Les vecteurs amplicons dérivés du virus HSV1
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revue Virologie 2007, 11 (5) : 339-50 Les vecteurs amplicons dérivés du virus HSV1 : un système souple et puissant pour le transfert de gènes Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. J. Thomas D. Cuchet C. Potel A.L. Epstein Université Lyon 1, 69003 Lyon, CNRS, UMR5534, Centre de génétique moléculaire et cellulaire, 69622 Villeurbanne <[email protected]> Résumé. Les amplicons sont des vecteurs défectifs et non intégratifs dérivés du virus herpes simplex de type 1 (HSV1). Leur génome ne contient aucun gène viral, ce qui leur confère une totale innocuité pour les cellules infectées et les animaux inoculés. De plus, ils sont capables de véhiculer jusqu’à 150 kpb d’ADN exogène, ce qui les classe parmi les vecteurs viraux les plus puissants et les plus prometteurs pour le transfert de gènes. Cette revue illustre quelques-unes des nombreuses applications utilisant les amplicons, ainsi que les questions qui restent à résoudre pour obtenir une expression stable et physiologique du transgène. Mots clés : HSV1, amplicon, thérapie du cancer, thérapie génique, applications fondamentales Abstract. Amplicons are non-integrative defective herpes simplex type 1 (HSV1) derived vectors. Their genomes are entirely free of viral genes, making these vectors non toxic for infected cells and non pathogenic for inoculated animals. In addition, amplicon vectors possess the unique property of delivering up to 150 kbp of foreign DNA. These characteristics make amplicon vectors one of the most powerful and promising viral vectors for gene transfer. This review illustrates several interesting applications using amplicon vectors, as well as problems that need to be resolved in order to obtain stable and physiological transgene expression. doi: 10.1684/vir.2007.0115 Key words: HSV1, amplicon, cancer therapy, gene therapy, fundamental applications Au cours de ces vingt dernières années, l’amélioration des méthodes de transfert de gènes et la compréhension des facteurs contrôlant leur expression dans les cellules ou organismes mammifères ont été, et restent, des objectifs majeurs de la biologie cellulaire et moléculaire. Comme les virus possèdent naturellement les éléments moléculaires permettant le transfert de gènes et leur expression efficace dans la majorité des cellules, les vecteurs viraux demeurent les outils les plus intéressants. Cette revue est plus particulièrement consacrée aux vecteurs amplicon dérivés du virus herpes simplex de type 1 (HSV1). Ces vecteurs, qui sont défectifs, non intégratifs et dépendants de virus auxiliaires, Tirés à part : A.L. Epstein Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 s’inscrivent parmi les vecteurs viraux les plus puissants, les plus souples et les plus prometteurs pour le transfert de gènes. D’un point de vue structural et immunologique, les amplicons [1] sont identiques au virus HSV1 sauvage et, par conséquent, possèdent le même large spectre d’hôtes et de tissus. Les particules d’HSV1 sont composées d’une quarantaine de protéines structurales qui sont délivrées dans les cellules lors de l’infection. En l’absence de néosynthèse de protéines virales, ces dernières disparaissent assez rapidement après l’infection, permettant à la cellule de retrouver ses fonctions normales. La différence majeure entre un vecteur amplicon et le HSV1 réside dans la substitution du génome d’HSV1, au sein de la particule virale, par un concatémère d’ADN plasmidique, qui forme ainsi le 339 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue génome du vecteur amplicon. Le génome amplicon dérive d’un plasmide, appelé plasmide amplicon. Ce dernier (figure 1) correspond à un plasmide standard d’Escherichia coli qui contient, en plus des séquences transgéniques d’intérêt, une origine de réplication virale (OriS) et un signal de clivage et d’encapsidation (a) d’HSV1. Un des avantages pour le transfert de gènes est donc l’absence de gènes viraux dans le génome amplicon, ce qui confère à ces derniers une totale innocuité pour les cellules infectées et les animaux inoculés. De plus, cette absence de gènes viraux réduit drastiquement le risque de réactivation, complémentation ou recombinaison avec des génomes latents de HSV1 sauvages. La flexibilité des amplicons est en partie due au fait que, lors de leur production, leur génome se réplique, comme le génome d’HSV1, selon un mécanisme de cercle roulant, générant de longs concatémères composés de répétitions en tandem du plasmide amplicon [2] (figure 2). Les particules infectieuses d’HSV1 empaquettent toujours 150 kpb d’ADN, ce qui correspond à la taille du génome viral. Au niveau du génome amplicon, cela se traduit par un nombre variable de répétitions du plasmide, en fonction de la taille initiale de ce plasmide [3]. Par exemple, un plasmide amplicon de 5 kpb sera répété environ 30 fois sous la forme génome, alors qu’un plasmide amplicon comportant un locus génomique de 150 kpb ne sera présent qu’en une seule copie. C’est le deuxième avantage résultant de l’absence de gènes viraux dans le plasmide amplicon, qui laisse ainsi une place disponible pour l’insertion de très grands fragments d’ADN, allant jusqu’à la taille maximale de 150 kpb. Cette dernière propriété apporte, sans conteste, une spécificité particulière aux amplicons. En effet, aucun autre système de vecteur viral n’est aujourd’hui capable de délivrer autant d’ADN exogène dans le noyau d’une cellule de mammifère. La production des amplicons implique l’intervention de plus d’une cinquantaine de protéines virales qui sont nécessaires à la réplication et à l’empaquetage du génome amplicon dans une particule virale. Le plasmide amplicon étant dépourvu de gènes viraux, les protéines codées par ces gènes doivent nécessairement être apportées en trans, soit par un HSV1 auxiliaire, soit par de l’ADN viral, soit par des cellules transcomplémentantes. Actuellement, deux méthodes sont principalement utilisées pour la production des amplicons. La première repose sur l’utilisation d’un virus auxiliaire génétiquement modifié, possédant une séquence d’encapsidation unique, entourée par deux sites loxP en orientation parallèle. Ce virus est également défectif grâce à la délétion du gène codant pour la protéine essentielle ICP4. Tout d’abord, des cellules exprimant ICP4 sont transfectées par un plasmide amplicon et surinfectées par le virus auxiliaire décrit. Un premier stock viral dit intermédiaire se composant de vecteurs amplicons et de virus 340 auxiliaires est alors obtenu. Il est ensuite utilisé pour infecter des cellules exprimant simultanément ICP4 et la recombinase CRE. Le virus auxiliaire présent dans le stock intermédiaire apporte l’ensemble des fonctions permettant l’amplification et l’encapsidation du génome amplicon. En revanche, le génome du virus auxiliaire lui-même n’est pas encapsidé à cause de la délétion des signaux d’encapsidation par la recombinase CRE. Cette technique permet d’obtenir des stocks importants de vecteurs amplicons, très faiblement contaminés par des particules du virus auxiliaire défectif et non pathogène [4], qui peuvent donc être utilisés dans des essais thérapeutiques chez l’animal (figure 3). La seconde technique de production repose sur la cotransfection du plasmide amplicon avec un génome d’HSV1 cloné dans un chromosome bactérien artificiel. Ce génome a été modifié de manière à ne pas pouvoir être encapsidé : 1) par la délétion des séquences d’encapsidation (a) et 2) en rajoutant des séquences qui augmentent sa taille. De plus, le gène ␣27 codant pour la protéine essentielle ICP27 a été éliminé pour être rendu plus sûr [5, 6]. La cotransfection s’effectue donc dans des cellules exprimant ICP27 (figure 4). Cette technique a permis, pour la première fois, la production de stocks d’amplicons totalement dépourvus de contamination par des virus recombinants. Cependant, ce système de production, fondé sur des méthodes de transfection, permet uniquement la production d’amplicons en faible quantité, limitant ainsi leur utilisation. Donc à ce jour, aucune méthode combinant l’absence totale de contamination par des particules auxiliaires et la production de stocks importants de vecteurs amplicon n’est disponible. Ainsi, des travaux sur l’amélioration de la production des amplicons sont encore nécessaires et devraient permettre de passer outre ces limitations. Dans cette revue, nous décrirons quelques-unes des nombreuses applications développées récemment avec les amplicons, tout en mentionnant également les limitations actuelles de l’utilisation de ces vecteurs. Les amplicons et leurs applications dans la thérapie du cancer Les vecteurs amplicon ont été utilisés dans la plupart des stratégies anticancéreuses. En effet, ils sont capables de transférer efficacement des gènes dans la plupart des cellules cancéreuses, in vitro comme in vivo. Cependant, comme ils ne sont pas autoréplicatifs, ils se diluent durant les divisions cellulaires. C’est pourquoi la majorité des études ont utilisé des méthodes drastiques, comme la destruction rapide de la cellule cancéreuse, ou une approche systémique basée sur l’immunothérapie ou les thérapies anti-angiogéniques. Les principales voies anticancéreuses ayant été ciblées par des amplicons sont résumées dans la figure 5. Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 revue Immunothérapies OriS Séquences bactériennes Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. a Séquences transgéniques Figure 1. Structure du plasmide amplicon. Un plasmide amplicon est un plasmide d’Escherichia coli standard (contenant une origine de réplication bactérienne et un gène de résistance à un antibiotique) portant une origine de réplication (OriS) et un signal de clivage/encapsidation (séquence a) herpétiques, ainsi qu’une séquence transgénique d’intérêt (représentée par la flèche rouge). Thérapies anti-angiogéniques Une stratégie antitumorale, qui semble particulièrement prometteuse, consiste à inhiber la néovascularisation du tissu cancéreux afin de limiter l’approvisionnement des cellules et d’induire une hypoxie. Deux études ont pu montrer une importante inhibition de la croissance tumorale et donc une réduction du volume de tumeurs hépatiques [7] et pancréatiques [8] après leur infection par des amplicons exprimant l’inhibiteur angiogénique sFlk1, une version dominante négative du récepteur au facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), par rapport aux tumeurs non infectées. L’inhibiteur a été mis sous le contrôle du promoteur inductible par hypoxie permettant ainsi de tirer parti des conditions d’hypoxie, naturellement retrouvées dans la plupart des tumeurs. a OriS a Plusieurs approches immunothérapeutiques ont été décrites, dont l’utilisation d’amplicon, pour exprimer des antigènes spécifiques des cellules cancéreuses. En effet, les amplicons peuvent infecter efficacement des cellules présentatrices d’antigènes en culture, comme des cellules dendritiques humaines et murines, ou des cellules lymphocytaires B issues de leucémie chronique. Willis et al. [9] ont infecté des cellules dendritiques de souris in vitro avec un amplicon exprimant un antigène spécifiquement présent sur des cellules de carcinomes de la prostate. Après réintroduction de ces cellules dans la souris, ils ont pu mettre en évidence une réponse cytotoxique médiée par les lymphocytes T, réponse qui est dirigée spécifiquement contre les cellules exprimant cet antigène. De plus, les souris ainsi immunisées sont protégées contre de nouvelles tumeurs exprimant ce même antigène. Une deuxième approche vise à utiliser les amplicons pour induire la sécrétion de cytokines par les cellules cancéreuses afin de stimuler la réponse immunitaire antitumorale. Par exemple, un amplicon exprimant le facteur de croissance GM-CSF (granulocyte-macrophage colonystimulating factor), injecté in situ au niveau d’un mélanome chez la souris, inhibe la croissance tumorale. De manière intéressante, cette expérience a également démontré la mise en place d’une immunité antitumorale systémique qui entraîne l’inhibition de la croissance d’une tumeur collatérale non infectée [10]. Une troisième stratégie utilise les amplicons pour modifier ex vivo la capacité des cellules tumorales à exprimer des molécules d’adhésion ou des protéines costimulatrices, avant de les réintroduire dans l’hôte. Par exemple, dans un modèle de métastases hépatiques, une réponse immune médiée par les lymphocytes a été observée après injection de cellules tumorales préalablement infectées par des amplicons exprimant RANTES, B7.1 et/ou le facteur de croissance GM-CSF. De plus, des cellules lymphocytaires B issues de leucémie chronique, qui ont été infectées par des OriS a OriS Concatémère de plasmides amplicon Taille totale ~ 150 kpb Particule virale HSV1 Figure 2. Structure du vecteur amplicon. Un vecteur amplicon se compose d’une particule virale d’HSV1 contenant un concatémère de 150 kpb composé d’unités dérivées du plasmidique amplicon. Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 341 revue Virus HSV1 auxiliaires défectifs Plasmide amplicon Plasmide amplicon BAC-HSV1 Génome HSV1 augmenté en taille amputé des séquences Na0 et α27 Séquences bactériennes Transfection Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Surinfection ICP4 Cotransfection ICP27 Vecteurs amplicon Virus auxiliaires Vecteurs amplicon Infection CRE ICP4 Vecteurs amplicon Virus HSV1 auxiliaires défectifs 0,5 % Figure 3. Méthode de production des vecteurs amplicon à l’aide de virus HSV1 auxiliaires défectifs. Des cellules transcomplémentantes, pour une fonction virale essentielle, sont transfectées par le plasmide amplicon et surinfectées par un HSV1 auxiliaire défectif. À cette étape, le ratio entre les vecteurs amplicon et les virus auxiliaires obtenus est d’environ 1:1. Des cellules exprimant la recombinase Cre sont ensuite infectées par le stock viral précédemment obtenu. La recombinase CRE induit la délétion de la séquence de clivage/encapsidation (a), entourée de deux sites loxP, du génome des virus auxiliaires, empêchant alors leur encapsidation. Cela résulte en une production de stocks de vecteurs amplicon faiblement contaminés par des virus auxiliaires défectifs (0,1 à 1 %). amplicons exprimant B7.1 et/ou CD40L ou LIGHT, provoquent une augmentation de la présentation d’antigènes et l’induction d’une forte réponse proliférative des cellules T [11, 12]. Enfin, un vaccin contre la leucémie a été généré en utilisant des lignées cellulaires lymphoblastiques infectées par des amplicons exprimant IL2 et CD70. Le traitement de souris avec ces cellules a permis de diminuer de manière 342 Figure 4. Méthode de production des vecteurs amplicon par cotransfection avec le génome HSV1. Un BAC portant le génome HSV1 amputé de la séquence a et du gène ␣27, codant pour la protéine ICP27, et le plasmide amplicon sont cotransfectés dans des cellules exprimant ICP27. Comme la taille du génome d’HSV1 porté par le BAC a été augmentée et que ses séquences d’encapsidation ont été éliminées, celui-ci ne peut pas être incorporé dans les particules d’HSV1. Cela permet d’obtenir des stocks de vecteurs amplicon purs. significative la prolifération des cellules lymphoblastiques et d’augmenter ainsi la survie de ces animaux [13]. Enfin, les propriétés immunostimulatrices décrites précédemment pourraient également être utilisées en association avec d’autres traitements, comme c’est déjà le cas en combinaison avec des stratégies oncolytiques utilisant des vecteurs HSV1 recombinants [14, 15]. Expression de gènes antitumoraux La plupart des mises au point pour l’amélioration de l’efficacité et l’innocuité des thérapies contre le cancer par ciblage des cellules prolifératives ont été réalisées en utilisant des gliomes. L’infection de cellules humaines dérivées de glioblastome par des amplicons exprimant la protéine très précoce ICP0 d’HSV1 [16], qui possède une activité E3-ubiquitine ligase et induit notamment la dégradation de protéines centromériques, entraîne un arrêt de la prolifération de ces cellules ainsi que leur mort par nécrose. En revanche, l’infection par ce même amplicon de cellules qui Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 revue Inhibition de la vascularisation des tumeurs Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Métabolisation de prodrogues Induction de la mort des cellules cancéreuses Augmentation de l’immunité antitumorale Figure 5. Principales voies anticancéreuses ayant été ciblées par les vecteurs amplicons. ne se divisent pas, comme des cardiomyocytes ou des neurones de rat, n’entraîne aucune mortalité ou toxicité induite par ICP0. Ces résultats démontrent ainsi le potentiel thérapeutique possible de la protéine virale ICP0 [17]. Une autre stratégie développée est le ciblage des cellules tumorales par le contrôle transcriptionnel de transgènes d’intérêt thérapeutique. Par exemple, Ho et al. [18] ont dans un premier temps construit un amplicon, dans le génome duquel le transgène est sous le contrôle d’un promoteur chimère comportant les éléments enhancers et promoteurs de la GFAP (glial fibrillary acidic protein) ainsi que les éléments régulateurs spécifiques du cycle cellulaire du promoteur de la cycline A. Le vecteur amplicon résultant est capable d’exprimer le transgène de manière dépendante du cycle cellulaire et spécifiquement dans les cellules issues de gliome in vitro et in vivo. Ce même promoteur chimère a été utilisé avec succès in vitro et in vivo pour tester l’efficacité antitumorale de protéines proapoptotiques comme le ligand Fas et FADD (Fas-associated protein with a death domain) délivrés par l’amplicon [19]. Deux autres protéines proapoptotiques, TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) et sa version sécrétée S-TRAIL, ont été testées dans les cellules Gli36 et dans des gliomes [20, 21]. Les résultats obtenus après infection ont montré l’induction d’une apoptose in vitro et une réduction des gliomes in vivo. L’ensemble de ces résultats permet de démontrer le potentiel de l’utilisation des amplicons pour délivrer des gènes proapoptotiques. Enfin, une étude plus récente a utilisé les amplicons pour exprimer des petits ARN interférents (siRNA) afin d’inhiber posttranscriptionnellement le gène EGFR (epidermal growth factor receptor). L’inhibition de ce gène dans des cellules issues de glioblastome humain provoque une diminution de leur croissance in vitro et in vivo [22]. Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 Stratégie d’activation de prodrogues Parmi le grand nombre d’enzymes transformant des molécules en drogue antitumorale testées en thérapie anticancéreuse, certaines ont été exprimées via un vecteur amplicon. Par exemple, l’expression à partir d’un amplicon de la thymidine kinase (TK), qui permet de convertir le ganciclovir en un analogue toxique, induit la mort des cellules infectées [23]. Par ailleurs, Rainov et al. [24] ont construit un amplicon exprimant la protéine de fusion 4B1:EGFP qui a été utilisé pour traiter des gliomes humains et murins. Cette protéine chimérique combine les avantages de l’expression du cytochrome P450B41, un puissant gène suicide bioactivateur, avec celle de la protéine EGFP. L’introduction de l’amplicon exprimant la protéine 4B1:EGFP transforme la cyclophosphamide (CPA) en métabolites toxiques. Par imagerie, il a été possible d’observer un puissant effet collatéral médié par la transmission de ces métabolites de cellule en cellule. Les amplicons en thérapie génique du système nerveux La plupart des travaux en thérapie génique se sont focalisés sur la protection contre les dommages du cerveau. Seules quelques études utilisant des amplicons ont été réalisées sur le traitement thérapeutique de désordres neurodégénératifs, comme la maladie de Parkinson, ou des maladies génétiques, comme les ataxies (figure 6). Neuroprotection Une mort cellulaire est observée dans de nombreuses pathologies ou chirurgies du cerveau. De ce fait, plusieurs approches ont été développées pour réduire la neurotoxicité 343 revue Maladie de Parkinson (TH) Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Ataxies Ataxie télangiectasie (locus génomique ATM) Ataxie de Friedreich (locus génomique FRDA) Neuroprotection Facteurs neurotrophiques (BDNF, NT3 et GDNF) Facteurs anti-apoptotiques (bcl2, HSP70 et HSP72) Figure 6. Principales applications en thérapie génique des vecteurs amplicon. Les gènes exprimés par les amplicons testés sont indiqués entre parenthèses. et la perte de cellules nerveuses par l’expression, entre autres, de facteurs neurotrophiques ou anti-apoptotiques. Les neurotrophines font partie d’une famille de facteurs de croissance qui jouent un rôle important dans le développement et la maintenance du système nerveux. Par exemple, le facteur neurotrophique du cerveau BDNF (human brainderived neurotrophic factor) participe à la maturation et à la fonction des neurones auditifs chez les mammifères. Des amplicons exprimant l’ADN complémentaire (ADNc) de ce gène ont été construits et leur efficacité a été évaluée pour le traitement de la surdité. Ils ont été testés dans un modèle de souris dont le ganglion spiral a été endommagé, entraînant une mort par apoptose des neurones auditifs suite à la privation en facteur de croissance. Les auteurs ont pu montrer que, grâce à l’expression de BDNF par l’amplicon, les neurones auditifs pouvaient résister à l’apoptose induite suite à la lésion [25]. Le pouvoir protecteur de la neurotrophine 3 (NT3) a également été testé via les amplicons dans un modèle d’explants cochléaires de souris. Après infection, ces explants ont été exposés au cisplatine, un agent utilisé lors de la chimiothérapie de patients atteints d’un cancer et qui induit, entre autres, la destruction des neurones dans le système auditif. Les amplicons exprimant NT3 ont pu limiter l’ototoxicité générée par le cisplatine démontrant ainsi leur potentiel dans la protection des neurones du ganglion spiral [26]. De plus, les amplicons exprimant NT3 ont montré des effets de protection similaires in vivo chez la souris [27]. Ces études permettent donc d’espérer que les amplicons puissent être utilisés dans la prévention de la surdité induite par des agents chimiques ou, tout simplement, par la vieillesse. 344 Enfin, la neurotrophine GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) exprimée par un amplicon a été testée in vivo chez le rat dans un modèle d’ischémie cérébrale ; elle permet également de protéger les neurones [28]. Une autre approche utilisant les amplicons pour la neuroprotection est l’expression de gènes anti-apoptotiques, comme bcl2, ou de gènes codant pour des protéines induites par le choc thermique, comme HSP70 ou HSP72. Par exemple, l’injection d’amplicons exprimant bcl2 dans le cerveau de rats permet de protéger de manière significative les tissus proches du point d’inoculation contre une ischémie [29]. Citons également l’utilisation des amplicons pour exprimer des gènes permettant de limiter la neurotoxicité médiée lors d’un stress oxydatif par le glutamate [30], lors d’une hypoglycémie [31] ou lors de l’augmentation de calcium intracellulaire qui est induite, par exemple, en cas de traumatismes neurologiques liés à la vieillesse ou à certaines maladies neurologiques [32]. Traitement de la maladie de Parkinson et des ataxies Parmi les premiers traitements thérapeutiques utilisant des vecteurs amplicons in vivo, nous pouvons citer le travail de During et al. [33] sur des rats modèles de la maladie de Parkinson. En traitant ces animaux avec un amplicon exprimant la tyrosine hydroxylase humaine (TH), les auteurs ont montré une amélioration comportementale et biochimique, qui s’est maintenue un an durant, après le transfert de gène. À la suite de ces travaux, ils ont construit des amplicons coexprimant la TH et d’autres enzymes impliquées dans la Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue biosynthèse de la dopamine. Testés sur le même modèle animal, ces amplicons ont permis une amélioration de l’état des animaux malades, le rendant proche d’une situation normale pendant 6 mois [34, 35]. Des amplicons ont été évalués pour le traitement de l’ataxie-télangiectasie, une maladie humaine autosomale récessive caractérisée, notamment, par une dégénérescence neuronale. L’ADNc correspondant au gène ATM possède une taille de 9 kpb, ce qui limite son transfert par d’autres vecteurs viraux. Plusieurs études in vivo semblent suggérer la possibilité de complémenter le gène défectif grâce à l’expression de l’ADNc de l’ATM par les amplicons [36, 37]. Grâce à la propriété des amplicons de véhiculer de grands fragments d’ADN, ces derniers ont été évalués dans le traitement de l’ataxie de Friedreich, une des ataxies les plus fréquentes qui résulte d’une déficience en frataxine, codée par le gène FRDA. Un amplicon contenant les 135 kpb d’ADN de la totalité du locus génomique FRDA, incluant les longues séquences régulatrices en amont et en aval, a été construit. Il a été utilisé pour infecter des fibroblastes de patients atteints de la maladie, et l’expression du locus FRDA a permis de restaurer un phénotype normal dans ces cellules [38]. L’utilisation de ce même amplicon dans un modèle de souris atteinte d’ataxie de Friedreich conditionnelle a permis la restauration des fonctions neurologiques déficientes chez ces animaux [39]. Les amplicons dans les applications fondamentales L’utilisation des vecteurs amplicon ne se limite pas aux seules applications thérapeutiques. En effet, de nombreuses études fondamentales ont utilisé ces derniers comme outil d’investigation. Ce chapitre se limitera à décrire quelquesunes de leurs utilisations pertinentes dans le domaine de l’étude du système nerveux central (SNC) et celui de la virologie. Étude du SNC Des amplicons ont été délivrés dans différentes régions du système nerveux afin d’étudier divers aspects du fonctionnement du SNC comme les fonctions cognitives, la neuroplasticité et la neurogenèse. Parmi les fonctions cognitives et comportementales, de nombreuses études sur l’apprentissage et la mémoire, les interactions sociales, l’anxiété, le stress et les phénomènes de dépendance ont été réalisées avec des amplicons. Ces travaux ont récemment été décrits dans une revue de Jerusalinsky et Epstein [40]. La neuroplasticité est un phénomène complexe qui nécessite une régulation très fine de l’expression et de l’activité Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 des protéines dans les neurones, entraînant un changement de potentiel de ces cellules qui vont ensuite modifier l’activité neuronale. Par exemple, les neurotrophines sont des modulateurs de la neuroplasticité [41] et il a été démontré que le facteur de croissance neuronal NGF (nerve growth factor) joue un rôle important dans la plasticité neuronale impliquée dans l’apprentissage et la mémoire [42]. Des souris hétérozygotes invalidées pour le NGF présentent des déficits dans l’apprentissage spatial. L’injection d’amplicons exprimant le NGF, dans l’hippocampe de ces souris, permet de restaurer partiellement leur capacité d’apprentissage spatial [43]. Plus récemment, les amplicons ont été utilisés comme outil pour comprendre comment les cellules souches peuvent se différencier en différents types cellulaires. Des cellules souches de souris ont été infectées par des amplicons exprimant le FGF2 (fibroblast growth factor 2) provoquant ainsi leur différenciation en neurones [44]. Les amplicons sont donc d’excellents outils pour exprimer des facteurs de croissance dans les cellules souches ou dans leurs dérivés, afin d’obtenir, par exemple, des progéniteurs neuronaux. Virologie Les amplicons ont été utilisés pour exprimer une ou plusieurs protéines provenant d’autres virus afin d’étudier leur fonction, de générer des vecteurs hybrides ou d’induire des réponses immunes. Grâce à leur grande capacité transgénique, ils ont également été utilisés pour exprimer l’ensemble des protéines structurales d’autres virus, dans le but d’obtenir des particules vides (VLP), qui pourront éventuellement être utilisées pour l’élaboration de vaccins. Savard et al. [45] ont été les premiers à construire des amplicons hybrides exprimant l’ensemble des protéines nécessaires à la formation de particules vides du virus de Moloney (MoMLV). Cet amplicon possède une cassette qui apporte en trans les protéines gag-pol et env (cassette GPE) permettant ainsi de complémenter le génome de vecteurs rétroviraux défectifs intégrés dans les cellules [45]. D’autres études ont montré que les amplicons peuvent également être utilisés pour coexprimer la cassette GPE et celle d’un vecteur rétroviral, permettant ainsi la production de vecteurs rétroviraux dans tous les types cellulaires infectables par un amplicon [46]. Les amplicons ont également été très utiles pour l’étude du virus de l’hépatite C (HCV). En effet, un des problèmes majeurs rencontré pour l’étude d’HCV est l’absence d’un système efficace de production du virus in vitro, ce qui rend difficile l’étude des protéines virales. Les amplicons, qui sont capables d’infecter efficacement de nombreuses lignées cellulaires dérivées d’hépatomes ainsi que des hépatocytes primaires humains et murins, ont permis l’expression de plusieurs protéines d’HCV dont NS3 et NS4A. L’obtention de quantités importantes de ces deux protéines 345 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue a permis de réaliser des études enzymatiques qui ont, pour la première fois, montré que NS3 posséderait une activité ARN hélicase fonctionnant dans le sens 3’ vers 5’. Les protéines structurales de l’enveloppe d’HCV, E1 et E2, ont été produites avec succès par des amplicons et il a été montré que ces deux glycoprotéines sont synthétisées et maturées correctement. Les travaux en cours se focalisent sur la construction d’amplicons qui seraient capables d’exprimer l’ensemble des protéines structurales d’HCV, Core, E1 et E2, pour produire des particules HCV vides. L’ensemble des travaux sur les amplicons exprimant HCV est décrit dans une revue de Tsitoura et al. [47]. Questions non résolues Le potentiel des amplicons pour le transfert de gènes n’est plus à démontrer. Cependant, de nombreux aspects de la biologie des amplicons restent à découvrir et plusieurs problèmes liés à leur production sont encore en cours d’étude. Parmi les questions non résolues, l’une des plus importantes concerne la nature transitoire de l’expression du transgène délivré par les amplicons. L’extinction de l’expression du transgène peut résulter tant d’une instabilité de la cassette portant le transgène que d’une extinction de l’expression du transgène dans la cellule infectée. Une autre question qui ne sera pas traitée dans cet article concerne l’éventuelle action de la réponse antivirale innée et acquise. Expression de la cassette transgénique Différents facteurs doivent être pris en compte pour l’analyse de l’expression des transgènes véhiculés par les amplicons, comme la spécificité tissulaire, la régulation physiologique, l’intensité et la durée de l’expression. Comme le génome amplicon est incompétent pour la réplication, sa perte après infection de cellules qui se divisent est très rapide. Cependant, même dans des cellules quiescentes, il ne s’exprime que durant une période limitée, et ce phénomène n’est pas lié à la mort de la cellule infectée. Le génome amplicon est donc rendu silencieux, avant d’être perdu. Pour le moment, il n’y a pas de réponse claire permettant de comprendre l’extinction de l’expression d’un transgène à partir d’un génome amplicon. Ce phénomène est particulièrement important lorsqu’on utilise des amplicons non contaminés par du virus auxiliaire, indiquant que l’expression de protéines herpétiques, peut-être des facteurs de transcription ou des protéines qui bloquent les réponses cellulaires à l’infection, serait nécessaire pour le maintien d’une expression stable et significative à partir du génome amplicon. Il semble cependant clair que la force et la durée de l’expression du transgène sont également dépendantes 346 du type cellulaire, ce qui implique l’intervention de facteurs cellulaires dans la répression de l’expression du génome amplicon. Une étude récente menée par Suzuki et al. [48] a montré que les séquences bactériennes présentes dans le génome amplicon pouvaient induire rapidement une répression transcriptionnelle du transgène par la formation de chromatine inactive. D’autres travaux ont comparé l’expression d’un transgène porté soit par un amplicon classique, contenant donc des séquences bactériennes, soit par un amplicon dépourvu de séquences bactériennes, et ce in vitro dans des cellules primaires fibroblastiques et in vivo dans des souris nude [49]. Les auteurs ont pu montrer que, in vitro, l’expression du transgène était deux fois plus intense en l’absence de séquences bactériennes. De plus, 6 jours après l’infection, la diminution de l’expression du transgène est beaucoup plus faible que dans le cas des amplicons classiques. L’hypothèse émise par les auteurs est que les séquences d’origine bactérienne sont détectées par la cellule infectée, qui les inactive aussitôt par association avec des formes répressives d’histones. Bien qu’une amélioration notable de l’expression en l’absence de séquences bactériennes dans le génome amplicon ait été observée, cette expression finit toujours par s’éteindre, indiquant l’intervention d’autres facteurs, comme les réponses immunes contre les infections virales ou des protéines pouvant potentiellement reconnaître de l’ADN nu entrant dans le noyau. Un certain nombre d’études se sont également concentrées sur l’effet du promoteur sur l’expression du transgène. La plupart des protocoles expérimentaux utilisent des promoteurs viraux, herpétiques ou autres, pour exprimer le transgène. Ces promoteurs permettent en général une forte expression dans de nombreux types cellulaires mais, comme décrit précédemment, ils sont rapidement réprimés dans la cellule infectée. Plusieurs alternatives ont été testées pour remplacer les promoteurs d’origine virale, comme : 1) l’utilisation de promoteurs inductibles, 2) celle de promoteurs spécifiques de tissus, ou bien encore, 3) celle de loci génomiques complets, contenant le promoteur endogène ainsi que les séquences régulatrices. Les résultats obtenus avec les différents promoteurs inductibles ont été plutôt décevants, le problème majeur étant une expression basale trop forte. Une explication possible est la présence, dans la séquence OriS, du génome amplicon, du motif TAATGARAT qui est activé par VP16, une protéine transactivatrice d’HSV1 qui est incorporée dans le tégument des vecteurs amplicon lors de leur production [50]. L’action d’un facteur de transcription aussi puissant sur le génome amplicon peut donc entraîner l’activation des promoteurs inductibles de manière non spécifique. Différents promoteurs tissus-spécifiques ont été évalués dans le contexte des amplicons. Par exemple, le promoteur de la préproenképhaline de rat, cloné en amont du gène Virologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue rapporteur lacZ dans un vecteur amplicon, permet une expression restreinte du transgène dans le cerveau qui persiste pendant 2 mois après infection [51]. Une autre étude a montré qu’un transgène, mis sous le contrôle du promoteur de la tyrosine hydrolase, s’exprime de manière spécifique durant 6 semaines dans le SNC [52]. L’utilisation de promoteurs cellulaires permet donc une expression ciblée et plus longue du transgène en comparaison aux promoteurs viraux. Enfin, une régulation physiologique de l’expression du transgène est primordiale pour la thérapie génique. Grâce à leur capacité unique à pouvoir véhiculer de très grands fragments d’ADN, les amplicons ont été utilisés pour délivrer des loci génomiques entiers qui contiennent l’ensemble des éléments nécessaires à la régulation physiologique de l’expression de gène. Par exemple, de tels amplicons ont permis une expression physiologique et à long terme du gène du récepteur des lipoprotéines à faibles densités et du gène FRDA [38, 53]. Cette dernière approche semble donc la plus prometteuse. Maintenance de l’expression transgénique dans les cellules en division Le deuxième problème lié à l’expression transitoire du transgène est la dilution du génome du vecteur amplicon dans les cellules en prolifération. En effet, l’amplicon est un vecteur entièrement dépourvu de gènes viraux et par conséquent non réplicatif. Actuellement, deux stratégies très différentes sont développées pour éviter la perte du génome amplicon ou de la cassette transgénique dans des cellules en division. Alors que l’une repose sur l’intégration ciblée de la cassette contenant le transgène dans le génome de la cellule infectée, l’autre cherche à transformer le génome amplicon en un épisome capable de se répliquer et de se propager de manière autonome dans les cellules. Concernant l’intégration des séquences transgéniques, l’approche principale consiste à construire des amplicons chimériques contenant les éléments intégratifs du virus adéno-associé (AAV), afin d’induire l’intégration de la cassette transgénique au niveau de sites spécifiques dans les chromosomes cellulaires. Les amplicons hybrides HSV1AAV contiennent deux éléments génétiques de AAV : les séquences terminales inversées répétées ITR, de part et d’autre de la séquence transgénique, et le gène rep. La protéine Rep est supposée promouvoir l’intégration des séquences transgéniques flanquées des ITR au niveau du site AAVS1, présent dans le chromosome 19 des cellules humaines. Ainsi, l’infection de cellules par ces amplicons hybrides devrait entraîner l’intégration de la séquence transgénique dans le site AAVS1. De nombreux travaux ont démontré le potentiel d’un tel système in vitro et in vivo [54]. Néanmoins, plusieurs problèmes subsistent, tels que la très faible efficacité de production de ces vecteurs hybriVirologie, Vol. 11, n° 5, septembre-octobre 2007 des due à la protéine Rep qui interfère avec la réplication d’HSV1, ainsi que des insertions multiples hors des sites d’intégration. Deux méthodes ont été développées dans la stratégie de maintenance du génome amplicon sous une forme réplicative épisomale. La première utilise les propriétés du réplicon du virus d’Epstein-Barr (EBV), composé de l’origine de réplication virale pendant la latence (oriP) et de la protéine EBNA1 (EBV-encoded nuclear antigen 1), qui permet la maintenance du génome dans des cellules en division. La seconde approche utilise la technologie des chromosomes humains artificiels (HAC). La maintenance des amplicons hybrides HSV1-EBV ainsi que l’expression du transgène ont été confirmées dans différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines et in vivo chez des souris nude portant des implants de tumeur du foie [55]. Ces mêmes vecteurs ont été utilisés pour évaluer l’expression physiologique à long terme du locus de 115 kpb contenant le gène humain de l’hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HPRT). Ce vecteur est effectivement capable de complémenter des fibroblastes humains déficients en HPRT ainsi que des hépatocytes primaires dérivés de souris invalidées pour HPRT. De plus, les auteurs ont pu démontrer la persistance du génome amplicon sous forme épisomale, pendant au moins 2 mois dans des clones de fibroblastes humains déficients en HPRT infectés par le vecteur [56]. Ces études confirment donc le potentiel des amplicons hybrides HSV1-EBV pour le maintien, dans des cellules en division, de génomes contenant de grands fragments d’ADN. Cependant, au moins deux facteurs limitent considérablement les applications de ces amplicons. En effet, ils ne fonctionnent que dans des cellules humaines, avec souvent la nécessité d’appliquer une sélection pour avantager les cellules contenant le réplicon. De plus, la protéine EBNA1 exprimée par ces vecteurs pourrait avoir un pouvoir oncogénique, ce qui limite leur utilisation dans des protocoles de thérapie génique. La deuxième alternative, plus récente, pour obtenir des épisomes stables d’un génome amplicon est la transformation des génomes amplicon en chromosomes humains artificiels (HAC). Les HAC sont des molécules d’ADN qui contiennent des séquences alphoïdes permettant leur ségrégation et leur maintien durant la division des cellules humaines. Ces séquences ont été introduites dans le génome amplicon et les vecteurs correspondants ont été utilisés pour infecter différentes lignées cellulaires humaines. Les résultats ont montré que le maintien du génome amplicon est variable, en fonction du type cellulaire. En effet, ce dernier peut être très rapidement perdu dans les cellules de reins 293 ou être conservé plus de 3 mois dans des cellules de gliome [57]. Bien que des améliorations de ce système soient encore nécessaires, ces travaux ouvrent une nouvelle voie dans l’amélioration des vecteurs amplicon. 347 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. revue Conclusion Références L’énorme potentiel des vecteurs amplicon n’est donc plus à démontrer. Ils sont largement utilisés dans de nombreux domaines fondamentaux et appliqués, notamment les thérapies anti-cancers, la thérapie génique des maladies neurologiques et le développement de vaccins. Ce dernier aspect, plus récent et encore peu documenté, mérite néanmoins d’être souligné. Les premières études impliquant des amplicons ont été dirigées contre un agent pathogène viral (VIH1) et contre des facteurs participant à l’étiologie de maladies neurologiques (maladie d’Alzheimer et à prion). Les résultats obtenus chez la souris sont très encourageants et révèlent tout le potentiel des vecteurs amplicon dans ce domaine. Les amplicons sont les seuls vecteurs viraux capables de délivrer un locus génomique entier pouvant aller jusqu’à 150 kpb et contenant tous les exons et introns, ainsi que les séquences régulatrices d’un gène, dans les noyaux des cellules de mammifères. Aussi, nous pouvons mettre en avant cette considérable capacité à véhiculer de grands fragments d’ADN qui les rend tout à fait uniques et donc très prometteurs pour le transfert de gènes. Cependant, les limitations actuelles à l’utilisation de ce vecteur sont réelles et des améliorations sont nécessaires avant de pouvoir les utiliser en thérapie génique chez l’homme. Effectivement, des efforts restent à faire pour optimiser leur production et leur purification. De plus, les facteurs qui influencent l’expression de la cassette transgénique et qui provoquent inexorablement son extinction ne sont pas encore tous déterminés. Cependant, la démonstration que l’utilisation de loci génomiques entiers permet d’obtenir une expression physiologique à long terme ouvre une voie de choix pour résoudre ce problème. Enfin, les différentes stratégies développées pour éviter la dilution de la cassette transgénique sont encore imparfaites, mais seront sans aucun doute améliorées dans un futur proche. Les questions sur la biologie de l’amplicon, en particulier celles qui concernent les réponses cellulaires antivirales, commencent tout juste à être étudiées. En tout état de cause, l’étude de ces vecteurs fait partie d’un domaine de recherche encore jeune et très dynamique. Nous pouvons noter qu’il bénéficie également des avancées réalisées dans le contexte des autres vecteurs viraux, mais aussi dans le domaine de la génomique (HAC, études de promoteurs cellulaires et artificiels...). Assurément, leur capacité à véhiculer de grands fragments d’ADN, ce qu’aucun autre vecteur est capable de faire, reste leur atout majeur et leur assure un avenir prometteur. 1. Spaete RR, Frenkel N. The herpes simplex virus amplicon : a new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector. Cell 1982 ; 30 : 295-304. Remerciements. Ce travail a été réalisé grâce au financement de l’Association française contre les myopathies (AFM) et de la Commission européenne (THOVLEN project, FP6). CD et CP sont financées par un contrat de la Commission européenne. 348 2. Boehmer PE, Lehman IR. Herpes simplex virus DNA replication. Annu Rev Biochem 1997 ; 66 : 347-84. 3. 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