università degli studi dell`insubria université paris-sud
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL’INSUBRIA Dipartimento di Scienza e alta tecnologia Corso di dottorato in Scienze Chimiche, XXVII ciclo UNIVERSITÉ PARIS-SUD Faculté de Pharmacie CO-TUTORED PHD THESIS PRESENTED BY: LEILA VAHDATI TITLE: SYNTHESIS OF PEPTIDOMIMETICS CONTAINING BIFUNCTIONAL DIKETOPIPERAZINE SCAFFOLDS AND THEIR EVALUATION AS MODULATORS OF AMYLOID-PEPTIDE OLIGOMERIZATION PHD SUPERVISORS: PROFESSOR UMBERTO PIARULLI (UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL’INSUBRIA) PROFESSOR SANDRINE ONGERI (UNIVERSITÈ PARIS-SUD) Academic Year: 2013-2014 Les protéines sont la classe la plus importante de molécules organiques présentes dans les cellules, ce qui composent 50% ou plus de leur poids sec. Ces macromolécules sont responsables de la plupart des fonctions complexes qui rendent la vie possible, par exemple: la catalyse enzymatique, transport et stockage, mouvement coordonné, soutien mécanique, protection immunitaire, génération et transmission de l'impulsion nerveux, contrôle de la croissance, et de différenciation. Malgré la différence de fonction, toutes les protéines sont constitués de petits blocs de construction, à savoir les acides aminés qui sont reliés ensemble de manière covalente par des liaisons amide pour former des chaînes polypeptidiques. La diversité dans la structure, la fonction et les propriétés générales des protéines sont tous déterminés par la séquence d'acides aminés qui composent sa séquence primaire linéaire. Toutefois, la séquence linéaire d'acides aminés (structure primaire) ne suffit pas à expliquer l'activité biologique des protéines. En fait, l'activité de la protéine peut être réalisée une fois que la séquence primaire correcte se replie dans une conformation tridimensionnelle unique et précise. La conformation repliée obtenue est la forme thermodynamiquement la plus stable. Les structures des protéines peuvent être classées en quatre niveaux principaux: a) la structure primaire; b) la structure secondaire (y compris -hélix et -feuilles plissées); c) la structure tertiaire; d) la structure quaternaire. Les interactions protéine-protéine, qui sont fondamentales pour de nombreuses fonctions biologiques, se produisent souvent dans des régions de protéines, qui sont organisés dans des éléments de structure secondaire comme des segments hélicoidaux, des feuillets ou des épingles à cheveux . En conséquence, une approche pour moduler les interactions protéineprotéine est de reproduire les segments en interaction et les utiliser comme antagonistes des interactions. En principe, la meilleure approche serait d'utiliser des peptides courts biaisés, de reproduire la conformation et les interactions correctes. Le Peptide -brin est le plus simple élément peptide structurel, qui n’est normalement pas trouvé dans des peptides isolés, mais au moins jumelé dans des structures d' hydrogène liés, formant des feuillets dans les protéines. L'association d'un -brin du ligand avec un brin ou d'un feuillet dans le partenaire de liaison joue un rôle important dans les interactions protéine-protéine (IPP) qui sont essentielles à presque tous les niveaux de l'organisation et de la communication dans les cellules vivantes. L'approche la plus simple dans la conception de mimétiques de -brin serait d'utiliser des peptides courts correspondant à des régions de protéines brin/feuillet. Cependant, l'inconvénient d'utiliser des peptides courts est bien connu, en raison de leur flexibilité conformationnelle et des profils pharmacologiques pauvres. Des procédés pour augmenter la stabilité conformationnelle implique la limitation de la liberté du peptide par incorporation de contraintes de conformation dans le squelette du peptide, ou à travers différents types de cyclisations.1 Le remplacement de composants d'acides aminés avec une grande variété de contraintes telles que des ponts disulfures, des doubles liaisons, des N-méthyl amino-acides, des acides D-aminés et des cycles aromatiques ou hétérocycliques, conduit à la préparation de peptidomimétiques conformationnellement et métaboliquement stables ou mimétiques non peptidiques qui sont capables de mimer -brins. Des motifs en épingle à cheveux dans les peptides et protéines naturelles disposent d'un remarquable degré de diversité structurelle. La diversité peut se produire en raison de variations dans la taille de la boucle, registre épingle à cheveux, occurrence des -renflements dans les -brins, et bien sûr en raison de la variation de séquence. Au cours des 20 dernières années, Nowick et ses collègues ont développé un travail conséquent dans le domaine des mimétiques de feuillet . Leur premier document, publié en 1992, décrit un échafaudage moléculaire de oligourée avec des liaison hydrogène intramoléculaires. Ce groupe a également développé une série de modèles moléculaires basés sur l’acide 5-amino-2méthoxybenzoique, et ses dérivés hydrazide, d'imiter et de compléter la fonctionnalité de liaison hydrogène de brins peptidiques et bloquer des liaison hydrogène. Le groupe 2méthoxy joue le double rôle de bloquer le groupe de donateurs H-bond et en fournissant l'organisation par liaison hydrogène intramoléculaire au sein de ces ß-brins. En combinant l'échafaudage moléculaire à base d'urée qui est un échafaudage rigide avec ces mimes de ßbrin, une variété de feuillets ß artificiels ont été créés, qui se replient dans des structures bien définies dans le chloroforme et d'autres solvants organiques non concurrentiels.2 Plus récemment, le groupe de Nowick a développé des blocs de construction contenant de l'ornithine et la soi-disant “unité Hao” pour créer un fragment composite Orn (i-PrCO-Hao) qui peut être incorporé dans des peptides pour induire un repliement et une dimérisation dans les solvants organiques. L'acronyme “Hao” a été conçu pour tenir compte des trois composants par lesquels elle est formée: hydrazine, l’acide 5-amino-2-méthoxybenzoique, et l'acide oxalique. Récemment, sur la base de ces données obtenues, ce groupe a établi des feuillets macrocycliques composés de deux mimétiques ornithine -tour δ-liés, un pentapeptidique dans le brin "supérieur", l'acide aminé Hao et deux acides -aminés dans le brin "inférieur". Hao est un mime relativement rigide de -brin tripeptidiques qui sert en tant que modèle pour le pliage du brin supérieur et bloque le brin inférieur pour réduire au minimum l'agrégation bord-à-bord. Ils ont décrit ce macrocycle 1 comme l'un des meilleurs inhibiteurs synthétisés dans leurs laboratoires (Figure 1) qui supprime l'agrégation de peptide dérivé de la protéine tau AcPHF6 à 1,0 équiv.3 La surface hydrophobe créé par les valine, isoleucine, et les résidus de leucine aux positions R1, R3, et R7 sur ce macrocycle est nécessaire pour l'inhibition. Figure 1. La structure générique de peptide macrocyclique Leur étude démontre que les surfaces hydrophobes entre les couches de feuillet sont importantes dans l'inhibition de l'agrégation amyloide. Ils suggèrent que ce principe est applicable à de plus grandes protéines amyloides telles que la protéine tau entière ou des peptides -amyloides . Ils ont également montré la bonne activité inhibitrice de ces feuillets dans l'agrégation de la protéine amyloide dans la maladie d'Alzheimer.4 La formation de peptides et de protéines agrégats par l'interaction de feuillets a de plus en plus attiré l'attention car il se produit dans de nombreuses maladies humaines généralisées, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d'Alzheimer (AD), la maladie de Parkinson (PD), les maladies à prions et la maladie de Huntington (HD). Beaucoup de maladies d'agrégation de protéines affectent le système nerveux; parmi celle-ci l'une des plus difficile est AD. La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence qui provoque la perte de la mémoire chez les personnes âgées. En 2013, il y avait 35 millions de personnes souffrant de AD à travers le monde, un chiffre qui devrait doubler d'ici 2050.5 Les caractéristiques neuropathologiques de cette maladie sont la perte neuronale dans des régions liées à la mémoire, un appauvrissement en neurotransmetteur et l'altération synaptique qui se trouvent dans les cerveaux des patients atteints de AD. Au cours des deux dernières décennies, le rôle de l'agrégation des protéines dans les maladies neurodégénératives a été largement étudiée, ce qui suggère que le mauvais repliement des protéines et l'agrégation sont une des principales causes du dysfonction neuronal et de la mort dans ces types de maladies.6 Microscopiquement, les résultats les plus courantes sont dépôts de protéines, dont les plaques neuritiques séniles (PNS) et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF). L'accumulation extracellulaire d'agrégats insolubles de la protéine β-amyloide (A) conduit à la formation de plaques séniles, alors que NFT sont intracellulaires et sont composés de filaments hélicoidaux appariés de la protéine tau hyperphosphorylée. Les fibres amyloides sont auto-assemblées, ce sont des protéines filamenteuses ou des agrégats peptidiques avec des structures moléculaires β-croisées, ce qui signifie qu'ils sont riches en feuillets β, dans lesquels les β-brins sont approximativement perpendiculaires à l'axe des fibrilles longues et les liaisons entre brins d'hydrogène s’étendent parallèlement à l'axe des fibrilles. L’architecture β-croisée fournit une très grande stabilité aux fibrilles, car il permet la formation d'un réseau continu de liaisons hydrogène.7 Les peptides A (39-43 acides aminés de longueur) sont dérivés du clivage protéolytique de la protéine précurseur amyloide (PPA) par des enzymes appelées sécrétases. Comme la conversion de protéines de leurs états solubles à la forme amyloide implique la formation de contacts intermoléculaires, la stabilité thermodynamique de l'état amyloide est plus favorisée à des concentrations plus élevées.8 Les espèces produites principalement sont A40. Des traces de A42 sont également formées dans un rapport d'environ 99 à 1. A42 a une propension élevée de β-brin et ainsi une plus grande tendance à s’agréger et est donc plus toxique pour les neurones que A40. La séquence de A (1-42) contient six résidus chargés négativement (D1, E3, D7, E11, E22, D23) et trois résidus chargés positivement (R5, K16, K28), donnant une charge nette de -3. Les trois résidus His (H6, H13, H14) ont un PKa proche du pH physiologique. Il existe une importance particulière pour la région hydrophobe flanquée par des résidus positivement et négativement chargées, à savoir KLVFFAE (A 1623), et à la position de K28 (Figure 2). Figure 2. Amyloid β peptide (1-42) Les peptides A sont produits en tant que monomères solubles et subissent l'oligomérisation et la formation de fibrilles amyloides via un processus peu élucidé. Plusieurs études ont proposé que A monomère en solution existe dans un équilibre entre une conformation αhélicoidale et en feuillet β et à partir de ce mélange seulement le conformère en feuillet β peut accueillir la formation de bas poids moléculaire. Cependant, les propriétés fonctionnelles des Aß peptides ne sont pas été totalement clarifiées à ce jour, bien que de nombreuses études suggèrent que les peptides ont un certain nombre de propriétés neurotrophiques et neurotoxiques. Il est suggéré que Aß soluble joue un rôle important dans la croissance neuronale, la survie et la modulation synaptique, tandis que les oligomères et fibrilles ont des propriétés toxiques.9 Mimer des -brins pour empêcher la formation de en feuillet β représente une nouvelle stratégie thérapeutique vers la prévention ou le traitement de maladies associées à des structures en feuillet β et, en particulier, AD, dans lequel le processus d'agrégation des protéines implique une transition de la structure secondaire de non ordonnée/α-hélice à une conformation riche en feuillet β, conduisant à la formation de fibres. Dans ce cas, la conception de médicament consiste en l'étude des interactions protéine-protéine associées à cette maladie, suivie par la conception de petites molécules qui peuvent imiter ou se lier à l'une des protéines en interaction impliquées dans cette maladie. Il y a deux stratégies possibles pour le traitement AD: inhibition de la formation d'oligomères ou de rediriger la cascade d'agrégation vers des espèces hors voie avec une toxicité réduite (fibrilles).10,11 Récemment, notre groupe a développé des ligands potentiels de β-amyloide qui pourraient moduler l'agrégation de β-peptides impliqués dans AD. Une nouvelle classe de dérivés de glycopeptides, sur la base de deux dipeptides hydrophobes (Ala-Val et Val-Leu) liés à un échafaudage D-glucopyranosyl hydrophile par des segments aminoalkyle et carboxyéthyle en positions C1 et C6, respectivement ont été conçus pour lier la séquence hydrophobe de peptide ß-amyloide KLVFF (Aβ16-20) (Figure 3). Ces composés sont censés établir des interactions hydrophobes avec le peptide A, tandis que l'échafaudage de glycoside est censé perturber le réseau régulier de liaisons hydrogène entre les brins , et par conséquent, perturber l'interaction avec d'autres peptides A agissant comme élément casseur de feuillet , et empêchant par conséquent l'oligomérisation. Parmi ces molécules, le composé 2 possède une bonne activité inhibitrice, évaluée par le test ThT, en augmentant la phase de latence de A1-40 aux ratios composé: A1-40 de 1:1 et 0.1:1 respectivement.12 Des pharmacomodulations ont permis la découverte de molécules capables soit de stabiliser le peptide monomère ou d'accélérer l'agrégation de A1-42, afin de prévenir la présence de petits oligomères toxiques.13 Cette série glycopeptides n'a pas montré de conformation favorisée en solution sans la présence de peptides A. Figure 3. Le conception peptidomimétique à base de sucre Ayant ces résultats, nous avons décidé de suivre une autre stratégie en utilisant des mimes d’ d’épingle à cheveux β. Sur la base des quelques données publiées récemment sur des mimes d’épingle à cheveux β, en particulier sur les structures macrocycliques de Nowick,14 comme inhibiteurs de l'agrégation des protéines, nous avons supposé que la pré-structuration des molécules peptidomimétiques pourrait augmenter leur affinité pour les peptides A et donc augmenter leur activité inhibitrice de l'agrégation. Notre conception vers des mimes d’ d’épingle à cheveux β stables, qui pourraient interagir et éventuellement agir en tant que ligand de feuillet β, et inhibiteur de l'agrégation, implique un assemblage d’un échafaudage bifonctionnel dicétopipérazine (DKP-1), un brin peptidomimétique pour stabiliser la formation de feuillets β et enfin une séquence peptidique convenable pour la liaison à la protéine cible (Figure 4(. Figure 4. La structure générale de β-épingle à cheveux DKPest un échafaud dérivé de l'acide L-aspartique et (S)-2,3- acide diaminopropionique, portant les fonctionnalités amino et acide carboxylique dans une relation cis qui est capable de stabiliser les structures en épingle à cheveux lorsqu'il est introduit entre deux séquences peptidiques. Par rapport au travail précédent dans notre groupe, le choix de remplacer l'une des séquences peptidiques par un brin peptidomimétique était destiné à accroître la stabilité métabolique de la molécule vis-à-vis de son utilisation potentielle dans des essais biologiques comme inhibiteur de l'agrégation d'amyloide. Comme brin peptidomimétique, nous avons décidé d'intégrer dans notre séquence le 5-amino2-methoxybenzhydrazide, qui est une partie des mimes de -brin (unité "Hao") reportés par Nowick et ses collègues. L'introduction de 5-amino-2-methoxybenzhydrazide dans les mimes -brin s’est avérée extrêmement efficace pour la formation de feuillets β intermoléculaires avec les parties terminales des protéases du HIV-1 et l'inhibition de leur dimérisation, ainsi que pour augmenter la stabilité métabolique par rapport aux protéases. Enfin, comme pour la séquence peptidique, quatre résidus Gly-Val-Val-Ile ont été introduits. Le séquence GVVI a été choisie parce que c’est la séquence 38-41 de Aβ-1-42 et il a été montré comme interagissant avec l'autre séquence hydrophobe 16-19 (KLVF) dans la structure des protofilaments de Aβ-1-42 par RMN à l'état solide, et dans les oligomères solubles du βpeptide amyloide. Par ailleurs, en vue d'augmenter l'affinité de cette série de mimes d’épingle à cheveux pour A1-42, nous avons fourni à ces molécules la possibilité d’engager également des interactions électrostatiques avec A1-42. A cet effet, le résidu N-terminal a été déprotégé dans toutes les molécules finales en vue de promouvoir des interactions ioniques avec des résidus acides d'A1-42. En effet, plusieurs études expérimentales et computationnelle sur A1-42 ont montré que, en plus des interactions hydrophobes comportant en particulier la séquence 16-21 (KLVFFA), la formation d'un pont salin entre les acides aminés Asp23 et Lys28 pourrait stabiliser un coude impliquant les résidus 24-28.15 Une interaction avec Glu22 pourrait également être promue et bénéfique pour l'activité des molécules, comme suggéré par le travail de T. Schrader.15b Notre groupe a précédemment observé que les interactions ioniques améliorent l'activité inhibitrice des glycopeptides. La synthèse de divers dérivés de l'hydrazide 5-amino-2-méthoxybenzoique contenant l'acétamide et le trifluoroacétamide a été réalisée, et les β-brins préparés ont ensuite été liés à deux échafaudages dicétopipérazines de configuration cis ou trans. La préparation de bras peptidiques suivie de la synthèse peptidique en solution stratégie Boc conduisant à la formation de séquences de tétrapeptide GVVI et KLVF. Les critères étudiés qui peuvent influencer l'activité sur l’oligomérisation précoce et la fibrillation ont été: 1. La structure en épingle à cheveux β: cis contre trans -DKP; la présence de deux bras liés à l'échafaudage par rapport à un seul bras; l'effet du tétrapeptide isolé et les bras peptidomimétiques 2. La séquence peptidique: GVVI (C- résidus de séquence terminale 38-41, séquence complémentaire dans les fibrilles) par rapport KLVF (résidus 16-19, séquence hydrophobe centrale) 3. Le Groupement CH3 par rapport CF3 dans la partie C-terminale des molecules 4. La possibilité de former des interactions électrostatiques: le clivage de la partie N-terminale des molécules; différence entre résidu Lys contre un résidu Val dans le bras peptidomimétique. L'un des composés intéressants, 4 qui contient le bras Val-peptidomimétique et la séquence peptidique GVVI a en outre été étudiée par analyse conformationnelle RMN confirmant la structure en épingle à cheveux. L'évaluation biologique de ce composé a été suivie en utilisant un essai de fluorescence à la ThT, démontrant que cette épingle à cheveux retarde la cinétique d'agrégation en augmentant la phase de latence par un facteur de 2.5. Afin de confirmer la capacité de ce composé à moduler la cinétique d'agrégation, des analyses par microscopie électronique à transmission (MET) ont également été réalisées et les résultats obtenus sont en accord avec les données ThT. D'autre part, l'épingle à cheveux 5 composé de bras Valpeptidomimétique fluoré et la séquence KLVF comme bras peptidique (Figure 5) montre un effet significatif sur la cinétique d'agrégation A1-42. Il peut effectivement retarder la cinétique de oligomérisation confirmée par un essai de fluorescence à la ThT, ainsi que par des analyses de TEM et CE. Donc, en conclusion, les mimes d’épingles à cheveux préparés avec la séquence GVVI ou la séquence KLVF sont capables de retarder la cinétique d'agrégation et nous pouvons les considérer comme des modulateurs de l'agrégation Aß1-42. La présence d'une amine libre à N-terminaison de l'épingle à cheveux a augmenté de manière significative l'activité de toutes les molécules contre l'agrégation de Aß1-42, par rapport à l'activité des composés protégés suggérant que des interactions ioniques sont susceptibles d'être mises en place entre le groupe amino terminal et les résidus acides du peptide amyloide (probablement asp 23 qui est crucial pour la structure en épingle à cheveux de Aß). Figure 5. La structure d'épingles à cheveux avec une activité inhibitrice prometteuse Le DKP2 (la configuration trans) a été généralement utilisé dans notre groupe comme un échafaudage avec la possibilité de construire une structure étendue. La synthèse de la seconde série de molécules conçue contenant trans DKP comme des analogues de l'épingle à cheveux, a été réalisée révélant des résultats biologiques importants. Fait intéressant, la combinaison de DKP2, le brin Val-peptidomimétique fluoré, et la séquence GVVI, le composé 6, accélère la cinétique de l'agrégation de A1-42, conduisant à la formation de fibres qui sont morphologiquement différentes des fibres formées par A confirmés par ThT essai ainsi que ainsi que l'analyse de TEM et CE. De manière surprenante, par modification de l'acide aminé de bras peptidomimétique de la valine à la lysine, nous avons obtenu un composé plus puissant qui retardent la cinétique d'agrégation à un rapport 01:10 de A1-42: composé 7 (Figure 6). Figure 6. Composés contenant DKP trans avec une activité intéressante D'après les résultats obtenus, nous pouvons penser que la présence de groupe CF3 a un rôle important dans la liaison et la modulation de la cinétique d'agrégation de -42. En résumé, des résultats prometteurs ont été obtenus avec les deux échafaudages DKP (cis / trans), différents bras peptidomimétiques dérivés des motifs Nowick avec deux séquences différentes de tétrapeptides. Les résultats de l'essai de fluorescence ThT ont confirmé l'importance de la molécule entière pour moduler les cinétiques d'agrégation de Aß1-42. Les évaluation par CE ont confirmé que les molécules 4, 5, et 6 sont capables de moduler aussi considérablement le procédé d'oligomérisation précoce. Les évaluations cellulaires, sur l'effet de la toxicité Aß1-42 sur cellules de neuroblastome humain, de quelques molécules représentatives et prometteuses sont en cours. 1 M.J. de Vega, M. Martín-Martínez, R.González-Muñiz, Curr. Top. Med. 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Boggetto, S. Sicsic, M. Reboud- Ravaux, S. Ongeri, J. Med. Chem., 2006, 49, 4657.; b) A. Vidu, L. Dufau, L. Bannwarth, JL Soulier, S. Sicsic, U. Piarulli, M. Reboud- Ravaux, S. Ongeri, ChemMedChem., 2010, 5, 1899. 13 a) J. Kaffy, D. Brinet, JL Soulier, L. Khemtémourian, O. Lequin, M. Taverna, B. Crousse, S. Ongeri, Eur. J. Med. Chem., 2014, 86, 752-758. b) J. Kaffy, D. Brinet, KF Fera, C. Bernardi, N. Tonali, JL Soulier, L. Khemtémourian, I. Correia, O. Lequin, M. Taverna, B. Crousse, S. Ongeri, manuscrit en préparation. 14 PN Cheng, C. Liu, M. Zhao, D. Eisenberg, JS Nowick, Nat. Chem., 2012, 4, 927-933. 15 a) MD Smith, L. Cruz, J. Phys. Chem., 2013, 117, 14907-14915. b) K. Hochdörffer, J.-März Berberich, L. Nagel- Steger, M. Epple, W. Meyer-Zaika, AHC Horn, H. Sticht, S. Sinha, G. Bitan, T. Schrader, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 4348-4358.
