application à la pathologie

BASES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DES PATHOLOGIES- PARTIE I - Régulation de l'expression génique :
application à la pathologie
22/10/2013
WINNICKI Camille L2
BMCP
Pr A. Margotat
16 pages
Régulation de l'expression génique : application à la pathologie
PARTIE I
Plan :
A. Introduction
B. Zones de régulation de l'expression génique
C. Remodelage de la chromatine
D. Modifications post traductionnelles des histones
I. Acétylation
II. Méthylation
III.
Phosphorylation
IV. Ubiquitinylation
V. Désacétylation
E. Méthylation de l'ADN
F. Héritage de générations en générations
G. Eléments « cis » et facteurs « trans »
A. Introduction
Le génome humain est composé d'environ 25000 gènes (Gène dans le sens classique c'est-à-dire une
séquence précise d'ADN exprimant une protéine)
L'expression de chaque gène doit être contrôlée dans le temps et l'espace c'est-à-dire à l'endroit voulu et au
moment voulu.
Lorsqu'on parle d'un gène de façon classique (codant pour une protéine), on a
→ une séquence d'ADN
→ Le commencement par un promoteur (région dans laquelle va commencer la transcription) + un certain
nombre d'exons (partie codante) et d'introns (éliminés au cours de la maturation/épissage).
→ dans les premiers et le dernier exons, il existe des régions non traduites (en 3' et 5') ainsi qu'un site de
polymérisation.
En moyenne :
la région 5'UTR en région promotrice : 200 à 300 pb (soit 0,2 à 0,3 kb)
La région 3'UTR en région terminale : 700 à 800 pb (soit 0,7 à 0,8 kb)
La taille des introns subit d'énormes variations de quelques dizaines à quelques centaines de pb.
Exemples :
β-globine : 2kb et 3 exons
BRCA 1 : 80 kb et 24 exons
NYH7 : 20kb et 40 exons
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La taille d'un exon est relativement homogène et est en moyenne 122 pb (variations entre 100 et 200 pb)
Le nombre moyen d'exons est de 9 par gène mais subit de considérables variations.
Exemples :
• Taille moyenne d'un ARNm : 2,6 kb (considérables variations entre les ARNm)
alors que :
• La titine : 115 kb
•
La taille moyenne d'un gène humain ( plus difficile à connaitre car exons, introns, promoteur
proximal...) : 27 kb
Si on considère la médiane, elle est de 14 kb ( certains gènes sont très longs, ex : dystrophine = 2400kb)
Si la moyenne est différente de la médiane, on assiste à une distribution pas normale dans le sens mathématique
On estime qu'environ 4% de la longueur d'un gène humain est codante pour une protéine. 1,5% du génome est
donc codant et 25% représente des gènes codant pour des protéines.
Pour illustrer la très grande diversité de taille des gènes, on peut distinguer 3 « catégories » :
1. Gènes de moins de 10kb
• gènes d'histones ( - d'1kb) : 100% de la séquence est codante ( pas d'introns mais uniquement des exons)
• gène de la β-globine : 38% exons
2.Gènes entre 10 et 100kb :
• le pourcentage diminue de 12 à 3% pour la phénylalanine par exemple. Ainsi lorsqu'un gène s'agrandit,
il s'agrandit par le nombre et la taille de ses introns alors que la taille des exons reste relativement
constante. Par conséquent, le pourcentage de codons diminue.
3. Gène de taille > 100kb
Gène de la dystrophine (mutation → myopathie de Duchenne)
On observe une extrême variabilité des échelles de taille.
Rappel : Diapo illustrant la transcription puis la traduction d'un gène en protéine.
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B. Zones de régulations
Toutes les étapes de transcription peuvent être un site de régulation.
La photo n'étant pas nette même sur le diaporama, je suis désolée de la qualité de la photo... Mieux vaut aller
voir directement sur l'ENT...
1ère zone de régulation : la chromatine elle-même (ensemble d'ADN et de protéines dont les histones)
( /!\ différent de l'ADN ou des histones seuls )
La chromatine correspond au génome fonctionnel pour laquelle il existe de nombreuses régulations possibles :
1. l'assemblage entre ADN et nucléosome ( c'est-à-dire les protéines histones ) peut être modifié à
tout moment. La modification post-traductionnelle des histones modifie la structure de cette
chromatine.
2. La méthylation des cytosines de l'ADN qui va lui aussi réguler l'accès d'autres protéines
régulatrices à l'ADN pour faire s'exprimer/réprimer l'expression des gènes.
2ème zone au niveau transcriptionnel : sites CYS (séquences d'ADN particulières au voisinage des gènes)
1. Cette séquence accueille des protéines régulatrices appelées effecteurs TRANS qui sont des protéines
qui vont reconnaître une séquence d'ADN CYS pour réguler l'expression des gènes.
2. On peut réguler également l'expression des gènes en choisissant des promoteurs différents pour un
même gène.
3. La maturation de l'ARN est également un site de régulation via l'épissage alternatif : choix de
différents exons.
3ème zone : niveau post-transcriptionnel
•
•
•
Si la polyadénylation ne se fait pas correctement, la durée de vie de l'ARNm sera altérée.
De même, au cours de son transport, l'ARNm peut être dégradé avant d’être transporté.
L' interférence ARN : régulation de la traduction par des ARN non codants.
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On ne parlera pas ici de la régulation purement traductionnelle (au niveau des ribosomes).
4ème niveau : niveau post-traductionnel
La maturation post-traductionnelle des protéines représente autant de site de régulations.
ex : protéine non glycosylée → incapable de remplir sa fonction.
Lorsqu'on parle d'un gène et de sa régulation, tous les éléments clés de la régulation de la transcription
(éléments régulateurs proximaux, distants, introns, exons, etc.) sont inclus dans une structure tridimensionnelle
où l'ADN est entouré autour des histones.
Il faut que l'ADN polymérase puisse naviguer dans cette structure tridimensionnelle afin d'assurer la
transcription.
C) Remodelage de la chromatine:
Les modifications de la chromatine régulent l'expression du génome :
Physiquement, entre les divisions cellulaires, l'ADN se retrouve sous la forme de chromatine présente dans le
noyau. Selon la phase de la division cellulaire on va pouvoir ± observer cette chromatine. Celle-ci présente des
plages sombres ou claires.
Chromatine = ADN enroulé autour de protéines Histones + présence de protéines non Histones.
Si on regarde la chromatine de façon plus précise on remarque deux types de chromatine :
• Région assez claires : l'euchromatine → partie du génome impliquée dans l'expression des gènes. C'est
la partie active du génome. Elle est dispersée dans le noyau.
•
Région sombre en MO : l'hétérochromatine à la périphérie du noyau → région du génome qui est
impliquée dans la structure, la compaction dans les divisions. Elle ne contient pratiquement pas de gènes
exprimés. C'est donc une région inactive du point de vue de la transcription.
On considère deux formes différentes d'hétérochromatine :
→ Constitutive : +++ compactée et située à l'extrémité vers les télomères.
Sa séquence contient de nombreuses répétitions nécessaires à la réplication des télomères (aucun intérêt pour
les gènes mais dans la conservation de la même longueur des chromosomes au fil des divisions). Elle est riche
en nucléotides A et T.
→ Facultative : Selon les moments du cycle, elle peut se décompacter et produire quelques ARN
(dont rôle parfois inconnu). Ces régions contiennent de nombreuses séquences répétitives de type LIME
susceptibles de transposer d'un endroit à l'autre du génome. Il existe des périodes de la vie cellulaire où cette
chromatine-là se décondense.
Si on considère l'euchromatine, elle peut se trouver sous deux formes:
•
•
Filaments : de 11-12 nanomètres entourés autour de nucléosomes. C'est une forme détendue.
Forme inactive : Sous forme de solénoïde ++ compactée de 30 nm.
Au moment des divisions cellulaires il y une compaction de 6000 fois la longueur de chaque chromosome :
cela implique 2 nouveaux états de repliement qui recrutent d'autres protéines que les histones.
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D. Modifications post-traductionnelles des histones:
NUCLEOSOMES :
La structure de base de la chromatine est d'environ 147pb autour d'un nucléosome, et la présence d'un
nucléosome tous les 200/300 pb.
Ce sont des octamères protéiques compacts de type H2A, H2B, H3, H4.
Ce sont des petites protéines très conservées au fil des ans, qui sont codées par des gènes sans introns.
Elles sont codées par des gènes qui ne possèdent pas d'introns car cela permet une production rapide.
Lorsque ces histones sont associées avec l'ADN, l'extrémité N-terminale des histones est saillante à l'extérieur
du nucléosome. Ces mêmes extrémités N-terminales peuvent être modifiées.
Au pH cellulaire, elles sont chargées positivement car elles sont riches en acides aminés basiques (arginine,
lysine) → elles vont interagir avec le squelette de l'ADN qui lui est chargé négativement et assurer la stabilité
de l'ADN.
Elles peuvent être modifiées de façon transitoire par modification de leur charge. Cela permet la modification
de la structure de la chromatine (au moment de la réplication et de la transcription) en modifiant la charge donc
en modifiant l'interaction avec les phosphates (chargés négativement) de l'ADN.
Exemple : l'Histone H1 (qui ne fait pas partie du nucléosome) peut être phosphorylée.
Modifications post-traductionnelles des histones :
3 exemples :
• Phosphorylation : Sur les sérines grâce à des kinases/phosphatases.
• Méthylation : Sur les lysines ou arginines. Grâce à des enzymes, les histones méthylases ( HMT), et
Déméthylation grâce à une seule déméthylase connue : la LSD1.
• Acétylation : Sur les lysines, grâce à des histones acétyl-transférases (HAT), et Désacétylation grâce à
des histones désacétylases (HDAC).
• Ubiquitinylation : sur des lysines grâce à des enzymes E1,E2,E3/isopeptidase.
Chacune de ces modifications va diminuer la charge et donc diminuer la force de l'interaction des histones avec
l'ADN.
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I. Acétylation des histones :
Lorsqu'on s’intéresse à l'inhibition de l'expression d'un gène, on observe que c'est pratiquement toujours lié à la
désacétylation des histones dans la région promotrice et du gène lui-même.
L'acétylation des histones autorise la transcription.
Des protéines possédant une activité histone-acétyl-transférase (HAT) sont étroitement associées à la régulation
de l'expression des gènes.
Exemple : CBP/p300 ( cAMP respons element Binding Protein/p300)
Ces protéines ne fonctionnent pas seules mais au sein de complexes multiprotéiques (ex: récepteurs hormonaux
nucléaires).
Pour communiquer d'une cellule à une autre, il faut un système de communication entre les cellules : pour
envoyer des signaux, il existe 2 catégories de signalisation :
→ signalisation via la membrane cellulaire
→ signalisation via directement le noyau
La réponse à un signal correspond à ordonner l'augmentation ou la diminution de la production d'une protéine.
Parmi ces messages, de nombreux passent par l'AMPcyclique.
Autre type de signalisation : molécule hydrophobe et plus petite : traversée de la membrane plasmique (via
récepteurs) → membrane nucléaire → récepteurs nucléaires.
II. La méthylation des histones ( sur lys et arg)
-L'histone H3 peut être méthylée sur les lysines 4 et 9.
-La méthylation en 9 crée un site de liaison pour la protéine HP1 qui induit la compaction de la chromatine
(expression du gène inhibée).
Elle recrute une protéine qui va elle-même compacter la chromatine : permet le phénomène
d'autoamplification/régulation.
-La méthylation de la lysine 4 a l'effet inverse .
Chaque dérivé a des effets différents.
-On connaît un certain nombre de méthylases ; elles sont maintenant caractérisées ( +/- 20 chez l'homme).
-Une seule histone déméthylase a été décrite à ce jour, LSD1 ( Lysin Spécific Démethylase I ) qui est capable
de déméthyler la lysine 4 de l'histone H3).
III. Phosphorylation : ce n'est pas le moyen de régulation le plus important.
-Majorité des études sur Sérine 10 de H3 qui a un effet activateur.
-Joue probablement un rôle mineur dans la transcription.
IV. Ubiquitinylation
-L'ajout d'ubiquitine est généralement associé à la dégradation par le protéasome. /!\ Mais ici, dans le cas des
histones, elle semble non dégradative.
-elle pourrait jouer un rôle dans la spermatogénèse ? La réponse au stress ? La formation de
l'hétérochromatine ?
L'ubiquitine est peu connue et est formée de 77 acides aminés.
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Ce qui est important c'est de savoir que chaque modification influence les autres :
Exemples :
La phosphorylation de la sérine 10 de H3 entraine une acétylation plus importante que celle de la lysine 14 du
même histone mais inhibe la méthylation de la lysine 9 et inversement.
La méthylation de l'arginine 3 de l'histone H4 augmente l'acétylation des lysines 8 et 12 de cette histone. En
revanche l'acétylation de résidus 5, 8, 12 et 16 inhibe la méthylation de l'arginine 3. La phosphorylation de la
sérine 1 de H4 inhibe l'acétylation de la lysine 5, une inhibition bloquée par la méthylation de l'arginine 3.
Il est important de noter que la modification des histones peut aussi réguler la modification de l'ADN : la
méthylation de la lys9 de H3 peut diriger la méthylation de l'ADN.
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Effet des modifications sur les queues des histones : une fois que les modifications ont été faites : charges des
histones modifiées → modification de la force de l'interaction avec l’ADN : structure plus débobinée.
•
•
•
histones non débobinées : sites d'interaction avec d'autres protéines non histones.
histones acétylées : modifications des charges, nouveaux sites d'interaction dévoilés : bromodomaines.
histones méthylées : on fait apparaître des chromodomaines ( sites de régulation de protéines non
histones qui ont des activités enzymatiques susceptibles de modifier la chromatine).
V. Désacétylation
La désacétylation des histones est généralement associée à une inhibition de l'expression génique.
En acétylant les histones, on dévoile des sites d'interaction avec des bromodomaines, on élargit la structure des
nucléosomes et on rend accessibles des domaines ADN à des protéines de régulation.
La désacétylation va jouer le rôle inverse, en refermant ces possibilités d'interaction.
Ce sont des histones désacétylases qui sont impliquées dans ces processus.
Concernant les méthylations/acétylations, elles n'impliquent pas de modifications de covalence mais nécessitent
de l'ATP .
Remodelage de la chromatine :
Il existe 3 changements possibles au niveau des nucléosomes :
• On peut légèrement défaire son association avec l'ADN.
• On peut également le faire glisser le long de la séquence d'ADN (sliding) : le nucléosome se déplace le
long de la séquence ADN, ce qui peut être un avantage si on veut faire processer une enzyme le long de
l'ADN.
• On peut également l'enlever d'un endroit pour le faire se réassembler à un autre endroit, ce qui est une
manière de libérer une partie de l'ADN, pour la transcription par exemple.
Ce remodelage de la chromatine va donc se faire à l'aide de grands complexes protéiques qui vont reconnaître
les bromo/chromodomaines des histones. Ces ensembles ne se lient pas directement à l'ADN mais aux protéines
histones.
La chromatine peut également être modifiée par les HMGN (High Mobility Group N). Ces petites protéines
(10kDa) sont très mobiles dans le noyau. Cette mobilité est compatible avec l'hypothèse qu'elles jouent un rôle
dans les modifications transitoires et locales de l'ADN en fonction des besoins cellulaires.
Elles peuvent se fixer au noyau octamère des histones mais la relation directe avec une régulation d'expression
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n'est pas encore établie.
Les proteines SRY ( Sex-Determinating region on the Y chromosome) et SOX9 ( SRY-related HMG box9)
possèdent un domaine HMG, se lient à l'ADN et induisent une ouverture de la structure. Cela va donc permettre
un accès aux bases de l'ADN.
l'hypothèse du code histone :
Chaque gène porterait une « étiquette » d'histone modifiable d'une manière unique et caractéristique du gène →
Ce serait une sorte de code barre formé à partir de méthyl et d'acétyl sur la séquence.
La « traduction » se ferait via des complexes protéiques capables de reconnaître spécifiquement ces états de
méthylation et d'acétylation.
Les domaines protéiques les mieux caractérisés sont les bromodomaines et les chromodomaines. Certaines de
ces protéines non-histones possèdent plusieurs de ces domaines et peuvent donc reconnaître des combinaisons
de modifications.
Cependant, on pourrait aussi considérer que les modifications observées sont la conséquence
d'activation/répression de la transcription.
Chaque histone porterait donc une « étiquette » , un « code barre » qui peut :
• soit être traduit directement et amorcer la transcription du gène
• soit faire intervenir un traducteur/interpréteur qui correspond à une protéine/complexe protéique qui
interpréterait ce code histone et recruterait les éléments nécessaires à la transcription du gène.
Mais les protéines spécifiques liant l'ADN restent les supports de spécificité les plus forts.
Ce sont eux qui sont les plus impliqués dans la régulation de l'expression des gènes.
E. Méthylation de l'ADN :
L'ADN bactérien est méthylé de façon à pouvoir reconnaître un ADN étranger et/ou nouvellement répliqué (site
de restriction : apparition de site de coupures).
Lorsqu’un ADN étranger entre dans une bactérie il est donc reconnu car ses métylations seront différentes, une
enzyme va reconnaître cet ADN étranger et va donc le couper : site de restrictions.
Chez les eucaryotes, le rôle principal de la méthylation semble être la régulation de l'expression des gènes. C'est
toujours la Cytosine des doublets Cytosine/Guanine (CpG) qui est méthylée.
En première approximation, on peut associer séquences méthylées et inactivation des gènes. Chez l'homme,
environ 10% des Cytosines sont méthylées mais 56% des gènes sont associés à des « ilots CpG »
hypométhylés.
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Plusieurs méthylases ont été caractérisées :
• DNMT1 procède à la méthylation conservatrice (au cours de la réplication)
• DNMT3a et DNMT3b participent à la méthylation de novo (voir plus loin)
La méthylation étant associée à la non expression des gènes, les îlots CpG sont peu méthylés.
Les cytosines méthylées seront retrouvées dans les régions où il n'y a pas de gène qui s'exprime.
Cependant,un certain nombre de paires CpG a disparu au fil du temps du fait de leu désamination → La
séquence d’ADN s'est appauvrie en CpG,
Conséquences : ce mécanisme conduit (à l'échelle de l'évolution) à la déplétion en CpG dans l'ADN
(généralement 20% de la fréquence attendue) partout où les CpG étaient méthylés.
A l'inverse, la présence de nombreux CpG est souvent associée à une région 5' d'un gène exprimé, hypométhylé.
On appelle « Ilots CpG » (ou HTF) des séquences de quelques centaines de paires de bases riches en C et G
hypométhylés, souvent situées en amont de gène exprimés (en amont du promoteur).
Ils peuvent être facilement repérés par des enzymes de restriction qui coupent rarement ce qui peut permettre le
repérage cartographique et le décompte des gènes présents dans une séquence.
F. Héritage de génération en génération
Les allèles d'origine paternelle ou maternelle d'un même gène peuvent différer par leur pattern (nombre et
position) de méthylation : ce phénomène s'appelle « l'empreinte génétique » ( imprinting).
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Ceci résulte de méthylations de novo à des sites spécifiques dans des cellules germinales.
Il s'agit d'un exemple classique d'héritage épigénétique. On connaît une quarantaine de gènes soumis à
empreinte parentale.
Génétique : Etude des caractères héréditaires transmissibles selon les lois de Mendel. Ces caractères sont portés
par les gènes et codés par l'ADN.
Epigénétique : Etude des caractères tels les changements des états de transcription des gènes, qui sont
héritables au cours des divisions cellulaires et des générations mais qui n'impliquent aucun changement de la
séquence d'ADN. Ces caractères sont en général réversibles. (« reprogrammables » selon le type cellulaire et
sont portés par des modifications dites épigénétiques).
On connaît une vingtaine de maladies liées à ces modifications. (exemple : syndrome de Rett). Plusieurs seront
traitées en cours de génétique.
Quelques exemples : j'ai mis la diapo car le prof l'a mise en cours et que ça peut être interessant mais les
exemples ne sont pas à apprendre sauf le syndrome de Rett sur lequel il a passé du temps.
Ainsi, Le syndrome est différent selon que l'allèle est d'origine maternelle ou paternelle.
Un des deux gènes va donc s'exprimer différemment du fait qu'il soit méthylé ou pas.
En général, lorsqu'il est méthylé : le gène s'exprime
pas méthylé : le gène ne s'exprime pas.
Comment se fait la transmission de génération en génération ?
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Il existe un site particulier de déméthylation/méthylation dans les gamètes.
Au cours du cycle de production des gamètes, il y a déméthylation des deux allèles puis reméthylation en
fonction du sexe du producteur.
Si l'allèle femelle est méthylé, elle produira toujours des allèles méthylés. Et inversement.
Au cours de la vie embryonnaire, l'environnement peut influencer de façon non négligeable les
méthylations/déméthylation des gènes qui peuvent être ensuite transmises.
Ex: Etude de personnes qui ont subit une grande famine durant la vie embryonnaire.
→ Relation entre méthylation de l'ADN et expression génique : Le syndrome de Rett
Des mutations du gène codant pour la protéine MeCP2 sont à l'origine du syndrome de Rett.
MeCP2 ( dont le gène est sur l'X) mutée ne permet par le recrutement de HDAC
→ Conséquences : dépression de plusieurs gènes.
Prévalence : entre 1 cas/10 000 et 1/20 000.
Conclusion :
Les modifications post-traductionnelles des histones, la méthylation de l'ADN et ce qu'il est convenu d'appeler
« remodelage de la chromatine » sont des processus intimement liés chronologiquement et topologiquement.
Toutes ces modifications montrent des corrélations claires avec les différents états de la chromatine mais il n'a
pas été possible d'identifier un contrôle unique. Chacun des processus décrits contribue pour une part à une
combinaison d'ensembles qui détermine l'état de la chromatine à un endroit et un moment donné.
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G. Les éléments « cis »( dans la séquence de l'ADN ) et les facteurs de régulation « trans » qui les
reconnaissent.
Les éléments « cis » sont des séquences d'ADN consensus proches des gène sur lesquels viennent se fixer des
protéines de façon plus ou moins spécifique.
Séquences activatrices proximales : Promoteur minimal de la Polymérase 2 (qui permet la transcription des
gènes codant les protéines)
Dans presques tous les gènes, on trouve une boite de séquence TATAA. Elle est située environ 35 paires
de nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Assez souvent on trouve aussi d'autres
séquences au voisinage immédiat de la boite TATA. Par exemple :
- En aval un élément « Downstream Promoter Element » DPE et/ou DCE « Downstream Core
Element »
- Le site d'initiation de la transcription (Inr)
→ Ces deux éléments sont reconnus par des facteurs TAFs
• En amont, on remarque des séquences GC-riches qui lient les facteurs Sp1 par exemple
• Séquences CATAA lient les facteurs de la famille C/EBP (Cat box Enhancer Biding Protein)
•
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Eléments cis au voisinage du promoteur (éléments proximaux) dans quelques exemples.
•
Initiation de la transcription par l'ARN polymérase II : formation du PIC (Pre Initiation Complex)
Afin de transcrire un gène, il faut réunir un certain nombre d'éléments afin de décompacter la structure dont :
◦ En premier le Complexe de Pré Initiation (PIC) dans lequel va venir s'insérer l'ARN polymérase II.
◦ L'ensemble des protéines qui participent à la constitution de ce complexe d'initiation s'appellent
généralement les facteurs généraux de la transcription.
→ intervention des facteurs généraux de transcription ( élément « trans ») : TBP, TFIIA, TFIIB, TRIF, TRIH et
TAFs' TBP Associated Factors)
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1ère chose reconnue : la TATAA box, reconnue par TF2B (complexe) ; la sous-unité TBP va initier l'ensemble
des phénomènes.
L'interaction TBP/ADN se fait via des feuillets béta dans le petit sillon (très particulier /!\)
→ Contrainte qui exerce une petite ouverture.
2° : d'autres sous-unités aident à la formation du complexe
3° : l'arrivée de l'ARN polymérase recrute d'autres éléments → formation d'un gros complexe
Elle ne peut transcrire que des petits bouts puis transcrit vraiment grâce à la phosphorylation de son extrémité N
terminale.
Certains TAFs ( facteurs associés au TBP) ont une configuration voisine des histones, d'autres interagissent
avec les protéines fixées sur des éléments en amont, d'autres peuvent avoir des activités enzymatiques
(phosphorylation d'autres facteurs, acétylation des histones).
Contrairement aux ADN polymérases, les ARN polymérases n'ont pas besoin d'amorce mais nécessitent des
facteurs TFII. La sous-unité TFII H est une hélicase ( qui consomme de l'ATP).
Il ne semble pas y avoir de signal de terminaison (contrairement à la traduction), mais c'est la coupure de l'ARN
puis la dégradation par une exonucléase de la chaine en progression qui détermine la fin de la transcription.
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