(URCA), MOBICYTE, UMR CNRS 7312 ICMR

APR 2015
Evaluation a priori des risques immuno-toxiques associés aux composés
biosourcés d’origines microbiennes – Cas des rhamnolipides.
Hakim Chouki Samaï1, Damien Rioult2, Arnaud Haudrechy3, Elodie Geba1,2, Amandine Sommé1,2, Marc
Ongena4, Sandrine Bouquillon3, Stéphan Dorey5 et Stéphane Betoulle1,2
1Unité
Stress Environnementaux et Biosurveillance des milieux aquatiques, UMR-I 02, Université de Reims Champagne-Ardenne, UFR des Sciences
Exactes et Naturelles, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2
2Plateau technique mobile en cytométrie environnementale MOBICYTE, Université de Reims Champagne-Ardenne/INERIS, UFR des Sciences Exactes et
Naturelles, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2
3Institut de Chimie Moléculaire de Reims UMR CNRS 7312, Université de Reims Champagne-Ardenne, UFR des Sciences Exactes et Naturelles, BP 1039,
51687 Reims Cedex 2.
4Unité de Bio-Industries, Centre de Biophysique Moléculaire Numérique, Unité de Chimie Générale et Organique, Unité de Phytopathologie - Gembloux
Agro-Bio Tech - Université de Liège.
5Unité de Recherche Vignes et Vins de Champagne EA 4770, Université de Reims Champagne-Ardenne, UFR des Sciences Exactes et Naturelles, BP
1039, 51687 Reims Cedex 2.
APR 2015
Nous remercions l’organisme de la SFR Condorcet d’avoir permis la mise
en place du projet D2BIO et de notre collaboration
URVVC – CWBI – ICMR – SEBIO – MOBICYTE
Objectifs du projet
Approche appliquée
 Participation à la vérification de l’innocuité environnementale de biomolécules utilisées dans
l’élicitation des mécanismes de défense des plantes.
 Contexte de l’évaluation a priori du risque écotoxicologique
Approche fondamentale
• Immunologie comparée des réponses cellulaires liées à l’immunité chez les organismes
végétaux et animaux
Les rhamnolipides
 Alternative aux pesticides issus de la chimie de synthèse
 Biomolécules d’origines bactériennes : Elicitation de la défense immunitaire des plantes
 Si effets bénéfiques pour les plantes
Effets toxicologiques pour organismes non cibles?
O
O
Rhamnolipides
O
HO
CH
CH2
( CH2 ) 6
CH3
C
O
O
CH
CH2
C
O
H
( CH2 ) 6
CH3
CH3
 Rhamnolipides : biosurfactants d’origine bactérienne
(Pseudomonas aeruginosa) (Vatsa et al. 2010)
O
OH
O
HO
CH3
OH
OH
 Molécules considérées comme ayant une activité « Endotoxine-Like » :
similitude avec les endotoxines bactériennes lipopolysaccharidiques
ou LPS (Andrä et al. 2006) => Risque toxicologique pro-inflammatoire ?
 Application en agriculture comme biofongicide (Etats Unis), Exemple du Zonix
 Application possible dans d’autres domaines : Bioremédiation, décontamination, biomédicale…
(Vatsa et al. 2010, Cameotra et al. 2010, Cameorta & Makkar. 2004)
Rhamnolipides
(URVVC – EA 4770) Varnier et al. 2009
 Mort cellulaire programmée chez les
plantes à fortes doses
• Potentiel éliciteur d’induction d’une activité oxydative
chez les plantes
Rhamnolipides
puis chitosan
Rhamnolipides +
chitosan
~ 40μM
Chitosan T0 et à
6h
Rhamnolipides
seuls ou eau
Protocole expérimental
Modèle animal aquatique :
Cellules immunitaires de gardon (Rutilus rutilus): Cultures primaires de leucocytes
spléniques
 Exposition des leucocytes selon différents temps (Temps 0,1,6,7,12 et 13 heures)
 Différentes concentrations de rhamnolipides (10 nM, 100 nM , 1 et 10 μM)
Mesure de la cytotoxicité des rhamnolipides par le test à l’Iodure de Propidium
(cytométrie en flux) :
 Pré-incubation (12 heures) des leucocytes spléniques avec les différentes
concentrations de rhamnolipides
 Mesure de la production de ROS (espèces réactives d’oxygène) intra et extra
cellulaire des leucocytes induite par une molécule pro-oxydative connue (Phorbol
Myristate Acétate, PMA) (Technique de chimioluminescence)
Cytotoxicité des rhamnolipides
Valeurs médiane (min-max)
Temps 13h
Mortalité
cellulaire
Temps 7h
Mortalité
cellulaire
Mortalité
cellulaire
Temps 1h
Temps 12h
Mortalité
cellulaire
Temps 6 h
Mortalité
cellulaire
Mortalité
cellulaire
Temps 0
N = 6, RL : Rhamnolipides
* : Test statistique Mann-Whitney, différence significative avec le témoin
Rhamnolipides et activité oxydative – sans incubation
(+)
Témoin négatif (DPBS)
Témoin Positif (PMA 500Ng/mL)
Rhamnolipides 10 nM
Rhamnolipides 100 nM
Rhamnolipides 1 M
Rhamnolipides 10 M
(-)
Valeurs médianes
Ajout de PMA / Rhamnolipides
N = 10
Rhamnolipides et activité oxydative – avec pré-incubation
(+)
Témoin négatif (DPBS)
Témoin Positif (PMA 500Ng/mL)
Rhamnolipides 10 nM
Rhamnolipides 100 nM
Rhamnolipides 1 M
Rhamnolipides 10 M
Valeurs médianes
(-)
Ajout de PMA
N = 15
Rhamnolipides et activité oxydative – avec pré-incubation
RL : Rhamnolipides
N = 15
* : Test statistique MannWhitney, différence significative
avec le témoin négatif
Anova Kruskal-Walis p = 0
Conclusion et perspectives
 Cytotoxicité des rhamnolipides vis-à-vis des leucocytes spléniques de gardon à relativiser en
regard de l’approche expérimentale ex vivo mise en jeu => poursuite de travaux sur des lignées
cellulaires
 Stimulation de l’activité oxydative par les doses non cytotoxiques : Confirmation de l’action
observée chez les plantes.
Effets positifs (immuno-stimulation et amélioration des capacités de défenses) ou négatifs
(immuno-stimulation et inflammation) de ces composés pour la fonction immunitaire d’espèces
piscicoles d’élevage ? => Nouveaux débouchés pour ces biomolécules…???
Bibliographie:





Cameotra Swaranjit Singh and Makkar Randhir S. 2004. Recent applications of biosurfactants as biological and
immunological molecules. Current Opinion in Microbiology 7:262-266
Cameotra Swaranjit Singh, Makkar Randhir S., Kaur Jasminder, Mehta S.K. Synthesis of Biosurfactants and Their
Advantages to Microorganisms and Mankind. IN : Biosurfactants. Ramkrishna Sen. 2010. Landes Bioscience and Springer
Science+Business Media.
Parul Vatsa, Lisa Sanchez, Christophe Clement, Fabienne Baillieul, Stephan Dorey. 2010. Rhamnolipid Biosurfactants as
New Players in Animal and Plant Defense against Microbes . International Journal of Molecular Sciences 11:5095-5108
Andrä Jörg, Rademann Jörg, Howe Jörg, Koch Michel H.J., Heine Holger, Zähringer Ulrich, Brandenburg Klaus. 2006.
Endotoxin-like properties of a rhamnolipid exotoxin from Burkholderia (Pseudomonas) plantarii: immune cell stimulation
and biophysical characterization. Biologiacl Chemistry 387:301-310
Varnier A.L., Sanchez L., Vatsa P., Boudesocque L., Garcia-Brugger A., Rabenoelina F., Sorokin A., Renault J.H., Kauffmann
S., Pugin A., Clement C., Baillieul F., Dorey S. 2009. Bacterial rhamnolipids are novel MAMPs conferring resistance to
Botrytis cinerea in grapevine. Plant, Cell & Environment 32:178-193