Question 1 (temps conseillé 1 heure) Chez les eucaryotes, les gènes des ARNt son présents en de nombreuses copies dispersées dans le génome. Exposez précisément les différentes étapes qui vont conduire à partir de la transcription d'un tel gène à la synthèse d'un ARNt chargé fonctionnel pour la traduction. Réponse : Chez les eucaryotes les gènes codant les ARNt sont monocistroniques (ou bien chaque gène possède son propre promoteur). Leur transcription est réalisée par l'ARN polymérase III (ou bien se sont des gènes de classe III). Ces gènes se caractérisent par un promoteur interne (par rapport au site d'initiation de la transcription) = deux sites de reconnaissance (sites A et B) présents dans la région transcrite du gène. Le recrutement de l'ARN polIII nécessite des facteurs particuliers. Il y a tout d'abord reconnaissance des sites internes A et B par TFIIIc qui joue le rôle de facteur d'assemblage. Il y a ensuite recrutement de TFIIIB (complexe protéique contenant entre autre la TBP) = facteur de positionnement qui va recruter et positionner correctement l'ARN polIII. Le transcrit primaire qui est produit n'est pas fonctionnel et va subir un ensemble de modifications regroupées sous le nom de maturation. L'extrémité 5' de l'ARNt va être définie par une coupure du transcrit primaire par l'endoribonucléase P tandis que l'extrémité 3' va être produite suite à l'intervention de plusieurs ribonucléases dont la Rnase Z. La séquence CCA est ensuite ajoutée à l'extrémité 3' de l'ARN par l'ARNt nucléotidyl transférase. (C'est au niveau de l'adenosine de cette séquence CCA que sera chargé ultérieurement l'acide aminé). Certains gènes codant pour des ARNt possèdent un intron de petite taille. Cet intron est éliminé par un processus d'épissage qui consiste en un clivage enzymatique de l'intron suivi d'une ligature des deux extrémités de l'ARNt par une ARN ligase (le processus est donc différent de celui décrit pour les ARN pré-messager qui est basé sur deux réactions successives de transéstérifications). En plus de cette maturation par clivage l'ARNt va subir des modifications covalentes de certains nucléotides. Ces modifications sont catalysés par des enzymes spécifiques qui modifient ou additionnent des résidus aux bases présentes dans l'ARNt. Parmi les modifications les plus fréquentes on peut donner : l'isomérisation de l'uridine en pseudouridine : l'uracile est liée au sucre par le carbone C5 au lieu de l'azote N1. la réduction de l'uridine en dihydrouridine : il y a perte de la double liaison présente entre le C5 et le C6 de l'uracile. la désamination de l'adenine en hypoxanthine (ou adenosine en inosine) : remplacement du groupement NH2 présent en C6 de l'adénine par un groupement céto. Parallèlement à ces modifications chimiques l'ARNt va adopter une structure secondaire dite en feuille de trèfle et une structure III dite en L renversé. La structure secondaire en feuille de trèfle comporte quatre structures caractéristiques : - la tige acceptrice qui est formée par l'association de l'extrémité 5' et 3' de l'ARNt. La séquence CCA présente à l'extrémité 3' de l'ARNt dépasse de cette tige. - la boucle pseudouridine qui se caractérise par la présence de pseudouridine. - la boucle D qui se carectérise par la présence de dihydrouridine. - la boucle anticodon qui contient l'anticodon élément composé de trois nucléotides complémentaire du codon présent sur l'ARNm. Lorsque l'ARNt a adopté la structure en L inversé on retrouve à une extrémité le site de fixation de l'acide aminé et à l'autre extrémité l'anticodon. Pour pouvoir être utilisé lors de la traduction l'ARNt doit être chargé avec un acide aminé. Le chargement d'un acide aminé consiste à l'établissement d'une liaison acyl entre le groupement COOH de l'acide aminé et la fonction 2' ou 3' de l'adénosine à l'extrémité 3' de la tige acceptrice. L'attachement de l'acide aminé à l'ARNt est catalysé par une aminoacyl ARNt synthétase qui reconnaît à la fois l'acide aminé et l'ARNt. Il existe une enzyme pour chaque acide aminé (donc 20 aminoacyl ARNt synthétase différentes). La reconnaissance de l'ARNt se fait essentiellement au niveau de la boucle anticodon et de la tige acceptrice. La sélection du bon acide aminé repose dans un premier temps sur une reconnaissance stérique et chimique de l'acide aminé par le site catalytique. Il existe un mécanisme de correction de la sélection du bon acide aminé qui est basé sur la vérification du produit d'adenylylation par un site catalytique spécifique appelée poche d'édition. Si l'AA-AMP peut entrer dans la poche d'édition celui ci-est hydrolysé et la réaction s'arrête (par contre si c'est le bon AA qui a été sélectionné l'AA-AMP ne peut pas entrer dans la poche d'édition et la réaction continue) L'attachement de l'acide aminé à l'ARNt se fait en deux étapes : - Dans une première étape la fonction COOH de l'acide aminé réagit avec le phosphate alpha de l'ATP pour donner un amino acyl AMP (acide aminé adénylé) Cette étape est appelée l'adénylylation. AA + ATP --> AA-AMP + PPi - Dans une deuxième étape l'acide aminé adénylé réagit avec la fonction 3' OH de l'adénosine à l'extrémité 3' de l'ARNt pour donner un aminoacylARNt et de l'AMP. AA-AMP + ARNt --> AA-ARNt + AMP Question 2 (temps conseillé 1 heure) La protéine alpha est codée par un gène qui ne contient pas d’intron. Ce gène semble impliqué dans des déficiences immunitaires héréditaires. Pour déterminer l’origine de ces déficiences, des échantillons sanguins d’individus malades et sains sont examinés pour y détecter le gène alpha et son niveau d’expression. La figure 1A représente un Southern-blot obtenu en digérant l’ADN génomique par l’enzyme SnaBI (site = 5’-TACGTA-3’), puis en hybridant l’ADN transféré par une sonde radiomarquée spécifique du gène alpha (= ADN complémentaire de alpha). Les individus 1 et 2 sont normaux d’un point de vue immunitaire ; les individus 3, 4 et 5 présentent des déficiences immunitaires. Question 1 : D’après la figure 1A, pouvez-vous dire quels sont les individus homozygotes pour le gène alpha ? Réponse : Les individus 1, 3, 4 & 5 sont homozygotes (et donc l’individu 2 est hétérozygote) La figure 1B représente un Northern-blot et la figure 1C correspond à un Western-blot. Les bandes détectées sont spécifiques au gène alpha. Question 2 : Quelle molécule est détectée dans un Northern, et dans un Western ? Comment dans ces techniques, peut-on spécifiquement reconnaitre le produit d’un gène particulier ? Réponse : Northern => détection des ARN. Nécessite une sonde d’acides nucléiques pouvant s’hybrider (séquences complémentaires) avec l’ARNm. Western => détection des protéines. Nécessite un anticorps spécifique de la protéine cible. Question 3 : A votre avis, quelles sont les causes des déficiences immunitaires des individus 4 et 5 ? (le cas de l’individu 3 sera traité ultérieurement dans la question 6) Décrivez le type de mutation génétique qui pourrait expliquer les profils obtenus dans la figure 1. Réponse : Les échantillons des individus 4 & 5 présentent un profil de Southern et de Northern strictement identique à celui de l’individu 1 qui est sain. Par contre, des différences sont visibles au niveau du Western, ce qui laisse présager que les protéines synthétisées ne sont pas de type sauvage => sans doute synthèse de protéines mutantes non fonctionnelles. Type de mutation envisagé : La première phrase de l’énoncé permet d’exclure les cas d’épissage alternatif. Comme les profils de Southern et de Northern sont identiques, ont peut également écarter les hypothèses de grandes délétions, insertion, translocation. Reste les cas de mutations ponctuelles ou de micro-délétion/-insertion qui modifie le cadre de lecture. Individu 4 = protéine plus grande, c’est sans doute une mutation qui supprime le codon stop => traduction continue jusqu’au prochain => extension C-terminale Individu 5 = protéine plus petite, c’est sans doute une mutation qui créé un nouveau codon stop => traduction s’arrête prématurément => protéine plus courte coté Cterminal. L’hypothèse d’une insertion ou d’une délétion de quelques nucléotides qui décale le cadre de lecture (=> codons stop fréquents si on est hors cadre de lecture ouvert), est naturellement acceptée Un fragment d’ADN génomique de 4,5 Kb, contenant l’intégralité du gène alpha est cloné et inséré dans le site EcoR I du plasmide pX (figure 2A). Le clonage a été réalisé pour le gène alpha des individus 1 et 3. Afin d’expliquer les résultats du Southern, le plasmide recombinant est digéré par plusieurs enzymes de restriction. Le résultat de ces diverses digestions est présenté dans le tableau de la figure 2B. Question 4 : Etablissez la carte de restriction du gène alpha de l’individu 1 et celle du gène alpha de l’individu 3. En quoi ces résultats peuvent expliquer les résultats du Southern de la figure 1A ? Réponse : Carte de restriction de l’individu 1 (pour l’individu 3, la carte est strictement identique à l’exception du site SnaB I qui est absent. L’absence du site SnaB I dans le gène X de l’individu 3 explique la différence au niveau des Southern car c’est cette enzyme qui a été utilisée pour digérer l’ADN génomique. L’absence de ce site implique que l’enzyme n’a pas pu couper à ce niveau mais qu’elle a dû couper plus loin au niveau du site suivant, générant ainsi un plus grand fragment. Le plus petit fragment EcoR I – Hind III du gène alpha est sous-cloné et séquencé par la méthode des didésoxynucléotides. Une partie de l’autoradiogramme du gel de séquençage est présenté sur la figure 3. Question 5 : Déduisez la séquence nucléotidique du gène alpha des individus 1 et 3 (chaîne nucléotidique d’ADN synthétisée à partir de l’amorce). Orientez correctement ces séquences en marquez les extrémités 5’ et 3’. Indiquez également de quel coté se trouve l’amorce qui a servit au séquençage. Réponse : Individu 1 = 5’-amorce-TGCTTACGTATAAAGTACAT-3’ Individu 3 = 5’-amorce-TGCTTACGTGTACAT-3’ La localisation du site d’initiation de la transcription du gène alpha, a permit de déterminer que la mutation observée pour l’individu 3 se situe à 30 paires de bases en amont (coté 5’) de ce site. Question 6 : Quel modèle pouvez-vous proposer pour expliquer les conséquences de cette mutation ? Ce modèle devra prendre en compte les résultats obtenus dans la figure 1 pour les individus 2 et 3. Réponse : La mutation observée pour l’individu 3 se situe à 30 paires de bases en amont du site d’initiation, elle est donc située au niveau du promoteur du gène X. On a : individu 1 = TGCTTACGTATAAAGTACAT individu 3 = TGCTTACGT-----GTACAT Pour l’individu 1, le site SnaB I est souligné et la TATA-box est en rouge. Pour l’individu 3, une micro-délétion à supprimer le site SnaB I ainsi que la TATA-box. L’individu 3 a donc un promoteur qui ne possède plus de TATA-box fonctionnelle. De ce fait il ne peut plus être reconnu par le TFIID (ou TBP), bloquant ainsi la première étape de la reconnaissance du promoteur par l’ARN polymérase II. On n’a aucune transcription au niveau de ce gène => visible sur le Northern de la figure 1B, où aucun ARNm n’est détecté. L’individu 2 est hétérozygote. Un allèle est normal et l’autre est porteur de la délétion supprimant la TATA-box. Donc seul un allèle sur les 2 permet une expression génétique normale. Ce qui explique pourquoi les intensités des bandes sont plus faibles en Northern et en Western (on a 2 fois moins d’ARNm et de protéines que pour un individu sain homozygote). Néanmoins, cette plus faible production de protéine (fonctionnelle) est suffisante pour donner un phénotype sain.