Dépôt Institutionnel de l`Université libre de Bruxelles

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles /
Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis
Citation APA:
Tencer, R. (1961). Etude cytochimique du métabolisme des acides nucléiques au cours des premiers stades du développement de l'embryon de
batracien (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/215571/3/f0fa6a4a-f89a-4c22-b67d-b7cd49a8b61a.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à
prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit
identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre
accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits
voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins
d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou
reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
- Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
- L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
- Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit
toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou
de l’ayant droit.
------------------------------------------------------ English Version ------------------------------------------------------------------This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is
invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the
native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access
as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes,
to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other
works, available in DI-fusion, provided:
- The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
- The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
- The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must
always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
ETUDE CYTOCHIMIQÜE DU METABOLISME
DES ACIDES NUCLEIQUES AU COURS DES PREMIERS STADES
DU DEVELOPPEMENT DE L'EMBRYON DE BATRACIEN
Mémoire présenté pour l'obtention du
grade de Docteur en Sciences Zoologiques
Université libre de Bruxelles
Laboratoire de Morphologie animale
R. TENCER
1961
Nous aimerions témoigner notre profonde gratitude et notre
respectueuse admiration à Monsieur le Professeur Brachet en
reconnaissance de l'enseignement que nous lui devons.
Nous adressons nos remerciements à Madame Picq qui nous a
enseigné l'autoradiographie et nous a fait profiter de son
expérience tout au long de ce travail.
Nous tenons, tout particulièrement, à remercier Madame et
Monsieur De Saedeleer qui nous ont si gentiment aidée dans la
préparation des photographies.
Enfin, nous remercions vivement l'Institut Interuniversi­
taire des Sciences Nucléaires pour l'aide financière qu'il nous
a accordée.
R. TENCER
ETUDE CYTOCHIMIQUE DU METABOLISME
DES ACIDES
NUCLEIQUES AU
PREMIERS STADES
DU
COURS
DEVELOPPEMENT
L’EMBRYON DE BATRACIEN
MÉMOIRE PRÉSE'NTÉ POUR
L'OBTENTION DU GR7\DE DE DOCTEUR EN
SCIENCES ZOOLOGIQUES
LABORATOIRE DE MORPHOLOGIE ANIMALE
UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES
1961
DES
DE
TABLE
DES
MATIERES
Pages
INTRODUCTION
1
lere PARTIE : Etude autoradiographique de l'incorporation de
précurseurs radioactifs dans les embryons de Batraciens
11
Introduction
11
Partie expérimentale
14
A. Incorporation de
d'urodèles
14
CO^ dans des gastrulas
14
1. Incorporation de ^^C02 dans des gastrulas
d'Axolotl (Siredon mexicanum)
14
2. Incorporation de ^^C02 dans des embryons de
Pleurodeles V/altii après centrifugation de
la gastrula
18
B. Incorporation de précurseurs d'acides nucléiques
dans des embryons après désintégration du "coat"
21
1. Incorporation de thymidine-H3
1) dans des embryons normaux
2) dans des hybrides létaux
22
22
24
2„ Incorporation d'uridine-H5
Effet de la: fluorodésoxyuridine
Effet de la thymidine, de la d^xycytidine
et de la désoxyadénosine
28'
35
36
3» Incorporation d'adénosine-H3, d'adénine-C14,
d'acide orotique-C14
37
Discussion
2ème PARTIE : Les effets des fluoropyrimidines sur le déve­
loppement embryonnaire
Introduction
41
45
45
II
Partie
expérimentale
47
A. Les effets des fluoropyrimidines sur la
segmentation
47
1. La fluorodésoxyuridine (FUDR)
a) les effets de la PdDR
b) expériences de réversibilité
c) expériences de protection
47
47
50
53
2. Le fluorouracile
(Fü)
54
3* La fluorouridine
(PUR)
55
B. Les effets des fluoropyrimidines sur la blastula
et la gastrula de Pleurodèles
55
1. La fluorodésoxyuridine
2. Le fluorouracile
3* La fluorouridine
c. Incorporation de précurseurs marqués dans des
embryons traités à la FUPR
Discussion
55
'
58
61
61
62
DISCUSSION GENERALE
6?
BIBLIOGRAPHIE
70
INTRODUCTION
A partir d'une cellule oeuf s'édifie un organisme complexe ;
à partir d'une cellule, chargée de réserves, où aucune spécialisation,
aucune structure particulière
n'est reconnaissable, se développent
des cellules, des tissus, des organes hautement spécialisés.
Très précocement, d'ailleurs, les différentes régions de l'embryon
ont un comportement différent et produisent des organes divers dont
l'ensemble harmonieux constitue l'organisme adulte.
Ainsi, tout en se divisant, le zygote donne naissance à des
cellules, à des territoires qui, au cours du développement, vont se
diversifier et se différencier de plus en plus 5 au cours du temps,
ces cellules vont acquérir et manifester des complexes de structures,
des fonctions de plus en plus spécialisées.
L'embryon évolue sans cesse et à tout moment, on se trouve en
présence d'un enchevêtrement de phénomènes, de réactions et
d'interactions multiples.
Et, qu'il s'agisse de la transformation de l'ectoblaste en
neuroblaste, de la cinématique des cellules pendant la gastrulation
ou, plus tard, d'une différenciation histologique, on ne connaît que
certaines caractéristiques de la modification et on ignore les
mécanismes qui commandent ces changements.
Toutefois, on considère généralement que la différenciation
s'accompagne de la formation de protéines spécifiques.
L'utilisation de méthodes immunologiques a montré que de nouveaux
antigènes apparaissaient dès le stade gaetrula (Perlmann et
Gustafson (I948), Perlmann (1953)» Harding et col.
(1954) chez
l'oursin, Cooper (1948), Clayton (1953) chez les Amphibiens).
2
D'ailleurs, d'une façon générale, des synthèses protéiques ne
peuvent être détectées pendant la segmentation, elles ne débuteraient
qu'à la gastrula et deviendraient de plus en plus importantes au
cours du temps.
Spiegel (i960) a étudié, au cours du développement, les protéines
solubles en les caractérisant par leur mobilité électrophorétique.
Dans cette étude, il apparaît que certaines protéines disparaissent
au cours du développement.
Il pourrait s'agir d'une restriction des
capacités de synthèse des cellules différenciées ou d'une modification
des propriétés de solubilité des protéines.
Rappelons, d'autre part, les résultats d'Ebert (1955) sur le
comportement de la myosine.
Dans le jeune embryon de poulet, la
myosine cardiaque se synthétise déjà ; au stade de la ligne primitive,
les groupements antigéniques de cette myosine sont répartis uniformé­
ment dans tout l'embryon.
Mais, quelques heures plus tard, la
distribution de la myosine se confine au territoire qui donnera p1v>-.
tard naissance au coeur.
Ainsi, l'édification de l'ébauche cardiaque
entraîne la disparition, dans une grande partie de l'embryon, de la
capacité préexistante de synthétiser la myosine cardiaque.
Au cours du développement, on observe donc l'apparition de
protéines nouvelles.
A la fois, on peut montrer qu'au cours du temps
des cellules embryonnaires perdent la capacité de synthétiser une
protéine.
Enfin, certaines protéines disparaissent, d'autres subis­
sent peut-être des modifications.
On peut considérer qu'au cours du développement s'établissent
des séquences, des arrangements particuliers responsables de la
synthèse des protéines nouvelles.
L'établissement de ces séquences
est évidemment sous le contrôle du nouveau génôme établi dans l'oeuf
au moment de la fécondation.
Progressivement et par des mécanismes
qu'il faudra préciser, celui-ci contrôlera l'agencement des cellules.
Signalons à ce propos que Keck (i960) a montré, par des greffes
noyau-cytoplasme entre les algues Acetabularia mediterranea et
Acicularia Schenckii que la phosphatase acide de l'algue Açicularia
est modifiée ou remplacée par la phosphatase acide du type
5
mediterranea en présence du noyau mediterranea.
Cependant, quand le
‘
rhizoïde Acicularia se trouve en présence du cytoplasme mediterranea,
on ne décèle que l'enzyme du type mediterranea»
Enfin, un autre point concerne la manifestation de ce génome
dans un cytoplasme hétérogène»
Si on admet que ce dernier peut
influencer son expression, on peut, dans une certaine mesure,
comprendre la diversification embryonnaire»
En effet, l'oeuf présente une très grande hétérogénéité qui joue
sans doute un rôle important dans le développement ultérieur et qui a
donné naissance au concept de gradient.
Chez les Amphibiens, en particulier, l'oocyte mûr possède une polarité
suivant un axe vertical, animal-végétatif, qui se manifeste nettement
dans la distribution du vitellus : en effet, chez les Batraciens,
le vitellus se présente sous la forme de plaquettes de toutes dimen­
sions et, quoique distribué dans tout le cytoplasme de l'oeuf, le
vitellus est plus abondant au pôle végétatif où les plaquettes sont
aussi plus grandes»
Une seconde polarité, dorso-ventrale, se superpose à la première.
Si celle-ci est peut-être déjà esquissée dans l'oeuf vierge, elle se
stabilise à la fécondation lors de l'apparition du "croissant gris".
Il est important de signaler que ces 2 gradients se retrouvent,
inversés, dans différentes activités biochimiques»
Enfin, une autre particularité de l'oeuf réside dans la nature de
son cortex qui joue un rôle important dans certains mouvements morpho­
génétiques (Holtfreter, 1945 ; Curtis, I960).
Dans une cellule adulte ou dans une bactérie, la séquence qui
mène du gène à la protéine commence à être quelque peu connue, ou,
du moins, on en connaît certains points»
Si le rôle génétique est dévolu à l'acide désoxyribonucléique
(ADN), on ne possède cependant aucune évidence de son intervention
directe dans la synthèse des protéines» De nombreuses données portent
à croire que, dans la transmission de l'information, les acides ribonucléiques jouent un rôle très important»
4
L'hypothèse d'une relation entre l'acide ribonucléique (ARN) et
la synthèse des protéines avait été formulée par Brachet, dès 1941»
à la suite d'études cytochimiques.
Simultanément, Caspersson ('194'! )>
au moyen d'une autre méthode, était arrivé à la même conclusion.
Depuis, cette hypothèse a suscité de nombreux travaux qui ont permis
de préciser quelque peu cette relation.
Une première étape de la synthèse des protéines concerne l'acti­
vation des acides aminés et leur transport par un polynucléotide
soluble de faible spécificité.
Cet ARN soluble ou "de transfert"
transporte les acides aminés activés aux ribosomes qui sont des centre"
de synthèses protéiques.
La spécificité relèverait du ribosome sur
lequel, par sa configuration, viendraient s'attacher dans un certain
ordre les différents ARN transporteurs.
Plus récemment, des auteurs ont attiré l'attention sur une
fraction particulière d'ARN : l'ARN messager.
Volkin et Astrachan
(■1956), Astrachan et Volkin (1958) ont montré qu'après infection par
un phage, il est possible d'isoler un ARN très instable dont la
composition en bases est voisine de celle de l'ADN infectant.
Plus
récemment. Hall et Spiegelman (196I) ont montré qu'il y a moyen
d'isoler cet ARN et qu'il peut former une hélice mixte avec de l'ADN
complémentaire.
Enfin, des expériences de Brenner et coll. (I96I)
soulignent aussi l'importance d'un ARN très instable qui apparaît,
notamment, après une infection.
D'après ces auteurs, la spécificité
serait liée à cet ARN qui viendrait se fixer sur des ribosomes qui,
par eux-mêmes, ne seraient pas porteurs de message.
Si ce système existe dans les cellules bactériennes, il n'a pas
encore été mis en évidence dans une cellule embryonnaire ou adulte et
ce sera l'une des tâches du proche avenir de démontrer sa généralité.
Dans diverses cellules, on a montré que la synthèse d'ARN
nucléaire est importante et rapide, tant dans les nucléoles que dans
les régions hétérochromatiques.
Toutefois, il est malaisé de mettre
clairement en évidence des passages d'ARN du noyau au cytoplasme.
5
Brachet (1944> 52, 57, 60) a fréquemment souligné le rôle impor­
tant joué par l'AM dans la morphogénèse.
Il a montré que l'ARN est
distribué suivant un gradient décroissant du pôle animal au pôle
végétatif dans l'oocyte mûr, l'oeuf fécondé et l'oeuf en segmentation.
A la gastrula, un second gradient d'ARN dorso-ventral se superpose au
premier.
Ces gradients d'ARN se superposent aux gradients morphogénétiques
de l'embryologie expérimentale.
Par ailleurs, toute action ayant un
effet sur la synthèse de l'ARN provoque des retards ou des anomalies
dans le développement.
Inversément, quand le développement est altéré
expérimentalement, par centrifugation ou retournement, les gradients
ribonucléiques sont profondément modifiés.
Cependant, jusqu'à la
gastrula, des synthèses d'ARN ne sont guère décelables.'
La teneur en
ARN augmente pendant la gastrulation, mais surtout pendant la
neurulation.
La synthèse d'ARN est surtout appréciable dans les
régions dorsales de l'embryon en différenciation.
On sait que de nombreux phénomènes importants prennent place à
la gastrulation : jusqu'à ce stade, l'embryon présente vine certaine
plasticité.
On sait que, dans une jeune gastrula, de nombreuses
transformations sont possibles ; l'ectoblaste peut donner du neuroblaste, du mésoblaste et même de l'entoblaste | le mésoblaste ventra]
peut donner de la chorde, etc...
Quand on avance dans le temps, ces
transformations ne sont plus possibles.
qui
Des modifications ont eu lieu
excluent la possibilité de telles transformations et qui condui­
sent à la perte de la "compétence".
C'est à ce même moment que s'arrête le développement dans les
oeufs fécondés par des spermatozoïdes intoxiqués par un gaz moutarde
et de nombreux hybrides létaux.
En effet, on sait que, après une fécondation entre espèces ou
genres différents, l'embryon se segmente normalement ; dans tous les
cas étudiés, qu'il s'agisse d'embryons haploïdes ou diploïdes, le stade
le plus précoce du blocage est la blastula avancée ou la jeune gas­
trula.
produit.
On ignore encore les raisons pour lesquelles ce blocage se
6
Brachet (1954) a décrit l'aspect particulier que présentent
certains noyaux dans ces hybrides
charge anormale en ARN.
î
ceux-ci se caractérisent par une
Tout se passe comme si les noyaux de la
gastrula bloquée synthétisaient l'ARI'f a une vitesse trop grande et
comme si cet excès d'ARN (qui pourrait être de composition anormale)
ne pouvait plus être utilisé par le cytoplasme (Brachet 1954)*
Zeller (1956) a publié des résultats en accord avec ceux de
Brachet, à la suite d'études sur des hybrides létaux d'Urodèles.
En ce qui concerne la synthèse d'ADN, divers travaux indiquent qu'elZo
a lieu normalement dans les hybrides létaux.
Toutefois, la question des modalités de la synthèse d'ADN au
cours des premiers stades du développement embryonnaire a suscité de
très nombreux travaux et est encore quelque peu controversée.
En effet, le dosage de l'ADN dans l'embryon se heurte à de sérieu­
ses difficultés techniques ; la quantité d'ADN présente dans la
pronucleus femelle, qu'à priori on suppose relativement petite, est
perdue dans d'abondantes réserves de substances diverses pouvant
interférer dans les dosages et sensiblement modifier les résultats.
Une technique microbiologique, qui semblait très spécifique et
très sensible, a été utilisée par des auteurs danois (Hoff-Jj(^rgensen
et Zeuthen, 1952 ; Hoff-Jj((rgensen 1954)»
Be principe de cette méthode
est le suivant s on utilise une souche bactérienne exigeant comme
facteur essentiel de croissance un désoxyribonucléoside ; en mesurant
la croissance des bactéries en présence d'un extrait de matériel à
doser, on peut, à condition de dégrader l'ADN, mesurer quantitativemcn''
la teneur en ADN.
Les dosages sont effectués sur une poudre acétoniqi:;:
soumise à l'action de la désoxyribonucléase (DNase).
D'après Hoff-J^rgensen (1954)> la synthèse de l'ADN ne débuterait
qu'au stade 16 blastomères chez l'Oursin, à la fin de la segmentation
chez la Grenouille et à partir du 5ème jour seulement dans l'embryon
de poulet.
Gregg et L/^vtrup (1955)» L/vtrup (1959) ont confirmé ces résultats
chez les Amphibiens.
7
En effet, Hoff-j/rgensen et Zeuthen (1952) ont trouvé des quan­
tités d'ADN beaucoup trop grandes comparées à la quantité n du sper­
matozoïde ou 2n des noyaux de foie de la même espèce.
Ce résultat - la teneur élevée en ADN - au chiffre près concorde avec
les cçnclusions de travaux plus anciens, où les auteurs (Bràchet 1954,
Sze 1955) avaient utilisé des techniques différentes.
Néanmoins,
ces auteurs ont mis en évidence une synthèse au cours des premiers
stades du développement.
En résumé, quelle que soit la technique utilisée, les auteurs
sont unanimes à trouver des quantités trop grandes d'ADN dans l'oeuf
au début du développement et sont amenés à penser que l'oeuf vierge
doit contenir une réserve d'ADN dans son cytoplasme.
A l'opposé des résultats biochimiques, la mise en évidence de
l'ADN dans le noyau des oocytes par la technique de Feulgen n'est
guère aisée.
Tantôt la réaction Feulgen est négative, tantôt elle
est très faible.
Marshak et Marshak (1955) ont soutenu que le noyau de l'oeuf mûr
d'Oursin ne contient pas de matériel Feulgen positif décelable.
D'après ces auteurs, la dispersion de l'ADN dans la vésicule germina­
tive ne peut expliquer le manque de colorabilité.
Par contre, Burgos (1955*) a décelé du matériel Feulgen positif
dans le pronucleus femelle de l'oeuf mûr d'AxbacAprès traitement
des coupes à la DNase, la réaction Feulgen ..‘-t de-'enue négative.
Du matériel Feulgen positif a également été mis en évidence dans
l'oeuf d'Oursin par Brachet et Ficq (1956).
Immers (1957), par contre, a confirmé les résultats de Marshak
et affirmé que l'ADN, du moins sous sa forme habituelle, est absent
du pronucleus et aussi durant iine certaine période dans le eyncaryon.
Marshak a appuyé ses résultats cytochimiques par des dosages
biochimiques.
Mais à l'inverse d'autres auteurs, il ne trouve pas
d'ADN dans le cytoplasme de l'oocyte.
8
Marshak et Marshak (1953) ont utilisé une technique très spéci­
fique et très sensible : le dosage de l'ADN par dilution isotopique
de la thymine.
Sans suivre Marshak dans ses conclusions, nous
retiendrons cependant 2 points importants de ses critiques :
- le danger de contamination de l'ADN oocytaire par les noyaux des
cellules folliculeuses, déjà signalé par Brachet dès 1936 ;
- la présence de thymine libre dans l'oocyte (Marshak et Marshak
1954).
En ce qui concerne les Batraciens, dès 1952 , Hoff-J/(rgensen et
Zeuthen avaient montré qu'une partie importante de l'ADN qu'ils
dosaient se trouve dar.'? le cytoplasme de l'oocyte.
Ce dernier con­
tiendrait 5*000 fois plus d'ADN que la vésicule germinative.
Quelle est la constitution de cet ADN
et quel est son rôle ou
sa participation dans les premiers stades du développement embryon­
naire ?
Grant (1958a), modifiant légèrement la technique des auteurs
danois, a fractionné son matériel en acido-soluble et acido-insoluble.
Ses résultats montrent que l'oocyte contient une quantité importante
de composés désoxyribosidiques solubles à côté d'un ADN insoluble qui
augmenterait au cours du développement.
Les valeurs qu'il trouve
pour cet ADN sont plus faibles que celles des auteurs danois.
Des résultats assez semblables ont été obtenus par Kuriki et
Okazaki (1959)
: ces auteurs confirment la présence dans les embryons
de composés désoxyribosidiques acido-solubles constitués principale­
ment par des désoxynucléotides di- et triphosphates ; enfin, tout en
trouvant un excès d'ADN dans l'oeuf (par rapport à la valeur diploïde),
ils observent cependant une augmentation de la teneur en ADN dès la
segmentation.
On peut se demander quelle est la quantité d'ADN présente dans le
noyau de 1'oeuf ?
England et Mayer (1957) ont isolé des vésicules germinatives et
y ont trouvé les mêmes quantités d'ADN que dans les noyaux des cellules
somatiques.
9
Mais ces résultats sont en contradiction avec ceux de Finamore
et coll.
(1960) qui ont également isolé des vésicules germinatives
et dosé l'ADN par un dosage du P désoxyribonucléique.
Ils concluent
de leurs expériences que l'hypothèse de la constance de l'ADN par
noyau n'est pas valable dans le cas du noyau de l'oocyte.
Cependant Bieber et col.
(1959) en combinant des méthodes dif­
férentes - dosages de P, analyse colorimétrique du désoxyribose,
détermination microbiologique, dosage de l'ADN isolé - sont arrivés
aux conclusions suivantes : la quantité de composés désoxyribosidiques
est plusieurs milliers de fois supérieure à celle trouvée dans le
sperme.
Ces composés comprennent de l'ADN, des dérivés acido-solubles■
une fraction qui est extraite par du NaCl, mais n'est pas précipitable
par l'alcool - cette fraction représente 85 i° de l'ADN - et enfin, un
composé riche en P et en désoxyribose, mais qui n'absorbe pas ou très
peu dans l'U.V. - il s'agirait d'un polymère pentose-phosphate.
Enfin, 9/I 0 environ de ces composés se trouvent dans le cytoplasme.
Bien que la situation soit encore confuse et les données fragmen­
taires, la question semble cependant se préciser.
En ce qui concerne
la réserve cytoplasmique, il semble qu'elle existe principalement
sous forme soluble ou sous une forme polymérisée qui ne présente pas
les propriétés de l'ADN.
Signalons, à ce propos, les travaux de
Durand (196O), qui a étudié cette question dans les oeufs d'insectes.
Il a pu montrer, entre autres, l'existence dans le cytoplasme de
1'oocyte,d'un ADN sensible à la DNase, mais dont la composition en
bases est anormale.
Cependant, on ne possède encore aucune indication sur la partici­
pation de cette réserve à la formation de nouveaux noyaux et on n'a
de données définitives ni sur la vitesse de synthèse de l'ADN pendant
les premiers stades, ni sur les modalités de cette synthèse, ni sur la
quantité d'ADN existant dans le noyau de l'oocyte ou dans les noyaux
au cours du développement.
B.C. Moore (1955)» pa^r des mesures histo-
photométriques, a montré, cependant, que la quantité d'ADN par noyau
est très variable et différente de la quantité diploïde ou tétraploïde
de l'espèce.
10
Le présent travail porte sur le métabolisme des acides nucléiques
au cours des premiers stades du développement.
Nous avons vu que, jusqu'au stade gastrula, les synthèses sont
peu importantes, tant en ce qui concerne les acides nucléiques que 1er
protéines.
A ce stade, on observe une reprise de toutes les activités
de synthèse.
Cependant, vu l'hétérogénéité et la complexité du matériel,
’
l'accumulation de réserves qu'on considère comme métaboliquement
inactives, on ne peut cependant affirmer qu'il n'existe pas des eynthèses discrètes qui s'accomplissent dès le début du développement et
que des méthodes biochimiques ne permettent pas de déceler.
C'est pourquoi il nous a semblé intéressant de combiner l'emploi
de radioisotopes, précurseurs d'acides nucléiques, à une détection des
traceurs au niveau cellulaire.
1ère partie du travail.
Ces expériences sont décrites dans la
Dans la seconde, nous avons essayé de
modifier le métabolisme normal des acides nucléiques en traitant les
embryons par des dérivés fluorés des pyrimidines.
11
1ère
PARTIE
ETUDE AUTORADIOGRAPHIQÜE DE L'INCORPORATION DE
PRECURSEURS RADIOACTIFS DANS LES EMBRYONS DE BATRACIENS
INTRODUCTION
Au cours de ces dernières années, quelques travaux ont porté sur
l'incorporation de précurseurs radioactifs d'acides nucléiques et de
protéines dans les embryons en voie de développement.
Il faut remarquer tout d'abord que les résultats de ces expérien­
ces d'incorporation sont en bon accord avec les dosages biochimiques :
en effet, pour tous les précurseurs étudiés, les incorporations sont
faibles jusqu'à la gastrula ; à ce moment, les acides nucléiques et
les protéines se marquent très rapidement.
Citons notamment les travaux de Kutsky (1950)> qui a étudié le
métabolisme du P
dans les embryons de Rana pipiens.
L'auteur a
injecté le phosphate radioactif à la femelle avant la ponte et a suivi
au cours du développement la distribution du radioisotope dans diffé­
rentes fractions.
Dès le début du développement, on observe un
marquage, assez faible cependant, des acides nucléiques, tant dans
l'ADN que l'ARN.
Jusqu'au début de la gastrulation, la distribution
du traceur varie très peu.
A ce stade, le transfert de
de la
fraction acido-soluble aux acides nucléiques, devient très important.
Grant (1958b) a obtenu des résultats assez similaires quand il a
injecté du P^^ ou de la glycine-C^^^ dans l'oeuf fécondé.
L'incorpo­
ration de la glycine augmente notablement pendant la gastrulation.
Cohen (1954) a montré que le ^^CO^ entre dans le cycle de Krebs et
qu'il est incorporé dans les protéines et les acides nucléiques des
embryons.
12
Flickinger (1954)» utilisant ce meme précurseur, a obtenu des résu
tats semblables.
Fn ce qui concerne les acides nucléiques, 1 ' incorporf;.
tion dans l'ARN est très importante comparée au marquage de l'ADlT.
Une
fois de plus, les vitesses d'incorporation augmentent sensiblement à la
gastrulation.
Ces résultats ont également été confirmés par Tiedemann
et Tiedemann (1954)»
Fnfin, les travaux de Friedberg et Eakin (1949)
sur l'incorporation de la glycine-C14 et de Eakin et coll.
(1951) sur
celle de la méthionine montrent que, pour les protéines également,
l'incorporation est quasi négligeable jusqu'à la gastrula et qu'elle
eugmente à ce stade.
En ce qui concerne l'autoradiographie, signalons les travaux de
Ficq (1954)J de Sirlin et -ïaddington (1954)» de Brachet et Ledoux (1955
et de Sirlin (1955, 1959)Ficq (1954), utilisant la technique des émulsions nucléaires, a
analysé l'induction neurale en greffant des organisateurs marqués au
préalable soit au glycocolle, soit à l'acide orotique.
Elle a observé,
entre autres, que l'activité est très nettement localisée dans les
noyaux et que les régions à morphogénèse active sont celles qui se
marquent le plus.
Brachet et Ledoux (1955) ont montré que, pendant la segmentation,
809^ des traces proviennent des noyaux après traitement des embryons
au ”'^C02.
Sirlin et Waddington (1954) et Sirlin (1955), utilisant la méthode
de stripping de Doniach et Pelc (1950), ont suivi le sort de la glycine
et de la méthionine dans les embryons de triton.
Ils ont également
observé une activité nucléaire intense t pour ces auteurs, l'activité
serait prédominante dans les noyaux de l'organisateur.
Plus récemment, Sirlin (1959), étudiant l'incorporation de phénylalanine et d'acide orotique, a montré que les noyaux de l'organisateur
incorporent plus rapidement l'acide orotique que ceux des autres terri­
toires .
Enfin, tout récemment, B.C. Moore (1959) a pu observer un marquage
des noyaux des morulas après injection de thymidine-HJ aux femelles
49 h avant la ponte.
13
Cependant, ces ctudes ont été limitées par l'existence d'un
"coat" (revêtement superficiel) recouvrant les embryons et les rendant
peu perméables à un grand nombre de substances.
Si le COg diffuse
rapidement à travers la membrane vitelline et le "coat" des embryons,
les autres précurseurs semblent ne pénétrer que très lentement.
Dans la plupart des travaux, le précurseur a été injecté soit à la
femelle quelque temps avant la ponte, soit dans l'embryon lui-même.
Un autre procédé consiste à immerger dans la solution radioactive des
fragments d'embryon ou encore des embryons largement entaillés.
En raison de sa vitesse de pénétration, nous avons d'abord suivi
l'incorporation de CO^ dans des gastrulas d'ürodèles.
Ensuite, nous
avons utilisé des précurseurs plus spécifiques des acides nucléiques.
Dans ce but, nous avons, en collaboration avec W. BIELIAVSKY, développé
une technique facile permettant d'obtenir l'incorporation, dans les
cellules embryonnaires, de divers précurseurs, auxquels l'embryon est
normalement peu perméable.
On sait, depuis les travaux de Holtfreter (1943, 1944), que
lorsqu'on place les embryons dans un milieu dépourvu de Ca"*^'*' et conte­
nant un chélateur d'ions bivalents comme le versène ou le citrate,
on observe la désintégration de la couche superficielle du cortex et
la désagrégation de l'embryon en cellules dissociées.
Nous avons
observé que ces cellules sont très perméables.
L'incorporation des précurseurs a été étudiée par autoradiographie.
Nous avons suivi la technique des émulsions nucléaires mise au point
par A. Ficq (1955) .
La technique cytochimique à elle seule ne nous renseigne malheu­
reusement pas sur le mode d'incorporation du précurseur et sur la
radioactivité spécifique des macroraolécules marquées.
Mais,lorsqu'on
se trouve en présence d'un matériel aussi complexe qu'un embryon, il
est tout aussi intéressant de posséder des données sur la distribution
des substances actives dans les différentes régions de l'embryon et au
niveau de ses constituants cellulaires.
14
PARTIE EXPERIMENTALE
A. Incorporation de '*‘^00- dans des gastrulas d'Urodèles.
1 . INCORPORATION DE '*'^00^ DANS DES GaSTRÜLAS D'AXOLOTL
Nous avons suivi l'incorporation de ce précurseur dans les acides
nucléiques et les protéines par la méthode autoradiographique.
Les
gastrulas d'Axolotl traitées dans cette étude présentent de grandes
cellules où on peut, sans trop de difficultés, dénombrer et localiser
les traces laissées dans l'émulsion photographique par les p du
Procédé expérimental s
Les oeufs d'Axolotl obtenus par ponte spontanée étaient dégangués
et lavés dans une solution saline ayant la composition suivante s
NaCl, 550 mg ; KCl, 5 mg ; CaCl2, 10 mg ; H2O,
1.000 c.c.
2 c.c. de
la solution saline additionnée de bicarbonate radioactif (concentration
finale 4 pc./c.c. soit 56 y/c.c.) étaient versés dans un pèse-filtre.
Dix à vingt oeufs étaient traités, dans un pèse-filtre, pendant une
durée de 5 heures.
Après ce laps de temps, les embryons étaient lavés
et fixés à 1'alcool-acétique à froid (acide acétique à 5 pour cent
dans l'alcool absolu refroidi à - 8°) pendant 4 heures.
Après un
séjour de 12 heures dans de l'alcool absolu, également à - 8°, les
oeufs étaient placés dans du toluol préalablement refroidi 5 ils
étaient enfin ramenés à la température ordinaire et enrobés dans la
paraffine.
Les ooupes de 10 microns étaient déposées sur des lames
recouvertes au préalable d'un film de gélatine alunée, permettant
l'application de l'émulsion.
Certaines lames ont été traitées à la
ribonucléase pendant 1 à 2 heures à 58° (conc. 0,4 à 1 mg/c.c.) afin
d'éliminer l'activité de l'ARN.
Un autre lot de préparations a été
soumis à l'action successive de la ribonucléase et de la désoxyribo-
15
nucléase (2 heures dans une solution à 0,1 mg/c.c. de NaCl ^ o/oo addi
tionnée de
M/300).
Après un lavage soigneux des lames hydrolysée
et séchage, l'émulsion nucléaire était appliquée suivant la technique
décrite par Ficq (1955) •
I^es durées d'exposition étaient de 5 jours.
Après révélation et fixation, toujours suivant la technique de Ficq,
les préparations ont été colorées au mélange vert de méthyl-pyronine
pendant 10 minutes environ, lavées à l'eau courante et montées à la
glycérine.
Résultats !
Nous avons étudié quatre régions de jeune gastrula (cf. fig. 1).
Le tableau 1 donne les résultats.
C'est le neuroblaste qui présente
la plus forte activité ; l'ectoblaste est un peu plus actif que le
chordomésoblaste, tandis que l'entoblaste est très peu actif.
D'ime
façon générale, l'activité est élevée dans les noyaux.
Les divers territoires de la gastrula avancée où les traces ont
été dénombrées sont indiqués sur la fig. 2.
résumés dans le tableau 2.
Les résultats sont
L'activité se distribue de la même façon
que dans la gastrula jeune.
Enfin, nous avons déterminé l'activité par unité de surface pour
le cytoplasme et le noyau.
Les tableaux 3 et 4 résument les résultats
obtenus aux deux stades étudiés.
Nos observations montrent que, dès
la jeune gastrula, des gradients d'activité sont très reconnaissables
dans le cytoplasme, sans qu'il y ait de grandes différences pour les
noyaux ; au stade gastrula avancée par contre, les noyaux présentent
des gradients d'activité très nets, parallèles à ceux qu'on trouve
dans le cytoplasme aux deux stades étudiés.
16
Fig. 1. Jeune gastrula. Territoires étudiés: a, neuroblaste
présomptif; b. ectoblaste; c, région correspondant à
l’organisateur; d, portion entoblastique.
Fig. 2. Gastrula avancée. Territoires étudiés:
a,
blaste; B. ectoblaste ventral; c, chordomésoblaste;
tion entoblastique.
Tableau 1
neuro­
por­
d,
: Résultats relatifs à la je\ine gastrula.
Nombre moyen de
traces par unité de surface des quatre territoires étudiés
(cf. fig. 1)
Régions
A. Neuroblaste
B. Ectoblaste
C. Région de l'organisateur
D. Portion entoblastique
I
I
I
1
I
Nombre de
traces/156 |i
Nombre total de
traces/nombre total
de surfaces
I
I
I
1
3,12
572/183
1,85
737/402
»
j
j
I
}
cp
0,50
711/405
166/331
Dans la colonne de droite figurent le nombre total de traces et le
nombre total de surfaces dénombrées.
Tableau 2 : Résultats relatifs à la gastrula avancée.
Nombre moyen
de traces par unité de surface des 4 territoires (cf. fig. 2)
Régions
}
I
I
..................-......................................4
I
A. Neuroblaste
{
B. Ectoblaste ventral
C. Chcrdomésoblaste
D. Portion entoblastique
{
I
}
I
{
Nombre de
traces/156 ji.
Nombre total de
traces/nombre total
de surfaces
4,14
1556/572
2,91
993/541
1,00
546/541
0,55
151/238
17
Tableau 3 : Jeune gastrula.
Nombre moyen de traces par unité de
surface.
Régions
|
Noyau
-----------------1----------- .------------------------
Cytoplasme
A
;
4,93 (291/59)
1,79 (172/96)
B
j
4,84 (659/136)
1,20 (54/11)
C
j
4,65 (652/140)
0,70 (145/205)
D
j
4,16 (129/51)
0,27 (116/420)
Entre parenthèses, figurent le nombre total de traces et le nombre
total de surfaces dénombrées.
Tableau 4 : Gastrula avancée.
Nombre moyen de traces par unité de
surface.
Régions
{
Noyau
----------------- j------- J--------------------------A
j
Cytoplasme
‘7,44 (849/114)
2.45 (59/24)
5,25 (361/69)
1.46 (49/35)
B
I
C
I
4,96 (164/53)
0,83 (150/179)
D
;
2,30 (23/10)
0,48 (64/131)
Entre parenthèses, figurent le nombre total de traces et le nombre
total de surfaces dénombrées.
Pour déterminer la distribution de la radioactivité parmi les
différentes substances marquées, nous avons procédé à quelques
digestions enzymatiques.
Les résultats montrent qu'une partie impor­
tante de la radioactivité est liée à l'ARN (70 °/o environ). La spéci­
ficité de ces essais est cependant insuffisante lorsqu'on se trouve en
présence d'un marquage aussi général que celui qu'on obtient après
14
traitement au
CO2.
18
2. INCORPORA.TION DE '’^CO^ DANb DES GASTRÜLAS CENTRIFUGEES
Des expériences de Pasteels (1953) ont montré que la centrifuga­
tion de la jeune gastrula provoque l'apparition d'organes axiaux secon­
daires présentant des structures rhorabencéphaliques et caudales.
Comparant ce résultat à ceux d'Holtfreter (1947)> qui obtient la
neuralisation de l'ectoblaste après un choc précytolytique, Pasteels
propose d'attribuer cet effet morphogénétique à une activation des
cellules ectoblastiques par la centrifugation.
Signalons cependant que Karasaki et Yamada (1955) n'ont pas
obtenu la neuralisation de fragments ectodermiques, lorsque ceux-ci
sont centrifugés après explantation.
Ces résultats indiqueraient
que la neuralisation n'est probablement pas due à une simple activation
de l'ectoderme par la centrifugation.
Procédé expérimental :
Nos expériences ont été réalisées sur le Pleurodèle.
Les
gastrulas ont été centrifugées à 2.4OO t/min. pendant 4 minutes envi­
ron.
Pendant la centrifugation, la voûte du blastocoele s'affaisse
au contact de son plancher et l'oeuf se présente avec un pôle animal
entièrement aplati et sillonné de plis irréguliers.
Dans certains
oeufs, des plis persistent et c'est à partir de ces amas que se
formeront les organes surnuméraires.
Leur localisation est très
variable.
Des observation inédites de Brachet et Pasteels ont attiré
l'attention sur la distribution de l'ARN dans les cellules de l'ecto­
blaste après centrifugation de la gastrula.
Au lieu d'être disséminé
dans l'ensemble de la cellule, il s'accumule à l'un des pôles.
D'autre part, certaines régions mésoblastiques présentent une baso­
philie accrue.
Nous avons essayé de voir si la centrifugation provoque des
variations dans l'incorporation de
Des gastrulas ont été
traitées par le précurseur immédiatement après la centrifugation.
19
Un premier lot a été fixé après 5 h d'incubation et un second a été
fixé au bout de 24 h.
Les iémoins avaient atteint alors le stade
neurula.
Observations autoradiographiques :
Après 9 h d'incubation :
Témoins : les résultats sont très comparables à ceux que nous
avons obtenus sur l'axolotl.
Les noyaux sont très actifs | ils pré­
sentent des radioactivités peu différentes, tandis que les différences
cytoplasmiques sont très apparentes.
Embryons centrifugés ; les résultats semblent indiquer une
activité plus grande de l'ectoblaste à l'endroit des replis et,
parfois, du mésoblaste environnant.
Après 24 h. d'incubation :
Témoins : l'activité reste fortement concentrée dans les noyaux.
L'activité de la plaque médullaire est intense ; les traces dessinent
un gradient dorso-ventral superposable au gradient de basophilie
(fig. 3).
Embryons centrifugés ; les formations secondaires, encore peu
différenciées à ce moment, présentent une radioactivité voisine de
celle de la partie dorsale normale.
A la suite de ces expériences, il nous a évidemment semblé
intéressant d'utiliser des précurseurs plus spécifiques.
Plusieurs
tentatives ont été effectuées avec divers précurseurs : glycine,
uridine, cytidine.
Dans ces expériences, nous n'avons pu observer de
radioactivité appréciable.
C'est ce qui nous a amenée ainsi à
travailler sur cellules dissociées, car il s'agissait, très probable­
ment, d'une pénétration insuffisante des précurseurs essayés.
20
Fig. 3
au
coupe transversale dans une neurula de Pleurodèle traitée
21
B. Incorporation de précurseurs d'acides nucléiques
dans des embryons après désintégration du "coat"
Procédé expérimental :
Les oeufs prélevés au stade voulu sont dégangués et, munis encore
de leur membrane vitelline, ils sont cultivés dans le milieu suivant :
NaCl 17 io
20 ml
KCl 0,5 io
10 ml
Tris
HCl N
H^O
citrate
560 mg
(Tris(hydroxymé thy1)aminomé thane)
4 ml
966 m;
5 gr
pH : 7-7,5
Le temps de dissociation est variable suivant le stade et l'es­
pèce.
Après dissociation, les embryons sont incubés dans ce milieu
(Tris/citrate) additionné du précurseur radioactif.
Dans certaines
expériences, on a utilisé cette même solution mais dépourvue de
citrate (Tris 0).
Les cellules embryonnaires ainsi isolées ont été décrites par
Holtfreter : les cellules deviennent amiboïdes et présentent des
pseudopodes hyalins, pauvres en inclusions et très pyroninophiles.
Récemment, N. Bieliavsky et col.
(196O) ont décrit les diverses
anomalies que présentent des cellules exposées au citrate pendant des
temps longs (24 h).
Il est cependant peu probable que l'absence d'ions
bivalents chélatés par le citrate tue rapidement les cellules ou
change profondément leur métabolisme normal.
En effet, les oeufs
remis en présence de Ca"*"*", après un temps de traitement au citrate
variable suivant les espèces et les stades, se réagrègent en une
masse cellulaire qui se différencie et présente la morphologie d'une
neurula avancée.
22
A titre de contrôle, on a suivi l'incorporation de divers précurseurs
dans des fra,:?ments d'embryons ou dans des gastrulas où les précurseurs
avaient été injectés dans le blastocoele : leurs cellules présentent
le même type d'incorporation que celui des oeufs dissociés au même
stade.
Après incubation, les embryons ont été lavés et fixés générale­
ment par cryo-substitution (Lison 1955) et les coupes ont été soumises
à la technique autoradiographique de A. Ficq.
Nous avons utilisé
l'émulsion Ilford "in gel form" type L4 quand il s'agissait de mettre
en évidence les p du tritium, les types G5 ou K5 quand il fallait
détecter les électrons émis par le carbone.
Préalablement au recou­
vrement par l'émulsion photographique, des lames ont été soumises à
l'une ou l'autre des hydrolyses décrites ci-dessous.
Ribonucléase Sigma - 0,2 à 0,5 mg/ml tampon Tris pH 7>5 additionné de
Mg'^'^ M/500 - 1 h à 57°.
Désoxyribonucléase NBC - 0,1 mg/ml tampon Tris pH 7,5 additionné de
M/300 - 30' à 1 h à 37°.
Tampon Tris pH 7>5 - 1 h à 37°.
PCA 1 5^ - 20 minutes à 4°*
NaCl M - 10 minutes à 4°.
Les temps d'exposition, en chambre noire, ont varié de 3 à 10 jours
suivant les précurseurs et les temps d'incubation étudiés.
Ensuite,
on a procédé au développement photographique suivant les directives
de A. Ficq.
1. INCORPORATION DE THYMII)INE-H3
1| Dans des embryons normaux :
Les expériences ont été réalisées sur Pleurodeles Waltii.
modalités de l'expérience sont indiquées dans le tableau 5«
Les
23
Tableau 5
Stade
morula
: Incorporation de thymidine-H3
I
Précurseur
j----------------------------------------------}thymidine-H3 (Mol)
milieu d'inc. temps
{tps de dis
-j-—.............
{
4-6 h.
J_________________ s
I
I
{Tris 0/Th. H3{ 17 h.
{activité spéc. 500 mC/mM
'
-9
{conctétudiée 5*10
M
I
soit 2,5 pC/ml
4
................................................. -
blastula
-...................................................................
fl
II
4 h
II
If
{
»
f
3 h
II
18 h
Résultats ;
Aux 2 stades étudiés,
nous observons une incor­
poration de thymidine-H3.
Les noyaux et les chromo­
somes sont fortement
marqués.
Cette activité
est presque totalement
éliminée lorsque les coupes
sont traitées à la DNase
avant l'application de
l'émulsion photographique
et la radioactivité n'est
guère affectée par l'action
de la ribonucléase.
Au bout de 3 heures, on
observe déjà des mitoses
marquées dans les cellules
des blastulas.
Fig. 4 ! Autoradiographie de cellules de
blastula incubées en présence de thymidine-H3 ; métaphase marquée.
24
2. Incorporation de thymidine-H3 dans les hybrides létaux ;
Nous avons étudié le croisement Bufo vulgaris femelle x Rana
temporaria mâle, dont .e développement se bloque au stade blastula
avancée et qui a été examiné cytologiqùement et cytochimiquement par
Brachet (1954)*
1. Des embryons, aü stade 2 blastomères, ont été placés dans
le
milieu chélateur additionné de thymidine-HJ (Mol) à la concentration
5.10"^ M/2,5 mC.
Après 17 h d'incubation, les embryons ont été fixés par congé­
lation-dissolution et soumis au processus autoradiographique de la
façon habituelle.
Observations :
Signalons d'abord que, parmi les hybrides, la moitié des embryons
sont morts pendant l'incubation, alors que les témoins (Bufo femelle
X
‘
Bufo mâle) ont tous résisté au traitement.
La thymidine s'incorpore dans les noyaux.
La quasi-totalité de
la radioactivité est éliminée après traitement à la DNase, tandis que
les images ne sont guère modifiées après traitement à la RNase.
2. L'arrêt du développement des hybrides s'est effectivement mani­
festé au stade blastula.
Nous avons effectué une 2ème expérience à
ce stade pour les hybrides, au stade gastrula jeune pour les témoins.
Bans cette expérience et dans les suivantes, nous nous sommes conformée
aux indications de Barth (1959) en ce qui concerne les milieux de
culture : les embryons dépourvus de membrane vitelline sont dissociés
dans le milieu II pendant 2 heures ; ensuite, ils sont incubés dans le
milieu I.
Milieu I :
additionné de thymidine-HJ.
NaCl
515 nig
KCl
7,5 mg
7 H^O
Ca(N0^)2 HgO
20,4 mg
6,2 mg
25
CaCl^ 2 H^O
NaHCO,
6 mg
20 mg
Na2.HP0^
3 mg
KI2PO4
3,75 mg
100 ml H^O
100 mg de serumglobuline
NaCl
Milieu II ;
680 mg
KCl
10 mg
Versène
74,4 mg
Na^HPO,
2
A
KH2PO4
11 mg
NaHCO^
5
20 mg
2 mg
100 ml H^O
Afin de pouvoir aisément transporter les embryons sans léser les
cellules, nous avons utilisé, comme support, des fragments de filtre
millipore.
Après I6 h d'incubation, les cellules ont été fixées dans
un mélange d'alcool et d'acide acétique (90/1O v/v) pendant 50 mi­
nutes à 4° •
Observations :
On observe également, à ce stade, une incorporation de thymidine
dans les noyaux et les chromosomes.
Cette activité est presque
totalement éliminée par la DNase (fig. 5, 6)
On retrouve les anomalies nucléaires décrites pour cet hybride
par Brachet : dans de nombreux noyaux, la chromatine est accolée à la
membrane nucléaire et des grains d'argent disposés en couronne s'y
superposent très nettement 5 quelquefois, on observe des éliminations
de chromatine marquée dans le cytoplasme | enfin, dans de nombreuses
cellules, on observe la présence de 2 hémicaryons.
Fig. 5 : Incorporation de thymidine-HJ dans les cellules de la gastrula
témoins (Bufo femelle x Bufo mâle)
Fig. 6 : Cellules provenant d'une gastrula hybride, incubées en pré­
sence de thymidine-H5.
a) lame témoin : les noyaux sont marqués p quelquefois la chroma­
tine est disposée en couronne et les grains d'argent s'y
superposent.
27
Fig. 6, b) lame traitée à la DITase préalablement au recouvrement par
l'émulsion photographique : la quasi-totalité de la radio­
activité a été éliminée.
Fig. 6, c) lame traitée à la RNase : la radioactivité est peu affectée.
28
3» 24 heures après le blocage, nous avons tenté une incorporation
dans les embryons hybrides ; les témoins étaient en neurula.
Parallè­
lement, sur une 2ème ponte, nous avons repris des blastulas peu de
temps après l'arrêt du développement et des jeunes gastrulas témoins.
Nous avons utilisé les milieux de Barth comme dans l'expérience précé­
dente.
Les embryons ont été abandonnés dans le milieu chélateur
pendant 50 minutes environ et l'incubation dans le milieu radioactif
a été de 1h30.
Observations ;
blastulas bloquées - gastrulas
Dans la plupart des cellules au repos, on observe une incorpo­
ration de thymidine-H3 dans l'ADN.
pas marquées.
En général, les mitoses ne sont
Il semble que l'intensité de la radioactivité soit un
peu plus grande dans les témoins que dans les embryons hybrides.
Dans ces derniers, les noyaux sont fréquemment constitués de 2 hémicaryons différant par leur colorabilité : on observe une coïncidence
entre la colorabilité au vert de méthyle et la distribution des grains
d'argent.
blastulas bloquées - neurulas
L'activité est très faible dans les 2 séries.
En ce qui concerne
l'hybride, on décèle cependant encore une légère incorporation dans
certains noyaux.
. 2. INCORPORATION D'ÜRIDINE-H5
Modalités :
Les tableaux 6 et 7 résument les modalités des expériences.
Celles-ci ont été réalisées sur des embryons de Pleurodèles et
d'Axolotl.
29
Ta~bleau 6 ; Incorporation d'uridine-H3 (Schwarz) - Axolotl
Activité spécifique ;
100 mC/l25 pM
Concentration étudiée ; 5*10 ^ M
4 pC/ml
Stade
tps dis.
tps d'inc.
milieu d'incubation
2-8 blast.
Tris citrate/uridine
25 h
2-4 'blast.
Tris citrate/uridine
5 h
’
6 h
23 h
blastula
Tris citrate/uridine
1 h
2 h
4 h
21 h
gastrula
Tris citrate/uridine
2 h
5 h
7 h
24 h
gastrula
2 h
Tris O/uridine
2 h
5 h
22 h
neurula
Tris citrate/uridine
5 h
1
neurula
0
17 h
Tris O/uridine
3 h
17 h
30
Tableau 7 : Incorporation d'uridine (Schwarz) - Pleurodèles
Activité spécifique : 100 mC/l25 pM
-6
Concentration étudiée ; 5-10^
M
4 pC/ml
Stade
r tps dis
»
•
1
milieu d'incubation
t tps d'inc.
f
-i.
blastula
1
f
1
î
gastrula
jeune
1
!
1
f
!
!
î
!
r
6 h
6 h
2 h
f
vitellin
»
?
1
1
!
Tris O/uridine
It
1
1
1
r
f
t
ï
!
Tris O/uridine
6 h
T
!
î
t
î
î
t
f
!
t
f
t
1
t
t
f
f
1
1
!
f
»
t
bouchon
»
1
1
t
f
Tris o/uridine
f
1
1
t
f
1
t
1h50
19 h
2 h
24 h
2 h
19 h
Ces expériences ont été réalisées en collaboration avec N, BIELIAVSKY
Fig. 7 ! cellule de Morula incubée pendant 20 h en présence d'uridine
H5 ; télophase marquée.
31
Fig. 8 : métaphase marquée.
Résultats :
Aux stades morula et blastula, l'incorporation de l'uridine-H5
est exclusivement nucléaire.
Pour les temps courts d'incubation
(1 h ou 2 h), les cellules en mitose sont vierges de traces ; seuls
les noyaux en interphase révèlent la présence du radioisotope.
Pour
les temps longs d'incubation, les chromosomes deviennent radioactifs
à leur tour.
Au début de la segmentation, l'importance du "coat" est
encore telle que la pénétration de l'uridine est très faible, même en
présence de citrate.
Les oeufs indivis, après s'être segmentés 21 h
dans du citrate, présentent cependant une incorporation nucléaire dans
les blastomeres fils*
Lors des temps longs d'incubation (7 h, 15 h,
24 h), la distribution de l'intensité des radioactivités nucléaires
dans l'ensemble d'une blastula dissociée suit vin gradient décroissant
du pôle animal au pôle végétatif.
Il faut signaler que les fuseaux
mitotiques, l'endoplasme et le pseudopode ne sont jamais marqués, et
que la localisation des traces est soit nucléaire, soit chromosomiale
(fig. 7, 8).
De plus, l'action de la DNase sur les coupes, préalable­
ment au recouvrement par l'émulsion photographique, élimine la
32a
radioactivité des chromosomes et des noyaux | au contraire, un traite­
ment des coupes au tampon ou à la ribonucléase ne modifie pas les
résultats.
L'uridine où, plus probablement, le résultat de sa trans­
formation métabolique s'est donc incorporée spécifiquement dans l'ADÏÏ
chromosomial.
L'incorporation se fait sans doute au niveau des bases
pyrimidiques de l'ADN, car une hydrolyse des coupes à l'HCl N pendant
5 minutes à 60° n'affecte pas la radioactivité des chromosomes,
(fig. 9
Fig. 9 s Cellules de blastula incubées en présence d'uridine-H3
a) lame témoins s la radioactivité est exclusivement nucléaire
32b
Fig. 9
: Cellules de blastula incubées en présence d'uridine-HJ
b) Hydrolyse à l'HCl N 5 minutes à 60" préalablement au recouvrement
par l'émulsion photographique : on n'observe pas de diminution
appréciable de la radioactivité.
c) Lame traitée à la DNase : toute l'activité est éliminée.
55a
Dans la gastrula, l'autoradiographie révèle toujours une intense
activité nucléaire.
Les particularités de ce stade sont, d'une part,
une plus grande hétérogénéité dans la distribution de la radioactivité
parmi les noyaux de la gastrula, d'autre part, l'apparition d'une
incorporation cytoplasmique qui s'accroît surtout quand on approche
de la neurulation.
Les tests cytochimiques indiquent, de plus, un
changement dans la nature des substances incorporant l'uridine s dans
les coupes traitées à la RNase ou à l'HCl N à 60°, les noyaux perdent
la moitié environ de leur radioactivité.
Après une incubation des
coupes dans la DNase, 30 à 40 5^ de la radioactivité subsiste dans les
noyaux (fig. 10).
Toutes les cellules d'une gastrula n'ont pas le
même comportement vis-à-vis des réactifs employés : les cellules d'une
gastrula avancée se différencient non seulement par l'intensité de
l'incorporation, mais aussi par la nature des substances où l'uridine
est incorporée.
En plus de l'ADN, l'ARN de certains noyaux incorpore
fortement l'uridine.
Les effets amorcés lors de la gastrulation s'accentuent pendant 1
neurulation ; à ce stade, la vitesse d'incorporation devient très
grande.
On note une incorporation intense dans le cytoplasme endo­
plasmique et pseudopodial.
Fig. 10 : Cellules de gastrula avancée incubées en présence d'uridineà) lame témoin
H3
33b
Fig. 10 s Cellules degastrula avancée incubées en présence d'uridino-i
b) coupes traitées à l'HCl N à 60° pendant 5 minutes.
c) autoradiographie après traitement des coupes à laJDWase.
54
Il nous a semblé utile de procéder à quelques vérifications ayant
trait à l'incorporation de l'uridine.
Son incorporation presque exclu­
sive dans 1'ADN. pendant les premiers stades du développement était un
résultat quelque peu inattendu.
Sous quelle forme se fait cette
incorporation, est-elle liée à une synthèse d'ADN que ne décèlent pas
les dosages biochimiques ?
Nous avons poursuivi ces expériences à l'aide d'uridine-H3
d'Amersham.
L'activité spécifique de cette préparation étant plus
faible, nous avons utilisé des concentrations 10 fois plus importantes
que dans les expériences précédentes.
Les modalités de l'expérience
sont résumées dans le tableau 8.
Tableau 8 : Incorporation d'uridine-H3 (Amersham) - Pleurodèles
Activité spécifique : 100 mC/l,6 mM
Concentration étudiée ; 4 M-C/ml
Stade
morula
t
t
T
f
-4t
t
blastula
f
1
t
t
Tps dis.
4-6 h
1
t
milieu d'incorporation
1
f
t
î
1
Tris O/uridine
f
4 h
!
t
f
t
!
Tris O/uridine
1
1
----- -f1
t
tps
»
17 h
t
1
1
f
3 h
!
1
f
18 h
Résultats ;
Nous avons retrouvé les mêmes résultats ; vine radioactivité nu­
cléaire ou chromosomiale qui disparaît quand on traite les lames à la
DNase.
Cependant, on observe de très nombreux grains d'argent autour
des coupes, alors que le background est très faible quand le précurseur
étudié est la thymidine, que nous avons suivie parallèlement.
55
Effet de la fluorodésoxyuridine (EUDE^ s
On sait que ce composé inhibe la synthèse de l'ADN dans les cel­
lules tumorales et chez les bactéries.
Par ailleurs, Cohen a montré
que la 2-fluorodésoxyvridine inhibe irréversiblement l'enzyme de
synthèse de l'acide thymidylique à partir de l'acide désoxyuridylique.
C'est pourquoi, il nous a semblé intéressant d'étudier l'incorporation
de thymidine-H3 et d'uridine-HJ en présence de la FUDR.
Conditions expérimentales ;
Des gastrulas d'Axolotl ont été traitées pendant 5 h dans le
milieu dissociant, puis réparties en 4 lots dans les milieux suivants
1.
Tris 0
0,9 ml
Holtfreter
0,1 ml
Thymidine-H3 (Mol)
2,8 pC - 5.10”^ M
2. Tris 0
0,9 ml
Holtfreter + FUDR 2.10"^ M
0,1 ml - 2.10“^ M FÜDR
Thymidine-H3
2,8 pC - 5.10
5. Tris 0
0,9 ml
Holtfreter
0,1 ml
Üridine-H3 (Amersham)
4 pC - 10 -4
4. Tris 0
-6 M
0,9 ml
Holtfreter + FUDR
0,1 ml - 2.10 -4 M
Uridine-H3
4 pC - 10"^
Résultats :
L'examen des autcradiographies montre que l'incorporation de la
thymidine est légèrement inhibée, tandis que celle de l'uridine dans
les noyaux l'est complètement.
Notons que les embryons témoins se sont réagrégés pendant 1'incu­
bation, tandis que les cellules traitées par la FUDR sont dissociées.
Leurs noyaux évoluent vers la pycnose.
Cette expérience préliminaire plaide cependant en faveur de
l'idée que l'incorporation d'uridine est liée à la synthèse de l'ADN.
36
Dans les expérienceg suivantes, nous avons étudié l’effet d’autres
d^xynucléosides sur l'incorporation d'uridine-HJ .
étudiés sont :
Lee composés
.
la_thymidine2^_la_désoxycytidine, la désoxyadénosine t
Klenow (1959) a montré, que dans les cellules d’ascites des tumeurs
d’Ehrlich,lû désoxyadénosine inhibe la synthèse de l'ADN.
Plus récem­
ment, Maley et Maley (i960) ont obtenu des résultats semblables dans
le cas de l’embryon de poulet.
Conditions expérimentales :
1_ère expérience : Incorporation d'uridine-H3 dans des blastulas
d’Axolotl en présence de thymidine non radioactive.
Les modalités sont
résumées dans le tableau 9*
Talbeau 9 : Incorporation d'uridine-H3 (Amersham) - activité spécifique
de l'uridine ; 100 mCyi,6 mM.
6 |aC/ml.
blastula
Thymidine - concentration étudiée s
1 tps dis. }
Stade
1
f
1
f
1
1
Concentration étudiée 10*’'^ M soit
2 h
f
t
1
10“^ M,
milieu d'incubation
Tris O/uridine
{Tris o/uridine + thymidine froide
{
1
|
|
temps
18 h
H
£^ème__e^é_rj^ence_ : Dans cette expérience, nous avions à notre dis­
position un nouveau lot d'uridine-H5 d'Amersham d’activité spécifique
plus grande : 1,1 C/mM.
Des Pleurodèles, au stade morula-blastula,
ont été traités en présence de citrate pendant 5 h, puis lavés et ré­
partis dans les milieux suivants :
Tris 0 + uridine-H3 5 M-C/l, 1 y/ml concentration 5* 10*"^ M,
Tris 0 + uridine-H3 + thymidine à la concentration 10“^ M.
Tris 0 + uridine-H3 + désoxycytidine 10”^ M.
Tris 0 + uridine-H3 + désoxyadénosine 10“^ M,
Les embryons ont été fixés après I6 h d’incubation.
Résultats :
Dans la 1ère expérience, on ne peut déceler d’effet inhibiteur de
la thymidine sur l’incorporation d'uridine.
37
Dans la seconde, il semble que, en présence de thymidine et de
déecxycytidine,1'incorporation totale soit légèrement plus faible.
Cependant, les comportements vis-à-vis des tests enzymatiques ne sont
pas très différents.
L'effet de la désoxyadénosine est plus apparent ; on observe d'un
part un ralentissement très grand des mitoses et, par ailleurs, une
beaucoup plus grande inhibition de l'incorporation.
De plus, une
partie très importante de l'activité disparaît après traitement des
coupes au tampon et à la ribonucléase.
On note, cependant, une
certaine incorporation dans l'ADN.
3. IMCORPQBATIOM D'ADEN0&IHE-H3. D'ADENINE-CU. D'ACIDE 0R0TIQUE-C14.
Ces trois précurseurs ont été étudiés parallèlement.
Le tableau
10 rend compte des conditions de l'expérience.
Tableau 10 :
Stade
blastula
(Axolotl)
{ Tps dis.
1
J
}
t
}
f
milieu d'incubation
«1
4 h
Tris O/adénosine
Tris O/adénine ^
Tris O/acide orotique ^
1
t
;
t
t
t
f
?
f
temps
21 h
Adénosine-H3 - Schwarz ; activité spécifique 1 C/mM - concentration
étudiée 4*10 ^ M soit 0,004 pmole/ml/4 IJ.C.
2
5
A
Adénine-8-C14 - Amersham - concentration étudiée s 5-10”^ M/ml/|iC
Acide orotique-6-C14 - Amersham - concentration étudiée
0,2 |imole/pC/ml
Dans ces expériences, les coupes ont été étalées sur de l'alcool
absolu afin d'éviter toute extraction par l'eau.
58
Résultats :
Adénosine-H5
Dans les lames non traitées,'on observe de très nombreux grains
d'argent au-dessus des noyaux, du cytoplasme et, également, dans
l'émulsion autour des coupes.
La radioactivité liée au cytoplasme et
à des substances diffusant au moment de l'application de l'émulsion
est éliminée après traitement des coupes à l'acide perchlorique (PCA),
au NaCl M à froid et à la ribonucléase.
Après ces trois traitements,
les noyaux et les-chromosomes restent fortement marqués.
L'intensité de la radioactivité est du même ordre de grandeur
dans ces trois lames.
L'activité nucléaire disparaît presque totalement
lorsqu'on traite les coupes à la DNase.
(fig. 11)
Adénine-8-C14
Dans ce cas aussi, les lames témoins montrent une très grande
diffusion autour des coupes, même après lavage des lames dans de
l'adénine non marquée pendant 50 minutes à 4°.
Cette diffusion disparaît après traitement au PCA, au ïïaCl et
à la RNase.
Cependant aucun des trois traitements n'enlève complète­
ment l'activité du cytoplasme.
Après l'action de la DNase, la concen­
tration des traces au-dessus des noyaux diminue, mais il reste de nom­
breuses traces dans le cytoplasme» (fig. 12)
Acide orotique-6-C14
Dans ce cas aussi, la distribution de la radioactivité est
complexe.
On observe, néanmoins, un marquage de l'ADN, mais plus
faible, semble-t-il, qu(
pour les autres précurseurs.
39
Fig. 11
; incorporation d’adénosine-H3 dans des cellules de blastula.
a) lame témoin
Fig.
11, b) après RNase
40
Fig.
12 : Incorporation d'adénine-8-C14
: lame traitée à la RNase.
41
DISCUSSION
En ce qui concerne la synthèse de l'ADN, les expériences réalisée
ne répondent directement à aucune des questions posées ; mais elles
fournissent cependant quelques données sur les capacités des cellules
embryonnaires à incorporer divers précurseurs.
Pendant la segmentatio
nous avons observé un marquage de l'ADN avec les 5 précurseurs étudiés
la thymidine-H5, 1'uridine-H3, 1'adénosine-H3, 1'adénine-8-C14 et
l'acide orotique-6-C14•
On observe une incorporation assez rapide de la thymidine-HJ
|
dans ce cas, la quasi-totalité de la radioactivité est éliminée par la
DNase.
En ce qui concerne les hybrides, on peut observer un marquage de
l'ADN tant dans les cellules des morulas que dans celles des blastulas
même 24 heures après l'arrêt du développement.
Ceci montre que les
cellules de l'hybride sont encore capables d'incorporer ce précurseur
dans leurs noyaux après l'arrêt du développement.
Rappelons que les
dosages biochimiques de l'ADN, effectués par Gregg et L/^vtrup (i960)
dans l'hybride létal Rana pipiens femelle x Rana Sylvatica mâle, ont
conduit à la conclusion que le blocage du développement chez ces hy­
brides n'est pas dû à l'arrêt de la synthèse d'ADN.
L'uridine-H3 marque intensément l'ADN pendant la segmentation.
On peut supposer que cette incorporation a lieu sous forme de thymi­
dine ou de désoxycytidine.
L'inhibition de son incorporation par la
FUDR semble montrer qu'elle doit subir une méthylation ou que son
incorporation est liée à la synthèse d'ADN.
Par ailleurs, l'incorpo­
ration dans l'ADN d'uridine et d'adénosine semble montrer que la
réduction ribonucléoside en désoxyribonucléoside de l'ADN a lieu dans
les cellules embryonnaires.
Rappelons que dès 1956, Brachet avait envisagé la possibilité
d'une utilisation de l'ARN pour la synthèse de l'ADN au cours des
premiers stades du développement ; la transformation se ferait au
niveau du nucléoside ou du nucléotide.
42
L'effet de la désoxyadénosine sur les cellules des blastulas est
en accord avec les observations de Klenow (1959) et de Maley et
Maley (196O).
Enfin, nous n'avons observé qu'un très faible effet de la thymi­
dine et de la désoxycytidine sur l'incorporation d'uridine.
Il se
pourrait que des mesures de la radioactivité spécifique de l'AM four­
nissent une image différente.
En effet, on peut craindre que l'addi­
tion de métabolites en telles concentrations ne perturbe le métabolisme
des cellules et il serait prudent de procéder à certaines vérifications
avant de tirer des conclusions.
Il serait indiqué, notamment, de
procéder à quelques dosages d'ADN et d'ARN et de permettre aux cellules
de se réagréger afin de voir si la différenciation est normale.
Enfin, il faudrait tenir compte des anomalies que peut amener
l'introduction de tritium dans les cellules et plus particulièrement
dans l'ADN fKrause et Plaut I96O).
De nombreuses données venant de la bactériologie et de l'étude
des cellules animales ont fixé quelque peu les idées quant à la bio­
synthèse de l'ADN.
Depuis les travaux de Kornberg (1957) on a pu dans
différents systèmes mettre en évidence une polymérase qui permet la
formation d'ADN à partir de désoxyribonucléosides triphosphates.
On
peut imaginer que, dans les embryons, un pareil enzyme de synthèse
existe et que les précurseurs de l'ADN sont en dernière analyse des
désoxynucléosides triphosphates qu'ils proviennent d'une réserve cyto­
plasmique d'ADN, d'ARN ou de toute autre source.
En ce qui concerne la synthèse des désoxyribonucléosides triphos­
phates, les résultats des travaux récents font penser que ceux-ci se
formeraient à partir de ribonucléotides.
En effet, dès 1955f Rose et Schweigert ont montré que la cytidine
marquée uniformément au CI4 s'incorpore dans l'ADN des cellules de
mammifères sans rupture du lien glycosidique.
Ces résultats ont été
confirmés dans diverses cellules pour la cytidine, l'uridine et égale­
ment pour les nucléosides puriques (Pruooff, 1958 5 Reichard 1959).
43
De plus, la réduction du ribose aurait lieu au niveau du ribonucléoside diphosphate (Reichard et coll. ^^60),
Par ailleurs, il
semble que les désoxyribonucléosides triphosphates jouent un rôle
régulateur dans la synthèse d'ADN ou dans la conversion des ribonucléotides en désoxyribonucléotides.
Entre autres, la désoxyadénosine
triphosphate inhiberait la conversion de la guanosine diphosphate en
désoxyguanosine diphosphate (Overgaard-Hansen et Klenow I961), la
thymidine triphosphate inhiberait la conversion de cytidine diphosphate
en désoxycytidine diphosphate (Morris et Fisher 196O).
Les résultats obtenus au moyen de la désoxyadénosine plaident en
faveur de l'existence de tels systèmes pendant la segmentation.
Nous observons également un marquage de l'ADN par l'adénine et
l'acide orotique, mais relativement plus faible pour ces précurseurs.
En effet, une activité importante est liée à une fraction labile qui
diffuse au moment de l'application de l'émulsion.
On retrouve cette
diffusion dans le cas de l'adénosine et à un degré moindre dans le
cas de l'uridine.
En ce qui concerne l'incorporation totale du
14
^CO^, nos observa­
tions autoradiographiques sont en bon accord avec les résultats de
Plickinger qui a utilisé des techniques biochimiques : il a observé
des gradients d'activité analogues à ceux que nous venons de voir,
tant en ce qui concerne les protéines que les acides nucléiques.
En
particulier, cet auteur trouve que la fraction microsomiale est très
active.
Ces gradients d'activité sont superposables aux gradients
ribonucléiques animal-végétatif et dorso-ventral décrits par Brachet.
Nous remarquons donc un parallélisme parfait entre l'incorporation et
l'activité morphogénétique.
Ce fait est particulièrement frappant dans le cas de la centri­
fugation, où les formations secondaires manifestent très précocement
une incorporation accrue.
Il faut noter, comme l'avaient déjà signalé les divers auteurs
liii ont utilisé la technique autoradiographique, que la radioactivité
est concentrée dans les noyaux.
Ce fait influence évidemment les
J
44
résultats, les gradients étant liés à la densité des cellules, qui
suit la même distribution.
Cependant, si l'on examine la radioactivité
cytoplasmique, on observe un parallélisme entre l'augmentation du
nombre de traces et la diminution de la taille des plaquelles
vitellines.
En ce qui concerne l'activité des noyaux, nous avons vu qu'ils
présentent des radioactivités assez voisines au début de la gastrula­
tion et que les différences s'accentuent dans le sens des gradients
quand les vitesses de synthèse augmentent.
Il serait intéressant de déterminer avec plus de précision la nature
des substances marquées dans les noyaux.
Il semble toutefois que
l'incorporation soit surtout liée à l'ARN.
Enfin, pour l'uridine, on constate que l'incorporation se produit
dans l'ARN à partir de la gastrulation, tant en ce qui concerne les
noyaux que le cytoplasme.
Il serait intéressant, en utilisant des techniques plus fines,
d'analyser les structures marquées : xone fixation meilleure ou
l'autoradiographie à l'échelle du microscope électronique pourraient
sans doute fournir des données intéressantes à ce propos.
45
2ème
PARTIE
LES EFFETS DES F.V.'ÜROPYRIMIDINES SUR
LE DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE.
INTRODUCTION
En 1957, Heidelberger et ses collaborateurs ont découvert les
propriétés cancérostatiques du 5-fluorouracile (PU) et de l'acide
5-fluoroorotique.
Plus tard (1958)> ils ajoutèrent deux autres
composés à ce groupe de substances : la 5-fluorouridine (PUR) et la
5-fluorodésoxyuridine (FUDR).
Les effets de ces substances sur le
métabolisme des cellules cancéreuses ont été étudiés par les mêmes au­
teurs (Danneberg et coll.
195®)
Ils ont pu montrex' que les dérivés fluorés de l'uracile inhibent,
d'une part, la méthylation de l'acide désoxyuridylique et, d'autre
part, l'incorporation de l'uracile et de l'acide orotique dans l'ADN.
Ces données ont été confirmées par Eidinoff et coll.
(1957)*
Ces étufl
ont été quélque peu étendues dans un travail plus récent (Harbers et
coll. 1959)*
En effet, l'utilisati on de fluorodésoxyuridine-C14 a
permis les constatations suivantes ; en présence de ce radioisotope,
on observe un marquage de l'ARN, surtout de l'ARN nucléaire, et cette
radioactivité est liée au ribonucléotide du fluorouracile | par contre
il n'y a pas d'incorporation dans l'ADN.
D'ailleurs, les composés
fluorés peuvent être transformés en ribonucléotides mono-, di- et
triphosphates et désoxyribonucléoside monophosphate.
Cependant,
l'action thérapeutique semble être liée à l'inhibition de la synthèse
de l'ADN due, en dernière analyse, à l'arrêt de la formation de l'acic
thymidylique.
46
L'étude du mode d'action du 5-fluorouracile et de ses dérivés sur
les bactéries a confirmé, en règle générale, les résultats d'Heidelberger et de ses collaborateurs-
Cohen et coll. (195Q) ont montré
que la FUDR induisait le syndrome "thymineless"-
D'après ces auteurs,
l'effet bactéricide initial de la FUDR serait lié à l'inactivation de
l'enzyme de synthèse de l'acide thymidylique par le raononucléotide de
la fluorodésoxyuridine •, ensuite, on observe un effet bactériostatique
sur les organismes survivants ; cet effet serait lié à l'inhibition de
la synthèse de l'ARN ou à la formation d'un ARN anormal.
On aurait donc un effet double par la voie de la thymine et de l'uracile.
Une telle possibilité d'interférence avec le métabolisme des
acides nucléiques apparaissait pleine d'intérêt dans l'étude du déve­
loppement embryonnaire.
Récemment d'ailleurs, Karnofsky et coll. (196O) ont étudié
l'effet des fluoropyrimidines sur le développement des embryons
d'Echinoderme.
La fluorodésoxyuridine, notamment, appliquée après la
fécondation, provoque l'arrêt du développement au stade de la jeune
blastula.
Cet effet peut être complètement levé si on ajoute de la
thymine ou de la thymidine pendant les 6 heures qui suivent la fécon­
dation.
Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons utilisé
surtout la 5-fluorodésoxyuridine-
Dans quelques expériences, nous
avons étudié les effets du FU et de la FUR.
A l'inverse d'autres composés et analogues des métabolites nor­
maux, les fluorodérivés semblent pénétrer assez rapidement dans les
embryons de Batraciens ou être actifs à faible dose.
47
PARTIE EXPERIMENTALE
Les expériences ont été réalisées sur des embryons de Pleurodèles,
d'Axolotl et de Xénopes.
D'une façon générale, les embryons dégangués
ont été traités dans la solution de Holtfreter :
NaCl
3>5 gr
KCl
0,050
gr
CaCl2
0,100
gr
H^O
1 1
additionnée de l'analogue.
A différents temps, on a prélevé des embryons qui ont été fixés
au mélange Zenker/acide acétique ; les coupes ont été colorées au
mélange vert de méthyle-pyronine ou soumises à la réaction de Feulgen-
A. Les effets des fluoropyrimidines sur la segmentation
1.
PLÜORODESOXYURIDINE (FUDR)
a) Les effets de la FUDR
Quand on traite des embryons aux stades 1 à 8 blastomères, aux
concehtrations 2.10’^, 10“^, 5.10’^, 2.10"^, 10"^ jj
on observe
un blocage au stade blastula pour les 5 espèces étudiées.
Les blastulas bloquées présentent une distribution particulière
du pigment ; il est concentré au centre des cellules.
Au bout de
quelques heures de blocage, les cellules se dissocient (fig. 15, 14).
Pendant ce temps, on a l'impression que la taille des cellules augment'
48
Fig. 13 : témoins - jeunes gastrulas de Pleurodèles.
Fig. 14 : tlastulas bloquées obtenues en traitant des embryons depuis
le stade 2 blastomères par la FUDR à la concentration 10
M.
49
Observations cytologiques
Ex^éri e,n£e_s s_ur l.e_X£n_op_e ; '
Les embryons, au stade 2 blastomères, ont été placés dans de la
solution de Holtfreter additionnée de PUDR à la concentration de
_3
10
M.
Des embryons ont été prélevés au cours du temps.
Le blocage
était apparent après. 6 h de traitement.
d'anomalies avant 4 h de traitement.
En coupe, on n^obeerve pas
A ce moment, on est frappé par
la fréquence des noyaux en prophase : des asters entourent des vésicu­
les chromatiques, ressemblant à des chromosomes en télophase.
Enfin,
au moment du blocage, on n'observe plus qu'une vésicule, assez pâle
et gonflée, entourée d'asters.
Les noyaux de l'entoblaste semblent
moins touchés (fig. 15)*
Fig. 15 ! coupe dans une blastula de Xénope traitée par la FUDR depuis
le stade 2 blastomères : les noyaux, pâles et gonflés, sont entou
rés d'asters.
Expériences sur le Fle.u^o^è]^e_:
Les mitoses paraissent également bloquées en prophase 5 dans ce
cas aussi, l'entoblaste semble moins affecté par le traitement.
A l'Unna, le cytoplasme reste très basophile ; les noyaux, pâles et
gonflés, sont généralement entourés d'asters ou d'une zone pyroninophile ; la chromatine se présente sous la forme de fibres très fines,
très pâles ; de temps à autre, on remarque une fibre plus épaisse.
50
Quelquefois, on note la présence de gouttelettes pyroninophiles dans
les noyaux.
Au Feulgen également, la' chromatine apparaît concentrée en filaments
irréguliers dispersés dans une vésicule fortement dilatée et souvent
entourée de pigment.
Fig. 16 : coupe dans une blastula bloquée de Pleurodèle :
aster accolé au noyau très pâle
et dilaté - coloration au vert
de méthyle-pyronine.
Fig. 17 î coupe dans une blastula
bloquée de Pleurodèle : mise en
évidence de la chromatine par la
réaction de Feulgen.
b) Expériences de réversibilité
1ère expérience (T°19-20'’)
Des embryons au stade 2 ont été traités, pendant 6 h, en présence
-5
de FUDR 10
M.
Ensuite, ils ont été reportés soit dans du Holtfreter,
soit dans du Holtfreter additionné de thymidine à la concentration
10
-2
M.
Le tableau 11 résume les conditions de cette expérience.
51
Tableau 11
:
1ère expérience de réversibilité
»
J
Stade
FUDR 10"^ M j
..
.
Holtfreter
«
«
J
Thym. 10'^ M
f
I 0
Stade 2
+ 6h
{
+ 21h
Blastula
+ 36h
Gastrula
jeune
■ Thym•
\
1
!
t
1
»
!
I Oh
t
I Oh
1
;26h
{2ôh (blocage)
j Oh
! 6h
j20h (blocage)
1
f
f
1
1
f
f
1
;45h
69h
Neurula
f
f
t
?
12.1 h
1
»
f
I
+
t
1
|21h
f
;50h
+ 45h
Gastrula
avancée
!
f
1
I Oh
{ 6h
+ 30h
j 6h
;45h
t
1
1
t
f
t
r
!
f
1
!
f
1
1
;20h
1
1
1
f
f
i
jP3-l
!F3-2
1
»
|f3-3
|f3-4
1
|f3-5
|f3-6
|P3-7
|f3-8
t
f
f
t
f
1
1i
1
1
1
1
|f3-9
1
|f3-12
|f3-ii
! 6h
!39h
j 6h
f
r
{39h (blocage)
JF3-14
1
f
f
t
Î69h
f
t
;F3-17
f
»
»
|63h
{F5-18
{
Oh
1 6h
;F3-i3
1
1
Les embryons reportés dans le Holtfreter ont ^ÿé bloqués au même
stade que ceux laissés dans la FDDR.
Par contre, en présence de
thymidine, les embryons ont étteint le stade gastrula ; mais ces
gastrulas ont dégénéré par la suite.
Sur coupes :
£n_lj_a_bsen_çe_d_e FIJ]DR_(F3-7 - fig- 20), le Feulgen est un peu plus
intense que dans les blastulas qui sont restées en présence de FUDR
(F3-6 - fig. 19).
Après 24 h de blocage (F3-13), la colorabilité au
Feulgen augmente.
Il semble que, à ce moment, l'activité mitotique
reprenne.
triques.
On observe, notamment, la présence de mitoses pluricen-
52a
Fig. 18 : F3-5 (cf. tableau 11) - Témoins : coupe dans une gastrula
de Pleurodèle - Feulgen
Fig. 19 : F3-6 - coupe dans une blastula bloquée
52b
Fig, 20 : F3-7 - morula traitée pendant 6 h par la FÜDR, puis reportée
dans la solution de Holtfreter pendant 20 h.
Fig. 21 : F3-8 - morula traitée pendant 6 h par la FUDR, puis incubée
en présence de thymidine.
Enjr^é_senc£ ^e_thymi^ine__ (F5-6. - fig. 21), le Peulgen est cepen­
dant moins intense que dans les témoins.
La taille des cellules du
pôle animal est intenuJdiaire entre celle des embryons témoins et
celle des oeufs traités à la FÜLR, déjà bloqués à ce moment.
Cependant, il y a encore quelques mitoses.
Au moment du blocage (F3-1
on trouve encore d'assez nombreuses mitoses | cependant de nombreux
noyaux évoluent vers la pycnose.
Après 24h de blocage (F3-10), on ob­
serve une mosaïque de cellules à noyaux pycnotiques entourées de quel­
ques noyaux d'aspect normal au Peulgen.
2ème expérience (T° 15-18°)
Après 6h de traitement à la PUDR 10”^ M, les embryons ont été
reportés dans les milieux suivants :
Holtfreter,
Holtfreter + thymidine 10
Holtfreter + uracile 10
_2
_2
M,
M.
Alors que les embryons placés en présence de FUDR ont été bloqués en
blastula moyenne, dans tous les autres milieux, le développement se
poursuit.
Cependant, on observe diverses anomalies dans la suite du
développement.
3ème expérience (T° 23°)
Après 6h de traitement, les embryons ont été repottés dans les
mêmes milieux que dans l'expérience^ précédentes^.
Dans aucun des
milieux, on n'a pu observer de réversibilité.
c^^Expériences de protection
Des Pleurodèles, au stade de 2 blastomères, ont été placés dans
les milieux suivants :
Holtfreter
Holtfreter + FUDR 10”^ M
Holtfreter + FUDR 10“^ M + thymidine 10”^ M
Holtfreter + FUDR 10
M + bromodésoxyuridine 10”
?
M.
24 heures après, on observe l’arrêt du développement des embryons
traités.
En présence de thymidine et de bromodésoxyuridine, le
54
blocage a lieu en blastula avancée, tandis que dans les embryons trai­
tés à la FUDR, les cellules sont nettement plus grandes.
Observations cytologiques
Fn coupe, les cellules des embryons traités simultanément soit
par la FUDR et la thymidine, ou la FUDR et la bromodésoxyuridine, sont
plus petites que celles des embryons traités à la FUDR seulement.
^UDR_+_t^mi^ine_: les mitoses sont très rares ; les noyaux, peu
gonflés, sont cependant assez pâles, tant à l'Unna qu'au Feulgen.
On trouve aussi des cellules quasi normales.
; dans cette série, les noyaux sont
plus colorables 5 on observe des variations de cellule à cellule :
certains noyaux sont pycnotiques, certains sont très bleus à l'Unna ;
les mitoses sont plus fréquentes.
Des stades 2 blastomères ont été incubés dans les milieux suivants ;
Holtfreter,
Holtfreter + FUDR 10~^ M,
Holtfreter + FUDR 10”^ M + thymidine 10“^ M,
Holtfreter + FUDR 10”^ M + uracile 0,5*10”^ M.
Les embryons placés en présence de thymidine sont protégés comme
précédemment.
En présence d'uracile, on n'observe aucune protection.
Dans une autre expérience, on a étudié l'effet de l'uridine à la con_2
centration 10
M, et l'effet simultané de l'uridine et de la thymi­
dine.
L'uridine ne semble pas avoir d'effet protecteur, même en
présence de thymidine.
2. LE FLUOROURACILE
Le fluorouracile, appliqué au stade 2 blastomères, aux concentra_4
tiens 10
M et 10
M, provoque un blocage du développement au stade
gastrula.
Ces gastrulas présentent une calotte animale à cellules
bloquées sur un entoblaste moins touché, semble-t-il, et qui exogastrule légèrement.
55
3. LA FLUOROÜRIDINE.
A la concentration 10
_3
M, l'effet est semblable à celui du
fluorouracile, mais légèrement plus tardif.
B. Les effets des fluoropyrimidines sur
la blastula et la gastrula de Pleurodèles.
1. LA FLÜORODESOXYÜRIDINE.
Lorsqu'on traite des blastulas et des gastrulas jeunes à la
FUBR (concentration 10
M), on obtient, au bout de 20 h environ, des
embryons complètement dissociés.
La gastrula semble un peu moins
sensible que la blastula.
En réalité, le blocage semble être assez rapide et intéresser
tout d'abord les cellules du pôle animal | l'invagination de la zone
marginale progresse dès lors assez difficilement.
Très souvent, on
assiste à une dissociation rapide ; quelquefois, on peut observer la
formation d'une exogastrula suivie de sa dissociation.
Lorsqu'on traite des embryons simultanément par la PUDR 10
M
-3
-2
et la thymidine 10
ou 10
M, on obtient, suivant les pontes et
les stades ; des embryons qui, apparemment, gastrulent normalement,
formant des "pseudoneurulas".
plaque médullaire.
Ces embryons ne forment jamais de
Mais les cellules neuroblastiques s'arrondissent
et se dissocient du reste de l'embryon.
Quelquefois, on observe la
formation d'exogastrulas ; la calotte animale est alors fortement
réduite ; dans certains embryons, elle disparaît presque complètement:
on a, dans ce cas, des embryons recouverts d'endoderme 5 il semble que
les cellules animales, pycnotiques ou en voie de dégénérescence,
56
soient enfouis à l'intérieur de l'endoderme.
Lorsque l'embryon se
cytolyse, on peut Toir les cellules animales surgir au pôle animal.
L'uridine et l'uracile ne semblent avoir aucun effet protecteur.
Si on traite les embryons pendant 3 h environ à la FUDR et qu'on
les reporte dans le milieu normal, ils dégénèrent tout comme ceux qui
sont restés en présence de l'analogue.
Examen cytologique
Déjà après 6 h de traitement à la FUDR 10
-3
M, il n'y a plus de
mitoses dans les embryons traités.
Les cellules de l'hémisphère animal,
en particulier, ont des noyaux
très pâles au Feulgen et légèrement gonflés.
Ces noyaux sont aussi
très pâles à l'IJnna (fig. 25) alors que, dans les témoins, les noyaux
se colorent d'un bleu très intense à ce stade (fig. 22).
Fig. 22 : coupe dans une gastrula témoin; coloration au vert
de méthyle-pyronine.
Fig. 23 s coupe dans une gastrula
traitée pendant 6h à la FUDR s les
mitoses sont bloquées, les noyaux
sont très pâles.
57
Après 24 heures de traitement, l'embryon n'est plus qu'une masse
amorphe de cellules rondes à gros noyau, rond, granuleux, plutôt pâle
au Feulgen.
Ces cellules sont assez pyroninophiles.
aucune mitose.
On ne trouve
De temps en temps, on aperçoit des noyaux d'aspect
normal dans l'entoblaste (fig. 24, 25)
Fig. 24 : coupe dans une gastrula traitée pendant 24 h à la FUDR
Fig. 25
: image agrandie.
58
Quand ce traitement a lieu en présence de thymidine, rappelons
qu'on obtient souvent une "pseudoneurula".
En coupe fig. 26.
on observe les 5 feuillets en place, mais dorsalement, les cellules du
neuroblaste sont en voie de dégénérescence.
Ce sont des cellules
rondes à gros noyaux comme les cellules décrites dans le cas précédent
Par endroits, on trouve quelques pycnoses dans les autres tissus.
Fig. 26 ; gastrula incubée pendant 24 h en présence de FUDR et de
thymidine : les cellules du neuroblaste présomptif sont en voie
èe dégénérescence.
2. LE FLUOROURACILE
A la concentration 10
M, ce dérivé est un peu moins toxique
que la FUDR 5 l'arrêt du développement est moins rapide.
Quelquefois,
on peut assister à la formation d'exogastrulas ressemblant aux embryon
protégés par la thymidine.
Plus fréquemment cependant, les embryons
prennent rapidement l'aspect des oeufs traités par la FUDR,
59
Lorsque les oeufs-sont traités par un mélange de FU et de thymi­
dine,
on observe presque toujours ,la formation de pseudoneurulas.
Au moment, où la plaque médullaire se dessine chez les témoins,
sa
dissociation commence chez les embryons traités.
Des blastulas ont été traitées dans les milieux suivants :
fluorouracile 10 ^ M
"
+ uracile 0,5.10“^ M
"
thymidine 10 ^ M
"
BUDR 0,3.10"^ M
pendant 2 h, 5^30 ou 22 h.
Après ce laps de temps,
les embryons ont
été reportés dans du Holtfreter.
Les embryons traités au fluorouracile uniquement se sont dissociés
et sont morts rapidement.
Les embryons traités pendant 2 h au fluorouracile + uracile, +
thymidine ou BUDR sont presque normaux,
surtout ceux qui ont été
protégés par l'addition d'uracile.
A partir de 5h30 de traitement,
on assiste à la formation
d'embryons (pseudoneurulas) qui, au moment de la neurulation, perdent
de nombreuses cellules, mais se développent cependant quelque peu
(fig. 27, 28).
Les coupes faites à travers ces embryons révèlent une certaine
désorganisation %
on note principalement l'absence de système nerveux.
La chorde est présente 5 les somites sont plus ou moins bien formés |
on note souvent la présence d'un ectoderme atypique.
Enfin, par-ci,
par-là, on observe des régions en voie de dégénérescence.
En conclusion,
en ce qui concerne le fluorouracile,
une certaine protection par 1'uracile,
de traitement.
on observe
surtout pour des temps courts
60
Fig. 27 ; embryons obtenus après traitement des gastrulas pendant 22 h
simultanément au fluorouracile et à la thymidine.
Fig. 28 ; coupe transversale au travers d'un tel embryon : on note
l'absence de système nerveux.
6l
3. LA FLUORQÏÏRIDIITE
Il semble que ce composé agisse différemment ou beaucoup plus
lentement que les deux précédents.
En effet,
les embryons sont normaux jusqu'à des stades neurula
plus ou moins avancés suivant la ponte ; ensuite, ils dégénèrent
brusquement.
C.
Incorporation de précurseurs marqués dans
des embryons traités à la FÜDR
Nous avons cru que l'étude de l'incorporation de précurseurs
radioactifs dans les embryons traités fournirait des données intéres­
santes.
En effet, après avoir observé les effets de la thymidine et
de la bromodésoxyuridine, nous nous sommes demandé si l'embryon, ou
son cortex, ne présenterait pas des propriétés nouvelles de perméabi­
lité en présence des fluorodérivés.
Nous avons donc réalisé deux expériences dans lesquelles nous
avons suivi l'incorporation de précurseurs radioactifs par autoradio­
graphie.
Malheureusement, aucune des deux expériences n'a donné de
résultats positifs.
Dans la première expérience, nous avons étudié l'incorporation
d'adénine-8-C14 et d'acide orotique-6-C14 dans des morulas prétraitées
pendant 6 h à la FUDR.
Dans la seconde expérience,
on a suivi l'incorporation de
thymidine-H3 (5.10“^ M) et d'adénine-8-C14 (2.10"'^ M) en présence de
FUDR 10
M et en présence de thymidine froide 10”
simultanément.
M et de FUDR 10”^M
62
Nous n'avons pu déceler d'incorporation dans aucun cas.
S'agit-il
d'une faible pénétrabilité des précurseurs ou de l'inhibition de leur
incorporation dans l'ADN ou l'ARN ?
On a plutôt l'impression qu'on se
trouve en présence d'une faible perméabilité.
On s'explique assez mal les raisons pour lesquelles les fluorodérivés jouiraient de.propriétés particulières de pénétration.
cependant que Heidelberger et ses coll.
semblables.
Notons
(1959) ont décrit des phénomène
Ils ont comparé la pénétration, dans les cellules d'ascite
des composés normaux et des composés fluorés et ils ont pu observer
une accumulation plus grande des dérivés fluorée.
Ces faits pourraient expliquer, par ailleurs, le faible effet de
protection par la thymidine et la bromodésoxyuridine.
Nous nous proposons de reprendre cette étude sur des cellules
dissociées afin de ne plus être limitée par des problèmes de perméa­
bilité .
DISCUSSION DES RESULTATS
On a vu
que lorsqu'on applique les analogues pendant la segmen­
tation, les premiers signes du blocage n'apparaissent qu'au stade
blastula.
Les mitoses sont bloquées en prophase et la chromatine
apparaît très réduite et concentrée dans les noyaux qui gonflent très
rapidement.
lets.
D'entoblaste paraît moins sensible que les autres feuil­
Un simple report dans du Holtfreter, après quelques mitoses en
présence de l'analogue, ne suffit pas toujours à lever l'inhibition.
Il est difficile pour le moment de décider si l'arrêt du dévelop­
pement est dû à la FUDR accumulée dans les cellules en quantité suffi­
sante pendant le temps de traitement ou s'il s'agit d'une lésion plus
précoce, qui se manifeste au stade blastula.
Notons toutefois que, après deiix jours de blocage, on observe une
reprise des mitoses, mais très rapidement suivie d'une dégénérescence.
63
Enfin, la thymidine et la hromodésoxyuridine protègent les
embryons, mais cette protection est peu efficace.
Cette inefficacité
est-elle due à la faible accumulation de ces substances dans l'embryon
ou au fait que des "voies métaboliques autres que celles de la synthèse
de l'ADN sont touchées en présence de la FUDR ?
Bien que nous n'ayons
observé aucun effet de l'ùracile et de l'uridine, il est impossible
pour le moment de répondre à cette question.
compte de l'effet protecteur,
Cependant, si l'on tient
si faible soit-il, de la thymidine et de
la hromodésoxyuridine, de l'inhibition de l'incorporation d'uridine-H3
dans l'ADN en présence de FUDR, on a l'impression qu'on se trouve en
présence d'une inhibition de la synthèse d'ADN semblable à celle dé­
crite pour les cellules tumorales et les bactéries.
Dès lors, il
faudrait conclure que l'enzyme de synthèse de l'acide thyraidylique est
actif au stade blastula et que son inhibition est létale pour l'embryon
à ce stade.
Nous ignorons évidemment si la synthèse de l'ADN est normale avant
le blocage.
En effet, nous n'avons aucune donnée sur cette synthèse
en présence de FUDR 5 on peut voir que les mitoses se poursuivent
normalement, en apparence tout au moins 5 en effet,
la réaction de
Feulgen est toujours très faible au cours des premiers stades.
Notons que Lindner (1959) a trouvé que les noyaux de cellules cancé­
reuses traitées au 5-FU contenaient deux fois moins d'ADN que ceux
des témoins.
En ce qui concerne le FU et la FUR, on a vu que le blocage est
plus tardif.
L'étude n'ayant pas été poussée plus loin, on ne sait
rien des particularités de ce blocage.
Aux stades blastula et gastrula apparaissent à nouveau des diffé­
rences dans le comportement des différentes régions de l'embryon en
présence de FUDR et de FU.
La faible sensibilité de 1 *entoblaste,
qui se manifeste déjà quand on traite les embryons au stade 2,
s'accen­
tue encore à la gastrulation.
Par ailleurs, le maximum de sensibilité réside dans la partie
dorsale, plus précisément dans le système nerveux présomptif.
64
En. présence de thymidine, cet effet se manifeste encore plus spectacu­
lairement : on se souvient que, alors que les autres territoires sem­
blent quasi normaux, la plaque médullaire est fortement lésée.
dégénérescence est-elle liée à une déficience de l'ADN,
Cette
simplement
ralentie dans les autres régions, ou à des anomalies dans la synthèse
de l'ARN qui devient très importante à ce moment dans les cellules
neurales ?
Nous l'ignorons, mais on peut noter que la lésion devient
très rapidement irréversible.
Il serait certainement intéressant de poursuivre l'étude des
effets de la FUR.
Rappelons que, appliquée aux stades blastula ou
gastrula, elle provoque une létalité brusque et tardive.
demander si, dans ce cas,
On peut se
l'effet ne porte pas principalement sur la
synthèse d'ARN.
Dans les autres cas, on a souvent l'impression que l'effet pri­
mordial porte sur l'arrêt des mitoses et que cet effet masque un peu
les autres anomalies.
C'est,
en somme,
ce que les auteurs décrivent
pour les cellules tumorales et les bactéries.
On possède dertains renseignements sur les anomalies du dévelop­
pement provoquées par d'autres analogues de pyrimidines et de purines.
Dès 1947, Brachet avait étudié l'effet de l'acide
barbiturique
sur des gastrulas de Grenouille.
Il est intéressant de noter que, dans ces expériences également,
la neurulation est sévèrement atteinte ; la morphogénèse de la tête esi
rudimentaire et l'induction neurale fait entièrement défaut dans la
moitié postérieure de l'embryon qui conserve un aspect gastruléen.
Le benzimidazole et ses dérivés ont fait l'objet de toute une
série d'études (Brachet 1952,
Bieber
1954, VVaddington et coll. 1955)*
et coll.
1952, Liedke et coll.
Suivant les modalités d'application
- stades, concentrations - on observe toute une gamme d'anomalies
:
inhibition de la gastrulation, de la neurulation, embryons microcé­
phales.
Dans toutes ces expériences,
les analogues semblent plutôt
interférer avec le métabolisme de l'ARN et le blocage semble indé­
pendant des mitoses.
Tout récemment, Billett et Brahma (i960) ont
65
étudié l'effet du benzimidazole sur la différenciation de fragments
d'ectoblaste.
Ils concluent de leurs expériences que les tissus en
voie de différenciation sont particulièrement sensibles au benzimida­
zole*
Enfin, il convient de signaler le travail de Grant (I96O) sur les
effets d'analogues de l'acide folique sur le développement des Batra­
ciens.
Après injection de ces substances dans l'oeuf, il observe un
blocage au stade blastula ; ces blastulas bloquées ressemblent quelque
peu à celles qu'on obtient après traitement à la FUDR.
Grant a effec­
tué des dosages d'acides nucléiques en présence d'aminoptérines et a
observé que la synthèse de l'ARN n'est pas affectée par le traitement,
tandis que celle de l'ADN s'arrête au moment du blocage.
Ces données
concordent, en quelque sorte, avec nos propres résultats sur l'effet
de la FUDR sur la segmentation.
Il est intéressant de noter que, dans ces cas, le blocage est plus
précoce que lorsqu'on se trouve en présence d'hybrides létaux ou
d'embryons obtenus par fécondation d'oeufs normaux à l'aide de sperma­
tozoïdes traités par une chloréthylamine.
L’effet sur la gastrula pourra aisément être étudié d'une manière
plus approfondie.
En effet, à ce stade, on pourrait effectuer des
estimations d'ARN et d'ADN dans les diverses conditions expérimentales3
FU, FUR, FUDR, FU + thymidine, etc.
On sait que les synthèses d'ARN
deviennent très importantes à ce stade,
de l'embryon.
surtout dans la partie dorsale
Les noyaux de la plaque médullaire, notamment, devien­
nent très pyroninopMles (Brachet 1952).
L'utilisation de FU-CI4 pourra, sans aucun doute,
données intéressantes
fournir des
; ce marqueur, appliqué à différents stades du
développement ou à des explantats dans des conditions expérimentales
variées, révélera peut-être les fractions d'ARN actives dans les dif­
férents cas.
66
Effet de la bromodésoxyuridine
On sait que Dunn et Smith (1954). ont montré que le 5-bromouracilc
(Bü) pouvait quantitativement remplacer la thymine dans l'ADN du
phage T2.
Plus tard, Litman et Pardee (1956) ont montré que le Bü est
mutagène pour ces phages.
Enfin,
le BU s'incorpore également dans les
bactéries déficientes en thymine (Zamenhiof et Gruboff 1954» Dunn et
Smith 1957) et on peut augmenter l'incorporation de Bü dans l'ADN en
créant une déficience artificielle en thymine à l'aide de sulfamides,
d'aminoptérines ou de FUDR.
L'effet mutagène dépendrait de l’impor­
tance de l'incorporation (Zamenhof 1959)*
Freese (1959)»
D'après Meselson, cité'par
la présence de BU dans l'ADN donnerait lieu à des
appariements incorrects qui justifieraient l'effet mutagène.
Il serait évidemment tentant d'introduire une base anormale dans
l'ADN des embryons.
Cependant, appliquée à des embryons normaux, aux
concentrations 5•10 ^ à 5•10 ^ M,
la bromodésoxyuridine s'est avérée
sans effet.
Appliquée en présence de FUDR,
protecteur.
ce composé a manifesté un effet
Toutefois, dans nos conditions expérimentales, nous
n'observons pas de différences notables entre la thymidine et la
bromodésoxyuridine à cet égard.
67
DISCUSSION
GENERALE
En ce qui concerne le métabolisme de l'ADN pendant la segmenta­
tion, on observe un marquage avec tous les précurseurs étudiés#
L'incorporation est plus rapide à partir des précurseurs plus complexor
(nucléosides), comme c'est le cas dans les cellules en voie de multi­
plication rapide (Skold I96O).
L'incorporation des nucléosides, l'effet de la désoxyadénosine,
font penser que les systèmes de synthèse de l'ADN sont actifs dès le
début du développement.
L'arrêt du développement au stade blastula provoqué par la FÜDR
semble lié au blocage de la synthèse de l'ADN.
Ce résultat fait
penser que l'oeuf contient suffisamment de thymine utilisable,
sous
quelque forme que ce soit, jusqu'à ce stade.
Il serait cependant intéressant de vérifier si des cellules
dissociées ne sont pas sensibles plus précocement.
La sensibilité à la FÜDR augmente, en quelque sorte, en gastrula­
tion, au moment où les mitoses se ralentissent et où l'utilisation
d'uridine devient partagée entre l'ADN et l'ARN.
En effet, on sait
que, pendant la segmentation, le marquage de l'ARN est possible à
partir de ^^C02 et que, dans ce cas, la radioactivité est concentrée
dans les noyaux, tandis que l'activité du cytoplasme est très faible
(Brachet et Ledoux 1955)*
Jusqu'à la gastrula, les autres précurseurs étudiés dans ce
travail sont liés à une fraction labile dont la nature reste à préciser.
Enfin, à partir de la gastrulation, l'ARN se marque dans les noyaux
et le cytoplasme par l'uridine.
A ce moment aussi, le marquage nucléaire au CO^ s'intensifie et
se différencie.
C'est le moment où King et Briggs (1955) mettent en évidence, par
68
dos expériences de transplantation de noyaux, des changements irréver­
sibles dans ces derniers.
Si à ce moment, l'ARN se marque intensément,
nucléaire augmente et les nucléoles apparaissent,
si la basophilie
les structures
nucléaires et cytoplasmiques se modifient simultanément comme le
montrent les observations au microscope électronique de Karasaki
(1959, a, b).
Cet auteur a observé qu'à partir de la gastrula, on peut voir
dans les noyaux des particules, plus denses que celles formant le
nucléoplasme,
se concentrer et former le nucléole»
Par ailleurs, ces
particules ressemblent aux micro-particules qu'on trouve dans le cyto­
plasme.
Enfin, au moment où apparaît le nucléole,
la membrane externe
du noyau se garnit de micro-particules.
En ce qui concerne le cytoplasme, on observe au cours du dévelop­
pement une complication dans la structure des mitochondries.
Jusqu'à
la gastrula, Karasaki observe la présence de micro-particules assimi­
lables aux grains de Palade et des vésicules cytoplasmiques, mais il
n'observe pas de réticulum endoplasmique.
Les vésicules cytoplasmiques
sont constituées par une membrane unique et très fine et, à ce stade,
elle ne porte pas de micro-particules à sa surface.
Enfin, au cours du développement, le nombre de vésicules et de
particules augmente et les vésicules se garnissent de particules.
On peut se demander quelle est l'importance de l'apparition de
ces particules dans le noyau et quel est leur rôle dans les synthèses
qui ont lieu à ce moment.
Il serait aussi intéressant de voir s'il y a une relation entre
ces particules et celles du>cytoplasme.
Il convient aussi d'attacher de l'importance au parallélisme qui
existe entre les gradients morphogénétiques, les gradients ribonucléiques et les gradients d'incorporation (COg notamment).
ribonucléiques,
Ces gradients
comme le fait remarques Brachet (i960), coïncident sans
doute avec des gradients de ribosomes.
Or,
si les ribosomes jouent un
rôle dans la synthèse des protéines, ils semblent aussi jouer un rôle
important dans la différenciation embryonnaire.
69
En effet, des observations récentes de Perlmann et de Vincentiis
(1961) signalent la présence d'antigène cristallinien lié à la fractio’’
microsomiale.
On peut détecter ces antigènes, liés aux microsomes,
plus précocement que les antigènes solubles qui apparaissent au
moment de la différenciation du cristallin.
D'après ces auteurs,
l'antigène ribosomique constituerait un précurseur de l'antigène solu­
ble.
Ainsi, l'embryon contiendrait un certain nombre de ribosomes
bloqués ou inactivés par leur propre produit.
Pendant la formation
du cristallin, les substances inductrices libéreraient la protéine de
la particule et, en même temps, activeraient le "template" ribosomial,
qui se mettrait à produire de plus en plus de protéines.
De nombreux points retiennent donc l'attention et des expériences
nouvelles tendront à répondre aux questions qui se posent.
Quelle est la nature'de la fraction labile qui se marque au cours
de la segmentation ?
On essayera de préciser quelles sont les structures auxquelles
appartient l'AEN nucléaire marqué dans les différentes conditions et
aux différents stades.
Enfin, des techniques plus fines de microscopie et d'autoradio­
graphie, d'immunologie, permettront peut-être d'étudier les ribosomes
d'une manière plus approfondie et de mettre en évidence des échanges
noyau-cytoplasme.
70
BIBLIOGRAPHIE
1. Astrachan L,
et Volkin E,
(1958)
2. Barth L.G. et Barth-Jaoger L.
3» Bieber S.
(1959)
: BiocMm.Bioph. Acta
(1959)
s J.Embryol.Exp.Morph.
et Tencer R.
6. Billet F. et Brahma S.K.
(i960)
(1952)
: Proc«Soc.Exp.
: Exp.Cell Res. 2^, 279*
(I960): J.Eâabryol.Exp.Morph. 8_, 396.
7. Brachet J.
(1956)
: Bull.Soc.Chim.Biol.
8. Brachet J.
(1941 )
s Arch.Biol.
9. Brachet J.
J_8, 305.
207.
(1947) ’• Embryologie chimique, Desoer, Liège.
10. Brachet J.
(1952) s Le rôle des acides nucléiques dans la vie de la
cellule et de l'embryon, Masson, Paris.
11. Brachet J.
(1954)
î Arch.Biol.
12. Brachet J.
(1957)
s Biochemical Cytology, AcademiePress.
13. Brachet J.
(I96O)
; The Biochemistry of Development,
1.
14. Brachet J. et Ficq A. (1956) : Arch.Biol.
15. Brachet J.et Ledoux L. (1955)
16. Brenner S., Jacob
17» Burgos
210,
s Exp.Cell Res. J_6, 202.
4« Bieber S., Nigrelli R.F. et Hitchings G.H.
Biol.Med. dO_j 430.
5» Bieliavsky N.
544*
M.H,
(1955)
18. Caspersson T.
19* Clayton R.M,
(I96I)
suppl.
27»
: Nature 190. 576.
: Exp. Cell Res. _2., 360.
(194I)
(1953)
20. Cohen S. (1954)
431.
s Exp.Cell Res.
F. et Meselson M.
Pergamon Press.
: Naturwissenschaften 2^, 33*
: J. Embr. Exp. Morph. _1_, 25*
: J.Biol.Chem. 2rt_, 337*
21. Cohen S.S., Flaks J.S., Barner H.D., Loeb M.R. et Lichtenstein J.
(1958) : Proc.Nat.Acad.Sci.Wash.
IOO4.
22. Cooper R.S.
(1950)
23. Curtis A.S.G,
: J.Exp.Zool.
(196O)
114. 403.
: J, Embr .Exp. Morph. 8_,
I63.
24. Danneberg P.B.', Montag B.J. et Heidelberger C.
il, 529.
(1958)
25. Doniach L. et Pelc S.R.
(1950)
; Brit.J.Radiol. 21,
26. Dunn D.B. et Smith J.D.
(1954)
: Nature JJi, 305.
; Cancer Res.
I89.
71
27» Diuin D.B. et Smith J.D.
28. Durand M,
(I96O)
(1957)
: Biochem.J. 6j[^, 494-
; Thèse de doctorat, Paris.
29. Eakin R.M., Kutsky P.B. et Berg W.E.
Med. 2i, 502.
50. Ebert J.D.
(1951)
(1955) î In "Aspects cf Synthesis and Order in Growth",
p. 69 - Princeton Univ. Press.
31. Eidinoff M.L., Knoll J.E., Klein D. (1957)
11,
: Exp.Cell Res. H, 249*
33» Picq A.
(1954)
! Experientia J_0, 20.
34» Picq A.
(1955)
! Arch.Biol. §1,
35* Pinamore P.J.
39* Grant Ph.
509»
et Thomas D.J., Grouse G.T. et Lloyd B.
Arch.Bioch.Bioph.
10.
36. Plickinger R.A.
(1954)
(1959)
36. Priedberg P.
: Arch.Bioch.Bioph.
274.
32. England M.C. et Mayer D.T. (1957)
37* Preese E.
î Proc.Soc.Exp.Biol.
J Exp«Cell Res. 6_,
: J.Mol.Biol. J_,
et Eakin R.M.
(1949)
17*
s J.Exp.Zool.
: J.Cell.Comp.Physiol.
227.
40. Grant Ph. (I958b)
: J.Cell.Comp.Physiol.
249.
s Developmental Biol.
42. Gregg J.R. et Ljî^vtrup S. (1955)
43* Gregg J.R. et L^vtrup 3.
(i960)
44. Hall B.D. et Spiegelman S.
î
;
172.
(I958a)
41. Grant Ph. (I96O)
(196O)
110, 33*
197*
Biol.Bull.
108, 29*
: Exp.Cell Res. H, 621.
(1961)
: Proc.Nat.Acad.Sci.Wash.^,
45* Harbers E., Chaudhuri N.K., Heidelberger C.
234. 1255-
46. Harding C.V., Harding D. et Bamberger L.V.
suppl.
101.
(1959)
(1955)
137
s J.Biol.Chem.
! Exp.Cell Res.
47. Heidelberger G., Chaudhuri N.K., Danneberg P., Mocren D.,
Greisbach L., Duschinsky R., Schnitzer R.J.,
Pleven E. et Scheiner J. (1957) : Nature 179. 66
48. Heidelberger C., Griesbach L., Cruz 0., Schnitzer R.J. et
Grunberg E.
49. Haff-J;^rgensen E.
(1954)
(1958)
s Proc.Soc.Exp.Biol.Med.£7., 470
s Recent development in Cell Physiology.
50. Hoff-j/rgensen E. et Zeuthen E. (1952)
; Nature I69, 245.
51. Holtfreter J.
(1943)
s J.Exp.Zool.
26l .
52. Holtfreter J.
(1944)
î J.Exp.Zool. 21,
171.
53* Holtfreter J.
(1947)
! J.Exp.Zool.
IO6,
197.
72
54» Immers J.
(1957)
s Exp.Cell Res. _12_,
145«
55* Karasaki S.
(1959a)
: Embryologia
247»
56. Karasaki S.
(1959b)
s Embryologia
273*
(196O)
58. Karnofsky D.A. et Basch R.S.
59* Keck K.
(i960)
61. Klenow H.
56.
; Bioch.Bioph.Res.Com.
60. King T.J. et Briggs R.
t Proc.Nat.Acad.Soi.Wash.
(1955)
s Biochim.Biophys.Acta
(1959)
6l
s J.Biophys.Bioch.Cytol.
321.
412.
62. Kornberg A. (1957)
: The Chemical Basis of Heredity, John Hopkins
Press, Baltimore, p. 579»
63. Krause M. et Plaut W.
(i960)
64. Kuriki Y. et Okazaki R.
65. Kutsky Ph.
(1950)
: Nature 188, 511*
(1959)
: Embryologia
: J.Exp.Zool.
115. 429»
66. Liedke K.B., Engelman M. et Graff S.
67. Lindner A.
68. Lison L.
(1959)
(1953)
: Cancer Res.
1_2_,
(1954)
î J.Exp.Zool. 127. 201
I89.
: Histochimie et Cytochimie animales, 29 Gauthier-Villars, Paris.
69. Litman R.M. et Pardee A.B. (1956)
70. L^vtrup
337»
S. (1959)
I4I, 545*
: J.Exp.Zool.
(I96O)
: Nature 178, 529»
71. Maley G.P. et
Maley P.
; J.Biol.Chem. 235.2964.
72. Marshak
A. et
Marshak C.
(1953) • Exp.Cell Res.
288.
73. Marshak
A. et
Marshak C.
(1954) : Biochim.Biophys.
Acta 1_^,
74. Moore B.C.
(1957)
s J.Morph. _10J_, 227.
75. Moore B.C.
(1959)
: Anat.Rec.
76. Morris R. et Pischer S.A.
584*
134. 6IO.
(196O)
77» Overgaard-Hansen K. et Klenow H.
: Biochim.Biophys. Acta
(I96I)
183.
: Proc.Nat.Acad.Sci.Wash.
il» 5.
78!. Pasteels J.
(1953)
: J.Embryol.Exp.Morph. J_, 8.
79* Perlmann P.
(1953)
s Exp.Cell Res.
80. Perlmann P. et Gustafson R.
(1948)
81. Perlmann P. et de Vincentiis M.
82. Prus«ff W.H.
83. Reichard P.
(1958)
(1959)
394»
: Experientia
(I96I)
481.
5 Exp.Cell Res.
6l2,
: J.Biol.Chem. 231. 873.
.' J.Biol.Chem. 234.
1244.
84. Reichard P., Canellakis Z.N. et Canellakis E.S.
Biophys. Acta
85. Rose I.A. et Schweigert R.S.
(196O)
: Biochim.
558.
(1953)
î
J.Biol.Chem. 202, 635.
75
86. Sirlin J.L.
(1955)
s Experientia _1J_,
87. Sirlin J.L.
(1959)
sExp.Cell Res. 18, 598.
88. Skold 0.
(i960)
90:. Spiegel M.
91. Sze L.C.
: Biochim.Bioph. Acta H,
(I96O)
(1953)
Biol.Bull.
: J.Exp.Zool.
92. Tiedemann H. et Tiedemann H.
93« Volkin E.
112.
et Astrachan L.
118, 451.
122, 577.
(1954)
(1956)
: Naturwiss.
: Virology
94* Waddington C.H., Feldman M. et Ferry M.
95* Zamenhof S.
(1959)
(1956)
(1955)
s Exp.Cell Res. 1,36
s Nature 174. 306.
: Roux” Arch.Entw.Mech.
535.
149»
î Ann.N.Y.Acad.Sci. H, 784.
96. Zamenhof S. et Gruboff G. (1954)
97. Zeller G.
1.
148. 511.
Thèse annexe :
II existe chez les Bactéries des gènes régulateurs de la
synthèse des prott'lnes