alors qu'une forme mutée, ne pouvant plus interagir avec CtBP, en est incapable (Bartholomew et al., 1997; Palmer et al., 2001; Izutsu et al., 2001). De plus, Evi1 réprime la transcription de TGF-β en se fixant au niveau de son promoteur et en recrutant à la fois CtBP et Smad3, un effecteur de la voie de signalisation TGFβ (Alliston et al., 2005). Il a également été montré que la protéine Evi1 exerce une activation transcriptionnelle in vivo. Ceci s'observe lorsqu'elle est exprimée en présence des co-activateurs CREB Binding Protein (p300/CBP) et p300/CBP Associated Factor (PCAF) qui interagissent avec différentes régions de Evi1 et modifient son acétylation (Chakraborty et al., 2001). Citons également le facteur de transcription à doigts à zinc SENS impliqué dans le développement des organes sensoriels chez la drosophile. SENS interagit avec des facteurs bHLH à savoir Achaete et Daughterless. Il agit en synergie avec eux afin d'activer ou de réprimer, in vivo et in vitro, des gènes cibles bHLH. Le facteur SENS se comporte à faible dose comme répresseur de la transcription et à forte dose comme activateur de la transcription (Jafar-Nejad et al., 2003). Dans ce dernier cas, les activités de transcription antagonistes ne sont pas dues au recrutement de corépresseurs ou de coactivateurs mais bien dues à des effets de dose-dépendance. Par la suite, il a été montré qu'à faible dose SENS se fixe préférentiellement au motif nucléotidique "SBinding" et se comporte comme répresseur de la transcription en recrutant le facteur E(spl). A forte dose, SENS interagit en plus du motif S-binding, avec les facteurs bHLH Ac/sc et Da formant ainsi un complexe qui active la transcription de gènes cibles. Dans ce dernier cas, SENS se comporte comme un co-activateur (Acar et al., 2006). 25
