PARTIE II 2. Les cellules souches/progénitrices neurales

UNIVERSITE DE NANTES
FACULTE DE MEDECINE
INTERACTIONS CELLULES SOUCHES/PROGENITRICES
NEURALES – LYMPHOCYTES T : ETUDE IN VITRO ET
PERSPECTIVES POUR LA TRANSPLANTATION
THESE DE DOCTORAT
Ecole Doctorale BIOLOGIE-SANTE
Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité : NeuroImmunologie
Présentée et soutenue publiquement par
Virginie BONNAMAIN
Le 04 décembre 2009 devant le jury ci-dessous :
Président
Rapporteurs
Valérie CORONAS, Docteur, Poitiers
Brigitte LE MAUFF, Professeur, Caen
Examinateurs
Laure COULOMBEL, Professeur, Paris
Pascal DERKINDEREN, Professeur, Nantes
Directeur de thèse
Philippe NAVEILHAN, Docteur, Nantes
Co-encadrant de thèse
Isabelle NEVEU, Docteur, Nantes
________________________________________________________________________________________________________Sommaire
SOMMAIRE
REMERCIEMENTS........................................................................................................................................................................ I
SOMMAIRE................................................................................................................................................................................... III
LISTE DES ILLUSTRATIONS ................................................................................................................................................VII
LISTE DES TABLEAUX............................................................................................................................................................... X
LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................................................................. XII
AVANT-PROPOS .......................................................................................................................................................... 1
INTRODUCTION................................................................................................................................................ 7
PARTIE I : Présentation des cellules souches ................................................................................................ 9
1.1. Historique ..................................................................................................................................................................... 9
1.2. Définitions.................................................................................................................................................................. 10
1.2.1. Auto-renouvellement .................................................................................................................................... 10
1.2.2. Prolifération ...................................................................................................................................................... 12
1.2.3. Potentiel de différenciation ........................................................................................................................ 13
1.3. Classification ............................................................................................................................................................. 14
1.3.1. Les cellules souches embryonnaires ...................................................................................................... 15
1.3.2. Les cellules souches adultes ....................................................................................................................... 18
Les cellules souches fœtales ................................................................................................................... 18
Les cellules souches adultes tissulaires ............................................................................................. 20
Les cellules souches adultes « généralistes » .................................................................................. 21
1.3.3. Les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) ............................................................ 22
PARTIE II : Les cellules souches/progénitrices neurales ........................................................................ 24
2.1. Les cellules du système nerveux central ....................................................................................................... 24
2.2. Définition des cellules souches neurales ...................................................................................................... 25
2.3. Distinction entre cellule souche et cellule progénitrice ......................................................................... 26
2.4. Les cellules souches/progénitrices neurales in vivo ................................................................................ 27
2.4.1. Chez l’embryon ................................................................................................................................................ 27
2.4.2. Chez l’adulte ...................................................................................................................................................... 28
La zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux .................................................................... 30
La zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe ........................................................ 31
Origine et identification des nouveaux neurones formés .......................................................... 34
Neurogénèse et zones non neurogéniques....................................................................................... 35
2.4.3. Concept de niche neurogénique ............................................................................................................... 36
III
________________________________________________________________________________________________________Sommaire
2.5. Les cellules souches/progénitrices neurales in vitro ............................................................................... 38
2.5.1. Mise en culture et amplification ............................................................................................................... 38
2.5.2. Marqueurs des cellules souches/progénitrices neurales .............................................................. 40
2.5.3. Potentiel de différenciation ........................................................................................................................ 42
PARTIE III : Situation immunologique particulière du SNC........................................................................... 45
3.1. Présentation générale du système immunitaire périphérique............................................................ 45
3.1.1. Les principales cellules du système immunitaire périphérique ................................................. 46
Les granulocytes .......................................................................................................................................... 47
Les monocytes/macrophages ................................................................................................................ 48
Les cellules dendritiques ......................................................................................................................... 48
Les cellules NK (natural killer) .............................................................................................................. 49
Les lymphocytes B ...................................................................................................................................... 50
Les lymphocytes T ...................................................................................................................................... 50
3.1.2. Système lymphatique et présentation antigénique .......................................................................... 52
3.1.3. Transplantation et système immunitaire ............................................................................................. 53
3.2. Particularités immunologiques du SNC ......................................................................................................... 56
3.2.1. La barrière hémato-encéphalique ........................................................................................................... 56
Structure de la BHE .................................................................................................................................... 57
Fonction de la BHE ..................................................................................................................................... 59
Le trafic leucocytaire ................................................................................................................................. 60
3.2.2. Un drainage lymphatique particulier ..................................................................................................... 64
3.2.3. Cellules présentatrices d’antigène du SNC et expression du CMH ............................................. 66
La microglie et les macrophages péri-vasculaires ........................................................................ 66
Les astrocytes ............................................................................................................................................... 67
3.3. Transplantation et système nerveux central............................................................................................... 68
3.3.1. Allotransplantation ........................................................................................................................................ 69
3.3.2. Xénotransplantation ...................................................................................................................................... 71
PARTIE IV : Utilisation thérapeutique des CSPN......................................................................................... 75
4.1. Généralités sur la thérapie cellulaire et les cellules souches................................................................ 75
4.2. CSPN et thérapie cellulaire ................................................................................................................................. 76
4.2.1. Induction de la neurogénèse endogène ................................................................................................. 76
4.2.2. Transplantation des CSPN........................................................................................................................... 78
Source cellulaire .......................................................................................................................................... 78
Voie d’administration ................................................................................................................................ 81
Effets thérapeutiques ................................................................................................................................ 82
Induction de niches ectopiques............................................................................................................. 84
IV
________________________________________________________________________________________________________Sommaire
OBJECTIFS ................................................................................................................................................................. 87
MATERIELS ET METHODES .................................................................................................................. 89
Article : Neural stem/progenitor cells and immunoregulation........................................................................ 90
Informations complémentaires ................................................................................................................................... 103
RESULTATS ..................................................................................................................................................... 107
ARTICLE 1 ............................................................................................................................................................................ 108
1. Introduction ................................................................................................................................................................ 109
2. Article: Trophic and immunoregulatory properties of neural stem/progenitor cells: benefit for
intracerebral transplantation .................................................................................................................................. 113
3. Discussion .................................................................................................................................................................... 140
ARTICLE 2 ............................................................................................................................................................................ 147
1. Introduction ................................................................................................................................................................ 148
2. Article: In vitro characterization of the immunosuppressive properties of neural
stem/progenitor cells : a role for HO-1................................................................................................................ 150
3. Discussion .................................................................................................................................................................... 174
RESULTATS COMPLEMENTAIRES : Effet de l’interlekine 2 sur la prolifération et la différenciation
des cellules souches/progénitrices neurales ......................................................................................................... 180
1. Introduction ................................................................................................................................................................ 181
Présentation du système IL-2 / récepteur à l’IL-2 .......................................................................................... 183
1.1. Structure de l’IL-2 et de son récepteur .................................................................................................... 183
1.2. Activités biologiques de l’IL-2 ..................................................................................................................... 184
1.3. Rôles physiologiques de l’IL-2 et applications cliniques.................................................................. 185
1.4. IL-2 et système nerveux central ................................................................................................................. 186
2. Résultats ....................................................................................................................................................................... 188
2.1. Effet direct de l’IL-2 sur la prolifération des CSPN ............................................................................. 188
2.2. Effet indirect de l’IL-2 sur la différenciation des CSPN..................................................................... 193
3. Discussion .................................................................................................................................................................... 197
V
________________________________________________________________________________________________________Sommaire
DISCUSSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................................... 202
Objectifs des travaux de thèse ...................................................................................................................................... 204
Rôle de l’hème-oxygénase 1 dans l’activité suppressive des CSPN .............................................................. 204
Effet in vitro de l’IL-2 sur la prolifération et la différenciation des CSPN .................................................. 206
Bilan ........................................................................................................................................................................................ 208
CONCLUSION ......................................................................................................................................................... 209
REFERENCES ......................................................................................................................................................... 210
ANNEXES................................................................................................................................................................. 246
VI
_____________________________________________________________________________________________________ Illustrations
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1 : Définition des cellules souches ..................................................................................................................... 10
Figure 2 : Auto-renouvellement et division asymétrique ....................................................................................... 11
Figure 3 : Prolifération des cellules souches ................................................................................................................ 12
Figure 4 : Les différents types de cellules souches .................................................................................................... 14
Figure 5 : Technique de culture des cellules souches embryonnaires de souris........................................... 15
Figure 6 : Les cellules souches germinales .................................................................................................................... 19
Figure 7 : Les cellules souches adultes tissulaires .................................................................................................... 20
Figure 8 : Définition des cellules souches neurales (CSN) ...................................................................................... 25
Figure 9 : Neurogénèse corticale chez l’embryon....................................................................................................... 28
Figure 10 : Neurogénèse adulte ......................................................................................................................................... 29
Figure 11 : Neurogénèse dans la zone sous-venticulaire (ZSV) des ventricules latéraux ......................... 31
Figure 12 : Neurogénèse dans la zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe ........................ 33
Figure 13 : Représentation schématique des étapes de prolifération des cellules souches neurales in
vitro ....................................................................................................................................................................... 40
Figure 14 : Vue d’ensemble de l’hématopoïèse ........................................................................................................... 47
Figure 15 : Activation des lymphocytes T ...................................................................................................................... 51
Figure 16 : Structure d’un ganglion lymphatique....................................................................................................... 53
Figure 17 : Mécanismes potentiellement impliqués dans le statut « immuno-privilégié » du système
nerveux central ................................................................................................................................................ 55
Figure 18 : Première mise en évidence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) .................................. 57
Figure 19 : Structure de la barrière hémato-encéphalique (BHE) ...................................................................... 59
Figure 20 : Organisation anatomique du cerveau montrant les principales voies d’entrée des
leucocytes ........................................................................................................................................................... 61
Figure 21 : Extravasation des leucocytes à travers la barrière hémato-encéphalique ............................... 62
VII
_____________________________________________________________________________________________________ Illustrations
Figure 22 : Le drainage antigénique au sein du système nerveux central (SNC) .......................................... 65
Figure 23 : Concept de « niche atypique » ..................................................................................................................... 85
Figure 24 : Etude de la prolifération des lymphocytes T activés en fonction du milieu de culture....103
Figure 25 : Morphologie des lymphocytes T de rat naïfs ou stimulés, cultivés en présence ou non de
CSPN de rat irradiées (30 Gy), après 72h de culture dans du milieu RPMI/N2 2.5% SVF.
.......................................................................................................................................................................... 104
Figure 26 : Etude de l’impact de la composition du milieu de culture sur la mort cellulaire des cellules
T activées. … ................................................................................................................................................ 105
Figure 27 : Etude de l’impact de la composition du milieu de culture sur la mort cellulaire des cellules
ganglionnaires activées. ......................................................................................................................... 106
Figure 28 : Cinétique d’infiltration de la xénogreffe par les cellules immunitaires activées................. 110
Figure 29 : Schéma du protocole utilisé pour l’étude comparative de la xénotransplantation de
neuroblastes fœtaux porcins et de cellules souches/progénitrices neurales (CSPN)
porcines dans le cerveau de rat non lésé, non immunosupprimé ........................................ 111
Figure 30 : Résultats préliminaires d’immunisation de rats Lewis 1A........................................................... 144
Figure 31 : Expression des transcrits des hème-oxygénases 1 et 2 et implication dans l’effet
immunosuppresseur des CSPNp......................................................................................................... 145
Figure 32 : Analyse du phénotype des lymphocytes T après 72h de co-culture avec les CSPNp
irradiées ........................................................................................................................................................ 146
Figure 33: Etude de la mort cellulaire des lymphocytes T de rat cutivés en présence ou non de CSPN
de rat.................................................................................................................................................................. 176
Figure 34 : Analyse par cytométrie en flux de l’expression de CD25 dans une culture de CSPN de rat
après 10 jours de prolifération en présence de bFGF ................................................................... 182
Figure 35 : Schéma du récepteur à l’interleukine-2 ............................................................................................... 183
Figure 36 : Effet de l’interleukine-2 sur l’incorporation de thymidine tritiée et sur le nombre de
neurosphères formées dans une culture de cellules souches/progénitrices neurales à 5
jours ................................................................................................................................................................... 189
Figure 37 : Analyse dose réponse de l’effet de l’IL-2 sur le nombre de neurosphères primaires
formées dans une culture de CSPN. Mise en évidence par RT-PCR et
immunocytofluorescence de l’expression de la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25)
par des CSPN de rat cultivées en présence d’IL-2 ....................................................................... 190
Figure 38 : Analyse de la morphologie , de la prolifération et de l’expression de la nestine des
neurosphères primaires après 5 jours de culture en présence de bFGF ou d’IL-2 naturelle
de rat.................................................................................................................................................................. 191
VIII
_____________________________________________________________________________________________________ Illustrations
Figure 39 : Analyse du diamètre moyen des neurosphères formées et du nombre de cellules vivantes
après dissociation mécanique, en fonction des conditions de culture des CSPN .............. 192
Figure 40 : Comparaison de la morphologie des neurosphères et du phénotype des cellules les
constituant en conditions de différenciation, après une culture en présence de bFGF ou
d’IL-2 ................................................................................................................................................................. 194
Figure 41 : Etude par immunocytofluorescence de la différenciation des neurosphères issues d’une
culture en présence de bFGF (25 ng/mL) ou d’IL-2 (5 U/mL) .................................................. 195
Figure 42 : Quantification par cytométrie en flux de l’expression des marqueurs Nestine, GFAP et
TUJ-1 par des cellules issues de la différenciation de neurosphères cultivées en présence
de bFGF ou d’IL-2 ......................................................................................................................................... 196
IX
_________________________________________________________________________________________________________ Tableaux
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Distinctions entre cellules souches neurales (CSN) et cellules progénitrices neurales
(CPN) .................................................................................................................................................................... 26
Tableau 2 : Expression de molécules extracellulaires par les CSPN de rat en culture ................................ 42
Tableau 3 : Tableau récapitulatif des voies d’accès, du phénotype et de la fonction de leucocytes
migrant dans le système nerveux central (SNC) ................................................................................ 64
Tableau 4 : Avantages et désavantages des sources cellulaires pour la transplantation intracérébrale
................................................................................................................................................................................. 73
X
_____________________________________________________________________________________________________Abréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
ACTH : adreno CorticoTropic Hormone
ADCC : antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
ADN : acide désoxyribonucléique
ARN : acide ribonucléique
AVC : accident vasculaire cerebral
AVP : arginin vasopressin
BDNF : brain-derived growth factor
Blimp-1 : B lymphocyte maturation protein-1
BHE : barrière hémato-encéphalique
BMP4 : bone morphogenetic protein 4
BrdU : bromodéoxyuridine
CD : cluster de différenciation
CGP : cellule germinale primordiale
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
CMR : courant migratoire rostral
CNTF : ciliary neurotrophic factor
CO : carbon monoxide
CPA : cellule présentatrice d’antigène
CPN : cellule progénitrice neurale
CRF : corticotropin releasing factor
CSH : cellule souche hématopoïétique
CSM : cellule souche mésenchymateuse
CSN : cellule souche neurale
CSPN : cellule souche/progénitrice neurale
CTL : cytotoxic T lymphocyte
DCX : doublecortin
EAE : encéphalomyélite allergique expérimentale
EG : embryonic germ
EGF : epidermal growth factor
ES : embryonic stem
FDA : food and drug administration
(b)FGF : (basic) fibroblast growth factor
GDNF : glial-cell-line-derived growth factor
GFAP : glial fibrillary acidic protein
GFP : green fluorescent protein
HEV : high endothelial venules
HO : heme oxygenase
Ig : immunoglobuline
IGF-1 : insulin growth factor-1
IP : iodure de propidium
iPS : induced pluripotent stem
IVG : interruption volontaire de grossesse
KO : knock-out
XI
_____________________________________________________________________________________________________Abréviations
LAK : lymphokine-activated killer
LCR : liquide céphalo-rachidien
LIF : leukemia inhibitory factor
LPS : lipopolysaccharide
MBP : myelin basic protein
MCP-1 : monocyte chemotactic protein-1
MPTP : 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine
NEP : neuroépithéliale
NGF : nerve growth factor
NK : natural killer
NO : nitric oxide
NOS : nitric oxide synthase
OHDA : hydroxydopamine
PAEC : porcine aortic endothelial cell
PCR : polymerase chain reaction
PDGF : platelet-derived growth factor
PG : progéniteur glial
PGE2 : prostaglandine E2
PN : progéniteur neuronal
PRR : patter recognition receptor
PSA-NCAM : poly-sialated neural cell adhesion molecule
RT : reverse transcription
SLA : sclérose latérale amyotrophique
SNC : système nerveux central
SnPP : tin-protoporphyrin-IX
SVF : sérum de veau fœtal
TCR : T cell receptor
TEP : tomographie à emission de positrons
TH : tyrosine hydroxylase
TNF : tumor necrosis factor
UPDRS : unified parkinson’s disease rating scale
VEGF : vascular endothelial growth factor
ZSG : zone sous-granulaire
ZSV : zone sous-ventriculaire
ZV : zone ventriculaire
XII
A mon père,
XIII
AVANT-PROPOS
1
___________________________________________________________________________________________________ Avant-propos
AVANT-PROPOS
Le cerveau, bien que le fruit d’intenses études depuis plus de deux siècles, demeure toujours à
l’heure actuelle l’un des organes les plus mystérieux et méconnus du corps humain. La recherche en
Neurosciences, telle que nous la connaissons aujourd’hui, s’inscrit dans une démarche intégrative,
s’ouvrant à des domaines comme l’imagerie, la robotique, la modélisation informatique, la physique
ou encore la chimie. Si cette interdisciplinarité vise à améliorer la compréhension des mécanismes
neuraux régissant les fonctions les plus complexes du cerveau, elle se base pour autant sur les
connaissances fondamentales du système nerveux central (SNC), résultant du travail de plusieurs
générations de scientifiques.
Dès le milieu du XIXème siècle, Wilhelm His, anatomiste suisse et inventeur du microtome,
donna naissance à la neurobiologie développementale, en fournissant de précieux éléments
morphologiques et histologiques des différents types cellulaires présents dans le cerveau
embryonnaire. En 1886, il avança notamment l’idée que le corps cellulaire d’un neurone et ses
neurites forment des entités indépendantes et, en 1889, il fut le premier à employer le terme de
dendrite pour qualifier certains de ces prolongements.
Au début du XXème siècle, les recherches sur le cerveau s’orientèrent vers les origines des
cellules nerveuses. A l’époque, le célèbre neuroanatomiste espagnol Santiago Ramón y Cajal établit,
sous le dicton « pas de nouveaux neurones après la naissance », que la neurogénèse, processus de
production de neurones intégrés fonctionnels à partir de cellules souches ou progénitrices, se
déroulait uniquement au cours du développement embryonnaire du SNC chez les mammifères
(Ramón y Cajal 1913). Si Ramon y Cajal avait déjà avancé l’idée d’une « plasticité » neuronale dès
1894 pour caractériser les phénomènes régénératifs se produisant dans le SNC sous certaines
conditions (Stahnisch & Nitsch 2002), cette idée demeura ambiguë et en son temps, peu considérée.
Le postulat « tout peut mourir, rien ne peut régénérer » (Ramón y Cajal, 1928) fut donc perçu comme
le dogme central des neuroscientifiques pendant près d’un siècle (Gross 2000), le manque de
méthodes appropriées à l’époque n’ayant pas permis de réfuter cette théorie, quelques auteurs ayant
pourtant clairement décrit que des cellules se divisaient dans certaines régions précises du SNC
adulte (Allen 1912).
Les travaux de Joseph Altman dans les années 1960, bien que largement ignorés, avancèrent
les preuves de l’existence de neurones proliférant dans plusieurs zones du cerveau de rat adulte
(Altman 1962 ; Altman 1963), notamment au niveau du gyrus denté de l’hippocampe (Altman & Das
1965; Altman & Das 1965), du néocortex (Altman 1966; Altman & Das 1966) et du bulbe olfactif
(Altman 1969a; Altman 1969b). Mais ce n’est qu’à la fin des années 1970 que l’hypothèse d’une
2
___________________________________________________________________________________________________ Avant-propos
neurogénèse chez l’adulte réapparut, portée par les travaux de Michael Kaplan sur la survie à long
terme des nouveaux neurones hippocampaux (Kaplan & Hinds 1977; Kaplan & Bell 1983).
Ces études commencèrent à ébranler la vision dogmatique d’un tissu nerveux dépourvu de
création de nouveaux neurones à l’état adulte qui prédominait jusqu’alors. Il fallut néanmoins
attendre le début des années 1990 et la découverte par Brent Reynolds et Samuel Weiss de la
présence de cellules souches dans le cerveau adulte de rongeurs (Reynolds & Weiss 1992),
observation confirmée plus tard chez l’homme (Kukekov et al. 1999), pour véritablement la faire
voler en éclat. A cette découverte quasi simultanée de zones de neurogénèse et de cellules souches
chez l’adulte s’est ajouté le concept de progéniteurs communs pour les neurones et les astrocytes,
modifiant radicalement la conception de l’origine développementale des neurones et des cellules
gliales.
Si le XXème siècle a vu l’effondrement du dogme de l’absence de neurogénèse dans le système
nerveux adulte, il fut cependant le témoin de la naissance d’un autre postulat : celui du statut
« immuno-privilégié » du cerveau.
L’inflammation est le phénomène primaire élaboré par le système immunitaire en réponse à
des signaux de danger provoqués par une infection ou une irritation liée à l’intrusion de pathogènes.
La propriété particulière du système immunitaire de discriminer le Soi du non Soi lui permet
d’identifier et d’éliminer ces agents infectieux. Ce même mécanisme est à l’origine du principe de
rejet en transplantation.
Cependant, depuis les travaux de Van Dooremal en 1873 sur la greffe de cellules tumorales
dans la chambre antérieure de l’œil, il est connu que certains sites spécifiques de l’organisme
présentent des réactions immunitaires limitées. En 1948, Sir Peter Medawar, prix Nobel de médecine
et pionnier dans le domaine de l’immunologie de la transplantation, inventa le terme de « privilège
immunologique », décrivant une inflammation restreinte après inoculation de tissus allogéniques
dans certains organes dont le cerveau et la chambre antérieure de l’œil (Medawar 1948). Plus tard,
l’étudiant de Medawar, Rupert Billingham, étendit cette définition à une propriété particulière de
quelques organes ou tissus de bénéficier d’une survie plus longue, voire indéfinie, en cas de greffe à
des endroits conventionnels de l’organisme. Ainsi, au cours des années, la cornée, la chambre
antérieure de l’oeil (Billingham et Boswell, 1953 ; Hori et al. 2000) ou les testicules (Head et al. 1983)
furent des exemples très étudiés de tissus immuno-privilégiés. Dans ce contexte, le SNC et le système
immunitaire étaient traditionnellement perçus, pendant la majeure partie du siècle dernier, comme
des entités morphologiques et fonctionnelles indépendantes. Cette vision était supportée par
plusieurs éléments : l’existence d’une barrière hémato-encéphalique (BHE) empêchant les échanges
entre un grand nombre de molécules solubles du sang et du cerveau telles que les facteurs de
croissance, cytokines ou immunoglobulines (Goldstein & Betz 1983; Joó 1993), une absence
3
___________________________________________________________________________________________________ Avant-propos
d’expression des antigènes du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) par les cellules neurales
(Barker & Billingham 1977), et aucune preuve de l’existence de cellules présentatrices d’antigène
professionnelles, comme les cellules dendritiques, au sein du SNC. Les nouvelles découvertes de ces
deux dernières décennies ont cependant remis en cause le principe de privilège immunologique du
cerveau au sens strict, puisqu’il est maintenant établi l’existence d’un drainage lymphatique étendu
au SNC (Hatterer et al. 2006) et le passage régulier de leucocytes à travers la BHE (Wekerle et al.
1987; Hickey 1991). Ainsi, le cerveau est désormais plus volontiers considéré comme un organe
« immunologiquement particulier », et il est maintenant communément admis qu’il existe une forte
communication bidirectionnelle entre le système immunitaire et le système nerveux.
Pour autant, ce stimulant domaine de recherche qu’est la NeuroImmunologie telle que nous la
connaissons aujourd’hui, est très longtemps resté une discipline presque anecdotique, tapie dans
l’ombre des grands courants dominants de l’Immunologie et des Neurosciences. Il aura fallu attendre
une évolution significative de la communauté scientifique vers la pensée holistique au cours du XXème
siècle pour qu’explosent enfin les recherches transversales et interdisciplinaires visant à explorer les
interactions entre les différents systèmes et constituants d’un organisme vivant. Ce phénomène
s’appliqua aussi aux cellules souches dès le début des années 2000.
Les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN) ont largement été proposées comme
alternative aux neuroblastes fœtaux pour des stratégies thérapeutiques de remplacement cellulaire
dans le cadre de maladies neurodégénératives ou de traumatisme cérébral, du fait de la possibilité de
les multiplier in vitro, de leur capacité de survie, de migration et de différenciation en cellules
neurales in vivo. Si le bénéfice de la greffe de CSPN a été montré dans plusieurs modèles précliniques
de troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson (Richardson et al. 2005), de Huntington
(McBride et al. 2004) ou la sclérose en plaques (Pluchino et al. 2003), et aussi dans d’autres
pathologies comme l’ischémie-reperfusion rénale (Wang et al. 2009a), les différents mécanismes par
lesquels ces cellules exercent leur pouvoir thérapeutique ne sont toujours pas clairement définis.
Alors que le remplacement des cellules perdues ou endommagées était jusqu’alors présumé comme
étant le mécanisme thérapeutique majeur des cellules souches, il est désormais clair que les cellules
souches somatiques transplantées peuvent induire plusieurs effets positifs au-delà du remplacement
cellulaire en lui-même. En effet, il a récemment été montré dans plusieurs types de cellules souches
(embryonnaires et adultes comme les cellules souches mésenchymateuses ou neurales) un fort
potentiel immunosuppresseur (Fändrich et al. 2002; Zappia et al. 2005; Einstein et al. 2003), très
favorable à l’utilisation de ces cellules pour combattre les maladies à composante immunitaire,
comme par exemple la sclérose en plaques. Il est également envisageable que les CSPN induisent une
réparation cérébrale au travers de leurs propriétés intrinsèques de neuroprotection et
4
___________________________________________________________________________________________________ Avant-propos
d’immunomodulation, en libérant directement au niveau du site lésé un ensemble de molécules
(substances immunomodulatrices, facteurs de croissance neurotrophiques ou encore molécules de
régulation
des
cellules
souches),
temporairement
et
spatialement
orchestrées
par
le
microenvironnement, tout d’abord au niveau de la niche où se trouvent localisées ces cellules. Ainsi,
de cette capacité qu’auraient les cellules souches en général, et en particulier les CSPN, à adapter leur
devenir et leur fonctionnement à des besoins environnementaux spécifiques, est né le concept de
« plasticité thérapeutique » (Pluchino et al. 2009), dont une connaissance plus approfondie devrait
aboutir à la mise en place de traitements plus efficaces.
Par ailleurs, et de façon plus générale, il convient de retenir que l’identification d’un
marqueur spécifique des CSPN, la standardisation des procédés de culture et d’amplification des
cellules, la connaissance précise des mécanismes impliqués dans leur effet immunosuppresseur,
représentent sans doute des étapes critiques pour asseoir l’utilisation des CSPN comme stratégie
thérapeutique restauratrice dans le cadre d’affections neurologiques dégénératives ou traumatiques,
ainsi que pour le développement d’une nouvelle utilisation de ces cellules comme thérapie
immunosuppressive pour le traitement des maladies auto-immunes.
Chacun des points mentionnés dans le paragraphe précédent sera abordé dans le présent
travail de thèse, sous forme de quatre chapitres successifs :
- une introduction bibliographique. Nous y présenterons de façon générale les cellules
souches, en nous attardant plus particulièrement sur les propriétés fondamentales des cellules
souches/progénitrices neurales (CSPN), sur l’importance de l’identification de marqueurs
extracellulaires permettant de mieux les identifier et sur le rôle fondamental du concept de « niche »
et du microenvironnement qui s’y trouve. Les parties suivantes de cette introduction seront
orientées vers la description des particularités immunologiques du système nerveux central afin de
mieux cerner les avantages et limites de la transplantation cellulaire intracérébrale. Enfin, nous
évoquerons les potentialités thérapeutiques des CSPN, notamment leur bénéfice comparé aux
neuroblastes fœtaux dans le cadre d’une greffe intracérébrale. Nous décrirons brièvement leurs
effets réparateurs, neuroprotecteurs et immunomodulateurs.
Sur la base de ces connaissances théoriques, nous formulerons l’hypothèse de recherche de
ce travail de thèse, dont l’objectif global a été d’étudier les interactions cellulaires et moléculaires
entre les CSPN et les lymphocytes T, in vitro.
5
___________________________________________________________________________________________________ Avant-propos
- un chapitre matériels et méthodes. Présenté sous forme d’un article scientifique rédigé et
soumis pour publication dans un ouvrage de méthodologies et techniques, nous y décrirons de façon
détaillée la méthode de culture des CSPN ainsi que le protocole original que nous avons mis en place
afin d’étudier les propriétés modulatrices de ces cellules envers la prolifération des lymphocytes T.
- les résultats. Dans ce chapitre seront exposés les résultats obtenus pendant ces trois
années de doctorat sous la forme de deux articles scientifiques et d’une partie résultats
complémentaires. Le premier article (soumis), initié dans notre équipe en 2007 par les expériences
de Delphine Michel-Monigadon, est une analyse comparative de la xénogreffe de neuroblastes
foetaux et de CSPN de porc dans le cerveau de rat, avec une analyse in vitro des mécanismes
potentiels à la base de la survie prolongée de ces dernières. Le second article (en préparation)
concerne
l’étude
approfondie
des
mécanismes
moléculaires
régissant
le
potentiel
immunosuppresseur des CSPN, ainsi que les conclusions qui s’imposent quant-à leur possible
utilisation comme traitement immunosuppresseur pour les affections à composante immune.
L’objectif global de nos travaux étant de mieux caractériser les interactions entre les CSPN et
les lymphocytes T, nous avons également entrepris d’observer l’influence indirecte des cellules T sur
le comportement des CSPN in vitro. Ainsi, la partie résultats complémentaires expose les données
préliminaires que nous avons obtenues sur les effets de l’interleukine-2, une cytokine proinflammatoire sécrétée majoritairement par les lymphocytes T activés, sur la prolifération et le
devenir des CSPN.
- Enfin, un chapitre de discussion générale des résultats obtenus au cours de ce travail de
thèse et les perspectives qu’ils soulèvent pour la continuité du projet.
6
INTRODUCTION
7
PARTIE I
Les cellules souches
8
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
PARTIE I
Si les cellules souches fascinent certains chercheurs, scientifiques et cliniciens depuis plus
d’un siècle, elles attirent également l’attention du grand public de part les intensifs débats éthiques et
légaux qu’elles soulèvent. En effet, la recherche sur les cellules souches est un enjeu majeur des
prochaines décennies, et leur utilisation en médecine régénérative représente un espoir pour des
millions de personnes atteintes de maladies et de lésions dégénératives dans le monde. Aux EtatsUnis, huit ans après les restrictions imposées par le président George W. Bush, son successeur Barack
Obama vient d'autoriser la reprise des recherches sur les cellules souches embryonnaires. En cette
année de révision de la loi bioéthique dans notre pays, il convient, avant d’aborder la question des
cellules souches/progénitrices neurales qui ont fait l’objet de ces travaux de thèse, de revenir sur les
différents types de cellules souches présents dans l’organisme, et sur certaines de leurs propriétés
fondamentales.
1. Présentation des cellules souches
1.1. Historique
Le terme « cellule souche » est apparu dans la littérature dès la fin du XIXème, dans les travaux
de l’éminent biologiste et philosophe allemand Ernst Haeckel (Haeckel 1868). Ses premières
utilisations se firent dans le contexte des deux principales questions embryologiques de l’époque : la
transmission du patrimoine génétique et l’origine du système hématopoiétique. August Weismann
(Weismann 1885) pensait que le patrimoine génétique, transmis d’une génération à l’autre, était
isolé durant le développement embryonnaire à des cellules spécialisées (cellules germinales)
distinctes du reste du corps (cellules somatiques). Theodor Boveri et Valentin Häcker, inspirés par
cette théorie, utilisèrent le terme cellule souche pour décrire les cellules destinées à donner
naissance à la lignée germinale (Boveri 1892 ; Häcker 1892). En parallèle, d’autres auteurs
proposèrent ce terme pour décrire un précurseur commun du système sanguin (Pappenheim 1896 ;
Maximow 1908 ; Neumann 1912). Les significations originelles du terme cellule souche, au-delà des
références historiques, sont donc encore au cœur des aspects actuels de la biologie des cellules
souches (pour revue : Ramalho-Santos & Willenbring 2007).
9
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
1.2. Définitions
Les cellules souches sont généralement définies comme des cellules possédant les aptitudes
combinées de se diviser et de s’auto-renouveler indéfiniment in vitro (Avery et al. 2006), et de
pouvoir s’engager dans différents lignages pour donner naissance à de nombreux types cellulaires
matures (Fig. 1). Contrairement à la plupart des cellules de l’organisme dites « différenciées », les
cellules souches n’exercent pas de fonction définie. Elles sont considérées comme immatures et sont
maintenues dans un état quiescent, jusqu’à réception de signaux leur indiquant de se diviser et la
voie de différenciation à emprunter.
Figure 1 : Définition des cellules souches. Diagramme schématique représentant les principales
propriétés des cellules souches : l’auto-renouvellement et la différenciation en lignages cellulaires tissuspécifiques. Adapté de Fortier 2005.
1.2.1. Auto-renouvellement
L’auto-renouvellement est la capacité d’une cellule souche à produire une cellule fille
identique à elle-même. Ces cellules filles clonogéniques, qui restent quiescentes et réfrènent leur
prolifération, ont conservé la « souchitude » (stemness en anglais) transmise par la cellule mère.
Cet auto-renouvellement est rendu possible par une division symétrique de la cellule mère,
mais la balance entre auto-renouvellement et différenciation s’effectue par la division asymétrique
de cette cellule, autre propriété importante des cellules souches (Fig. 2 ; pour revue : Knoblich 2001;
Yamashita 2009). Dans le cadre de la division asymétrique, chaque cellule souche donne naissance à
deux cellules filles qui sont initialement identiques à la cellule mère, mais l’une d’elles exprimera le
programme génétique lui permettant de proliférer et de se différencier en une cellule mature
10
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
spécialisée. L’autre cellule fille ne prolifère pas et demeure identique à la cellule mère dans la niche
d’origine, permettant ainsi le maintien du pool de cellules souches (Ho 2005; Morrison & Kimble
2006).
Figure 2 : Auto-renouvellement et division asymétrique. (a) Division symétrique. La cellule souche
donne naissance à deux cellules filles totalement identiques à la cellule mère. (b) Division asymétrique.
La cellule souche se divise pour donner deux cellules filles. L’une d’elles est identique à la cellule mère et
est sujette aux divisions symétriques pour générer des copies cellulaires d’elle-même. L’autre cellule fille
prolifère et commence un processus de différenciation pour aboutir à une cellule spécialisée. Adapté de
Knoblich 2001.
L’analyse des mécanismes moléculaires susceptibles d’être impliqués dans l’autorenouvellement n’a pour l’instant pas permis de mettre à jour un mécanisme général et conservé
dans les différents types de cellules souches. Néanmoins, cette propriété s’accompagne le plus
souvent d’une forte activité de la télomérase (Morrison et al. 1996) et d’un « blocage de la
différenciation ». La plupart des gènes communs intervenant dans ce phénomène sont impliqués
dans la régulation du cycle cellulaire (Burdon et al. 2002 ; Niwa 2001). Ces mécanismes cellulaires
intrinsèques sont régulés par des signaux externes à la cellule, en provenance de la niche,
microenvironnement qui héberge les cellules souches et gère leurs fonctions dans les tissus. En
réponse à des demandes spécifiques du tissu ou de l’organe, les cellules souches modifient leur statut
dans le cycle cellulaire et s’engagent dans des processus de différenciation (Morrison 2009). La
fonction et la capacité régénérative réduites des cellules souches avec le vieillissement sont
probablement dues à des modifications intervenant dans les programmes d’auto-renouvellement. En
11
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
effet, bien que la plupart des cellules souches expriment la télomerase, son niveau d'activité n'est pas
suffisant pour maintenir la longueur des télomères pendant le vieillissement. Les cellules souches
semblent avoir un contrôle de l’intégrité de l’ADN plus strict que celui des cellules somatiques, ce qui
reflète le besoin de protéger ce compartiment cellulaire durable contre une transformation tumorale.
Mais ce phénomène, en induisant le raccourcissement des télomères, peut causer une sensibilité
accrue des cellules souches vers la sénescence ou l’apoptose (Ju & Rudolph 2006).
1.2.2. Prolifération
Les cellules souches constituent une population cellulaire qui continue de se diviser dans
l’organisme adulte, et qui produit des cellules destinées à la régénération des tissus. La plupart des
cellules souches se divise très lentement. Les cellules destinées à la différenciation sont donc
produites par une population cellulaire à potentiel plus restreint mais se divisant activement : les
cellules d’amplification transitoire (Fig. 3).
Figure 3 : Prolifération des cellules souches. Les cellules souches possèdent la propriété de s’autorenouveler afin de maintenir constant le pool de cellules indifférenciées dans l’organe ou le tissu. Après
réception de signaux appropriés, les cellules souches se divisent pour donner naissance à des cellules à
potentiel plus restreint, dotées d’une intense capacité proliférative, les cellules d’amplification
transitoire, qui s’engagent dans une voie de différenciation avant d’aboutir à la cellule différenciée postmitotique. Adapté de Knoblich 2001.
12
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
1.2.3. Potentiel de différenciation
Bien que présentant des caractéristiques générales communes, toutes les cellules souches ne
sont pas identiques. Au cours du développement embryonnaire, fœtal et de la vie adulte de
l’organisme, elles sont canalisées vers des voies spécifiques et perdent peu à peu leur capacité à se
différencier en de multiples types cellulaires spécialisés.
On peut donc distinguer plusieurs types de cellules souches selon leur potentiel de
différenciation ou « potence »:
- les cellules souches totipotentes, capables de créer un organisme dans son entier. Cette
propriété de totipotence concerne uniquement le zygote ainsi que les premières cellules issues de sa
division, jusqu’au stade 8 cellules de la morula (Bongso & Richards 2004). Elle est donc extrêmement
fugace et n’intervient qu’au cours des 72 à 96 premières heures du développement embryonnaire.
- les cellules souches pluripotentes, capables de former tous les tissus dérivés des trois
feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme), autrement dit, l’ensemble des tissus
intra-embryonnaires (Tam & Behringer 1997; Zernicka-Goetz 2002). A l’inverse des cellules
totipotentes, elles ne peuvent générer un organisme vivant entier puisqu’elles sont incapables de
donner naissance aux annexes embryonnaires comme le placenta ou l’amnios. Les cellules souches
pluripotentes correspondent aux fameuses « cellules souches embryonnaires » et sont dérivées de la
masse cellulaire interne du blastocyste (embryon au 5ème jour du développement pré-implantatoire
chez l’homme).
- les cellules souches multipotentes, capables d’engendrer l’ensemble des cellules composant
un tissu ou un organe donné. Les cellules obtenues peuvent présenter une morphologie et une
fonction très différentes, mais elles font généralement partie d’un même compartiment tissulaire. Les
cellules souches hématopoïétiques par exemple, vont générer toutes les cellules sanguines
(érythrocytes, leucocytes et plaquettes) ; les cellules souches neurales, quant-à elles, donnent
naissance aux trois principaux types cellulaires du système nerveux central (neurones, astrocytes et
oligodendrocytes).
A ces cellules est également associée la notion de « transdifférenciation », que l’on pourrait
traduire par la capacité qu’auraient les cellules souches multipotentes à générer des types cellulaires
différents de ceux dérivés du feuillet embryonnaire dont elles sont issues (Filip et al. 2005). Nous
reviendrons sur ce phénomène, encore très controversé, dans la suite de ce manuscrit.
13
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
- les cellules souches unipotentes, incapables d’auto-renouvellement, à potentiel très
restreint, ne se différencient qu’en un seul type cellulaire bien précis, comme par exemple les
kératinocytes de la peau ou les spermatagonies des tubes séminifères.
1.3. Classification
En fonction de leur potentiel de différenciation et de leur origine spatio-temporelle, on peut
classer les cellules souches en deux grandes catégories (Fig. 4) :
- les cellules souches embryonnaires (également appelées cellules ES).
- les cellules souches adultes, regroupant les cellules souches d’origine fœtale (sang de
cordon et tissus fœtaux) ainsi que les cellules souches présentes dans l’organisme adulte.
Figure 4 : Les différents types de cellules souches. On peut classer les cellules souches en deux
grandes catégories. Les cellules souches embryonnaires, pluripotentes, issues de la masse cellulaire
interne du blastocyste, et les cellules souches adultes, multipotentes, issues des tissus fœtaux ou adultes.
A ces deux grandes catégories s’ajoute une troisième : les cellules souches pluripotentes
induites (cellules iPS), issues de la reprogrammation nucléaire de cellules somatiques différenciées
leur faisant acquérir un programme génétique très proche de celui de la cellule souche
embryonnaire.
14
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
1.3.1. Les cellules souches embryonnaires
Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont été découvertes chez la souris il y a plus
de 20 ans (Evans & Kaufman 1981; Martin 1981) et ont été depuis intensivement utilisées pour la
manipulation génétique du génome murin et pour la création de souches mutantes de souris. Des
lignées de cellules ES murines peuvent être maintenues in vitro dans un état indifférencié et
pluripotent, en présence de fibroblastes servant de cellules nourricières (« feeders »), dans un milieu
de culture supplémenté en sérum et contenant des facteurs de croissance parmi lesquels le LIF
(facteur inhibiteur de leucémie ; Fig. 5). Cette cytokine, nécessaire au maintien de la capacité d’autorenouvellement des cellules ES en culture, n’est pas requise pour le développement du blastocyste
(Stewart et al. 1992). Ceci souligne que l’auto-renouvellement n’est pas nécessairement une
caractéristique physiologique des cellules ES au cours du développement normal, in vivo.
Figure 5 : Technique de culture des cellules souches embryonnaires de souris. Les lignées de
cellules ES sont établies en isolant les cellules constituant la masse cellulaire interne d’un blastocyste
(embryon de souris au 3ème jour et demi de développement pré-implantatoire). Ces cellules sont
ensemencées dans des boîtes de culture contenant des fibroblastes de souris irradiés jouant le rôle de
cellules nourricières, en présence de certains facteurs de croissance comme le LIF, permettant le
maintien du statut indifférencié des cellules ES. Adapté de http://stemcells.nih.gov/
15
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
Jusqu’à très récemment, la souris était la seule espèce à partir de laquelle de « vraies »
cellules ES avaient été obtenues (c’est-à dire, pluripotentes et capables de coloniser la lignée
germinale). Cependant, après des années d’échecs, des cellules ES de rat ont finalement été isolées, et
leurs caractéristiques fondamentales (pluripotence, capacité à coloniser la lignée germinale,
morphologie, signature moléculaire, dépendance au LIF) ne sont pas significativement différentes
des cellules ES murines (Li et al. 2008; Buehr et al. 2008).
Les cellules ES humaines ont été décrites pour la première fois en 1998 (Thomson et al.
1998) et ont été caractérisées in vitro par les tests de différenciation et de tératome (le chimérisme et
la transmission à la lignée germinale ne pouvant bien entendu pas être testés pour des raisons
éthiques). Ces tests ont révélé un degré de pluripotence comparable à celui des cellules ES de souris,
bien que le profil d’expression génique et les facteurs de croissance requis par les cellules ES
humaines soient différents de ceux des cellules ES murines. En particulier, la dépendance au LIF n’est
pas conservée. En effet, des conditions de culture incluant du sérum et du LIF activent la voie
JAK/STAT3 permettant la croissance des cellules ES de souris sans nécessité de feeders (Williams et
al. 1988; Smith et al. 1988). En revanche, dans des conditions comparables de culture, le LIF ne
permet pas de maintenir l’état indifférencié des cellules ES humaines, et la voie JAK/STAT3 ne
semble pas s’activer (Thomson et al. 1998). L’absence d’un réel test de développement in vivo pour
les cellules ES humaines empêche une comparaison directe avec les cellules ES murines et il aura
fallu des années pour comprendre que les différences entre ces deux isolats de cellules ES résultent
moins d’un problème d’espèces que d’une différence dans le stade développemental de ces cellules.
Les cellules ES humaines proviendraient ainsi d’un stade de développement plus tardif, les engageant
déjà vers l’un des trois feuillets embryonnaires, ce qui expliquerait la très grande hétérogénéité
relatée parmi les quelques 300 lignées de cellules ES humaines existantes dans le monde.
L’intérêt majeur de l’utilisation des cellules ES humaines dans des thérapies restauratrices
réside bien entendu dans leur capacité à former n’importe lequel des types cellulaires désirés. Des
études ont en effet montré la capacité des cellules ES humaines à se différencier en cellules neurales
(Zhang et al. 2001), cardiomyocytes (Mummery et al. 2002), cellules β des îlots de Langerhans du
pancréas (Assady et al. 2001), ostéoblastes (Sottile et al. 2003; Bielby et al. 2004), hépatocytes
(Schuldiner et al. 2000), ou encore en progéniteurs hématopoiétiques (Kaufman et al. 2001). De plus
les cellules ES humaines sont des cellules « normales » (non modifiées génétiquement), et
disponibles en nombre illimité, ce qui en fait un produit cellulaire standardisé pour la
transplantation.
16
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
L’espoir thérapeutique que représentent les cellules ES avait pris, en cette année 2009, une
signification particulière puisque la Food and Drug Administration (FDA) américaine avait autorisé
en début d’année le tout premier essai clinique chez l’homme utilisant des cellules ES comme
traitement. L’essai de phase I, coordonné par Geron Corporation, devrait concerner un petit nombre
de patients paraplégiques, condition résultant d’un traumatisme de la moelle épinière au niveau
thoracique. Les cellules ES humaines de la lignée H1 développée par James Thomson (Thomson et al.
1998) seront différenciées en oligodendrocytes et injectées directement au niveau de la lésion
traumatique. Néanmois, la FDA qui avait déjà, en mai 2008, reporté le lancement de l’essai clinique à
une date ultérieure, vient ce mois-ci (août 2009) d’en ordonner l'arrêt, avant même qu’un seul
patient ait pu être recruté. La FDA a pris cette décision au vu de données supplémentaires apportées
par les essais faits chez les animaux par Geron. Les difficultés que rencontre cet essai clinique pour
vraiment débuter reflètent les avis partagés de la communauté scientifique sur cette avancée
clinique. Si certains sont très enthousiastes, d’autres en revanche craignent, à défaut d’une toxicité
des cellules, une non-efficacité, ce qui représenterait pour la recherche sur les cellules ES un retour
en arrière de plusieurs années. Dans une interview accordée au New York Times à ce sujet en janvier
de cette année, le Dr. Steven Goldman, président de la chaire de Neurologie à l’Université de
Rochester (NY, Etats-Unis) a déclaré : « nous ne sommes pas encore prêts, du moins à mon avis, tant
que nous ne pourrons pas assurer que les cellules souches transplantées ont complètement perdu
leur tumorogénicité ». Car il ne faut pas l’oublier, en dépit de leurs nombreux atouts, l’utilisation des
cellules ES en clinique se heurte à plusieurs obstacles (Gruen & Grabel 2006):
- le premier de ces obstacles est le risque tumoral puisque la transplantation de cellules
souches pluripotentes indifférenciées a de fortes probabilités d’induire des tératomes. Pour
contourner cela, le but est de différencier les cellules ES in vitro et d’isoler à l’aide de marqueurs de
surface des progéniteurs d’intérêt hautement spécialisés pour les greffer. Cependant les progéniteurs
purifiés, bien que fortement engagés dans une voie de différenciation, restent des cellules immatures
avec l’instabilité génétique associée.
- un autre obstacle majeur est la barrière immunologique. La transplantation de tissus ou
d’organes entre des individus génétiquement différents engendre une réaction immunitaire
déclenchée par des antigènes de greffe (les complexes majeur et mineur d’histocompatibilité [CMH]
et les antigènes ABO du groupe sanguin) et peut résulter en un rejet de la greffe. Les cellules ES
indifférenciées expriment faiblement les antigènes du CMH de classe I, mais cette expression
augmente au cours de la différenciation. Bien que les progéniteurs dérivés des cellules ES expriment
les antigènes du CMH à des taux plus faibles que les cellules somatiques différenciées, cette
expression est néanmoins suffisante pour induire une réponse cellulaire T qui peut potentiellement
17
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
mener à la destruction du greffon (Drukker et al. 2002). Ainsi la thérapie cellulaire utilisant les
cellules ES risque de se heurter aux mêmes barrières immunologiques que les transplantations
allogéniques classiques de tissus ou d’organes, et nécessiter le recours à des traitements
immunosuppresseurs.
- enfin, la recherche sur les cellules souches embryonnaires est encore confrontée à
d’intenses questions éthiques et politiques qui la ralentissent dans de nombreux pays. Même si le
traitement de maladies reste l’objectif le plus prometteur de la recherche sur les cellules souches, il
ne faut pas perdre de vue qu’avant de passer à la clinique, beaucoup de questions concernant la
biologie fondamentale et les caractéristiques de ces cellules restent en suspend. De plus, les cellules
ES humaines peuvent également avoir un intérêt in vitro, notamment pour le criblage de molécules
pharmaceutiques ayant un intérêt thérapeutique, ou encore pour des criblages toxicologiques
permettant d’éviter le recours aux animaux.
1.3.2. Les cellules souches adultes
Les cellules souches adultes se distinguent des cellules souches embryonnaires par trois
caractéristiques principales : (i) la multipotence ; (ii) une capacité d’auto-renouvellement limitée ;
(iii) leur hétérogénéité du fait de la diversité des tissus auxquels elles appartiennent. On peut les
classer en trois catégories : les cellules souches adultes d’origine fœtale (ou cellules souches fœtales),
les cellules souches adultes tissulaires, et les cellules souches adultes dites « généralistes ».
Les cellules souches fœtales
Ces cellules sont isolées à partir de tissus fœtaux à un stade beaucoup plus tardif que le stade
de blastocyste embryonnaire. Chez l’homme, elles sont le plus souvent issues de fœtus (5 à 9
semaines) après interruption volontaire de grossesse (IVG). On en distingue 4 classes : les cellules
souches fœtales somatiques, les cellules souches du sang de cordon ombilical, les cellules souches du
liquide amniotique et les cellules souches germinales.
Les cellules souches fœtales somatiques
Elles correspondent aux cellules souches trouvées dans les organes du fœtus. Des cellules
souches de la crête neurale, des cellules souches hématopoiétiques fœtales, des CSPN ainsi que des
progéniteurs des îlots pancréatiques ont été isolés à partir de fœtus issus d’IVG chez l’homme
(Beattie et al. 1997).
18
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
Les cellules souches du sang de cordon ombilical
Le sang du cordon ombilical contient des cellules souches présentant des propriétés assez
différentes de celles de la moelle osseuse et du sang périphérique adulte. Néanmoins les cellules
souches du sang de cordon sont capables de se différencier en neurones et en cellules hépatiques
(Rogers & Casper 2004), constituant donc une source de cellules multipotentes facilement accessible
(Broxmeyer et al. 1992; Piacibello et al. 1998).
Les cellules souches du liquide amniotique
Le liquide amniotique contient un grand nombre de cellules provenant du fœtus en
développement (Polgár et al. 1989; Priest et al. 1978). Au sein de cette population hétérogène,
certaines cellules fœtales donnent naissance à des cellules différenciées comme des cellules
musculaires, osseuses ou encore neurales (In 't Anker et al. 2003; Prusa et al. 2004; Tsai et al. 2004).
Une étude récente a confirmé la pluripotentialité des cellules souches du liquide amniotique, ouvrant
ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques (De Coppi et al. 2007).
Les cellules souches germinales ou embryonic germ cells (cellules EG)
Elles proviennent des cellules germinales primordiales de la crête génitale de fœtus agés de 5
à 9 semaines chez l’homme. Les cellules EG humaines ont été isolées et caractérisées en 1998
(Shamblott et al. 1998). Elles sont pluripotentes et capables de produire des cellules appartenant aux
trois feuillets embryonnaires (Fig. 6).
Figure 6 : Les cellules souches germinales. Les cellules germinales primordiales (CGP) colonisent la
crête génitale à partir de la cinquième semaine de développement embryonnaire. A ce stade, ce sont des
cellules indifférenciées. Leur spécialisation en cellules reproductrices (gamètes) mâles ou femelles ne
débute qu’à la septième semaine chez les fœtus humains de sexe masculin et à la huitième chez ceux de
sexe féminin. Ces CGP peuvent être isolées et mises en culture pour donner naissance aux cellules
souches germinales pluripotentes. Adapté de Turnpenny et al. 2006.
19
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
Les cellules souches adultes tissulaires
Une cellule souche tissulaire somatique joue un rôle dans l’homéostasie d’un tissu ou d’un
organe. Elle remplace les cellules mortes ou endommagées et assure ainsi la pérennité de la fonction
de l’organe au cours de la vie de l’organisme (Fig. 7). De telles cellules ont été identifiées chez
l’homme dans les tissus ou organes suivants : la peau (Rochat et al. 1994), le sang (Morrison &
Weissman 1994), le cerveau (Gage 2000), l’os (Bianco & Gehron Robey 2000), l’intestin (Booth &
Potten 2000), le pancréas, les muscles lisses et squelettiques (Renault et al. 2000), le foie, le cœur
(Torella et al. 2005).
Figure 7 : Les cellules souches adultes tissulaires. (A) Cellules souches résidant dans des tissus à
fort renouvellement cellulaire. Elles assurent la régénération des cellules mortes ou vieillissantes. (B)
Cellules souches résidant dans des tissus quiescents, à faible renouvellement cellulaire. Leur fonction
n’est pas totalement définie. Adapté de Coulombel 2003.
20
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
Les cellules souches de trois tissus (sang, peau, intestin) fonctionnent en permanence
pendant la vie, pour renouveler régulièrement l’ensemble des cellules. Hormis celles de l’intestin, les
deux autres sont déjà utilisées avec succès en thérapeutique (Karanes et al. 2008; Shi et al. 2006).
Quant aux cellules souches des autres tissus, elles ne sont activées que lors d’une nécessité de
réparation tissulaire et leur utilisation en thérapie cellulaire demeure à l’heure actuelle douteuse
(Coulombel 2003).
Les cellules souches adultes « généralistes »
Ces cellules correspondent aux cellules souches mésenchymateuses (CSM). Elles sont classées
à part des cellules souches adultes tissulaires du fait de leurs caractéristiques particulières. Les CSM
s’amplifient très bien in vitro sous forme de cultures de cellules adhérentes. Ce sont des cellules
multipotentes capables de se différencier en cartilage (Fortier et al. 1998), os (Rickard et al. 1996;
Bruder et al. 1997), tendon, ligament et graisse (Pittenger et al. 1999), mais aussi en cellules
musculaires (Wakitani et al. 1995) ou pulmonaires (Ortiz et al. 2003). Bien qu’il n’y ait pas de
consensus sur ce point, certaines équipes ont également montré la capacité des CSM à former des
cellules hépatiques (Alison et al. 2000) et neuronales (Brazelton et al. 2000), sous l’effet de certains
facteurs de croissance. Les CSM sont donc très hétérogènes en terme de potentiel.
La transdifférenciation rapportée des CSM renvoie à la notion de plasticité, ou conversion de
lignage, des cellules souches adultes (Baksh et al. 2004; Wagers & Weissman 2004). Les mécanismes
sous-jacents à cette plasticité incluent la transdifférenciation qui correspond à la conversion d’une
cellule d’un lignage tissulaire spécifique en une cellule d’un lignage totalement différent, avec perte
concomitante des marqueurs spécifiques et de la fonction de la cellule d’origine au profit de ceux de
la cellule transdifférenciée. Les autres mécanismes pouvant expliquer cette apparente plasticité
impliquent une fusion entre une cellule souche et une cellule différenciée spécifique d’un tissu,
l’existence de plusieurs populations de cellules souches dans un même pool de cellules, ou encore la
capacité des cellules souches de se dé-différencier dans un lignage cellulaire moins spécialisé, puis de
se re-différencier dans un autre lignage (Wagers and Weissman 2004). Bien que chacun de ces
mécanismes soient possibles, le concept de plasticité reste controversé mais fait l’objet de nombreux
travaux étant donné le potentiel clinique que représenteraient des populations malléables de cellules
souches.
21
__________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie I
1.3.3. Les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS)
Afin de contourner les problèmes éthiques liés à l’utilisation des cellules ES, et de s’affranchir
des barrières immunologiques accompagnant l’allogreffe de cellules souches, un nouveau champ de
recherche sur la reprogrammation nucléaire des cellules somatiques est apparu. Les cellules souches
pluripotentes induites (iPS) sont des cellules pluripotentes dérivées de cellules somatiques
différenciées (Sung et al. 2006; Hanna et al. 2008) ou de cellules souches tissu-spécifiques (Kim et al.
2008a), présentant une expression ectopique de facteurs de transcription par infection virale
(initialement Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc). Les cellules iPS murines et humaines ont été décrites à un an
d’intervalle par le même groupe de scientifiques japonais (Takahashi & Yamanaka 2006; Takahashi
et al. 2007). Il est maintenant communément admis que les cellules iPS présentent les
caractéristiques des cellules souches pluripotentes, incluant l’expression de marqueurs de cellules
souches, la formation de tumeurs contenant des cellules issues des trois feuillets embryonnaires, et,
pour les iPS murines, la capacité de générer tous les tissus quand elles sont injectées dans des
embryons de souris (Maherali & Hochedlinger 2008).
Si les avantages de la recherche sur les iPS en terme d’éthique et de compatibilité
immunologique sont évidents, l’utilisation des ces cellules en clinique est cependant limitée pour
plusieurs raisons. D’abord l’utilisation de virus, notamment des rétrovirus, pour le transfert des
facteurs de reprogrammation induit des risques d’intégration permanente des transgènes dans le
génome. Les altérations de l’ADN et la possible réactivation des transgènes viraux qui en
résulteraient soulèvent de sérieuses inquiétudes et stimulent les recherches visant à produire des iPS
humaines sans utiliser de vecteurs viraux intégratifs (Stadtfeld et al. 2008). De plus, les facteurs de
reprogrammation Klf4 et c-Myc sont des oncogènes, et la génération des iPS, qui est un processus
lent et inefficace, peut conduire à une reprogrammation incomplète des cellules (Mikkelsen et al.
2008). L’échec de la reprogrammation des cellules peut s’expliquer par plusieurs raisons : les cellules
peuvent induire des gènes anti-prolifération en réponse à un stress prolifératif, elles peuvent activer
ou réprimer de façon inappropriée des facteurs de transcription ectopiques ou endogènes et devenir
piégées dans des états différenciés, et elles peuvent ne pas réussir à réactiver les gènes
hyperméthylés de pluripotence (Mikkelsen et al. 2008).
Bien que l’utilisation thérapeutique des iPS humaines ne soit pas encore assez sûre, ces
cellules ont néanmoins ouvert la possibilité d’établir des lignées de cellules pluripotentes de patients
atteints de maladies génétiques (Park et al. 2008), permettant la production de cellules somatiques
spécifiques d’une maladie afin de tester des molécules à visée thérapeutique (Chamberlain et al.
2008). Les iPS fournissent également de précieuses informations sur les mécanismes de pluripotence
et de différenciation aux niveaux cellulaire et moléculaire, nécessaires pour atteindre un jour
l’objectif de leur utilisation en médecine régénérative.
22
PARTIE II
Les cellules
souches/progénitrices neurales
23
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
PARTIE II
2. Les cellules souches/progénitrices neurales
Le tissu nerveux, et particulièrement celui du système nerveux central (SNC), est doté de
plusieurs caractéristiques particulières qui en font un tissu unique dans l’organisme. Ces propriétés
sont liées à la composition cellulaire hétérogène du SNC qui favorise l’élaboration d’un réseau
complexe permettant de traiter des quantités très importantes d’informations.
2.1. Les cellules du système nerveux central
Le SNC comporte deux types principaux de cellules : les neurones et les cellules gliales. Les
neurones constituent l’unité structurale fonctionnelle du système nerveux. Ils communiquent entre
eux à l’aide de synapses et nécessitent des apports métaboliques très importants. Les nombreux
neurones du cerveau et leurs prolongements sont intriqués avec des cellules de soutien, les cellules
gliales. Chez l’homme, les cellules gliales constituent 90% des cellules du SNC et occupent environ la
moitié de la masse totale du SNC. Elles entretiennent des relations fonctionnelles étroites avec les
neurones, leur fournissant un support à la fois fonctionnel et structural. Il existe quatre types
principaux de cellules gliales : les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules de la microglie et les
cellules épendymaires. Les astrocytes sont des cellules étoilées dont les prolongements sont en
contact direct avec les vaisseaux sanguins et les neurones. Ils constituent un soutien mécanique tout
en régulant les échanges de métabolites entre sang, liquide céphalo-rachidien et neurones. Ils font
également partie de la barrière hémato-encéphalique et interviennent dans les mécanismes de
réparation tissulaire après traumatisme ou maladie. Les oligodendrocytes ont pour fonction
principale la myelinisation des axones des neurones. La cellule microgliale doit son appellation à un
caractère morphologique qui, dans le tissu adulte, la différencie des autres types cellulaires gliaux du
fait de son corps cellulaire de dimension réduite et de longs prolongements ramifiés. C'est Franz
Nissl (1899) qui a décrit pour la première fois des cellules du cerveau capables de migrer et de
phagocyter. Ainsi la microglie correspond aux représentants du système monocyte-macrophage dans
le cerveau et possède donc des fonctions de défense immunitaire. Enfin, les cellules épendymaires,
organisées en épithélium spécialisé, séparent le tissu nerveux du liquide céphalo-rachidien contenu
dans les ventricules du cerveau et le canal de l’épendyme.
24
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
2.2. Définition des cellules souches neurales
Historiquement, l’architecture cellulaire complexe du SNC a été inextricablement associée au
paradigme de l’absence de renouvellement cellulaire dans le cerveau adulte (Ramón y Cajal 1913).
Cette vision dogmatique d’un tissu neural dépourvu de neurogénèse a désormais fait place à celle de
l’existence d’un renouvellement cellulaire au sein du SNC au cours de l’âge adulte (Altman 1962 ;
Altman et Das 1966 ; Nottebohm 1989). Ce processus neurogénique, qui se déroule avec une
efficacité décroissante au cours de la vie de l’organisme, est rendu possible grâce à la persistance de
cellules souches résidant dans certaines régions localisées du cerveau : les cellules souches neurales
(CSN ; Reynolds & Weiss 1992). Les CSN possèdent les trois caractéristiques fondamentales des
cellules souches : (i) l’auto-renouvellement afin de maintenir l’homéostasie du tissu neural, (ii) la
capacité de prolifération (avec probablement de très longs cycles cellulaires), et (iii) la multipotence,
permettant de générer les trois principaux types cellulaires du SNC que sont les neurones, les
astrocytes et les oligodendrocytes (Fig. 8).
Figure 8 : Définition des cellules souches neurales (CSN). Une CSN est une cellule multipotente
capable d’auto-renouvellement. Elle se divise pour donner naissance à une cellule progénitrice neurale
(CPN) à potentiel plus restreint. Cette dernière s’engage dans une voie de différenciation et, par
l’intermédiaire de précurseurs neuronaux (PN) ou gliaux (PG), génère les trois principaux types
cellulaires du système nerveux central que sont les neurones les astrocytes et les oligodendrocytes.
Adapté de Gage 2000.
25
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
2.3. Distinction entre cellule souche et cellule progénitrice
Le terme de progéniteur, bien que souvent utilisé pour désigner une cellule souche, fait
référence à une cellule ayant une capacité d’auto-renouvellement limitée et un potentiel de
différenciation plus réduit (Potten & Loeffler 1990; Weiss et al. 1996). Cette « restriction de lignage »
concerne les cellules souches neurales. Elles donnent en effet naissance à des progéniteurs neuraux
bipotents, correspondant aux cellules d’amplification transitoire, qui eux-mêmes sont à l’origine de
précurseurs neuronaux ou gliaux, incapables d’auto-renouvellement et totalement engagés dans une
voie de différenciation (McKay 1997). Pour autant, dans la littérature concernant les cellules souches,
de nombreuses populations de cellules neurales sont étiquetées sous la dénomination « cellule
souche », terme qui semble être utilisé pour qualifier toute cellule proliférative dans le système
nerveux. Bien que les cellules souches et les cellules progénitrices neurales se recoupent en terme
d’expression génique (Shin & Rao 2006), elles peuvent être clairement discriminées sur la base de
différences dans la voie de signalisation de Notch (Hitoshi et al. 2002), et surtout, sur la base de leurs
propriétés fonctionnelles (Seaberg & van der Kooy 2003). Dès lors, ces distinctions entre les deux
types cellulaires (Tableau 1) doivent être considérées plutôt qu’ignorées.
Caractéristiques
Cellule souche neurale
Cellule progénitrice neurale
Auto-renouvellement in vivo
Illimité ; pour toute la vie de Limité ; Transitoire
l’organisme
Auto-renouvellement in vitro
Illimité ; Peut atteindre un Limité ; Nombre de passages
maximum de passages avant restreint
différenciation
Potentialité
Multipotence
Bipotence / Unipotence
Tableau 1 : Distinctions entre cellules souches neurales (CSN) et cellules progénitrices
neurales (CPN). Les CSN possèdent les propriétés d’auto-renouvellement illimité et de multipotence.
Ces caractéristiques sont présentes chez les CSN fraichement isolées et ne résultent pas d’une
immortalisation ou d’un caractère acquis après une culture à long terme. Les CSN sont maintenues in
vivo pendant toute la vie de l’organisme. In vitro, les CSN peuvent maintenir leur multipotentialité à
travers les différents passages et peuvent s’auto-renouveler de façon illimitée jusqu’à induction de leur
différenciation. A l’inverse, les CPN déjà engagées dans une voie de différenciation ont un potentiel plus
restreint, avec une capacité d’auto-renouvellement très limitée in vivo et in vitro. Adapté de Seaberg et
van der Kooy 2003.
26
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
2.4. Les cellules souches/progénitrices neurales in vivo
2.4.1. Chez l’embryon
Au cours du développement du cerveau chez les Mammifères, des milliards de neurones sont
créés, directement ou indirectement, à partir du neuroépithélium. Avant le début de la neurogénèse,
l’intégralité de ce neuroépithélium ne représente qu’une simple couche d’épithélium pseudostratifié
correspondant à la zone ventriculaire (ZV).
Afin de générer une quantité massive de neurones, les cellules neuroépithéliales (NEP ;
Kalyani et al. 1997), qui représentent les premières cellules souches/progénitrices neurales,
subissent en premier lieu des divisons symétriques pour amplifier le pool de cellules indifférenciées
(Götz & Huttner 2005; Knoblich 2008). Avec le commencement de la neurogénèse, les cellules NEP
passent à un mode asymétrique de division (Zhong & Chia 2008) et donnent naissance à une cellule
souche et à une cellule progénitrice qui se différencie en neurone ou devient un précurseur
intermédiaire avec une capacité limitée de prolifération (Huttner & Kosodo 2005; Pontious et al.
2008; Kriegstein et al. 2006). Cette transition est accompagnée par des changements de l’identité
cellulaire : les cellules progénitrices issues des cellules NEP commencent à exprimer des
caractéristiques de cellules gliales et s’orientent obliquement, étendant leurs prolongements de la
face interne vers la face externe du tube neural. Ces cellules sont ainsi référencées comme cellules de
la glie radiaire (Kriegstein & Götz 2003 ; Fig.9).
D’élégantes études d’imagerie menées par l’équipe du Dr. Kriegstein ont montré que les
cellules de la glie radiaire subissent des divisions asymétriques, produisant soit un neurone, soit un
précurseur neuronal, pendant plusieurs cycles de division successifs (Noctor et al. 2004; Noctor et al.
2008). Ainsi, les cellules de la glie radiaire ne se limitent pas à des cellules de soutien, permettant la
migration des neurones de leur site de formation, dans la ZV, vers leurs positions finales (Rakic
2003). Elles peuvent également être considérées comme des cellules progénitrices neurales (Noctor
et al. 2001). Quand la migration neuronale est terminée, la glie radiaire se rétracte et se transforme
en astrocyte dans la plupart des régions du cerveau des mammifères (Schmechel & Rakic 1979; Voigt
1989).
Hormis les cellules NEP, les cellules de la glie radiaire et les précurseurs neuraux, on
distingue également, chez les rongeurs, un autre type de progéniteurs neuraux : les progéniteurs
basaux ou intermédiaires (Haubensak et al. 2004 ; Miyata et al. 2004). Ces derniers se divisent à
partir de la région apicale du neuroépithélium, transloquent leur noyau vers la région basale de la ZV
pour former une deuxième couche germinale, la zone sous-ventriculaire (ZSV), et rétractent leurs
extensions apicales et basales avant la mitose. Par conséquent, les divisions des progéniteurs basaux
sont localisées dans la ZV basale et la ZSV. La plupart de ces divisions sont symétriques et
27
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
aboutissent à la formation de deux neurones différenciés (Kowalczyk et al. 2009). Cependant, il a été
suggéré qu’une petite proportion de progéniteurs basaux, chez les rongeurs, sont capables de
divisions symétriques prolifératives, permettant ainsi le maintien du pool de progéniteurs basaux
dans la ZSV (pour revue : Farkas & Huttner 2008).
Figure 9 : Neurogénèse corticale chez l’embryon. Les cellules neuroépithéliales (NEP) localisées
dans la couche cellulaire luminale du tube neural appelée zone ventriculaire (ZV) se divisent
rapidement, générant initialement de la glie radiaire, des progéniteurs basaux et des neuroblastes. Les
cellules de la glie radiaire, considérées comme des cellules progénitrices neurales, expriment des
caractères de glie différenciée et émettent de longs prolongements qui servent de support pour la
migration des neurones nouvellement formés, de la ZV vers les couches émergentes du néocortex. Peu
après la neurogénèse, la glie radiaire se transforme en astrocytes et les cellules NEP de la ZV génèrent
des glioblastes. Ces glioblastes migrent vers la zone sous-ventriculaire (ZSV) où ils se différencient en
astrocytes et oligodendrocytes primaires, avant de quitter cette région pour aller peupler les couches
cellulaires en formation du cortex. Adapté de Clarke 2003.
2.4.2. Chez l’adulte
La neurogénèse se déroule tout au long de la vie et est régulée par des évènements
physiologiques et pathologiques à tous les niveaux, parmi lesquels la prolifération des cellules
souches et progénitrices neurales adultes, la différenciation et le devenir des progéniteurs, ainsi que
la survie, la maturation et l’intégration des neurones nouvellement formés. Dans le système nerveux
mammalien adulte, la neurogénèse a clairement été démontrée dans deux régions précises du
cerveau, sous des conditions physiologiques normales. Ces régions sont la zone sous-granulaire
28
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
(ZSG) du gyrus denté de l’hippocampe (Cameron et al. 1993; Kuhn et al. 1996; Eriksson et al. 1998),
et la zone sous-ventriculaire (ZSV) des ventricules latéraux (Lois & Alvarez-Buylla 1993; Lois &
Alvarez-Buylla 1994; Doetsch & Alvarez-Buylla 1996 ; Fig. 10).
Figure 10 : Neurogénèse adulte. (A) Vues sagittale et coronales du cerveau de rongeur. Les zones
rouges indiquent les régions germinales du cerveau des mammifères : la zone sous-granulaire du gyrus
denté de l’hippocampe et la zone sous-ventriculaire (ZSV) des ventricules latéraux. Les neurones générés
dans la ZSV migrent à travers le courant migratoire rostral (CMR) jusqu’au bulbe olfactif. (B-E)
Neurogénèse révélée par incorporation de BrdU (analogue de base de la thymidine) dans le bulbe
olfactif (B), le CMR (C), la ZSV (D) et le gyrus denté (E). Les fenêtres représentent en (C) une vue
sagittale du CMR avant arrivée au bulbe olfactif, et en (E) un grossissement de la zone indiquée par la
flèche. Le marquage BrdU est en rouge, NeuN (marqueur des neurones matures) est en vert. Adapté de
Zhao et al. 2008.
Les neurones formés dans la ZSG adulte migrent dans la couche granulaire du gyrus denté et
deviennent des cellules granulaires (Cameron & McKay 2001). Les nouveaux neurones générés dans
la ZSV, quant-à eux, migrent sur une longue distance à travers le courant migratoire rostral et se
différencient ntamment en interneurones dans le bulbe olfactif (Lois & Alvarez-Buylla 1994 ;
Kornack & Rakic 2001b; Carlén et al. 2002). La question d’une neurogénèse se déroulant dans
d’autres régions du cerveau adulte que celles précédemment citées demeure controversée (Rakic
2002; pour revue: Gould 2007).
29
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
La zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux
La ZSV est localisée près de l’épendyme, une fine couche de cellules bordant les ventricules
latéraux du cerveau (Fig. 11). Les cellules épendymaires ont pendant un temps été considérées
comme étant les cellules souches neurales adultes responsables de la neurogénèse dans la SVZ
(Johansson et al. 1999). Plusieurs études ont cependant montré que les cellules épendymaires sont
quiescentes dans des conditions physiologiques normales, et ne présentent pas les propriétés de
cellules souches in vitro (Doetsch et al. 1999; Capela & Temple 2002). Pour autant, une étude récente
a mis en évidence qu’en réaction à une lésion, les cellules épendymaires exprimant la glycoprotéine
CD133 (exprimée par les cellules souches de plusieurs tissus chez les rongeurs et chez l’homme)
s’activent, et se transforment en cellules présentant un phénotype de glie radiaire, et servant alors de
CSN adulte (Coskun et al. 2008; Zhang et al. 2007).
Il a par ailleurs été observé que des cellules présentes au sein de la ZSV participent à la
neurogénèse à long terme dans le bulbe olfactif (Consiglio et al. 2004). Le groupe d’Arturo AlvarezBuylla en 1997 remarqua la présence de plusieurs types cellulaires spécifiques dans la ZSV,
distinguables de part leur morphologie, et les classifièrent en cellules de types A, B et C (Doetsch et
al. 1997). Des sous-types de cellules se divisant lentement, exprimant la GFAP (Glial Fibrillary Acidic
Protein, marqueur des astrocytes) et se comportant comme des cellules souches (Doetsch et al.
1999) ont été morphologiquement définis comme cellules de type B. Les cellules souches (type B)
donnent naissance à des cellules progénitrices se divisant très rapidement. Ces cellules
d’amplification transitoire qui sont extrêmement sensibles au traitement par l’AraC (un antimitotique), ont été définies comme cellules de type C (Doetsch et al. 1997). Par la suite, ces cellules
d’amplification transitoire génèrent des neuroblastes, définis comme cellules de type A (Fig. 11).
L’identification des cellules souches/progénitrices de la ZSV a été principalement réalisée par une
analyse morphologique des cellules par microscopie électronique, mais les cellules de type C et A ont
aussi pu être identifées par des marquages au BrdU et à la thymidine tritiée, et par des marqueurs
moléculaires spécifiques comme DCX (doublecortine, marqueur de neurones immatures) ou la
molécule d’adhésion neuronale PSA-NCAM (marqueur de la migration neuronale). De façon
intéressante, il apparait que le potentiel des cellules souches/progénitrices de la ZSV est limité,
puisque le devenir des neuroblastes nouvellement formés est déterminé par les informations de
localisation spatiale établies durant le développement précoce du système nerveux (Merkle et al.
2007).
30
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Figure 11 : Neurogénèse dans la zone sous-venticulaire (ZSV) des ventricules latéraux. La ZSV
contient des cellules épendymaires (E), des astrocytes (B), des cellules progénitrices (C) et des neurones
immatures (A). Ces neurones immatures générés dans la ZSV migrent vers le bulbe olfactif à travers le
courant migratoire rostral. Dans la ZSV, les astrocytes positifs pour la GFAP (cellules de type B) se
comportent comme des cellules souches qui génèrent des cellules d’amplification transitoire (cellules de
type C) et se différencient ensuite en neuroblastes (cellules de type A). Adapté de Zhao et al. 2008.
La zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe
La ZSG est une couche germinale située entre la couche de cellules granulaires du gyrus denté
et le hile de l’hippocampe, région impliquée dans l’apprentissage et la mémoire. La ZSG est richement
vascularisée, et il a été noté une relation spatiale étroite entre les vaisseaux sanguins et les
progéniteurs neuraux en division (Palmer et al. 2000). De plus, ce groupe a également observé que la
neurogénèse à cet endroit est étroitement associée à un actif remodelage vasculaire, suggérant que la
neurogénèse adulte dans la ZSG se déroule dans une « niche vasculaire ». A cette niche vasculaire
s’ajoute une « niche astrocytaire », puisque les astrocytes de l’hippocampe approvisionnent
l’environnement local en facteurs qui régulent la neurogénèse en orientant les cellules souches vers
un phénotype neuronal (Song et al. 2002).
31
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Dans l’architecture cellulaire de la ZSG de l’hippocampe, trois types différents de cellules
prolifératives ont été mis en évidence, sur la base de critères morphologiques, de profils d’expression
de marqueurs et de propriétes électrophysiologiques (Fukuda et al. 2003 ; Kempermann et al. 2004 ;
Sohur et al. 2006) (Fig.12):
(i)
les cellules de type 1, apparentées aux cellules souches de la glie radiaire, exprimant la
nestine et la GFAP.
(ii)
les cellules de type 2 exprimant la nestine (cellules progénitrices d’amplification
transitoire).
(iii)
les cellules de type 3 positives pour la doublecortine (DCX, marqueur des neurones
immatures) et négatives pour la nestine (filament intermédiaire, marqueur des cellules
indifférenciées).
Les rares cellules en division avec une apparence de glie radiaire ont été identifiées comme
les cellules souches de la ZSG (Seri et al. 2001), bien que le degré de « souchitude » de ces cellules
hippocampales soit encore controversé. Les cellules de type 1, exprimant la nestine et la GFAP, sont
morphologiquement et fonctionnellement différentes des astrocytes matures formant la niche
astrocytaire et sont supposées donner naissance aux cellules progénitrices de type 2 par division
asymétrique. Pour autant, une preuve directe de la relation de lignage entre ces deux types
cellulaires est toujours manquante. Une récente étude a montré que les cellules de type 2, qui
peuvent être subdivisées en cellules de type 2a positives pour DCX et en cellules de type 2b négatives
pour DCX (Kronenberg et al. 2003), sont positives pour le facteur de transcription Sox-2 (essentiel à
l’auto-renouvellement et au maintien du caractère indifférencié) et peuvent s’auto-renouveler. Ainsi,
une cellule de type 2 positive pour Sox-2 peut générer un neurone et un astrocyte, fournissant la
première preuve in vivo des propriétés de cellule souche des progéniteurs neuraux hippocampaux
(Suh et al. 2007). Cette étude suggère également que les relations entre les cellules de type 1 et de
type 2 pourraient être réciproques. En effet, Sox2 est important pour maintenir la “souchitude” des
cellules souches adultes incluant les cellules souches neurales, mais également des cellules ES, et fait
partie du cocktail de facteurs permettant à des cellules somatiques adultes de recouvrir un
phénotype indifférencié semblable à celui des cellules ES.
32
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Figure 12 : Neurogénèse dans la zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe. La
formation de nouveaux neurones hippocampaux dans la couche granulaire passe par les divisions
successives de plusieurs types de cellules souches/progénitrices neurales, se distinguant par l’expression
de différents marqueurs au cours du processus neurogénique. Adapté de Kempermann et al. 2004.
La prolifération des cellules progénitrices est un élément important de la régulation
neurogénique. Bien qu’il y ait des preuves d’un passage par les quatre stades de cellules en division,
du type 1 au type 2a et b puis au type 3, ces différentes classes de cellules ne contribuent pas de
façon égale à l’activité proliférative globale dans le gyrus denté (Kronenberg et al. 2003). Dans des
conditions physiologiques normales, les cellules de type 2a se divisent plus activement que les
cellules de type 1, qui restent dans un état quiescent. Un stimulus comportemental, comme par
exemple un enrichissement de l’environnement, a un effet limité sur les cellules progénitrices en
division, et va plutôt affecter les stades cellulaires plus tardifs (cellules négatives pour la nestine).
Certaines cellules de type 3 deviennent post-mitotiques et commencent à exprimer des marqueurs
neuronaux comme NeuN. Les cellules granulaires en maturation vont également exprimer des
protéines liant le calcium vitamine D-dépendantes. D’abord la calrétinine de façon transitoire, qu’ils
échangeront plus tard contre la calbindine (Brandt et al. 2003). Pendant cette phase post-mitotique
précoce, soit les nouveaux neurones sont recrutés dans un rôle fonctionnel, soit ils meurent
(Kempermann et al. 2004).
33
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Origine et identification des nouveaux neurones formés
Comme décrit dans les paragraphes précédents, les neurones nouvellement formés dans le
SNC adulte semblent donc provenir de cellules souches neurales (CSN) multipotentes. Ces dernières
sont apparemment largement quiescentes in vivo, et correspondent, dans la zone sous-granulaire et
la zone sous-ventriculaire du cerveau adulte, à des astrocytes spéciaux exprimant la nestine et la
GFAP mais pas S-100β (marqueur d’astrocyte mature) et présentant certaines propriétés de glie
radiaire (Alvarez-Buylla & Lim 2004). Pour autant, l’identité exacte des CSN adultes est encore
inconnue, et leur multipotence à un niveau clonal in vivo n’a toujours pas été universellement
démontrée. De ce fait, certains auteurs limitent leur utilisation du terme cellule souche, et préfèrent
qualifier les cellules à l’origine des nouveaux neurones dans le cerveau adulte de progéniteurs ou
précurseurs multipotents, ce terme englobant à la fois les cellules souches à proprement parler, les
progéniteurs bipotents d’amplification transitoire, et les précurseurs unipotents restreints au lignage
glial ou neuronal (Seaberg & van der Kooy 2003; Sohur et al. 2006; Breunig et al. 2007). L’identité
précise des cellules souches neurales et progénitrices du cerveau est d’autant plus mystérieuse qu’il
n’existe pas de marqueur protéique précis permettant de les identifier. Le problème est le même
avec les neurones nouvellement formés, l’absence de techniques fiables et efficaces pour les repérer
avec certitude in vivo étant un frein à l’étude de la neurogénèse adulte.
Par exemple, les analogues de thymidine sont classiquement utilisés comme marqueurs de
prolifération pour suivre les cellules en division qui transmettront aussi le marquage aux cellules
filles. Or leur utilisation, en particulier celle du BrdU (bromodéoxyuridine), soulève plusieurs
interrogations. D’abord, la détection du BrdU par immunohistochime nécessite une fixation du tissu
et une dénaturation préalable de l’ADN, cette technique ne peut donc pas être utilisée pour analyser
des cellules vivantes. Ensuite, le marquage est restreint au noyau nécessitant une fine analyse en
microscopie confocale pour confirmer la co-localisation du marquage avec des marqueurs de types
cellulaires spécifiques. Enfin, la quantité de BrdU incorporée après une seule injection est
rapidement diluée à des niveaux indétectables après quelques cycles de division cellulaire (Hayes &
Nowakowski 2002). Par ailleurs, l’incorporation des analogues de thymidine est une indication
globale de la synthèse d’ADN, ce qui pourrait identifier les cellules subissant des réparations de leur
ADN plutôt que des cellules en prolifération (Cooper-Kuhn & Kuhn 2002). Cette hypothèse a
cependant été écartée, et il n’y a pas à l’heure actuelle de preuves permettant de confondre la
neurogénèse mise en évidence par un marquage au BrdU avec des cellules réparant un ADN
endommagé (Palmer et al. 2000).
Une autre limitation méthodologique concerne l’identification d’un phénotype cellulaire
précis. NeuN est le marqueur immunocytochimique standard pour identifier les neurones matures,
mais sa seule expression par des cellules positives pour le BrdU n’est toutefois pas suffisante pour
34
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
identifier ces cellules comme neurones nouvellement formés (Magavi & Macklis 2008). Il est
nécessaire de compléter ce marquage par des analyses morphologiques et/ou électrophysiologiques
et par d’autres marqueurs neuronaux, ce qui est possible pour les régions neurogéniques (par
exemple la calbindine pour le gyrus denté, et la tyrosine hydroxylase révélant les neurones
dopaminergiques pour le bulbe olfactif) afin de confirmer l’identité neuronale des nouvelles cellules
(pour revue: Sohur et al. 2006). Toutes ces options ne sont pas réalisables dans chaque contexte
expérimental, mais l’utilisation d’un seul marqueur pour énoncer une neurogénèse est
problématique, d’autant plus dans les cas où le marquage BrdU est révélé très précocement dans les
divisions cellulaires. En effet, les marqueurs neuronaux précoces tels que DCX, PSA-NCAM ou la β-IIItubuline ont dans certains cas une spécificité douteuse et des études réalisées dans le cadre du
développement neuronal ou de la neurogénèse adulte induite ont montré que certaines des cellules
exprimant ces marqueurs ne survivent pas ou ne se différencient pas en neurones fonctionnels
intégrés (Brown et al. 2003; Kronenberg et al. 2003).
Il apparait donc essentiel de prendre en compte les limitations techniques pour analyser et
interpréter les résultats concernant la neurogénèse adulte, notamment celle relatée dans des zones
du cerveau à priori non neurogéniques.
Neurogénèse et zones non neurogéniques
Un aspect de la recherche sur la neurogénèse adulte reste controversé : celui concernant la
formation de nouveaux neurones au-delà du bulbe olfactif et de l’hippocampe, régions collégialement
reconnues comme neurogéniques (pour revue: Gould 2007). En effet plusieurs études ont rapporté
une neurogénèse constitutive chez le rongeur au niveau du néocortex (Gould et al. 1999; Dayer et al.
2005), de l’amygdale (Bernier et al. 2002), du complexe vagal dorsal du tronc cérébral (Bauer et al.
2005 ; Charrier et al. 2006), de la moelle épinière (Yamamoto et al. 2001) et de la substance noire
(Lie et al. 2002; Ming Zhao et al. 2003), mais ces travaux restent à l’heure actuelle pour la plupart non
confirmés ou contredis par des résultats négatifs (Frielingsdorf et al. 2004; Koketsu et al. 2003;
Kornack & Rakic 2001a). Cette disparité dans la reproductibilité des études résulte moins du fait que
la neurogénèse dans les régions décrites comme non-neurogéniques est impossible, que de l’absence
de techniques fiables et efficaces pour marquer les nouveaux neurones, comme commenté dans le
paragraphe précédent. Néanmoins certains auteurs, par des expériences de transplantation de
cellules souches/progénitrices neurales (CSPN), soutiennent le principe de distinction des zones
neurogéniques et non-neurogéniques. En effet, lorsque des CSPN sont transplantées dans des régions
neurogéniques, elles se différencient en neurones spécifiques de la région d’implantation (Gage et al.
1995; Shihabuddin et al. 2000). Par exemple, les CSPN de la ZSG se différencient en neurones
hippocampaux quand greffées dans l’hippocampe, et les CSPN de la ZSG génèrent des interneurones
35
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
olfactifs quand transplantées dans le courant migratoire rostral (Suhonen et al. 1996). En revanche,
lors d’une greffe hors des régions neurogéniques, ces deux types de CSPN génèrent uniquement des
cellules gliales. Ces observations amènent à penser que la neurogénèse chez l’adulte est dépendante
d’un microenvironnement permissif plutôt que de propriétés intrinsèquement différentes des CSPN
en fonction de leur localisation. Ces microenvironnements hautement spécialisés qui régulent
finement le développement neuronal des CSPN correspondent aux « niches neurogéniques ».
2.4.3. Concept de niche neurogénique
Les niches sont des microenvironnements spécialisés qui régulent l’activité des cellules
souches, en particulier leur auto-renouvellement et leur production de cellules différenciées
(Spradling et al. 2001; Fuchs et al. 2004). Les cellules souches font partie intégrante de la niche et
interagissent avec elle. Les niches sont en fait des entités dynamiques qui modifient leur localisation
et leurs caractéristiques au cours du temps et en fonction du remodelage du tissu auquel elles
appartiennent. La comparaison des niches de cellules souches présentes chez les mammifères dans le
système hématopoïétique, l’épithélium intestinal, les follicules des cheveux ou de la peau et le
système nerveux a révélé l’existence de caractères communs mais également propres à ces niches
(Doetsch 2003; Li & Xie 2005). Comme dans les autres systèmes de cellules souches adultes
tissulaires, la niche neurogénique préserve les cellules souches neurales et régule leur
développement in vivo. De multiples types cellulaires ont été identifiés comme composants de cette
niche, à savoir les astrocytes, les cellules endothéliales, les cellules épendymaires, les neurones
locaux matures et les cellules progénitrices issues des cellules souches neurales (Ming & Hongjun
Song 2005; Zhao et al. 2008), communiquant entre eux par contact cellulaire, innervation spécifique
et libération de facteurs comme des neurotransmetteurs (Alvarez-Buylla & Lim 2004; Hagg 2009).
A l’intérieur des niches neurogéniques et en plus de leur rôle de cellules souches, les
astrocytes jouent le rôle de capteurs et régulateurs de l’environnement. Ils possèdent de longs
prolongements qui enveloppent et contactent tous les types cellulaires et structures de la niche
(Doetsch et al. 1997), incluant les vaisseaux sanguins et la lame basale (Mercier et al. 2002), ce qui
leur permet d’intégrer des signaux provenant de plusieurs sources. De plus, les astrocytes sont
souvent couplés entre eux par des jonctions gap, et forment un syncytium (Giaume & Venance 1998),
permettant de diffuser les signaux intercellulaires localement ou à la niche entière (Schipke &
Kettenmann 2004). En réponse à des stimuli physiologiques ou pathologiques, les astrocytes
expriment des molécules sécrétées ou liées à la membrane, incluant des cytokines comme les
36
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
interleukines 1 et 6 et des facteurs de croissance comme le NGF (facteur de croissance nerveuse), le
CNTF (facteur neurotrophique ciliaire), le GDNF (facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales)
ou le FGF (facteur de croissance des fibroblastes ; Ridet et al. 1997; Lafon-Cazal et al. 2003). Cette
sous-population particulière d’astrocytes dans les niches neurogéniques est différente des cellules
gliales classiquement associées aux fonctions de soutien dans le cerveau (Sanai et al. 2004). Pour
autant, le fait de savoir si tous les astrocytes du cerveau adulte possèdent un potentiel neurogénique
latent ou si les astrocytes spécialisés en cellules souches sont une particularité unique des niches
neurogéniques reste une question encore non résolue (Riquelme et al. 2008).
Parmi les facteurs de croissance sécrétés par les cellules de la niche, deux sont
particulièrement importants pour le maintien de la niche et la prolifération des cellules
souches/progénitrices neurales: il s’agit de l’EGF (facteur de croissance épidermique) et du bFGF
(facteur de croissance basique des fibroblastes). Il a été montré que L’EGF exogène induit la
différenciation des CSPN en cellules gliales in vivo (Gregg & Weiss 2003). A l’inverse, le bFGF stimule
la prolifération des CSPN, et un apport de bFGF exogène permet de restaurer chez une souris âgée un
taux de neurogénèse correspondant à celui d’une souris plus jeune (Jin et al. 2003). Cela suggère que
la niche est dotée d’une certaine plasticité lui permettant de s’adapter aux signaux reçus et d’initier
des processus de régénération et de différenciation.
Naturellement couplées aux astrocytes par l’intermédiaire des pieds astrocytaires, les cellules
endothéliales jouent également un rôle important dans la structure de la niche ainsi que dans le
maintien d’une coordination étroite avec les astrocytes pour réguler la neurogénèse (Palmer et al.
2000; Shen et al. 2004). En effet, le récepteur au VEGF (facteur de croissance de l’endothélium
vasculaire) est exprimé par les cellules souches progénitrices neurales et l’infusion intraventriculaire de VEGF augmente leur prolifération au niveau de la ZSG et de la ZSV. De plus, la
neurogénèse et l’angiogénèse sont en partie régulées par des facteurs communs comme le bFGF, le
VEGF ou encore l’IGF-1 (hormone peptidique de structure semblable à celle de l’insuline). En outre,
les cellules endothéliales sécrètent des facteurs mitogènes, de différenciation et de survie neuronale
tels que bFGF, IGF-1, VEGF, PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes), l’interleukine-8 et le
BDNF (facteur neurotrophique dérivé du cerveau ; Doetsch 2003). Ainsi le concept de « niche
vasculaire » a été proposé pour définir le lien existant entre neurogénèse et angiogénèse dans le
cerveau adulte. En plus des cellules endothéliales, d’autres signaux dérivés des vaisseaux sanguins
influent sur les CSPN, comme par exemple les facteurs du complément (Rahpeymai et al. 2006) ou les
lymphocytes T, qui coopèrent avec la microglie pour réguler positivement la neurogénèse (Walton et
al. 2006; Ziv et al. 2006). Il est à noter que les signaux provenant des cellules T et de la microglie
agissent exclusivement sur les précurseurs neuronaux, alors que les composants de la signalisation
du complément exercent leur effet sur les progéniteurs d’amplification transitoire ainsi que sur les
37
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
précurseurs neuronaux (Rahpeymai et al. 2006). Ces données soulignent la diversité des facteurs
agissant sur les CSPN dans les zones de neurogénèse adulte.
Ainsi, bien au delà de l’identité exacte de la cellule souche neurale adulte, ces observations
démontrent que le microenvironnement dans lequel elle se trouve est capital pour que son autorenouvellement, sa différenciation et même sa migration soient régulés et adaptés aux besoins
physiologiques. La compréhension de la structure et du fonctionnement de ces niches est primordial
pour appréhender le rôle des cellules souches/progénitrices neurales qui en sont issues ainsi que
leurs éventuels potentiels thérapeutiques.
2.5. Les cellules souches/progénitrices neurales in vitro
Comme nous venons de le voir, la composition des niches de cellules souches est un sujet
important qui doit être exploré en profondeur. Les cellules souches/progénitrices neurales issues de
l’embryon in vivo subissent des changements complexes de leur niche afin de leur permettre de
remplir leur rôle au cours du développement du SNC. Les CSPN adultes quant-à elles doivent être
strictement contrôlées au niveau de leur prolifération pour éviter une sur-expansion dans le SNC
adulte. Ainsi, il est important d’identifier la nature des facteurs libérés par les cellules de la niche et
agissant sur les CSPN et de comprendre les contacts cellulaires dont elles ont besoin pour maintenir
leur état physiologique. Pour ce faire, les expériences in vitro faisant appel aux cultures de CSPN afin
d’étudier leur comportement ex vivo sont incontournables.
2.5.1. Mise en culture et amplification
Les cellules souches/progénitrices neurales ont été initialement isolées à partir du cerveau
embryonnaire et adulte de la souris (Reynolds et al. 1992; Reynolds & Weiss 1992). La méthode de
culture utilisée comprend la dissociation du tissu cérébral prélevé et l’ensemencement de la
suspension cellulaire qui en résulte dans un milieu de culture défini supplémenté en hormones (N2
et/ou B27) et en mitogènes (EGF et/ou bFGF). Les cellules souches neurales prolifèrent alors en
suspension sous forme de clusters sphériques appelés neurosphères. Mais elles peuvent également
être cultivées sous forme d’une monocouche cellulaire adhérente, en présence de bFGF, comme l’ont
décrit Gage et al. pour les CSPN issues de l’hippocampe de rat (Gage et al. 1995).
La majorité des études ont montré que les CSPN répondent indifféremment à l’EGF et au
bFGF. Cependant, à des stades précoces du développement, notamment chez l’embryon, les CSPN ne
38
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
répondent pas à l’EGF. En effet, il faut attendre l’acquisition des récepteurs à l’EGF à des stades plus
tardifs pour qu’elles deviennent sensibles à ce facteur de croissance (Ciccolini & Svendsen 1998). Si
l’EGF et le bFGF peuvent tous les deux être utilisés pour induire la prolifération des CSPN, ils ne sont
toutefois pas complètement interchangeables. En effet, il semble que la culture des neurosphères en
présence d’EGF seul résulte en un plus haut degré d’engagement des CSPN vers un lignage glial, alors
que le bFGF permettrait une neurogénèse accrue dans la plupart des circonstances (Irvin et al. 2003).
Les neurosphères sont des structures sphériques entourées d’une riche matrice
extracellulaire et les cellules les constituant expriment entre autres des intégrines β1, le récepteur à
l’EGF et des cadhérines (Jacques et al. 1998; Lobo et al. 2003; Campos et al. 2004). Elles produisent
leurs propres molécules de la matrice extracellulaire (laminines, fibronectines) ainsi que des facteurs
de croissance (Lobo et al. 2003). Par ailleurs les neurosphères sont constituées par des types
cellulaires hétérogènes résultant des divisions symétriques et asymétriques d’une cellule souche
neurale initiale. En effet, seulement 10 % à 20 % des cellules retiennent les caractéristiques de
cellule souche (Reynols & Weiss 1996), tandis que les autres sont déjà engagées dans une voie de
différenciation (Fig. 13). Ainsi une neurosphère est une entité constituée d’un assortiment de cellules
souches neurales, de cellules progénitrices, et même de précurseurs neuronaux et gliaux en cours de
différenciation, selon la taille de la neurosphère et le temps de culture (Galli et al. 2003).
Dans ces conditions de culture particulières sans sérum qui ne favorisent ni la différenciation
des cellules souches neurales ni la survie de la plupart des types cellulaires, seules les cellules
répondantes aux mitogènes peuvent proliférer et s’amplifier. Ainsi, à mesure des passages, la
formation de neurosphères secondaires correspond au renouvellement de la population cellulaire
précédente et est en théorie indéfinie. En pratique, les neurosphères peuvent être passées jusqu’à dix
fois sans que s’opèrent de modifications majeures du potentiel de prolifération et de différenciation
(Reynolds & Weiss 1996 ; Gritti et al. 1999 ; Vescovi et al. 1999).
Etant donné la structure tridimensionnelle de la neurosphère, celle-ci s’apparente à une niche
permettant de modéliser in vitro des changements dynamiques de l’environnement en faisant par
exemple varier les facteurs de croissance ou la concentration des nutriments du milieu. Par ailleurs,
l’hétérogénéité cellulaire qui caractérise la neurosphère fait prendre tout son sens à la nécessaire
distinction entre cellules souches neurales et cellules progénitrices neurales. En effet, les expériences
in vitro menées avec un tel matériel cellulaire rendent difficile l’extraction d’informations concernant
le comportement de la petite fraction de « vraies » cellules souches (Galli et al. 2003) et justifient le
terme de « cellules souches/progénitrices neurales » utilisé dans ce manuscrit. De fait, des efforts ont
été faits pour essayer d’identifier des molécules pouvant servir de marqueurs discriminant les CSN
des CPN.
39
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Figure 13 : Représentation schématique des étapes de prolifération des cellules souches
neurales in vitro. En présence de mitogènes tels que l’EGF et/ou le bFGF, les cellules souches neurales
(CSN) prolifèrent en suspension sous forme de neurosphères primaires composées de CSN, de cellules
progénitrices neurales (CPN) et de précurseurs neuronaux (PN) et gliaux (PG). Après dissociation
mécanique et/ou enzymatique, la petite fraction de CSN prolifère à nouveau pour former des
neurosphères secondaires. Adapté de Reynolds & Weiss 1996.
2.5.2. Marqueurs des cellules souches/progénitrices neurales
Un des objectifs majeurs de la recherche sur les cellules souches neurales est l’identification
de marqueurs permettant de purifier des populations homogènes de CSN. Plusieurs molécules ont
déjà été mises en évidence. Par exemple LeX/ssca-1, un carbohydrate exprimé par les cellules
souches pluripotentes, est exprimé par une petite proportion de cellules épendymaires in vivo chez la
souris et une sous-population de ces cellules positives pour LeX donne naissance à des neurosphères
in vitro (Capela & Temple 2002). De même l’antigène CD133 (AC133) chez l’homme ou la prominine
1 (glycoprotéine transmembranaire), son homologue murin, ont été utilisés pour isoler les CSPN
issues du plusieurs régions du cerveau chez les mammifères (Corti et al. 2007; Lee et al. 2005a).
Néanmoins, le marqueur le plus utilisé pour identifier les CSPN est la nestine, une protéine
appartenant à la classe VI des filaments intermédiaires (Lendahl et al. 1990). Elle est exprimée
fortement dans les cellules souches multipotentes du neuroépithélium en développement. Au cours
de la différenciation, l’expression de la nestine est inhibée et cette protéine est progressivement
40
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
remplacée par les filaments intermédiaires spécifiques des cellules différenciées, comme par
exemple la GFAP pour les astrocytes ou les neurofilaments pour les neurones (Frederiksen & McKay
1988). La signification biologique de ce phénomène reste à déterminer mais l’expression de la
nestine peut être ré-induite chez l’adulte et une co-expression transitoire de la nestine et de la GFAP
a été observée pendant le développement post-natal du cerveau chez la souris (Wei et al. 2002) et
suite à une lésion du SNC (Lin et al. 1995). Une étude menée par notre groupe a révélé une coexpression de la nestine et de la GFAP dans des cultures primaires d’astrocytes. Cette co-expression
persiste pendant plusieurs semaines (Sergent-Tanguy et al. 2006a), soulevant la question de la
pertinence de l’utilisation de la nestine comme marqueur pour identifier les CSPN. De plus, la nestine,
tout comme la protéine de liaison à l’ARN Musashi-1 ou le facteur de transcription Sox-1, également
décrits comme marqueurs de CSPN (Sakakibara et al. 1996; Pevny et al. 1998), est une molécule
intracellulaire limitant son utilisation dans des stratégies de purification des CSPN par tri cellulaire.
Cette constatation nous a incité à rechercher par cytométrie en flux l’expression de molécules
extracellulaires par les CSPN de rat. Nous avons porté un intérêt tout particulier aux clusters de
différenciation (CD), antigènes classiquement utilisés pour la caractérisation des populations
leucocytaires (Sergent-Tanguy et al. 2006b). De manière intéressante, nous avons pu isoler trois
marqueurs dominants pour les CSPN de rat : CD3 (molécule associée au récepteur des lymphocytes
T), CD71 (récepteur à la transferrine) et RT1A (CMH de classe I ; Tableau 2). Une étape de tri
cellulaire par billes magnétiques a révélé que la population CD3+ se différenciait majoritairement en
astrocytes alors que la population CD3- avait un profil de différenciation mixte (astrocytes, neurones
et oligodendrocytes ; Sergent-Tanguy et al. 2006b).
Si l’utilisation de ces différentes molécules permet d’enrichir en CSPN une population
cellulaire hétérogène, pour autant il n’existe toujours pas à l’heure actuelle un ensemble de
marqueurs identifiant précisément une cellule souche neurale et la discriminant des progéniteurs,
précurseurs et cellules différenciées. Ainsi, l’identification formelle d’une cellule comme CSPN
requiert toujours la démonstration fonctionnelle de l’auto-renouvellement mais également de la
capacité de multipotence.
41
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
Tableau
2:
Expression
de
molécules extracellulaires par les
CSPN de rat en culture. Des analyses
par cytométrie en flux ont montré
qu’une proportion de CSPN est
immunoréactive pour CD3 (42%),
CD25 (15%), CD71 (50%) et le CMH
de classe I (RT1A, 41%). Adapté de
Sergent-Tanguy et al. 2006b.
2.5.3. Potentiel de différenciation
La multipotence des CSN a été démontrée in vitro. En effet, après une phase de prolifération,
la différenciation des CSPN contenues dans les neurosphères peut être induite en retirant les facteurs
mitogènes du milieu. Les CSPN sont alors capables de générer les trois types cellulaires principaux
du système nerveux central que sont les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes (Lois &
Alvarez-Buylla 1993; pour revue: Gage 2000). Il est à noter toutefois que les cellules issues des
neurosphères se différencient in vitro majoritairement en astrocytes, et que les neurones générés
sont pour la plupart d’un phénotype GABAergique (Reynolds & Weiss 1992).
L’orientation du devenir des CSPN vers un type cellulaire spécifique peut être réalisée par
différents moyens. Le premier consiste à manipuler l’expression de certains facteurs de
transcription. Par exemple, l’expression induite de Neurogenin-1 dans des cultures de CSPN issues
du télencéphale embryonnaire provoque une différenciation neuronale. En revanche, la
surexpression d’un récepteur constitutivement actif de Notch résulte en un engagement vers le
lignage glial. Les facteurs de transcription peuvent également influer sur le sous-type neuronal
produit par les CSPN. En effet, l’expression de Nurr1, associée à des facteurs produits par les
astrocytes du mésencéphale ventral, favorise l’apparition de neurones dopaminergiques dans des
cultures qui normalement n’en auraient contenu que très peu (pour revue : Kornblum 2007).
L’utilisation de certaines molécules ou facteurs trophiques, in vivo ou in vitro, est également un
42
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie II
moyen de manipuler le devenir des CSPN. Par exemple, le PDGF est connu pour promouvoir la
différenciation neuronale des progéniteurs corticaux embryonnaires, tandis que le CNTF, le LIF ou
encore l’interleukine-6 favorisent la différenciation astrocytaire (Williams et al. 1997; Galli et al.
2000; Taga & Fukuda 2005).
Comme nous venons de le voir dans cette partie, les cellules souches/progénitrices neurales,
de part leurs propriétés d’auto-renouvellement, de prolifération et de multipotence in vitro et in vivo,
représentent une population cellulaire intéressante pour des stratégies de restauration neuronale
après maladie ou traumatisme du SNC. Avant de revenir plus en détail sur les potentialités
thérapeutiques qu’offrent ces cellules, notamment dans la cadre de la transplantation, il convient de
revenir brièvement sur les bases de l’immunosurveillance périphérique afin de mieux appréhender
les caractéristiques particulières du cerveau. En effet, ce dernier offre un terrain plutôt favorable à la
greffe cellulaire en raison de sa spécificité immunologique qui lui a longtemps valu d’être considéré
comme un site immunologiquement privilégié. Les bases de ce contexte immun particulier sont
détaillées dans la partie suivante.
43
PARTIE III
Le SNC, un organe
immunologiquement particulier
44
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
PARTIE III
3. Situation immunologique particulière du SNC
Le
système
nerveux
central
a
longtemps
été
considéré
comme
un
organe
immunologiquement privilégié (Medawar 1948 ; Billingham et Boswell 1953) à l’instar de l’œil, des
testicules ou encore du placenta. Cela sous-entendait que le système immunitaire évitait toute
interaction avec le SNC afin de ne pas perturber son homéostasie, cette dernière étant critique pour
le fonctionnement des neurones. Cette hypothèse de privilège immun était avancée pour plusieurs
raisons : (i) l’existence de la barrière hémato-encéphalique (BHE), barrière hémato-tissulaire
constituée par les cellules endothéliales vasculaires du SNC qui délimitent le sang du parenchyme
nerveux (Bradbury 1984) ; (ii) l’expression par la BHE de molécules pro-apoptotiques; (iii) la faible
expression des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) par les cellules nerveuses
(Mauerhoff et al. 1988) ; et (iv) l’absence de cellules présentatrices d’antigène « professionnelles » au
sein du SNC. Malgré ces observations, il est désormais admis que des réponses immunitaires s’y
produisent et que les composants du système immunitaire périphérique peuvent en fait avoir accès
au SNC, sous des conditions normales dans un but d’immuno-surveillance mais également lors de
maladies neurologiques inflammatoires (Engelhardt 2006). Cependant, le microenvironnement
unique du SNC contrôle strictement les réactions immunes, qui se déroulent ainsi dans un contexte
très différent de ce qui est observé classiquement dans le système immunitaire périphérique.
3.1. Présentation générale du système immunitaire périphérique
Le système immunitaire a pour fonction de maintenir l’intégrité de l’organisme en repérant et
en éliminant les nouveaux antigènes provenant de l’environnement extérieur, mais également les
substances modifiées du milieu intérieur. Il est constitué par un réseau complexe de cellules et de
molécules permettant de détruire les pathogènes ou les cellules cancéreuses de façon assez
spécifique pour éviter d’endommager les tissus de l’hôte (Lippolis 2008). Ainsi, toute perturbation
dans la régulation du système immunitaire se traduit par de graves conséquences au niveau de
l’organisme, comme par exemple l’apparition de maladies opportunistes en cas de déficience de
l’immunité, ou à l’inverse le développement de maladies auto-immunes dans le cas d’une
hyperactivité du système.
45
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Afin de protéger l’organisme contre l’invasion d’éléments étrangers ou pathogènes, le
système immunitaire a évolué en deux parties : l’une est responsable de l’action immédiate et
relativement générique contre les agents externes, et l’autre est un système qui répond
spécifiquement à une menace externe et requiert plasticité et mémoire. Le système immunitaire
répondant immédiatement correspond à l’immunité innée qui représente la première ligne de
défense contre les infections. Elle permet la reconnaissance des structures étrangères grâce à des
récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) encodés par la lignée germinale. Le
système qui répond de façon spécifique correspond à l’immunité dite acquise ou adaptative. Elle
permet la reconnaissance via des récepteurs spécifiques de l’antigène générés par recombinaison
somatique. La réponse immunitaire acquise présente quatre propriétés caractéristiques. Tout
d’abord la spécificité antigénique, qui lui permet de distinguer des différences subtiles parmi les
antigènes. De plus, elle est capable de créer une très grande diversité dans ses molécules de
reconnaissance, ce qui lui permet de reconnaître des milliards de structures différentes sur des
antigènes étrangers. Une fois que le système immunitaire a reconnu un antigène et répondu à ce
dernier, il présente une mémoire immunitaire, permettant une réponse amplifiée en cas de seconde
rencontre avec le même antigène. Enfin, les composants de l’immunité adaptative peuvent
discriminer le Soi du non Soi, ce qui est une caractéristique essentielle car la survenue d’une réponse
inappropriée aux molécules du Soi peut être fatale.
Les recherches en Immunologie de la dernière décennie ont pu mettre en évidence des liens
entre l’immunité innée et adaptative, notamment dans le cadre des processus inflammatoires ainsi
que dans l’activation des cellules immunitaires. La caractérisation de ces cellules est d’ailleurs
continuellement affinée. Elles peuvent être classées dans des groupes fonctionnels bien définis, et
chacune d’elles joue un rôle bien précis dans les réponses immunes.
3.1.1. Les principales cellules du système immunitaire périphérique
Toutes les cellules du sang dérivent d’une cellule souche multipotente appelée cellule souche
hématopoïétique (CSH). Chez l’Homme, l’hématopoïèse débute dans le sac vitellin de l’embryon puis
se poursuit dans le foie fœtal et la rate au cours du deuxième trimestre de gestation. A partir de la
naissance, la différenciation des CSH en cellules sanguines ne s’effectue plus que dans la moelle
osseuse, qui devient alors le siège de l’hématopoïèse (Fig.14). Au cours de ce processus, la CSH se
divise pour donner naissance à une cellule progénitrice, qui peut être soit une cellule progénitrice
lymphoïde à l’origine des lymphocytes B et T et des cellules NK (natural killer), soit une cellule
progénitrice myéloïde à l’origine des érythrocytes, des mégacaryocytes et des autres leucocytes
(polynucléaires, monocytes, mastocytes ; Ceredig et al. 2009).
46
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Figure 14 : Vue d’ensemble de l’hématopoïèse. La division asymétrique des cellules souches
hématopoïétiques (CSH) permet d’une part de maintenir le stock de CSH dans la moelle osseuse, et
d’autre part de générer une cellule progénitrice myéloïde ou lymphoïde. Toutes les cellules de la lignée
myéloïde dérivent de progéniteurs myéloïdes, alors que les cellules lymphoïdes sont issues des cellules
progénitrices lymphoïdes (Kondo et al. 1997).
Les cellules phagocytaires, comme les monocytes/macrophages et les polynucléaires, ainsi
que les cellules NK, sont les principales cellules du système immunitaire inné. Les lymphocytes
portant les récepteurs spécifiques aux antigènes sont, quant-à eux, les cellules centrales de
l’immunité adaptative. Ils sont à la base des propriétés de diversité, de spécificité et de mémoire.
Mais les autres types de leucocytes jouent également un rôle essentiel en phagocytant les microorganismes ce qui aboutit à la présentation des antigènes et à la sécrétion de cytokines.
Les granulocytes
Les cellules immunitaires polynucléaires jouent un rôle important dans l’immunité innée. Les
granulocytes basophiles, éosinophiles et neutrophiles ont été trouvés dans plusieurs endroits du
corps incluant la peau, les poumons et les intestins, et sont parmi les premières populations de
cellules immunitaires à entrer en contact avec l’environnement extérieur et les pathogènes. Les
47
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
neutrophiles, en particulier, sont les premières cellules répondeuses à être recrutées sur le site d’une
lésion tissulaire (Fahey et al. 1990). Ces cellules sécrètent des cytokines pro-inflammatoires et des
chimiokines qui attirent les autres cellules immunitaires sur le site de l’infection. Elles participent
également à l’élimination des débris et des substances étrangères à travers leur activité de
phagocytose et la production de radicaux libres (Singer & Clark 1999).
Les monocytes/macrophages
Les monocytes sont une population de cellules présentatrices d’antigène avec des propriétés
de phagocytose (Volkman 1970). Les macrophages sont la forme mature des monocytes. Ils
produisent plusieurs cytokines comme le TNF-α (facteur de nécrose tumorale) et l’interleukine-1β
(IL-1β), afin de promouvoir une réponse inflammatoire (Gordon & Taylor 2005). Les différentes
sous-populations de macrophages expriment également une variété de récepteurs aux chimiokines,
ces dernières leur indiquant leur localisation tissulaire ainsi que leur fonction spécifique (Weber et
al. 2000). A des stades plus avancés d’une réponse inflammatoire, les macrophages nettoient la zone
lésée en phagocytant les granulocytes apoptotiques (Martin & Leibovich 2005). Ainsi, ces cellules
exercent à la fois la fonction de cellules potentialisatrices du degré de la réponse inflammatoire, mais
également d’élimination des déchets immunitaires.
Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont considérées comme la population de cellules présentatrices
d’antigène (CPA) la plus puissante, et sont aussi appelées CPA « professionnelles ». De même que les
monocytes/macrophages, elles peuvent reconnaître des pathogènes en utilisant des récepteurs de
reconnaissance de motifs moléculaires conservés (PRR, pour pattern recognition receptor) et
élaborer une puissante réponse immune. Les cellules dendritiques sont polyvalentes, elles se
présentent sous différentes formes et accomplissent la fonction de capture de l’antigène et de
présentation antigénique (Banchereau & Steinman 1998). En dehors des ganglions lymphatiques, les
formes immatures de ces cellules surveillent l’organisme du moindre signe d’invasion par des
pathogènes et capturent les antigènes étrangers. Elles subissent alors un processus de maturation et
migrent vers les ganglions lymphatiques où elles présentent l’antigène aux cellules T. Lorsqu’elles
sont matures, les cellules dendritiques produisent de grandes quantités de cytokines qui stimulent
les autres cellules immunitaires. Elles expriment fortement les molécules du CMH de classe II et des
molécules de costimulation (par exemple B7, CD40L) membranaires, ce qui est critique pour
l’activation des lymphocytes naïfs. Il existe plusieurs sous-populations de cellules dendritiques, les
48
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
cellules dendritiques myéloïdes et les cellules dendritiques plasmacytoïdes, chacune étant
considérée comme réalisant des fonctions distinctes dans l’immunité, et étant localisée à des endroits
spécifiques de l’organisme (Mellman & Steinman 2001). Parmi les cellules dendritiques myéloïdes,
on distingue les cellules dendritiques de Langherans et les cellules dendritiques interstitielles. Les
cellules dendritiques de Langerhans, les premières cellules dendritiques identifiées, sont connues
pour leur capacité à nettoyer l’environnement des particules étrangères. Elles sont situées dans la
peau au niveau de l’épiderme et sont vitales pour les réponses immunitaires cutanées (Anjuère et al.
1999). Les cellules dendritiques interstitielles résident dans la lamina propria et sont importantes
dans l’immunité de l’intestin (Iwasaki 2007). Les cellules dendritiques myéloïdes, aussi appelées
cellules dendritiques conventionnelles, sont les cellules dendritiques les plus étudiées et peuvent
être facilement isolées à partir de la moelle osseuse, du sang et de la rate. Elles sont les principales
cellules sécrétrices d’interleukine-12 (IL-12) ce qui stimule la production d’interféron-γ (IFN-γ) par
les lymphocytes T et les réponses immunitaires cellulaires. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes
sont importantes dans l’immunité virale, sécrètent de grandes quantités d’interférons de type I (IFNα/β) et jouent un rôle significatif dans les réponses immunes tolérogènes (Steinman et al. 2003).
Les cellules NK (natural killer)
Les cellules NK sont les cellules effectrices du système immunitaire inné, présentant un
phénotype similaire à celui des lymphocytes T (Cooper et al. 2001). Ces cellules exercent une
fonction cytotoxique de deux façons : (i) par un processus appelé cytotoxicité cellulaire dépendante
des anticorps (ADCC, de antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity). En effet, des cellules
tumorales, ou des cellules infectées par certains virus, exposent des antigènes contre lesquels le
système immunitaire a développé une réponse anticorps, de telle sorte que des anticorps
antitumoraux ou antiviraux soient liés à leur surface. Les cellules NK exprimant le CD16, qui est un
récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines, peuvent ainsi se fixer à ces anticorps et
détruire les cellules cibles en produisant notamment des perforines et granzymes. (ii) Les cellules NK
peuvent également induire l’apoptose par contact cellulaire via l’interaction du récepteur de mort
Fas avec son ligand FasL, et par la voie du récepteur au TNF (TRAIL), qui provoquent le recrutement
de la procaspase 8, induisant ainsi le déclenchement de la voie extrinsèque de l’apoptose dans les
cellules cibles (Screpanti et al. 2005). En plus de leur activité cytotoxique, les cellules NK expriment
des molécules de costimulation (CD40L) pour stimuler les lymphocytes et régulent les réponses
immunitaires en sécrétant des cytokines et chimiokines. Elles sécrètent l’IFN-γ qui stimule une forte
réponse TH1 (immunité cellulaire), ou l’IL-5 et l’IL-13 qui favorisent la réponse TH2 (immunité
humorale). Elles produisent des cytokines (TNF-α, IL-10) qui modifient l’activité des populations
49
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
cellulaires de l’immunité innée et des chimiokines (MIP-1, RANTES, IL-8) qui attirent les cellules
immunitaires sur le site des lésions cellulaires (Zanoni et al. 2007). Ces cellules sont également un
bon complément de l’activité des cellules T puisqu’elles reconnaissent des cellules cibles présentant
une faible expression des molécules du CMH à leur surface.
Les lymphocytes B
L’immunité humorale requiert l’intervention des lymphocytes B, qui sont les cellules
productrices d’anticorps du système immunitaire. Les cellules B se développent dans la moelle
osseuse et migrent vers la rate et les ganglions lymphatiques ainsi que vers d’autres organes
lymphoïdes périphériques, où elles rencontrent l’antigène et sont activées (Janeway et al. 1987). Lors
de leur activation, ces cellules forment des centres germinatifs, sites d’une intense prolifération des
cellules B, et donnent naissance aux plasmocytes sécréteurs d’anticorps (Tarlinton 1998). Les
anticorps ou immunoglobulines sont des molécules spécifiques d’un antigène, sécrétés en réponse à
l’activation des cellules B. Ils consistent en cinq isotypes différents, classés selon la séquence des
chaînes lourdes : immunoglobuline M (IgM, initie la voie classique de la cascade du complément), IgD
(importante pour l’élimination des lymphocytes B auto-réactifs), IgG (isotype le plus abondant dans
le sérum, active la cascade du complément), IgA (initie la voie alterne de la cascade du complément),
et IgE (active les mastocytes et les granulocytes, et est importante dans les réponses allergiques).
Chaque isotype est important dans la régulation des nombreuses réponses contre les pathogènes qui
nécessitent l’intervention de l’immunité humorale pour une inactivation et élimination efficaces
(LeBien & Tedder 2008). Les cellules B peuvent également jouer le rôle de cellules présentatrices
d’antigène « non professionnelles ».
Les lymphocytes T
Les lymphocytes T sont produits dans la moelle osseuse mais effectuent leur maturation dans
le thymus, phase pendant laquelle ils expriment sur leur membrane le TCR (récepteur des cellules T),
molécule susceptible de reconnaître un antigène spécifique (Schwarz & Bhandoola 2006).
Cependant, et contrairement aux récepteurs exprimés par les lymphocytes B, le TCR ne reconnaît
l’antigène que si ce dernier est associé à une molécule du CMH. Les molécules du CMH qui participent
à
la
présentation
antigénique
sont
des
glycoprotéines
membranaires
génétiquement
polymorphiques. On distingue les molécules du CMH de classe I, exprimées par la quasi-totalité des
cellules nucléées différenciées, et les cellules du CMH de classe II exprimées uniquement par
quelques cellules spécialisées dans la présentation antigénique (Appella et al. 1995). Les réponses
50
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
immunitaires spécifiques de l’antigène sont initiées par des interactions entre le TCR et le complexe
CMH-peptide de la cellule présentatrice d’antigène (CPA). Cette interaction seule fournit un faible
signal qui déclenche seulement une partie de la fonction effectrice comme la sécrétion de cytokines
mais bloque la prolifération clonale et peut même conduire à l’apoptose du lymphocyte (Russell et al.
1991; Russell et al. 1992). L’activation complète de la cellule T dépend d’un second signal, le signal de
costimulation, fourni par la CPA, en association avec le signal du TCR (Mueller et al. 1989). Par
exemple, CD80 (B7-1) ou CD86 (B7-2) qui sont des molécules membranaires de la CPA, fournissent le
signal de costimulation en activant le récepteur CD28 du lymphocyte T répondeur (Fig. 15). Après
activation par les CPA professionnelles, les cellules T se transforment en effecteurs ou en cellules
mémoire, mais la fonction effectrice des lymphocytes T activés requiert une seconde reconnaissance
entre le TCR et le complexe CMH/peptide.
Figure 15 : Activation des lymphocytes T. (1) L’activation de la réponse antigénique des cellules T
est stimulée par le contact entre le peptide antigénique (P) présenté par les récepteurs du complexe
majeur d’histocompatibilité (CMH) à la surface de la cellule présentatrice d’antigène (CPA) et le
récepteur de la cellule T (TCR). (2) Pour l’activation complète du lymphocyte T, un second signal est
requis. Ce dernier est délivré, entre autres, par l’interaction entre la molécule de costimulation B7 et le
récepteur CD28 de la cellule T.
Les cellules T interviennent dans l’élaboration de réponses immunitaires puissantes contre
les virus et les cellules tumorales et sont les premiers effecteurs de l’immunité adaptative. Plusieurs
populations de cellules T ont été décrites, chacune intervenant dans des réponses immunes variées,
incluant les réactions immunitaires cellulaires, humorales, et tolérogènes.
L’une des sous-populations de lymphocytes T les plus étudiées est la population de cellules T
CD4+ auxilliaires (TH) qui dirige l’immunité cellulaire (TH1) et humorale (TH2). A la suite de
l’activation induite par l’interaction CMH II/peptide (Kalish 1995), les cellules TH CD4+ se
51
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
différencient soit en en cellules mémoire (Zhang et al. 2009), soit en cellules effectrices T CD4+
helper, capables d’aider l’activation des cellules B, des cellules T cytotoxiques (TC) ou encore des
macrophages.
Une deuxième population de lymphocytes T correspond aux cellules T cytotoxiques (TC). La
reconnaissance du complexe CMH de classe I/antigène (Kalish 1995) par une cellule TC CD8+ conduit
à sa prolifération et à sa différenciation en cellule effectrice appelée lymphocyte T cytotoxique (CTL)
ou en cellule mémoire. Les CTL éliminent les pathogènes et les cellules infectées. De façon similaire
aux mécanismes décrits pour les cellules NK, ces cellules produisent des molécules qui attaquent la
membrane de la cellule cible en diminuant sa stabilité, ce qui permet d’éliminer les éléments
envahisseurs.
Les cellules T régulatrices CD4+ CD25+ (TREG) sont une autre catégorie de cellules T, très
étudiée depuis quelques années. Elles ont la capacité de réguler négativement l’activité des autres
cellules T. Elles permettent notamment de contrôler les lymphocytes autoréactifs et d’éviter le
déclenchement de maladies auto-immunes. Il a également été montré, d’abord chez la souris mais
également chez l’homme, qu’elles pouvaient contrôler la réponse allogénique lors d’une greffe
d’organe. (Kingsley et al. 2002). De la même façon que les cellules TH et TC, les cellules TREG peuvent
générer des cellules T mémoire.
3.1.2. Système lymphatique et présentation antigénique
Lorsqu’un antigène étranger pénètre dans l’organisme, il passe dans le système lymphatique
et est amené à différents tissus lymphoïdes organisés, tels que les ganglions lymphatiques ou la rate.
Ces formations lymphoïdes irriguées par de nombreux vaisseaux sanguins et lymphatiques sont le
siège de la rencontre des antigènes avec les lymphocytes circulants.
Les ganglions lymphatiques (Fig.16), par exemple, sont essentiels à l’initiation de réponses
immunitaires en créant un environnement dans lequel les lymphocytes et les cellules présentatrices
d’antigène (CPA) peuvent interagir de façon optimale (van Ewijk et al. 1988). Les antigènes et les
CPA arrivent dans le ganglion lymphatique par un vaisseau lymphatique afférent (Sixt et al. 2005),
alors que la majorité des lymphocytes pénètrent dans le ganglion à partir de la circulation sanguine
via des veinules possédant des cellules endothéliales spécialisées (les veinules à endothélium épais
ou HEV ; Anderson & Anderson 1976) par le phénomène d’extravasation. Le flux ainsi formé de
lymphocytes et de cellules dendritiques présentatrices d’antigène permet une sélection rapide des
lymphocytes spécifiques de l’antigène parmi la quantité énorme de cellules passant par le ganglion.
L'activation spécifique du lymphocyte peut mener à la prolifération clonale puis à la différenciation
en cellules effectrices, tandis que ceux qui ne rencontrent pas l'antigène spécifique quittent le
52
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
ganglion lymphatique par un vaisseau lymphatique efférent (pour revue : Ohtani & Ohtani 2008).
Ainsi, les lymphocytes effectuent une constante recirculation entre le sang, la lymphe et les organes
lymphoïdes. Cette intense recirculation augmente considérablement les chances pour que le petit
nombre de lymphocytes spécifiques d’un antigène donné rencontre effectivement cet antigène.
Figure 16 : Structure d’un ganglion lymphatique. Les vaisseaux lymphatiques afférents distribuent
la lymphe (contenant des cellules dendritiques, des macrophages et quelques lymphocytes) dans l’espace
sous-capsulaire. La lymphe circule autour des compartiments lymphoïdes et quitte le ganglion par les
vaisseaux lymphatiques efférents. Pendant ce passage, la lymphe est filtrée par les macrophages qui
bordent les limites extérieures des compartiments lymphoïdes. Une partie de la lymphe entre dans le
système conducteur à l’intérieur de ces compartiments et quitte le ganglion pour la circulation sanguine
via les veinules à endothélium épais (HEV) qui sont aussi la principale voie d’entrée des lymphocytes
dans le ganglion lymphatique par le phénomène d’extravasation. Adapté de Roozendaal et al. 2008.
3.1.3. Transplantation et système immunitaire
Grâce à l’organisation à la fois architecturale et cellulaire complexe dont fait preuve le
système immunitaire, l’introduction d’éléments étrangers dans l’organisme au niveau périphérique a
peu de chance d’échapper à sa surveillance. Les organes ou cellules transplantées ne font pas
exception et les composants de l’immunité se mobilisent pour éliminer ces tissus reconnus comme
du non Soi (pour revue: Kim et al. 2008b). En effet, le rejet de greffe correspond à une réponse
immunologique de nature spécifique caractérisée par une mémoire et la reconnaissance du Soi et du
non Soi. Il existe trois principaux types de rejet : le rejet hyper aigu, le rejet aigu et le rejet chronique.
53
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Le rejet hyper aigu est provoqué par les anticorps préexistant chez l’hôte et qui réagissent
contre les antigènes du greffon, notamment les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité
de classe I et II et contre les protéines du système sanguin ABO. En allotransplantation humaine
(transplantation de cellules ou tissus au sein d’une même espèce), l’analyse systématique de la
présence de ces anticorps avant la greffe (test de cross-match), grâce aux travaux de Dausset et
Terasaki, a permis de réduire considérablement l’incidence de ce rejet qui est devenu extrêmement
rare. En revanche, en xénotransplantation (transplantation d’une espèce à une autre, comme par
exemple du porc à l’homme), le rejet immunitaire est très brutal. Dans le cadre de xénogreffes
discordantes, la raison principale de ce rejet hyperaigu est la présence d’anticorps xénogéniques
préformés (Galili et al. 1985) qui reconnaissent l’épitope Gal (glucide Gal(α1-3)Gal(β1-4)GlcNAc-R)
présent sur des glycolipides membranaires et des glycoprotéines de nombreux types cellulaires
(fibroblastes, cellules endothéliales, cellules musculaires lisses ) chez tous les mammifères à
l’exception de l’homme, des grands singes et des singes de l’Ancien Monde (Galili et al. 1988).
Le rejet aigu se caractérise par une infiltration interstitielle plus ou moins dense de
lymphocytes et de macrophages auxquels peuvent s’associer, dans certains rejets de grade élevé des
polynucléaires neutrophiles et éosinophiles. Les lymphocytes allo et xénoréactifs sont activés dans
les organes lymphoïdes secondaires drainant le site de la greffe, soit par présentation directe via les
cellules présentatrices d’antigènes (CPA) du donneur (Hornick et al. 1998), soit par la voie indirecte
de présentation via les CPA du receveur (Auchincloss et al. 1993). Outre ce rejet cellulaire, les
xénogreffes subissent également le rejet vasculaire aigu. Celui-ci présente une composante humorale
avec une importante production d’anticorps anti-donneur (Dehoux et al. 2002), ainsi qu’une
participation cellulaire impliquant les cellules NK (Lin et al. 2006), les macrophages, les neutrophiles
et quelques lymphocytes. La participation du complément dans ce processus reste débattue (Platt et
al. 1998).
Enfin le rejet chronique de la greffe, qui implique à la fois les composantes de l’immunité
cellulaire et humorale, est très mal connu en allotransplantation et les données sont quasi
inexistantes en xénotransplantation vu les durées très faibles de survie des xénogreffes (quelques
minutes
à
quelques
heures
sans
immunosuppression,
plusieurs
jours
en
présence
d’immunosuppresseurs; Séveno et al. 2005).
Dans tous les cas, la transplantation nécessite un certain degré d’immunosuppression si l’on
veut que le greffon survive. En allotransplantation, il est possible d’induire un état de tolérance des
lymphocytes T de plusieurs façons, incluant le recours aux traitements immunosuppresseurs (tels
que la cyclosporine A qui inhibe l’activation des lymphocytes T, contribuant ainsi au contôle du rejet
cellulaire),
aux
irradiations
lymphoïdes
localisées,
et
à
l’installation
d’un
chimérisme
hématopoïétique suite à la transplantation de moelle osseuse du donneur avant la transplantation de
54
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
l’organe vascularisé (Lee et al. 1994; Scherer et al. 2007). En xénotransplantation, ces méthodes
demeurent des échecs. En effet dans ces conditions, il faut aussi induire une tolérance des
lymphocytes B, étant donné la présence des anticorps anti-gal produits dans un système indépendant
des lymphocytes T (Sharabi et al. 1990) ou avoir recours à des porcs Gal-KO présentant une
invalidation des deux allèles de l’α1-3galactosyltransférase, l’enzyme responsable de la glycosylation
de Gal(α1-3)Gal (Séveno et al. 2005).
Dans certaines circonstances, une allogreffe peut être acceptée sans que des mesures
immunosuppressives ne soient prises. Ceci peut se produire lorsqu’un état de tolérance a été
biologiquement induit par une exposition précédente aux antigènes du donneur qui a provoqué chez
le receveur une tolérance immunitaire plutôt qu’une sensibilisation (Wood et al. 2001). Cela se
produit également lorsque les cellules ou tissus sont greffés dans un site dit privilégié, hors d’atteinte
de la surveillance du système immunitaire.
C’est Medawar en 1948 qui le premier observa cet état de « privilège immunologique ». En
effet, il remarqua que des morceaux de peau de lapin transplantés sur la peau d’un autre lapin étaient
rejetés très rapidement tandis que ces mêmes tissus transplantés à la surface du cerveau du receveur
étaient tolérés de façon prolongée (Medawar 1948). L’existence de la barrière hémato-encéphalique
(BHE), l’absence de drainage lymphatique conventionnel (Cserr et al. 1992), le déficit quasiment total
en molécules du CMH et en cellules dendritiques (Neumann et al. 1996) au sein du SNC sain ont fini
par asseoir le principe selon lequel cet organe échappait complètement à la surveillance
immunologique (Fig. 17).
Figure 17 : Mécanismes potentiellement impliqués dans le statut « immuno-privilégié » du
système nerveux central. Adapté de Lau & Joly 2001.
55
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Soixante ans plus tard, on sait désormais que le SNC interagit avec le système immunitaire. Si
les allogreffes de neurones fœtaux sont en général bien tolérées en présence d’un traitement
immunosuppresseur modéré ( Björklund & Lindvall 2000 ; Bachoud-Lévi et al. 2006; Krystkowiak et
al. 2007), des réponses immunes peuvent se dérouler dans le SNC contribuant au rejet systématique
des xénogreffes intracérébrales (Larsson et al. 2000). Cette dualité du cerveau présentant d’une part
un environnement plus favorable à la transplantation que la périphérie, et d’autre part un terrain
propice aux réactions inflammatoires délétères dans certaines conditions comme les processus
dégénératifs (Neumann & Wekerle 1998), ont conduit à qualifier cet organe de site
immunologiquement particulier plutôt que privilégié. Les bases de ces particularités sont détaillées
dans le paragraphe suivant.
3.2. Particularités immunologiques du SNC
3.2.1. La barrière hémato-encéphalique
Dans tout le corps, l’interface entre les parois capillaires et les tissus environnants revêt une
grande importance, car dans les deux compartiments, vasculaire et extravasculaire, elle maintient les
concentrations ioniques à des niveaux appropriés. Dans le cerveau, cette interface d’importance
toute spéciale est appelée barrière hémato-encéphalique (BHE). C’est le bactériologiste Paul Ehrlich
qui, au XIXème siècle, remarqua les propriétés particulières de la BHE par injections d’un colorant, le
bleu Trypan (Joó 1993). En effet, Ehrlich et son étudiant, Edwin Goldmann, observèrent que le bleu
Trypan, injecté par voie intraveineuse, diffusait à partir des capillaires dans presque toutes les
parties du corps pour marquer les tissus avoisinants à l’exception du SNC. A l’inverse, l’injection
sous-arachnoïdienne du colorant marquait uniquement le cerveau. Ils démontrèrent donc l’existence
d’une barrière physique entre le sang et le cerveau, mais il était supposé qu’une telle barrière
n’existait pas entre le cerveau et le liquide céphalo-rachidien (Fig.18).
56
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Figure 18 : Première mise en évidence de la barrière hémato-encéphalique (BHE). (A) Première
expérience de Goldmann : injection du colorant (bleu Trypan) dans le sang et analyse du cerveau et du
liquide céphalo-rachidien (LCR). (B) Deuxième expérience de Goldmann : injection du bleu Trypan dans
le LCR et analyse du sang et du cerveau. (C) Conclusions des deux expériences. Adapté de Zlokovic 2008.
Structure de la BHE
Le SNC est divisé en trois compartiments : le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le
tissu cérébral (Wolburg & Lippoldt 2002; Persidsky et al. 2006). L’épendyme et la pie-mère (couche
méningée la plus interne) constituent la barrière liquido-tissulaire séparant le LCR du tissu nerveux.
Le LCR occupe, dans la cavité cranio-rachidienne, deux secteurs intercommuniquants : le secteur
ventriculaire et le secteur leptoméningé. Au niveau de chacun de ces deux secteurs, le LCR entre en
contact avec le parenchyme du SNC. Une autre interface compartimentale est localisée au niveau de
l’épithélium du plexus choroïde qui contrôle les échanges entre le sang et le LCR. Il s’agit de la
barrière hémato-liquidienne dont les cellules épithéliales spécialisées expriment des jonctions
serrées (pour revue : Dziegielewska et al. 2001). La barrière hémato-encéphalique (BHE) est
localisée à l’interface entre le sang et le tissu cérébral. Elle est formée par les cellules endothéliales
des vaisseaux sanguins cérébraux qui présentent un phénotype unique caractérisé par la présence de
jonctions serrées intercellulaires et l’expression polarisée de nombreux systèmes de transport. Il est
à noter que certaines régions limitées du cerveau incluant les organes circumventriculaires (aera
postrema, éminence médiane, neuro-hypophyse, épiphyse) ne présentent pas de BHE et constituent
des sites spécialisés dans les interactions entre le cerveau et le système périphérique (McKinley et al.
2003).
La BHE est constituée de plusieurs éléments cellulaires, notamment des péricytes, des
astrocytes et des neurones, qui avec la lame basale engainant les vaisseaux sanguins cérébraux, sont
en étroite relation avec les cellules endothéliales cérébrales. Tous ces éléments sont indirectement
57
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
impliqués dans l’établissement et la maintenance de la BHE, constituant ainsi une « unité
neurovasculaire » contrôlant l’intégrité de la BHE (Fig.19).
Les cellules endothéliales que l’on trouve dans le cerveau diffèrent significativement de celles
des vaisseaux périphériques (Brightman & Kadota 1992; Petty & Lo 2002) par :
(i) l’absence de fenestrations, corrélée avec la présence de jonctions serrées ;
(ii) un nombre réduit de vésicules de pinocytose ;
(iii) une grande quantité de mitochondries, associées à une forte activité métabolique ;
(iv) l’expression de récepteurs et de transporteurs membranaires responsables du transport actif de
nutriments transportés par le sang vers le cerveau ou de la fuite de composés potentiellement
toxiques du compartiment cérébral vers le compartiment vasculaire.
En d’autres termes, la spécificité de l’endothélium cérébral est son très haut niveau de
restriction et de contrôle de la perméabilité aux composés et aux ions plasmatiques (Abbott et al.
2006).
En plus des jonctions serrées, les terminaisons en pied des astrocytes entourent l’extérieur
des cellules endothéliales des capillaires. Alors que le rôle des astrocytes dans l’induction et la
maintenance de l’intégrité de la BHE est désormais admis, la connaissance des mécanismes
moléculaires régissant leur action reste confuse (Janzer & Raff 1987). En effet, un certain nombre de
facteurs produits par les astrocytes et de manière plus générale par les cellules gliales ont été
désignés comme jouant un rôle dans le maintien de la BHE, incluant le GDNF (facteur dérivé des
cellules gliales), l’angiopoiétine-1 (Hori et al. 2004), et plus récemment l’angiotensine II (Wosik et al.
2007).
Les péricytes d’origine hématopoiétique (Thomas 1999) sont des cellules largement
associées aux cellules endothéliales et sont retenues dans l’espace péri-vasculaire par la lame basale.
Les péricytes sont activement impliqués dans le maintien de l’intégrité structurale de la BHE
(Ramsauer et al. 2002), dans la régulation de la perméabilité, ainsi que dans la croissance et la
différenciation des cellules endothéliales (Hirschi & D'Amore 1996).
L’endothélium cérébral, les astrocytes péri-vasculaires et les péricytes sont en contact étroit
avec des projections neuronales, ce qui permet aux neuromédiateurs d’être libérés dans la
circulation sanguine cérébrale. Cependant les conséquences physiologiques ou physiopathologiques
d’une innervation neuronale de la BHE restent obscures.
58
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Figure 19 : Structure de la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est composée de
vaisseaux sanguins constitués de cellules endothéliales à jonctions serrées associées à la lame basale.
Les cellules endothéliales interagissent avec les éléments péri-vasculaires comme la lame basale et les
pieds astrocytaires qui lui sont étroitement associés, les neurones péri-vasculaires et les péricytes. Dans
des conditions physiologiques normales, la BHE est intacte et les cellules de la circulation sanguine
systémique pénètrent rarement dans le tissu cérébral. En revanche, dans des états pathologiques,
l’intégrité de la BHE est perturbée et les cellules immunitaires peuvent pénétrer dans le parenchyme du
SNC. Adapté de www.stanford.edu/
Fonction de la BHE
Le rôle de la BHE est essentiellement centré sur la régulation de l’environnement cérébral car
son homéostasie est capitale pour le fonctionnement normal des neurones. Ainsi, la BHE contrôle
strictement les échanges entre les compartiments sanguin et cérébral, en empêchant la diffusion
para-cellulaire des solutés hydrophiles, en permettant le transport actif des nutriments vers le
cerveau (Pardridge 1986), en rejetant les molécules hydrophobes et les composés toxiques dans la
circulation sanguine (de Lange 2004). La BHE permet l’accumulation dans le liquide interstitiel et
dans le LCR de médiateurs immunosuppresseurs produits par les cellules nerveuses, parmi lesquels
le TGF-β (facteur de croissance transformant β ; Taylor & Streilein 1996). De plus, elle régule la
migration trans-endothéliale des cellules du sang circulantes et des pathogènes (Hickey et al. 1991).
59
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Ainsi dans des conditions physiologiques normales, la migration de cellules immunitaires dans le
SNC demeure très rare.
Dans un certain nombre de maladies neurologiques telles que la sclérose en plaques,
l’accident vasculaire cérébral, la maladie d’Alzheimer, les tumeurs cérébrales ou encore certaines
maladies infectieuses du SNC, des dysfonctions de la BHE ont été décrites. Ces anomalies de
l’intégrité de la BHE apparaissent non seulement à des stades avancés des pathologies, mais
pourraient être également impliquées dans leur évolution précoce, et se présentent sous deux formes
principales. La première est relative à une augmentation de la perméabilité de la BHE permettant la
diffusion passive des substances transportées par la circulation sanguine à travers la barrière. La
seconde anomalie correspond à une infiltration massive de cellules immunitaires à travers la BHE
(Weiss et al. 2009).
Le trafic leucocytaire
Il y a plusieurs voies d’accès pour l’entrée des leucocytes dans le SNC (Fig. 20): la migration
du sang vers le LCR à travers le plexus choroïde ou les vaisseaux méningés de l’espace sousarachnoïdien (barrière hémato-liquidienne); la migration du sang vers les espaces péri-vasculaires
du parenchyme cérébral (barrière hémato-encéphalique ; Rebenko-Moll et al. 2006). Le passage des
leucocytes à travers la barrière hémato-encéphalique s’effectue par le phénomène d’extravasation
(Fig.21). Il s’agit d’un enchaînement finement régulé d’étapes contrôlées par des molécules
d’adhésion et des facteurs activateurs (Springer 1994). Contrairement aux organes périphériques où
le phénomène d’extravasation des leucocytes est très rapide, ce dernier peut prendre des heures au
niveau de la BHE en raison de la présence des jonctions serrées entre les cellules endothéliales.
60
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Figure 20 : Organisation anatomique du cerveau montrant les principales voies d’entrée des
leucocytes. Les leucocytes peuvent entrer dans l’espace sous-arachnoïdien en migrant à partir des
vaisseaux sanguins du stroma et traverser la barrière hémato-liquidienne (sang-LCR) qui entoure le
plexus choroïde. Cette barrière est constituée de cellules épithéliales liées entre elles par des jonctions
serrées. Les leucocytes peuvent également entrer dans l’espace sous-arachnoïdien par extravasation à
travers la paroi cellulaire des veinules méningées dont les cellules endothéliales sont liées par des
jonctions serrées. De plus, les leucocytes peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui
entoure les veinules post-capillaires du parenchyme cérébral. Adapté de Goverman 2009.
Les quatre étapes classiques de la migration des leucocytes à travers l’endothélium sont :
(i)
La
capture
et
le
roulement,
médiés
par
des
sélectines/mucines
et
des
intégrines/membres de la famille des immunoglobulines.
(ii)
La phase d’activation, caractérisée par l’activation des intégrines du leucocyte.
(iii)
L’adhésion, médiée par les intégrines activées et leurs ligands exprimés par
l’endothélium.
(iv)
La diapédèse, correspondant à la transmigration endothéliale du leucocyte (Ley et al.
2007).
61
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Figure 21 : Extravasation des leucocytes à travers la barrière hémato-encéphalique.
(1) Capture et roulement. Les leucocytes circulants dans les capillaires sanguins roulent sur
l’endothélium entraînés par le courant circulatoire. Ils s’attachent aux cellules endothéliales à travers la
liaison des sélectines à leurs ligands, qui sont générés par ajout de carbohydrates à des glycoprotéines
transmembranaires. Les sélectines peuvent être exprimées à la fois par les leucocytes et les cellules
endothéliales. Les leucocytes roulent sur l’endothélium jusqu’à ce qu’ils rencontrent des chimiokines
luminales immobilisées à la surface des cellules endothéliales.
(2) Activation. L’engagement des récepteurs aux chimiokines des leucocytes avec les chimiokines
luminales initie des signaux conduisant au regroupement et au changement de conformation des
intégrines des leucocytes ce qui induit une haute affinité/avidité pour leurs ligands (molécules
d’adhésion cellulaire comme ICAM-1 ou VCAM-1).
(3) Arrêt. La liaison des intégrines à leurs ligands endothéliaux induit l’arrêt et l’adhésion des
leucocytes qui vont se positionner au niveau d’une jonction inter-endothéliale.
(4) Diapédèse. Les leucocytes émettent des pseudopodes à travers les jonctions inter-endothéliales, à la
recherche de chimiokines qui leur serviront de signaux conducteurs pour l’extravasation. En réponse à
ces signaux et en suivant le gradient de chimiokines, la transmigration s’opère. Les leucocytes
extravasés se retrouvent donc dans l’espace péri-vasculaire, entre la membrane basale de l’endothélium
et celle de la glia limitans. L’entrée dans le parenchyme cérébral à travers la glia limitans requiert
l’intervention de métalloprotéases matricielles. Adapté de Constantin 2008.
Dans un cerveau sain, le nombre de leucocytes pénétrant dans le SNC est très faible. En effet,
les cellules endothéliales expriment très peu de molécules d’adhésion nécessaires au passage des
leucocytes dans le parenchyme cérébral. De plus, les jonctions serrées entre les cellules endothéliales
rendent très difficile la diffusion de molécules à partir du sang (pour revue : Engelhardt 2006). En
revanche, il a clairement été montré qu’un grand nombre de lymphocytes T activés peut franchir la
BHE dans le cas d’une forte réaction immunitaire dans l’organisme, même si celle-ci ne se déroule
pas dans le SNC (Hickey & Kimura 1987). Si l’activation récente est un pré-requis, la nature de
62
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
l’antigène recherché, le type de CMH utilisé pour la reconnaissance antigénique et le phénotype de la
cellule T semblent, au contraire, ne pas être déterminants pour l’accès au parenchyme cérébral
(Hickey 1999). Les travaux réalisés par Hickey indiquent que l’activation polyclonale non spécifique
de lymphocytes T par la concanavaline A permet à ces cellules d’entrer dans le SNC quelle que soit
leur spécificité antigénique (Hickey et al. 1991). Ainsi, les cellules T passant la BHE pourraient être
assimilées à des chercheuses d’antigènes, et à ce jour, le concept de lymphocytes T ayant un
adressage spécifique pour le SNC n’a jamais été démontré. Il semble au contraire que les lymphocytes
T pénètrent de façon aléatoire dans le parenchyme cérébral (Hickey 1999). Néanmoins, le SNC est un
environnement hostile pour la survie des cellules T. Il contrôle strictement les réactions immunes en
éliminant par apoptose de nombreux lymphocytes T activés ayant pénétré dans le tissu nerveux
(pour revue : Pender 2007). Cette mort des cellules T n’apparaît pas être liée à la reconnaissance
antigénique, et ne concerne pas que les cellules T spécifiques d’un antigène du SNC. Il s’agit plutôt
d’un processus inhérent à l’environnement du SNC qui conduit à la mort de ces cellules (Bauer et al.
1998). Parmi les mécanismes d’apoptose avancés, on peut citer la voie Fas/FasL. En effet, les
lymphocytes T expriment le récepteur Fas/Apo1 (CD95), qui reconnaît le ligand FasL (CD95L) situé à
la surface de la plupart des cellules du parenchyme nerveux (Flügel et al. 2000). Cette
immunosuppression est renforcée, consécutivement à l’apoptose, par la libération de cytokines antiinflammatoires, notamment l’interleukine-10 et le TGF-β, dans le milieu interstitiel (Chen et al.
1998). Ainsi, il existe une relation étroite entre apoptose et tolérance immune (Li et al. 2000).
La capacité des lymphocytes B à surveiller le SNC est bien moins comprise que dans le cas des
cellules T. Il n’y a, à ce jour, pas de preuves de l’entrée sélective des cellules B dans le SNC ni de leur
capacité à franchir la BHE dans des conditions physiologiques normales. En revanche, lors de
processus pathologiques pendant lesquels la BHE est altérée en réponse à des stimuli
inflammatoires, les lymphocytes B peuvent pénétrer dans le parenchyme cérébral, subir une
expansion clonale, se différencier en plasmocytes et sécréter des anticorps directement dans le
liquide interstitiel du SNC (Knopf et al. 1998).
Il semble que les monocytes/macrophages, cellules microgliales et cellules dendritiques
jouent un rôle critique dans la surveillance immunologique du SNC sain, en plus de leur intervention
dans la promotion de l’inflammation (Hickey & Kimura 1987; Bechmann et al. 2001a). La présence
des membres de ce groupe cellulaire dans le cerveau sert à contrôler la réponse lymphocytaire T et
semble influer sur la capacité des cellules T à pénétrer dans le parenchyme cérébral (Aloisi et al.
2000). Alors que les cellules dendritiques ne sont pas détectées dans le parenchyme d’un cerveau
intact, ces cellules sont présentes au niveau des méninges et du plexus choroïde des rongeurs sains
(McMenamin 1999). Récemment il est devenu clair que des cellules exprimant des marqueurs de
cellules dendritiques (tels que CD11c) sont présentes dans le cerveau pendant différentes conditions
inflammatoires incluant l’ischémie, l’accident vasculaire cérébral, la toxoplasmose cérébrale et
63
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE, un modèle animal de sclérose en plaques;
Matyszak & Perry 1996; Serafini et al. 2000; Fischer et al. 2000; Reichmann et al. 2002; Michel et al.
2006). Des cellules dendritiques d’un phénotype mature ont été détectées dans les ganglions
lymphatiques cérébraux dans le cas d’une EAE chez le primate (de Vos et al. 2002). Il semble donc
que les cellules dendritiques peuvent migrer entre le SNC et la périphérie au cours d’un processus
neuroinflammatoire. Les détails précis de cette migration demeurent en revanche inconnus.
Voie d’accès
Du sang vers le
LCR
Du sang vers
les espaces
périvasculaires du
parenchyme
cérébral
Cellules rencontrées
pendant la migration
vers le SNC
Veinules stromales du
plexus choroïde (sans
jonctions serrées) puis
cellules épithéliales du
plexus choroïde (avec
jonctions serrées)
Cellules
endothéliales
activées de la BHE (avec
des jonctions serrées dont
l’intégrité
peut
être
compromise selon les
conditions)
Phénotype des leucocytes
infiltrés dans le SNC
90% de cellules T CD3+
mémoire (avec un ratio
CD4:CD8 de 3:1) ;
<10% de monocytes ;
< 1% de cellules B et de
cellules dendritiques
Cellules T CD3+ effectrices
et mémoire (avec un ratio
CD4:CD8 près de 1:1) ;
Proportion variable (2575%)
de
monocytes ;
Cellules B
Fonction
Immuno-surveillance
du SNC
Réactions immune et
inflammatoire pour la
défense de l’organisme
et lors de maladies
neuroinflammatoires
Tableau 3 : Tableau récapitulatif des voies d’accès, du phénotype et de la fonction de
leucocytes migrant dans le système nerveux central (SNC). LCR : liquide céphalo-rachidien ; CD3 :
complexe protéique membranaire marqueur des cellules T ; CD4 : marqueur des lymphocytes T
auxiliaires ; CD8 : marqueur des cellules T cytotoxiques. Adapté de Man et al. 2007.
3.2.2. Un drainage lymphatique particulier
Il n’y a pas de vaisseaux lymphatiques définis dans le cerveau. Dans le SNC, le liquide
interstitiel est drainé le long des espaces péri-vasculaires, appelés espaces de Virchow-Robin, vers le
LCR. Ce dernier est produit à partir du sang artériel par les plexus choroïdes du 4ème ventricule et du
ventricule latéral par des processus combinés de diffusion, de pinocytose et de transfert actif
(Strazielle & Ghersi-Egea 2000). Le LCR circule du système ventriculaire vers l’espace sousarachnoïdien où il pénètre dans le sinus veineux via les villosités arachnoïdiennes et gagne la
circulation sanguine et la rate. Il peut également passer par l’espace tissulaire intracrânien via les
prolongements de l’espace sous-arachnoïdien le long des nerfs crâniaux (olfactif, optique, trijumeau,
acoustique) pour atteindre les ganglions lymphatiques cervicaux profonds (Cserr & Knopf 1992).
64
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Les macromolécules antigéniques solubles présentes dans le liquide interstitiel du
parenchyme peuvent transiter vers le LCR via la substance blanche, grâce à des zones où les cellules
épendymaires qui bordent les ventricules sont dépourvues de jonctions serrées. Alternativement,
elles peuvent transiter à partir de la substance grise le long des espaces péri-vasculaires (espaces de
Virchow-Robin). Les antigènes sont alors drainés jusqu’aux tissus lymphoïdes où ils peuvent stimuler
une réponse spécifiques (Fig.22). Des études réalisées chez le lapin avec de l’albumine marquée à
l’iode 125 (125I) ont montré que, selon le site d’injection, 14% à 47% des protéines injectées dans le
cerveau se retrouvent dans les ganglions cervicaux dans un laps de temps de vingt heures (Yamada
et al. 1991).
Figure 22 : Le drainage antigénique au sein du système nerveux central (SNC). Les signaux
afférents en provenance du parenchyme cérébral et à destination du système immunitaire périphérique
sont initiés par le mouvement de protéines solubles dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), soit à partir
de la substance blanche au travers de l’épendyme, soit à partir de la substance grise le long des voies
péri-vasculaires. A partir du LCR, les protéines solubles sont transportées à travers les canaux
lymphatiques vers les ganglions lymphatiques périphériques où elles peuvent fournir une stimulation
antigénique aux cellules T naïves ou mémoire. Les phases efférentes des réactions immunes sont initiées
dans les organes lymphoïdes secondaires et favorisées localement par la re-stimulation due aux
interactions entre les cellules T mémoire et les cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Les CPA
résidentes du SNC incluent : (a) les macrophages du plexus choroïde, (b) les cellules de l’épiplexus, (c) les
macrophages des méninges et (d) les macrophages péri-vasculaires. Adapté de Ransohoff et al. 2003.
65
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
3.2.3. Cellules présentatrices d’antigène du SNC et expression du CMH
Le SNC intact est dépourvu de cellules présentatrices d’antigène professionnelles comme les
cellules dendritiques, les cellules B et les macrophages non péri-vasculaires (Wekerle et al. 1987).
Ceci permet de prévenir l’initiation et la propagation de réponses immunitaires spécifiques de
l’antigène au sein du cerveau. De plus, dans des conditions physiologiques normales, l’expression des
molécules du CMH de classes I et II est très faible, voire indétectable (Wekerle et al. 1987). Ainsi les
cellules nerveuses ne sont pas reconnues comme cibles par les lymphocytes T spécifiques d’un
antigène. Mais ce manque de réponse immune ne s’applique qu’au SNC normal. Au cours de divers
processus pathologiques, certains gènes sont activés permettant de remanier ce tissu
immunologiquement peu réactif en un milieu propice aux réactions inflammatoires. Dans ces
conditions, des macrophages sont recrutés à partir du stock de monocytes sanguins et infiltrent les
espaces péri-vasculaires. De plus les cellules microgliales du SNC sont activées et acquièrent des
capacités de phagocytose et de présentation d’antigène (Dickson et al. 1991; Fontana et al. 1992).
L’expression des molécules du CMH ainsi que la production de cytokines pro-inflammatoires telles
que le TNF et l’IL-1β sont induites par la microglie. La microglie et les astrocytes activés acquièrent la
capacité de présenter des antigènes via le CMH de classe I et II. En conséquence, les lymphocytes T
infiltrés dans le SNC peuvent reconnaitre le matériel antigénique et ainsi se comporter en puissantes
cellules immunitaires effectrices.
La microglie et les macrophages péri-vasculaires
La microglie et les macrophages péri-vasculaires sont les principaux types cellulaires
effecteurs de l’immunité innée dans le SNC. Les cellules microgliales représentent environ 10% de la
totalité des cellules nerveuses (Perry 1998), et contrairement aux autres cellules gliales du
parenchyme cérébral, elles ne sont pas d’origine neuroectodermique mais mésodermique. Elles
proviennent du système hématopoïétique et partagent de nombreuses propriétés avec les
macrophages comme l’expression (faible pour la microglie) de CD14 (co-récepteur pour la détection
du lipopolysaccharide (LPS) bactérien), CD45 (antigène commun des leucocytes) et les récepteurs Fc
(Carson et al. 1998). Lors du développement fœtal, les cellules myéloïdes infiltrent le SNC et forment
la microglie du parenchyme (Alliot et al. 1999). A l’inverse des phagocytes associés au SNC localisés
au niveau des leptoméninges et des espaces péri-vasculaires, la microglie n’est pas régulièrement
renouvelée par les monocytes circulants chez l’adulte (Hickey et al. 1992). Lors de conditions
inflammatoires dans le SNC, les cellules microgliales du parenchyme voient leur expression du CMH
de classe II très augmentée, ce qui suggère qu’elles participent à la présentation antigénique au cours
66
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
de l’inflammation (Sedgwick et al. 1998; Ulvestad et al. 1994; Williams et al. 1994) et donc à
l’immunité adaptative du SNC. Les cellules microgliales activées sur-expriment également les
molécules de costimulation telles que CD40, CD80 et CD86, ce qui les rend tout-à fait opérationnelles
pour induire l’activation des lymphocytes T (Aloisi 2001 ; Bechmann et al. 2001b). Par ailleurs, il a
été rapporté que les cellules microgliales activées, par leur capacité à sécréter la chimiokine MIP-1α
et l’IL-12, pourraient favoriser la polarisation TH1 des cellules TH CD4+ ayant franchit la BHE et
atteint le parenchyme nerveux, contribuant ainsi à intensifier la réaction inflammatoire (Aloisi et al.
2000). Outre ces fonctions pro-inflammatoires, la microglie peut exercer un rôle neuroprotecteur via
la synthèse de facteurs neurotrophiques variés tels que le NGF, le BDNF et les neurotrophines NT-3
et NT-4, in vitro et in vivo (Mallat et al. 1989; Nakajima et al. 2001). La microglie de rat peut
également produire du bFGF in vitro, ouvrant la possibilité d’une contribution bénéfique de la
microglie dans la régulation du développement neuronal ainsi que dans la protection des neurones
au cours des processus dégénératifs (Shimojo et al. 1993).
Les macrophages péri-vasculaires sont considérés comme des CPA compétentes au sein du
SNC. Tout comme les macrophages périphériques, ils expriment fortement le CMH de classe II, CD11b
et CD45, ce qui les distingue de la microglie qui, elle, exprime faiblement CD45 (Becher & Antel
1996). Les macrophages péri-vasculaires isolés du SNC de rongeur adulte activent à la fois les
cellules T CD4+ naïves et pré-activées, de façon aussi efficace que les CPA de la rate ou des ganglions
lymphatiques, et de façon plus efficace que la microglie du parenchyme cérébral dérivée du même
animal (Ford et al. 1996; Carson et al. 1998). Ainsi, du fait de leurs propriétés et de leur position
stratégique entre l’endothélium vasculaire et le parenchyme nerveux, les macrophages
péri-
vasculaires correspondent à des candidats idéaux pour la re-stimulation de cellules T préalablement
activées en périphérie (Hickey & Kimura 1988).
Les astrocytes
Bien que l’immunité innée du SNC repose fortement sur la microglie, de nombreuses études
ont démontré que les astrocytes participent également à la réponse immunitaire innée. En effet, les
astrocytes expriment des récepteurs PRR, le récepteur au mannose ainsi que les récepteurs pour le
complément. Dans le cadre d’une activation, chacun de ces récepteurs peut stimuler la production de
médiateurs immuns solubles, incluant des cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-2), des chimiokines
et des facteurs neurotrophiques (NGF, CNTF, LIF; pour revue: Farina et al. 2007).
En revanche, la capacité des astrocytes à fonctionner comme cellules présentatrices
d’antigène, ainsi qu’à exprimer des molécules de costimulation demeure controversée. Le groupe de
Miller notamment, a montré que les astrocytes exposés à l’IFN-γ ont la capacité d’exprimer les
67
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
molécules du CMH de classe II ainsi que les molécules de costimulation B7-1 et B7-2, leur permettant
de présenter l’antigène et d’activer efficacement les cellules T naïves et mémoire (Nikcevich et al.
1997). Une autre étude a suggéré que les astrocytes pouvaient exprimer les molécules B7 de façon
différentielle au cours de l’EAE, conduisant soit à la stimulation de la prolifération des cellules TH1
quand B7-2 est exprimé, soit à la sécrétion de cytokines TH-1 (IFN-γ et IL-2) quand B7-1 et B7-2 sont
exprimés (Tan et al. 1998). Ces travaux suggèrent ainsi que les astrocytes jouent un rôle dans la
présentation antigénique et la stimulation des cellules TH1. En revanche, beaucoup d’autres études ne
supportent pas ce rôle de CPA efficaces, et indiquent que la surexpression du CMH de classe II est un
évènement très rare (Matsumoto et al. 1992; Cross & Ku 2000). De plus, il a été observé que des
facteurs solubles produits par les astrocytes suppriment l’induction par le LPS de molécules
costimulatrices sur la microglie et les macrophages (Hailer et al. 1998), ce qui suggère que les
astrocytes seraient non seulement de mauvais activateurs des cellules T mais également des
inhibiteurs de l’activité des autres CPA. Il existe donc de nombreuses divergences dans la littérature
et, en conséquence, le rôle immunomodulateur précis des astrocytes reste à établir.
3.3. Transplantation et système nerveux central
Comme nous venons de le détailler, le SNC représente un site immunologique particulier,
isolé du reste de l’organisme par des barrières spécialisées qui favorisent le maintien d’un
environnement immunosuppresseur. Toutefois, la présence constitutive de la microglie, une
population cellulaire très réactive, ainsi que l’adaptation du drainage lymphatique à l’anatomie
locale, sont autant de témoignages du potentiel cérébral à répondre à des agressions ou
modifications de l’environnement du tissu cérébral, comme par exemple la transplantation cellulaire.
La mort des cellules neuronales est la caractéristique centrale des affections aiguës du SNC comme
l’AVC ou le traumatisme, mais également de plusieurs maladies neurodégénératives incluant les
maladies d’Alzheimer, de Parkinson et de Huntington. Le SNC adulte présente de faibles capacités de
remplacement cellulaire endogène et de réparation (c’est-à dire de reformation de connexions sur de
longues distances avec une organisation spécifique), les deux étant nécessaires pour aboutir à une
récupération fonctionnelle significative. La thérapie cellulaire de remplacement est donc une
stratégie porteuse d’espoir.
68
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
3.3.1. Allotransplantation
Afin d’optimiser l’efficacité de la transplantation cellulaire, plusieurs paramètres doivent être
pris en compte. Tout d’abord, le type de pathologie. En effet, le succès du remplacement cellulaire
implique que les éléments du donneur soient épargnés par la maladie. Ainsi, la transplantation est
indiquée lorsque la dégénérescence est causée par des défauts intrinsèques à une population
neuronale précise (dans le cas de maladies génétiques comme la maladie de Huntington par
exemple), ou par des agents extrinsèques qui ne sont plus actifs au moment de la transplantation
(comme par exemple une intoxication au 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) ou
des lésions traumatiques ou vasculaires). En revanche, l’issue bénéfique de ce traitement est
fortement compromise lorsque le processus dégénératif est lié à une toxicité environnementale
persistante (c’est le cas de la plupart des maladies démyélinisantes) qui affectera inévitablement les
cellules transplantées. Dans plusieurs conditions pathologiques, la neurodégénérescence concerne
différentes populations neuronales de manière progressive (par exemple la dégénérescence
cérébelleuse). Dans ce cas, la transplantation à un moment opportun, réalisée lorsque la
dégénérescence est encore limitée, peut être bénéfique à la fois pour le remplacement des éléments
perdus, mais également dans la prévention de la mort consécutive des autres populations cellulaires.
A l’inverse, pour les pathologies caractérisées par des lésions focales progressives comme la sclérose
en plaques, la transplantation serait utile seulement après l’arrêt de la progression du processus
dégénératif.
Par ailleurs, la thérapie cellulaire régénérative est plus accessible lorsque la perte neuronale
affecte une population cellulaire précise localisée dans une région cérébrale restreinte. Le
remplacement de cellules distribuées sur de larges zones (comme par exemple dans les structures
corticales et sous-corticales dans le cas de la maladie d’Alzheimer) nécessite des approches de
transplantation multiple et/ou repose sur la migration ciblée des cellules greffées, ce qui n’est pas
toujours possible. De plus, à cause des problèmes associés à la croissance axonale sur de longues
distances dans le SNC adulte, la distribution des connexions de la greffe à l’hôte est aussi une
question pertinente. La maladie de Parkinson, dans laquelle est affectée une population cellulaire
bien précise (les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta) avec un site de
projection spécifique (le striatum) représente un cas particulièrement bien adapté à la
transplantation. Et en effet, l’impact clinique potentiel du remplacement cellulaire a déjà été montré
par l’allotransplantation de cellules mésencéphaliques fœtales chez plus de 300 patients atteints de
la maladie de Parkinson. Cela a conduit à une amélioration symptomatique durable pour beaucoup
d’individus traités, associée à une survie des cellules greffées et à la ré-innervation partielle du
striatum (Björklund & Lindvall 2000). Une amélioration fonctionnelle a également été remarquée
dans une petite cohorte de patients souffrant de la maladie de Huntington et greffés avec des cellules
69
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
striatales fœtales (Bachoud-Lévi et al. 2000; Bachoud-Lévi et al. 2006), une étude ayant même
montré une intégration des cellules du donneur dans le tissu hôte (Freeman et al. 2000). Cependant,
malgré ces résultats prometteurs, des contraintes non négligeables gênent toujours l’utilisation de
tissus fœtaux pour la transplantation neurale (Björklund & Lindvall 2000). En plus des problèmes de
disponiblilité tissulaire et des considérations éthiques liés à l’utilisation de matériel provenant de
fœtus issus d’IVG, la viabilité des cellules ainsi que leur pureté ne peuvent être efficacement
contrôlées. A cela s’ajoute le fait que les cellules fœtales sont pour la plupart post-mitotiques et ne
peuvent donc être propagées ou conservées pendant plus de quelques jours ce qui implique que la
préparation du tissu du donneur doive être synchronisée avec la neurochirurgie dans une fenêtre de
temps très mince (Björklund et al. 2003). De plus, certains effets délétères de la thérapie cellulaire
ont été rapportés. Dans un essai clinique en double-aveugle concernant la maladie de Parkinson,
50% des patients ayant reçu une transplantation bilatérale de cellules mésencéphaliques fœtales ont
développé des dyskinésies (mouvements incontrôlés ; Olanow et al. 2003). Les auteurs ont spéculé
que cet effet serait lié à une libération de dopamine asymétrique au sein du striatum greffé, ainsi qu’à
un rejet immunitaire partiel impliquant une inflammation chronique. Les réactions immunitaires
sont en effet un frein à l’allogreffe de neuroblastes fœtaux. Même si le cerveau est un organe
particulier d’un point de vue immunologique et favorable à la transplantation, tous les patients
participant à un essai clinique ont été placés sous traitement immunosuppresseur. Néanmoins, aucun
cas de rejet n’a été relaté suite à l’arrêt du traitement même si des cellules T ont été observées sur le
site de la greffe après arrêt de la cyclosporine A chez certains patients autopsiés dont la greffe était
toujours saine et fonctionnelle au moment du décès (Kordower et al. 1995; Kordower et al. 1997).
Cela indique que malgré le relatif état de tolérance du tissu cérébral, des évènements de rejet
chronique peuvent se produire, ainsi que probablement une activation des cellules microgliales
produisant des molécules inflammatoires, des cytokines et des facteurs de croissance qui, à terme,
peuvent affecter la structure et la fonction de la greffe (Freed et al. 2001; Olanow et al. 2003).
Afin de contourner les évidents problèmes éthiques et pratiques qui accompagnent
l’utilisation de tissus provenant de fœtus avortés humains dans des programmes cliniques de
transplantation, des sources cellulaires alternatives ont été envisagées, et parmi elles, les
neuroblastes de porc (Pakzaban & Isacson 1994).
70
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
3.3.2. Xénotransplantation
Le tissu neural fœtal de porc est depuis longtemps considéré comme la source cellulaire la
plus adaptée pour la xénotransplantation dans le cerveau humain. En effet, le porc présente
l’avantage d’un élevage facile, permet de s’affranchir du manque de disponibilité en tissu puisque
chaque portée contient une quinzaine d’embryons selon des temps de gestation relativement courts
(3 mois, 3 semaines et 3 jours) et offre la possibilité de manipulations génétiques. Par exemple, un
porc transgénique CTLA4-Ig qui exprime une molécule humaine inhibitrice des cellules T (hCTLA4Ig) sous le contrôle du promoteur énolase, spécifique des neurones, a été développé (Martin et al.
2005). Cette construction permet ainsi aux neurones porcins génétiquement modifiés de libérer une
molécule immunosuppressive localement dans le cerveau. Outre leur intérêt méthodologique, les
cellules fœtales porcines se sont révélées être des outils efficaces pour la thérapie cellulaire dans des
modèles animaux de maladies neurodégénératives. En effet, l’intérêt pour ces cellules s’est largement
développé après les premières études ayant mis en évidence que les xénogreffes de cellules
dopaminergiques dérivant du mésencéphale ventral d’embryons de porc âgés de 21 à 26 jours (E21 à
E26) pouvaient survivre dans un cerveau de rat adulte modèle de la maladie de Parkinson et
immunosupprimé (Freeman et al. 1988; Huffaker et al. 1989). Au-delà de cette survie à long terme,
les xénogreffes de cellules neurales dans des modèles animaux de la maladie de Parkinson
présentent une capacité de croissance axonale sur de longues distances (Wictorin et al. 1990a;
Wictorin et al. 1990b; Wictorin et al. 1992; Deacon et al. 1994; Thompson et al. 2005). Isacson et ses
collaborateurs ont montré que des neurones isolés à partir de diverses aires cérébrales de fœtus
porcins, transplantés dans des régions lésées homotypiques ou ectopiques du cerveau de rat adulte
peuvent émettre des axones qui recolonisent les régions déafférentées pour reconstruire la
cytoarchitecture (Isacson et al. 1995; Isacson & Deacon 1996). Cette croissance axonale ciblée et
inter-espèce permet donc aux neuroblastes dopaminergiques d’embryons de porc de reconstituer en
quelques mois une innervation dopaminergique efficace. Une récupération fonctionnelle significative
a même été observée chez les rats transplantés et le degré de récupération a pu être corrélé au
nombre de cellules positives pour la tyrosine hydroxylase (TH, marqueur des neurones
dopaminergiques) ainsi qu’à la taille du greffon (Galpern et al. 1996).
Malgré des études montrant que les xénogreffes neurales dans le SNC sont capables de
survivre sur une période prolongée sans emploi d’immunosuppresseur (Bjorklund et al. 1982 ;
Dalinoff et al. 1985), la plupart des études récentes, y compris celles de notre groupe, indiquent que
les xénogreffes intracérébrales provoquent une forte réaction immunitaire menant à la destruction
rapide du greffon par l’apparition soudaine de cellules microgliales/macrophages, de lymphocytes T
et de cellules dendritiques dans les semaines qui suivent la transplantation (Rémy et al. 2001 ;
Melchior et al. 2002 ; Michel et al. 2006). De façon générale, le rejet des xénogreffes est
71
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
classiquement beaucoup plus agressif que celui observé dans le cas de l’allotransplantation et fait
majoritairement intervenir les lymphocytes T. Dans le SNC, la survie du xénogreffon est
significativement prolongée par l’administration de drogues immunosuppressives agissant sur les
cellules T, de même que lors de l’inactivation du TCR et du récepteur à l’IL-2 (CD25) ainsi que par
une déplétion en cellules T CD4+ (Okura et al. 1997). L’administration de deux doses élevées
successives d’anticorps monoclonaux anti-CD4 résulte en une survie prolongée des xénogreffes
discordantes (donneur Gal+ sur receveur Gal-) mais pas indéfinie, ce qui indique l’intervention
d’autres composants immuns (Wood et al. 1996). En effet, les cellules B et les immunoglobulines
interviennent dans la survie et la fonction du greffon. L’importance des immunoglobulines a été mise
en évidence en comparant la survie d’une xénogreffe discordante (suspension cellulaire provenant
du mésencéphale ventral fœtal de porc) entre des souris normales et des souris déficientes en
immunoglobulines. La majorité des souris knock-out (KO) pour les immunoglobulines ont présenté
une greffe fonctionnelle, peu infiltrée par les cellules immunitaires, pendant plus de 4 semaines, alors
que la survie du greffon fut très rare au delà de 4 jours pour les souris normales. Ceci indique que les
immunoglobulines jouent un rôle initiateur dans le rejet rapide des xénogreffes neurales
discordantes. Après une survie prolongée d’environ 4 semaines, une réponse cellulaire avec une
grande proportion de cellules CD8+ a conduit au rejet chez les souris KO (Larsson et al. 1999).
Les résultats encourageants obtenus chez les modèles animaux de la maladie de Parkinson
ont conduit à des études cliniques de petite envergure. Dans cette étude réalisée par le groupe
d’Isacson, 12 patients souffrant de la maladie de Parkinson ont reçu une greffe striatale unilatérale
constituée d’une suspension cellulaire issue de mésencéphale ventral porcin (E25-E28 de gestation ;
Schumacher et al. 2000). Une diminution significative d’une moyenne de 19% dans les scores UPDRS
(Unified Parkinson's Disease Rating Scale, échelle permettant de quantifier l’évolution de la maladie)
a été rapportée, mais les expériences de tomographie à émission de positrons (TEP) n’ont pas
montré d’augmentation de la recapture de Fluoro-Dopa (F-Dopa, dont le taux de capture striatale est
corrélé à la densité des terminaisons axonales des neurones dopaminergiques du greffon et à
l’activité de la dopa-décarboxylase qui transforme la dopa en dopamine). De plus, une étude postmortem a révélé que seulement 638 cellules TH+ sur les 12 millions de cellules porcines
transplantées ont survécu à ce stade, avec une infiltration lymphocytaire autour et dans la greffe,
malgré le fait que le patient était traité à la cyclosporine A (Deacon et al. 1997).
Toutes ces études ont mené à des résultats décevants et ont limité l’enthousiasme lié à
l’utilisation des neuroblastes xénogéniques fœtaux en médecine régénérative. Les recherches se
tournent donc maintenant vers des sources cellulaires alternatives pour la transplantation
intracérébrale. La source cellulaire idéale devrait pouvoir être amplifiée en grande quantité, stockée
sur de longues périodes, être efficace dans le remplacement cellulaire, pouvoir être manipulée pour
s’adapter au traitement spécifique de la pathologie en cause, tolérogène et sans risque pour la santé.
72
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie III
Jusqu’à présent, aucune cellule ne remplit tous ces critères à la fois et diverses cellules à différentes
étapes du lignage neuronal ont été testées dans des modèles animaux et des essais cliniques (Tableau
4). Parmi ces dernières, les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN) semblent être de bonnes
candidates. Outre leurs propriétés d’auto-renouvellement et de multipotence déjà décrites dans la
deuxième partie de cette introduction, les CSPN seraient moins immunogènes (Odeberg et al. 2005)
que les neuroblastes du fait d’une expression plus faible des molécules du CMH (Klassen et al. 2001 ;
Hori et al. 2003). De plus, elles sont dotées, tout comme les cellules souches mésenchymateuses pour
lesquelles ce phénomène est très bien décrit, de propriétés immunomodulatrices intervenant tout
particulièrement sur la population lymphocytaire T. La dernière partie de cette introduction
s’attachera donc à définir les intérêts de la transplantation de cellules souches/progénitrices
neurales pour des stratégies thérapeutiques régénératives, à décrire le comportement des CSPN
transplantées et en particulier leurs interactions avec les cellules T, qui leur confèrent des avantages
pour la thérapie cellulaire de pathologies à composante immune.
Type cellulaire
Source
Avantages
Cellules ES
Embryon
Prolifération illimitée dans
un état indifférencié, large
potentiel de différenciation
CSPN fœtales
Cerveau fœtal
Prolifération in vitro à long
terme, multipotence, pas de
formation de tumeurs
Précurseurs
neuronaux
Cerveau
embryonnaire ou
fœtal
Différenciation prévisible
en phénotype neuronal, pas
de formation de tumeurs
Cellules
neuronales
primaires
Cerveau fœtal
Différenciation en
neurones, sans risque
CSPN adultes
Cerveau adulte
Cellules
xénogéniques
Espèce différente
du receveur
Cellules souches
pluripotentes
inductibles (iPS)
Cellules
somatiques
adultes avec
transfert nucléaire
Evite les contraintes
éthiques et
immunologiques,
prolifération in vitro,
possible transplantation
autologue, pas de formation
de tumeurs
Bonne disponibilité,
modifications génétiques
possibles
Immunosuppression non
nécessaire, prolifération in
vitro, large potentiel de
différenciation
Désavantages
Difficulté à orienter la
différenciation in vitro et in
vivo, risque de formation de
tératomes
Faible différenciation en
neurones, hétérogénéité des
cellules
Prolifération très limitée,
potentiel de différenciation
restreint au lignage
neuronal
Non amplifiables, potentiel
de différenciation restreint
Potentiel très restreint de
différenciation neuronale,
différenciation et
intégration fonctionnelle
discutables
Rejet immunitaire, possibles
zoonoses
Difficulté à diriger la
différenciation in vitro et in
vivo, risque de formation de
tératomes
Tableau 4 : Avantages et désavantages des sources cellulaires pour la transplantation
intracérébrale. Adapté de Guillaume & Zhang 2008.
73
PARTIE IV
Les cellules
souches/progénitrices neurales
comme outil thérapeutique
74
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
PARTIE IV
4. Utilisation thérapeutique des CSPN
4.1. Généralités sur la thérapie cellulaire et les cellules souches
La greffe de cellules souches suscite un très grand intérêt de par la possibilité de les utiliser
pour reconstituer des populations cellulaires perdues lors d’une lésion ou d’une affection du SNC
(Lindvall & Kokaia 2006). Une telle approche restauratrice peut être réalisée de deux façons
différentes. La première préconise une différenciation in vitro des cellules souches dans le type
cellulaire désiré suivi de la transplantation de ces cellules pré-différenciées dans la région à traiter
(Kim et al. 2002). La seconde recommande la transplantation directe des cellules souches,
escomptant leur différenciation spontanée in vivo en cellules du phénotype requis (Bjorklund et al.
2002). La première stratégie est d’un intérêt tout particulier dans des situations où un type cellulaire
est spécifiquement perdu et où la fonction peut être restaurée par la greffe de cellules possédant des
propriétés similaires, comme dans le cas du diabète de type 1 (cellules β des îlots de Langherans du
pancréas), de la sclérose latérale amyotrophique (SLA ; motoneurones du cortex cérébral et de la
corne antérieure de la moelle épinière) ou de la maladie de Parkinson (neurones dopaminergiques
de la substance noire pars compacta). En revanche, l’utilisation de cellules indifférenciées ayant
conservé leur multipotence présente un intérêt lorsque la lésion affecte différents types cellulaires
sur une zone très étendue. Par exemple, il a été montré que les cellules souches mésenchymateuses
(CSM) indifférenciées issues de la moelle osseuse sont capables de différenciation en cellules
endothéliales et en cardiomyocytes après injection dans un modèle porcin de cardiomyopathie
ischémique (Quevedo et al. 2009).
En plus de leur utilisation comme cellules de remplacement, il apparaît désormais clair que
les cellules souches peuvent favoriser le processus régénératif (Prockop et al. 2000). Tout d’abord, il
est intéressant de noter que certaines cellules souches, comme les CSPN, font preuve d’un fort
tropisme pour les lésions tissulaires. En effet, alors que la plupart des cellules résidentes dans les
régions lésées meurent, les cellules souches semblent migrer vers ces sites et libérer des molécules
favorisant la survie et la régénération des populations atteintes (Ourednik et al. 2002). Plusieurs
groupes s’intéressent à ce tropisme des cellules souches pour les zones endommagées afin
75
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
d’exploiter cette propriété pour délivrer des composants thérapeutiques spécifiquement au niveau
du site de la lésion via des cellules souches génétiquement modifiées (Muller et al. 2006). Une telle
approche serait particulièrement appropriée pour les pathologies ischémiques dans lesquelles la
circulation sanguine altérée rend très difficile l’accès de telles molécules à la région affectée par
administration systémique.
Par ailleurs, outre la production de facteurs favorisant la survie des populations endogènes,
de nouvelles propriétés des CSPN ont été récemment décrites, incluant un effet paracrine bénéfique
des cellules transplantées (Pluchino et al. 2005a). Cet effet paracrine, résultant principalement de
mécanismes immunomodulateurs (Einstein et al. 2007), semble être très proche de celui déjà relaté
dans le cas des cellules souches mésenchymateuses et des cellules souches embryonnaires (Fandrich
et al. 2002 ; Zappia et al. 2005 ; Rossignol et al. 2009). Ces propriétés additionnelles font des CSPN
une source cellulaire très attractive pour la transplantation clinique.
Une alternative à la thérapie cellulaire de remplacement consiste à mobiliser les cellules
souches tissulaires résidentes afin de remplacer les éléments perdus. Dans beaucoup de tissus
comme la peau, l’intestin et la moelle osseuse, les cellules souches tissulaires fournissent
continuellement de nouvelles cellules pour le renouvellement cellulaire physiologique normal
(Chmielnicki et al. 2004). De plus, les cellules souches de plusieurs tissus de l’organisme participent à
la régénération cellulaire après lésion (Kolb et al. 2007). La neurogénèse spontanée en réponse à une
affection cérébrale importante est cependant insuffisante pour permettre une récupération
fonctionnelle. Ainsi des stratégies sont en cours de développement pour tenter d’amplifier cette
réponse régénérative endogène (Androutsellis-Theotokis et al. 2006).
4.2. CSPN et thérapie cellulaire
4.2.1. Induction de la neurogénèse endogène
Les CSPN adultes qui résident dans les niches germinales peuvent être bénéfiques pour la
régénération du système nerveux du fait de leur capacité à supporter la neurogénèse et la gliogénèse
chez l’adulte (Ming & Song 2005). Néanmoins, sans une certaine forme d’intervention, l’effet des
CSPN endogènes dans la réparation du tissu cérébral est très faible et dépend du
microenvironnement qui caractérise les différentes sortes d’affections du SNC (par exemple aiguës
ou chroniques, focales ou multifocales ; Yagita et al. 2001 ; Picard-Riera et al. 2002 ; Brundin et al.
76
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
2003 ; Zhang et al. 2005). Dans des modèles expérimentaux de sclérose en plaques ou de lésion de la
moelle épinière, la neurogénèse des CSPN endogènes résidant près de la région traumatique ou
ischémique et ayant survécu au processus pathologique se déroule sous environ sept jours. Des CSPN
exprimant la nestine ont été trouvées au niveau des régions endommagées où elles soutiennent la
neurogénèse post-lésionnelle dans une zone comprise entre le tissu endommagé et le parenchyme
cérébral intact avoisinant (Duggal et al. 1997 ; Namiki & Tator 1999 ; Takagi et al. 1999).
Dans des modèles animaux de maladies inflammatoires chroniques multifocales et
démyélinisantes comme l’EAE, des CSPN en prolifération qui résident soit dans la zone sousventriculaire, soit dans la couche sous-épendymaire du canal de l’épendyme de la moelle épinière,
peuvent adapter leur devenir physiologique et migrer vers les zones de démyélinisation où elles se
différencient en cellules gliales (Picard-Riera et al. 2002 ; Brundin et al. 2003). Cependant, malgré les
nombreuses données indiquant que la neurogénèse et la gliogénèse sont parties intégrantes du
processus d’auto-réparation intrinsèque du SNC au cours des maladies inflammatoires, il n’existe
toujours pas d’explication convaincante concernant l’incapacité des cellules souches endogènes à
promouvoir une réparation complète et durable du SNC. Des études ont montré que des composants
inflammatoires comme les cellules mononuclées circulantes du sang qui infiltrent le SNC, certaines
cellules réactives résidantes du SNC (par exemple les astrocytes, les cellules endothéliales cérébrales
et la microglie) et les médiateurs humoraux (cytokines, chimiokines) pourraient être responsables
d’une telle déficience. En effet, ils peuvent affecter la prolifération et la différenciation des CSPN
adultes, de façon directe ou indirecte, à travers la réexpression non coordonnée de programmes
génétiques qui contrôlent leur devenir. Cette hypothèse est supportée par des expériences réalisées
dans des modèles d’EAE et d’inflammation subaiguë du SNC induite par injection de LPS. Ainsi, les
lymphocytes encéphalitogéniques activés et les cellules réactives du SNC des souris EAE, qui causent
une démyélinisation non uniforme et coexistent dans les espaces péri-vasculaires, sécrètent la
protéine osseuse morphogénétique 4 (BMP4) et son antagoniste noggin, deux régulateurs majeurs
du devenir des cellules souches de la niche neurogénique de la ZSV (Lim et al. 2000). Au cours de
l’inflammation subaiguë du SNC induite par le LPS, l’IL-6 sécrétée par la microglie nuit
significativement à la neurogénèse dans l’hippocampe in vivo (Vallieres et al. 2002). Cette déficience
est toutefois complètement réversée lors de l’administration d’un anti-inflammatoire non stéroïdien
comme l’indométhacine (Monje et al. 2003). In vitro, la production de nouveaux neurones et
d’oligodendrocytes à partir de CSPN adultes murines est favorisée par la microglie ayant
préalablement été traitée avec de l’INF-γ et de l’IL-4, deux cytokines associées aux cellules T. Elle est
en revanche bloquée par les cellules microgliales préalablement activées par des endotoxines comme
le LPS (Butovsky et al. 2006). Ces résultats suggèrent que l’inflammation aiguë et chronique du SNC
peut perturber les relations anatomiques et fonctionnelles entre les composants cellulaires des
niches germinales, diminuant ainsi la capacité de régénération du compartiment des cellules souches
77
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
endogènes. En conséquence, les protocoles visant à stimuler la prolifération et la différenciation des
CSPN endogènes des niches par administration in vivo de molécules biologiquement actives comme
l’EGF, le bFGF ou le BDNF risquent d’être thérapeutiquement inefficaces dans certaines affections
inflammatoires du SNC (Arlotta et al. 2003 ; Goldman 2004).
La transplantation de CSPN adultes exogènes semble alors représenter une approche
thérapeutique alternative plus efficace.
4.2.2. Transplantation des CSPN
La thérapie cellulaire reposant sur l’utilisation des CSPN pour des maladies du système
nerveux telles que la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, la sclérose en plaques et les
lésions de la moelle épinière, a été développée avec succès dans des modèles animaux
expérimentaux. Cependant il existe encore de nombreux obstacles à franchir avant que l’utilisation
en clinique de ces stratégies prometteuses puisse voir le jour. En effet, la source cellulaire idéale pour
la transplantation reste à définir, de même que la meilleure voie d’administration des cellules (locale
ou systémique). De plus, les mécanismes putatifs qui soutiennent à la fois les capacités de
régénération et d’intégration fonctionnelle à long terme des CSPN après transplantation restent
confus. Bien qu’il y ait des indications que les cellules souches puissent atteindre leur tissu cible et se
différencier dans le lignage cellulaire approprié, les preuves que les CSPN transplantées pourraient
reconstruire l’architecture cellulaire tridimensionnelle du cerveau et donner naissance à de
nombreuses cellules fonctionnelles et intégrées dans la circuiterie nerveuse, sont encore rares.
Source cellulaire
Par définition, la source cellulaire la plus adaptée pour la transplantation dans le SNC doit
être plastique. Les cellules souches embryonnaires et les CSPN présentent toutes les deux cette
caractéristique puisqu’elles sont intrinsèquement capables d’adapter leur différenciation à des
besoins environnementaux spécifiques (Emsley et al. 2005). Cependant, en plus des considérations
éthiques, l’utilisation thérapeutique des cellules ES est encore limitée par des problèmes majeurs
comme la formation de tératocarcinomes in vivo (Vogel 2005 ; Ludwig et al. 2006). A l’inverse, les
CSPN représentent une population de choix pour la thérapie cellulaire parce qu’elles peuvent être
obtenues à partir de tissu nerveux fœtal ou adulte, et ont largement été utilisées in vivo sans causer
jusqu’à maintenant la formation de tumeurs, ni exercer d’effets secondaires indésirables non
contrôlables (Galli et al. 2003).
78
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
Autotransplantation
La découverte d’une neurogénèse adulte et de la présence de cellules souches dans le SNC
adulte des mammifères, dont l’homme, a ouvert de nouvelles possibilités pour la thérapie cellulaire
régénérative. Des CSPN dérivées de tissu nerveux adulte de rongeurs et transplantées de façon
autologue dans le SNC des ces animaux ont montré une intégration fonctionnelle dans le parenchyme
cérébral, confirmant leur utilisation potentielle en thérapie (Taupin & Gage 2002). La capacité
d’isoler et de cultiver des CSPN provenant du cerveau adulte offre l’opportunité de réaliser des
transplantations autologues, dans lesquelles des CSPN seraient isolées à partir d’une région non
lésée du SNC, amplifiées en culture in vitro, et ré-introduites chez le patient afin de réparer les
dommages cérébraux sans recours à des traitements immunosuppresseurs. Cette stratégie présente
l’énorme avantage de s’affranchir des problèmes de compatibilité immunologique mais souffre
cependant de sérieuses limitations. En effet, l’intervention chirurgicale invasive pour récupérer les
cellules du patient peut engendrer des conséquences critiques comme des dommages permanents de
la zone où ont été prélevées les cellules.
Jusqu’à ce jour, la transplantation autologue de CSPN n’a été réalisée que sur un seul patient
atteint de la maladie de Parkinson (Levesque et al. 2009). Les CSPN ont été isolées à partir d’une
biopsie du cortex pré-frontal et de la région sous-corticale puis amplifiées en culture pendant 6 mois
en présence d’EGF et de bFGF. Après cette phase de prolifération dans un état indifférencié, les
cellules ont été placées en conditions de différenciation en présence de plusieurs facteurs de
croissance favorisant la formation de neurones post-mitotiques d’un phénotype dopaminergique. Au
final, 15% de neurones dopaminergiques fonctionnels ont été caractérisés in vitro, avec mise en
évidence de la synthèse et de la sécrétion de dopamine, ce qui est significativement mieux que les 5%
de neurones dopaminergiques viables issus du tissu mésencéphalique fœtal (Freed 2002). Après
transplantation unilatérale, le patient a vu ses symptômes moteurs améliorés de 80% (score UPDRS)
avec une augmentation de l’incorporation de dopamine dans le putamen transplanté de plus de 33%
un an après la greffe. Cet effet thérapeutique a persisté durant 3 ans, puis, à partir de la quatrième
année, une régression clinique est apparue traduisant la progression bilatérale de la maladie
(Levesque et al. 2009). Ainsi, malgré cette étude encourageante, des travaux supplémentaires sont
nécessaires afin d’évaluer l’efficacité à long terme d’une telle stratégie.
Un des avantages que représenterait l’utilisation de cellules souches autologues en thérapie
cellulaire est la capacité de modifier ces cellules par thérapie génique pour réparer les potentiels
défauts génétiques relatifs à la maladie du patient (comme par exemple dans le cas de la maladie de
Huntington), stimuler la différenciation dopaminergique dans le cas de la maladie de Parkinson, ou
encore dé-différencier les CSPN vers un stade pluripotent en utilisant le gène Oct4 (qui est à lui seul
suffisant pour induire la pluripotence des CSPN adultes ; Kim et al. 2009a), avant de ré-implanter les
79
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
cellules dans le cerveau. La thérapie génique spécifique du patient associée à la transplantation de
CSPN adultes serait une stratégie puissante pour le traitement des maladies neurodégénératives
.
Dans ce contexte d’autotransplantation, la plasticité relatée des cellules souches adultes
somatiques serait également d’un intérêt non négligeable (Anderson et al. 2001). En effet, la capacité
à engendrer des cellules du lignage neuronal a été décrite pour les cellules souches provenant du
système hématopoïétique (Eglitis & Mezey 1997), de la moelle osseuse (Mezey et al. 2000), de la
peau (Toma et al. 2001), du muscle squelettique (Romero-Ramos et al. 2002), du tissu graisseux
(Safford et al. 2002) ainsi que du sang de cordon (Garbuzova-Davis et al. 2003), ces cellules
présentant l’avantage d’être plus faciles d’accès que les CSPN du SNC. Cependant le phénomène de
plasticité est toujours controversé (Anderson et al. 2001) et celui-ci pourrait résulter de mécanismes
de transformation cellulaire, de transdifférenciation ou de fusion à l’origine d’instabilités génétiques
qui constitueraient un frein à l’utilisation de ces cellules en thérapie.
Allotransplantation
Une allogreffe de CSPN ne peut pas survivre très longtemps dans l’hôte sans
immunosuppression (Muraoka et al. 2006 ; Krystkowiak et al. 2007). L’immunogénicité est donc un
paramètre à prendre en compte dans la survie des cellules transplantées. Les CSPN expriment les
molécules du CMH de classe I et des molécules de costimulation, mais elles n’expriment pas le CMH
de classe II dans des conditions physiologiques normales (Klassen et al. 2001; Hori et al. 2003) et
sont considérées ainsi comme moins immunogènes que les cellules différenciées. Cependant, au
cours d’un processus inflammatoire, notamment sous l’effet de l’IFN-γ, l’expression des molécules
immunogènes à la surface des CSPN est fortement augmentée (Imitola et al. 2004 ; Johansson et al.
2008 ; Yin et al. 2008) et elles peuvent exprimer le CMH de classe II, ce qui peut compromettre leur
survie, et par voie de conséquence, leurs effets à long terme (Imitola et al. 2004). Il est donc
nécessaire d’évaluer le potentiel de rejet chronique en transplantation neurale.
De plus, en ce qui concerne les stratégies d’allotransplantation, certaines études ont montré
que les CSPN dérivées d’un organisme adulte seraient moins efficaces que celles issues du tissu fœtal.
En effet, ces dernières sont dotées d’une plus grande capacité de prolifération et de survie in vitro
(Tableau 4) et se différencieraient plus facilement en neurones in vivo. Les CSPN isolées à partir de
tissu adulte, elles, ne s’intègrent qu’en faible proportion dans le tissu cérébral, leur temps de survie
est relativement faible et la formation de synapses est très limitée (Dziewczapolski et al. 2003),
compromettant ainsi une éventuelle restauration fonctionnelle. Ces données suggèrent que les CSPN
devraient être préférentiellement dérivées de tissus fœtaux. Or les CSPN fœtales, tout comme les
cellules ES, se heurtent à des problèmes éthiques limitant leur utilisation.
80
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
Xénotransplantation
L’utilisation de CSPN issues d’espèce animale telle que le porc permettrait de s’affranchir des
problèmes éthiques liés à l’utilisation de matériel fœtal humain. Une étude réalisée par le groupe de
Roger Barker a montré que des CSPN de porc xénogreffées chez des rats immunosupprimés par la
cyclosporine A et lésés à la 6-hydroxydopamine (molécule détruisant les neurones dopaminergiques
permettant de modéliser la maladie de Parkinson) sont capables de se différencier en neurones
dopaminergiques et ainsi de reconstituer en partie les circuits neuronaux endommagés (Armstrong
et al. 2002). Les CSPN de porc sont particulièrement intéressantes du fait de leur bonne capacité à
stimuler la croissance axonale des neurones de l’hôte, et également du fait de leur propriété de
multipotence. Cette double fonction en fait de très bonnes candidates pour la thérapie cellulaire
régénérative. De plus, différentes études suggèrent que, comme toutes les cellules souches, les CSPN
porcines auraient une immunogénicité réduite (Armstrong et al. 2001) ce qui pourrait favoriser leur
survie in vivo.
Voie d’administration
La voie d’administration des cellules la plus adaptée représente une contrainte de la
transplantation de CSPN, et est très dépendante du type de lésion (focal ou multifocal). Les
caractéristiques anatomo-pathologiques des affections focales du SNC comme la maladie de
Parkinson, les lésions de la moelle épinière, la maladie de Huntington ou encore l’AVC, suggèrent que
la transplantation intracérébrale directement au niveau du site de la lésion serait la plus appropriée
pour faciliter la régénération tissulaire. En revanche, la présence de plusieurs foyers lésionnels dans
certaines maladies comme la sclérose en plaques ou l’épilepsie représente une limitation majeure
pour les approches de transplantation cellulaire intra-lésionnelle. Les groupes israélien de Tamir
Ben-Hur et italien de Stefano Pluchino ont été parmi les premiers à montrer que la transplantation
systémique de CSPN (par voie intraveineuse ou intrathécale) pouvait avoir un effet thérapeutique
dans des désordres multifocaux du SNC (Einstein et al. 2003 ; Pluchino et al. 2003 ; Pluchino et al.
2005b).
81
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
Effets thérapeutiques
Remplacement cellulaire
Les CSPN humaines transplantées dans le cerveau de souris immunodéficientes prolifèrent,
migrent et se différencient de façon spécifique en fonction du site où elles se trouvent (Tamaki et al.
2002). La transplantation de CSPN s’est révélée efficace dans des modèles animaux d’AVC et de lésion
de la moelle épinière. Les CSPN issues de la lignée C17.2 implantées dans un cerveau murin
ischémique s’intègrent, survivent et se différencient en neurones et en cellules gliales (Snyder et al.
1997). Des modèles animaux d’ischémie cérébrale ont également été utlisés pour montrer que les
CSPN transplantées dans les ventricules cérébraux migrent vers et à travers la cavité infarcie,
s’intègrent et se différencient dans les principaux types de cellules neurales (Park et al. 1999 ; Riess
et al. 2002). De plus, des CSPN génétiquement modifiées pour surexprimer NT-3 ont montré une
forte intégration et une bonne capacité régénérative dans un modèle de lésion cérébrale hypoxique
et ischémique, avec une réduction de l’atteinte du parenchyme cérébral, une augmentation de la
croissance neuritique et une réduction de la cicatrice gliale (Park et al. 2006). Ces travaux suggèrent
que dans certaines conditions, le cerveau lésé peut être permissif pour le maintien des CSPN
transplantées (Ohab et al. 2006). L’intégration et la reconstruction de la circuiterie neurale est un but
important de la transplantation de CSPN. Dans ce contexte, plusieurs groupes ont montré que les
CSPN propagées in vitro pouvaient former des neurones fonctionnels connectés et électriquement
actifs (Auerbach et al. 2000) qui s’intégrent après transplantation dans la circuiterie corticale de
l’hôte (Snyder et al. 1997 ; Park et al. 2002 ; Lundberg et al. 2002).
Malgré ces résultats encourageants, les données concernant la capacité de CSPN à se
différencier en un nombre suffisant de neurones fonctionnels, qui, à leur tour, pourraient régénérer
la fonction perdue par un remplacement cellulaire massif, restent assez rares (Pluchino et al. 2004).
Quelque soit le modèle de la maladie, les bénéfices fonctionnels obtenus par la transplantation de
CSPN sont rarement corrélés au nombre de cellules neurales totalement différenciées générées à
partir de CSPN greffées. L’inefficacité à aboutir à une différenciation complète correcte ainsi que la
propension à se maintenir sous un phénotype plutôt indifférencié à l’intérieur du tissu hôte
suggèrent que les CSPN transplantées exerceraient leur effet thérapeutique par un ou des
mécanismes parallèles alternatifs au remplacement cellulaire.
82
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
Neuroprotection
Les cellules transplantées peuvent significativement augmenter la survie et la fonction des
progéniteurs gliaux et neuronaux endogènes qui ont survécu à l’évènement pathologique. Cet effet
neuroprotecteur est souvent accompagné par une biodisponibilité accrue in vivo de neurotrophines
majeures comme le NGF, le BDNF, le CNTF et le GDNF. Ceci a été démontré chez des rongeurs
présentant des troubles inflammatoires centraux primaires comme la sclérose en plaques (Pluchino
et al. 2003), les lésions de la moelle épinière (Lu et al. 2003a) ou l’AVC (Chu et al. 2004), ainsi que
chez des rongeurs servant de modèles expérimentaux d’affections dégénératives accompagnées
d’une réaction inflammatoire telles que maladie de Parkinson (Richardson et al. 2005) et de
Huntington (Ryu et al. 2004 ; McBride et al. 2004). Les mécanismes cellulaires et moléculaires
impliqués dans ce phénomène résident peut être dans les caractéristiques intrinsèques des
neurosphères, entités cellulaires artéfactuelles résultant de la culture des CSPN et à partir desquelles
dérivent les cellules transplantées. Classiquement, les neurosphères sont générées in vitro après une
dizaine de jours de culture en l’absence de sérum et en présence de fortes quantités de facteurs de
croissance (EGF et/ou bFGF). Ce protocole de culture permet de sélectionner uniquement les cellules
« répondeuses » à ces facteurs. Ainsi, après transplantation, les CSPN dérivées des neurosphères
peuvent être plus réceptrices à des signaux environnementaux (notamment au bFGF) du tissu cible
permettant ainsi la sécrétion des neurotrophines (Lu et al. 2003a ; Ryu et al. 2004).
Immunomodulation
Les CSPN indifférenciées transplantées exercent également une activité immunomodulatrice
puisqu’elles peuvent sécréter des molécules solubles (cytokines et chimiokines) et exprimer des
récepteurs intervenant dans l’immunité (comme les récepteurs aux chimiokines et les molécules
d’adhésion cellulaire), qui sont capables de modifier profondément l’environnement inflammatoire.
Par exemple, il a été montré in vitro chez des souris présentant une EAE que les CSPN transplantées
sont capables d’induire l’apoptose des lymphocytes T inflammatoires en augmentant l’expression
membranaire de certains ligands aux récepteurs de mort comme FasL, TRAIL et Apo3L (Pluchino et
al. 2005b). Ce mécanisme médié par les CSPN est déclenché par des cytokines pro-inflammatoires
comme l’IFNγ, l’IL-1β et le TNFα, mais pas anti-inflammatoires (IL-4, IL-5 ou IL-13). Par ailleurs,
d’autres études réalisées par le groupe de Tamir Ben-Hur ont montré que des CSPN injectées par voie
intraveineuse chez des souris EAE étaient capables d’atténuer la sévérité de la maladie (Einstein et
al. 2007). Dans ces conditions expérimentales, cet effet immunomodulateur ne serait pas dû à une
intervention locale des CSPN étant donné que ces dernières n’ont pas été détectées à l’intérieur du
SNC. La présence transitoire des CSPN dans les ganglions lymphatiques et la rate est plutôt en faveur
83
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
d’une action périphérique sur les cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes T. Les
résultats supportant ce rôle thérapeutique parallèle des CSPN a récemment été renforcé par l’étude
de Pamella Wang qui a montré que l’injection intraveineuse de CSPN issues de la lignée C17.2 dans
un modèle d’ischémie-reperfusion rénale chez le rat permettait d’améliorer les dommages tissulaires
par un fort effet paracrine, principalement dû à un méchanisme immunomodulateur faisant
intervenir la nitric oxide synthase (NOS, enzyme de synthèse du monoxyde d’azote) ainsi que les
prostaglandines PGE2 (Wang et al. 2009a).
Induction de niches ectopiques
Dans certaines affections inflammatoires multifocales du SNC, les CSPN injectées en
systémique via la circulation sanguine ou celle du liquide céphalo-rachidien, peuvent atteindre
spécifiquement les régions inflammatoires du SNC dans lesquelles elles persistent pendant plusieurs
mois et favorisent la réparation des tissus lésés (Chu et al. 2004). Le mécanisme par lequel les CSPN
migrent vers les sites où se déroule l’inflammation a récemment été analysé chez les souris
présentant une EAE chronique. Dans ces souris, les CSPN injectées par voie intraveineuse ou
intracérébroventriculaire entrent spécifiquement dans le parenchyme cérébral au niveau des lésions
où elles permettent de réduire de façon marquée la démyélinisation, la perte axonale ainsi que
l’astrogliose, et donc en conséquence, de restaurer les fonctions neurologiques (Pluchino et al. 2003 ;
Einstein et al. 2003 ; Ben-Hur et al. 2003a ; Pluchino et al. 2005b). Ce « homing » sélectif et spécifique
des CSPN transplantées dans les régions inflammatoires du SNC serait dû à l’expression constitutive
de molécules d’adhésion de haute affinité comme CD44 (Pluchino et al. 2003 ; Pluchino et al. 2005b),
des intégrines α et β (Leone et al. 2005), ainsi que de récepteurs fonctionnels aux chimiokines (CCR2,
CCR5, CXCR3 et CXCR4 par exemple ; Ji et al. 2004). Ces molécules rendent les CSPN capables d’imiter
le phénomène d’extravasation utilisé par les leucocytes pour pénétrer dans le parenchyme cérébral
inflammatoire. Les CSPN qui expriment ce type de molécules d’adhésion seraient en fait capables de
suivre un gradient de chimio-attractants (cytokines proinflammatoires et chimiokines) dont le point
de départ est le site de la lésion inflammatoire (Ransohoff 2002 ; Ben-Hur et al. 2003a ; Pluchino et
al. 2003 ; Pluchino et al. 2005b). Ce gradient favoriserait les interactions entre les cellules souches
transplantées et les cellules endothéliales et épendymaires entourant les tissus lésés du SNC, et
induirait la migration des CSPN à travers l’endothélium activé. Les CSPN s’accumuleraient autour des
espaces péri-vasculaires où co-résident des astrocytes réactifs, des cellules endothéliales activées et
des lymphocytes T issus de la circulation sanguine et ayant infiltré le SNC (Fig. 23). Ainsi, ces zones
qualifiées de « niches ectopiques atypiques », se développeraient indépendamment des niches
neurogéniques classiques, dans certaines conditions d’agression du SNC comme l’inflammation liée à
84
_________________________________________________________________________________________ Introduction : Partie IV
la transplantation ou à des affections dégénératives ou traumatiques. En fonction des signaux du
micoenvironnement, les CSPN resteraient soit dans la niche dans un état indifférencié, induisant ainsi
la mort par apoptose des cellules T avoisinantes, soit elles migreraient hors de la niche pour acquérir
un phénotype différencié. Le milieu environnemental semble être un élément clé de ce processus
dynamique. Ainsi, la compréhension des mécanismes régissant la communication moléculaire et
cellulaire des CSPN et des lymphocytes T apparait très importante pour le développement de
nouvelles thérapies permettant, entre autres, de ralentir la progression des maladies
neurodégénératives (Ziv et al. 2006).
Figure 23 : Concept de « niche atypique ». Après transplantation par voie intraveineuse, les CSPN
migrent sélectivement et s’accumulent dans les espaces péri-vasculaires du SNC. Ces zones contiennent
les CSPN, des lymphocytes infiltrants issus de la circulation sanguine, des cellules microgliales activées,
des astrocytes réactifs et des cellules endothéliales activées. Ces entités nouvellement formées,
anatomiquement atypiques, se comportent comme des niches ectopiques. Une forte communication a
lieu entre les composants cellulaires de la niche, ce qui régule la survie à long terme et le comportement
des cellules greffées. Adapté de Martino & Pluchino 2006.
85
OBJECTIFS
DU TRAVAIL DE THESE
86
_________________________________________________________________________________________________________ Objectifs
OBJECTIFS
Les affections du système nerveux central (SNC), en particulier les maladies
neurodégénératives, représentent un problème majeur de santé publique. Il est donc fondamental de
poursuivre les recherches visant à développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour ces
pathologies. La médecine régénérative a énormément progressé depuis ces vingt dernières années,
et la transplantation de cellules dans le SNC des mammifères a ravivé l’intérêt de la communauté
scientifique pour le statut immunologique du cerveau et pour les réactions de ce dernier face à
l’implantation de tissu nerveux exogène en son sein. La vision dogmatique du cerveau comme étant
un organe immunologiquement privilégié (Medawar 1948), permettant la survie indéfinie des
cellules greffées sans réaction de rejet et échappant totalement à la surveillance du système
immunitaire périphérique, s’est avérée être fausse. Ainsi, le cerveau doit être considéré comme un
organe dans lequel une réponse immunitaire peut se produire, et bien que particulière, elle peut sous
certaines conditions être aussi vigoureuse que celle observée dans les sites périphériques classiques
(Borlongan et al. 1996). En effet, il est maintenant admis que le SNC présente des caractéristiques
inflammatoires. En réponse à une lésion, une infection ou une maladie, les cellules résidentes
génèrent des médiateurs inflammatoires, incluant des cytokines proinflammatoires, des
prostaglandines et des radicaux libres, qui, à leur tour, induisent des chimiokines et des molécules
d’adhésion pour recruter les cellules immunitaires et activer les cellules gliales (Lucas et al. 2006). Ce
contexte immunologique particulier du cerveau est donc à prendre en compte dans la mise au point
de stratégies thérapeutiques de restauration neuronale après lésion ou maladie du SNC, notamment
celles présentant une base immunologique comme la sclérose en plaques.
L’allogreffe de tissu fœtal dans le SNC d’animaux présentant des lésions expérimentales, ou
dans celui de patients atteints de maladies neurodégénératives, a montré que les cellules greffées
pouvaient survivre, créer des synapses et en recevoir, et améliorer les déficits comportementaux
sans pour autant induire un processus de rejet significatif sous immunosuppression modérée.
Cependant, l’utilisation de tissu nerveux provenant de fœtus humains issus d’IVG soulève de tels
obstacles éthiques et logistiques que des sources cellulaires alternatives doivent être envisagées,
incluant les cellules nerveuses xénogéniques de porc et les cellules souches. Le principal problème lié
à l’utilisation de cellules porcines en xénotransplantation concerne le rejet immunologique. En effet,
les xénogreffes intracérébrales sont systématiquement rejetées en l’absence de traitement
immunosuppresseur. Bien que de plus en plus d’études suggèrent un rôle du complément et des
médiateurs de l’immunité humorale dans ce phénomène, le rejet des xénogreffes neurales fait
intervenir de façon très majoritaire une réponse cellulaire T. Dans ce contexte, les cellules
souches/progénitrices neurales, décrites comme possédant une immunogénicité réduite (Klassen et
87
_________________________________________________________________________________________________________ Objectifs
al. 2001; Hori et al. 2003) ainsi que des propriétés modulatrices de la réponse immune (Einstein et
al. 2007), pourraient être une alternative pertinente aux neuroblastes fœtaux pour prolonger la
survie des cellules xénogreffées dans le cerveau.
L’objectif global de ce travail de thèse a donc été d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des cellules
souches/progénitrices neurales en transplantation. Pour cela, nous avons procédé en 4 étapes :
La première étape a consisté en l’étude parallèle de la transplantation de neuroblastes de
porc et de CSPN de porc dans le cerveau de rat sain, non lésé, et en l’absence de traitement
immunosuppresseur. Nos expériences in vivo ayant montré une prolongation significative de la durée
de vie des xénogreffes de CSPN comparée aux neuroblastes, et en se basant sur les dernières données
de la littérature concernant un potentiel rôle immunomodulateur des CSPN, nous avons entrepris
d’étudier de façon approfondie les relations existant in vitro entre les CSPN et les lymphocytes T
(partie Résultats, Article 1).
La seconde étape de ce travail a donc été d’élaborer un protocole de co-culture original entre
ces deux types cellulaires (partie Matériels et Méthodes).
Une fois la méthodologie testée et approuvée, nous avons, dans le cadre de la troisième étape
du projet, recherché le mécanisme d’action sous-jacent à l’immunosuppression exercée par les CSPN
de porc mais également de rat, dans un contexte xénogénique et allogénique, respectivement (partie
Résultats, Articles 1 et 2).
Enfin, la dernière étape de ces travaux a consisté en l’étude des interactions moléculaires se
produisant du lymphocyte T activé vers la CSPN, via la sécrétion d’interleukine-2. Cette cytokine proinflammatoire a été testée sur des cultures de CSPN de rat pour en déterminer l’effet sur la
prolifération et la différenciation (partie Résultats complémentaires).
88
MATERIELS
ET
METHODES
89
CHAPITRE DE LIVRE
Neural stem/progenitor cells and
immunoregulation
Virginie Bonnamain, Isabelle Neveu and Philippe Naveilhan.
--- Soumis ---
90
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Neural stem/progenitor cells and immunoregulation
Virginie Bonnamain, Isabelle Neveu and Philippe Naveilhan
1, INSERM, UMR643, Nantes, France.
2, CHU de Nantes, ITERT, Nantes, France.
3, Université de Nantes, UFR de Médecine, Nantes, France.
Corresponding author: Naveilhan P., INSERM U643, 30 Bd Jean Monnet, 44 093 Nantes cedex
01,
France.
Tel :
+33
(0)240087414 ;
Fax :
+33
(0)240087411 ;
e-mail :
[email protected]
Abstract
Neural stem/progenitor cells (NSPCs) are multipotent cells defined by their ability to selfrenew and differentiate into cells of glial and neuronal lineage. Because of these properties,
NSPCs have been proposed as therapeutic tools to replace lost neurons. Recent observations
in
animal
models
of
immune-related
diseases
indicate
that
NSPCs
display
immunomodulatory properties that might be a great interest for cell therapy. In particular,
transplantation of NSPCs might be very useful as local immunosuppressive agent to promote
the long-term survival of neuronal xenotransplant in the brain. To study this possibility, we
have analysed the impact of NSPCs on anti-CD3/CD28 activated T cells. In vitro analyses
clearly show that porcine, rat and mouse NSPCs inhibit the proliferation of activated T cells.
This result raises new perspectives concerning the use of NSPCs in cell therapy.
Key words: neural progenitor, neural stem cell, T cell, immunosuppression, culture,
rat, pig, mouse.
91
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Introduction
Neural stem/progenitor cells (NSPCs) are multipotent cells present in embryonic and fetal
germinal zones (1). In the adult brain, NSPCs persist in particular areas such as the subventricular
zone or the hippocampus. Because of their self-renewal capacity and their multi-lineage
differentiation, NSPCs have received much attention (2-4). Indeed, NSPCs isolated from the fetal or
adult mammalian central nervous system can be easily expanded in vitro as free-floating clusters
upon treatment with EGF, bFGF (5, 6). The expanded NSPCs display a high level of plasticity, giving
rise to the three major neural lineages -oligodendrocytes, astrocytes and neurons- both in vitro and
following transplantation in vivo (6,7,8,9). NSPCs are therefore considered as a very interesting
source of transplantable cells in case of neurodegenerative disorders or stroke. Besides their utility
to replace lost neural cells, NSPCs appear as an excellent tool in cell therapy because of their
immunoregulatory properties. These unexpected properties have been recently brought to light by
transplanting NSPCs in animal models of immune-related diseases. For instance, systemic or
intraventricular transplantation of NSPCs in rodent model of multiple sclerosis attenuates the
primary demyelinating process and reduces the acute axonal injury by decreasing brain
inflammation (10,11,12) The mechanism by which transplanted NSPCs protect rat and mouse from
EAE is not clear yet. Einstein et al. suggest that NSPCs act by inhibiting the proliferation and the
activation of T lymphocytes in the lymph nodes (10) while Pluchino et al. think that NSPCs exert
neuroprotective effects by inducing programmed cell death of blood-borne, CNS-infiltrating proinflammatory Th1 cells (13). Whatever is the exact mechanism, both work substantiate
immunosuppressive property of NSPCs, and boost up further research to decipher the cross talk
between NSPCs and T cells. Indeed, the ability of NSPC to dampen T cell immune response has many
potential applications, including the use of NSPCs as local immunosuppressors in case of neuronal
xenotransplantation in the brain (14, 15). As a first step to analyse the immunoregulatory impact of
NSPCs on T cells in vitro, we have developed primary cultures of NSPCs and established co-culture of
NSPCs with freshly isolated T cells. Our results indicate that mice, rat and porcine NSPCs have
immunosuppressive effect on spleen-derived T cells.
92
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Materials
Cell culture
1. Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) without phenol red (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
supplemented with 100 U/ml penicillin and 0.1 mg/ml streptomycin (Gibco, Paisley, Scotland, UK).
2. Basal medium: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) / ham’s F12 1:1 (Gibco)
supplemented with 33 mM D-glucose (Sigma-Aldrich), 5 mM HEPES (pH 7.2, Gibco), 100 U/ml
penicillin and 0.1 mg/ml streptomycin (Gibco), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich).
3. Complete medium: basal medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS,
Lonza, Basel, Switzerland).
4. Defined medium: basal medium supplemented with N2-supplement (Gibco).
5. RPMI medium: RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 5 mM HEPES (pH 7.2, Gibco), 100 U/ml
penicillin and 0.1 mg/ml streptomycin (Gibco), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich), 1 mM sodium
pyruvate (Gibco), 1 µM 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 1% non essential amino acids (Gibco)
and 5% heat-inactivated FCS (Lonza).
6. Phosphate buffered saline (PBS): prepare 10X stock with 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM
Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (adjust to pH 7.4 with HCl if necessary). Prepare working solution by
dilution of one part with nine parts of water and autoclave before storage at room temperature.
7. Trypsin TPCK-treated from bovine pancreas (Sigma-Aldrich) is dissolved in PBS at 25 mg/mL and
deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Sigma-Aldrich) is dissolved in HBSS at 10 mg/mL. Both
are stored in aliquots at -20°C, and then used for tissue dissociation as required.
8. Human basic fibroblast growth factor (bFGF; Peprotech EC, London) is dissolved at 25 µg/mL in
PBS supplemented with 4% bovine serum albumine (BSA). bFGF is stored in aliquots at -20°C, and
then added to cell culture dishes as required.
9. Dynabeads® goat anti-mouse IgG (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway)
10. The following mouse anti-rat monoclonal antibodies were used for cell depletion and T cell
stimulation. OX42 (CD11b/c) and 3.2.3 (NKR-P1A) were obtained from the European Collection of
Cell Culture (ECCC). HIS24 (CD45R) and G4.18 (CD3) were obtained from BD Biosciences
Pharmingen (San Diego, CA, USA). The JJ319 mouse hybridoma producing anti-rat CD28 antibody
was kindly provided by T. Hüning (University of Würzburg, Germany) and a stock solution at 2
mg/ml was prepared in sterile PBS.
11. Red cell lysis solution : NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, Na2-EDTA 0,1 mM, diluted in PBS (pH =
7.2).
12. Cell culture dishes (100 x 20 mm), Microtest™ tissue culture plate 96 wells, Multiwell culture
plate (12 wells) are from BD Falcon™, Le Pont De Claix, France.
93
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Immunocytofluorescence
1. Microscope cover glasses, 20 mm Ø (Marienfeld GmbH and Co. KG, Lauda-Königshofen, Germany).
2. Poly-L-ornithine hydrobromide (Sigma-Aldrich) is dissolved at 500 µg/ml in tissue-culture water,
stored in aliquots at -20°C, and then used for coverslip coating as required.
3. Primary monoclonal anti-rat antibodies: anti-Nestin (rat 401; Developmental Studies Hybridoma
Bank, Iowa City, IA), anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP, BD Pharmingen), anti-TUJ-1 (SigmaAldrich) and RIP (DSHB).
4. Secondary antibody: fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-mouse IgG (Jackson
Immunoresearch, Cambridgeshire, UK).
5. Paraformaldehyde 16% solution (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) is diluted at 4%
in 1X PBS and stored at 4°C.
6. Dabco anti-fading medium (Sigma-Aldrich).
7. Axioskop 2 plus microscope (Zeiss, Le Pecq, France). Pictures were acquired using a digital camera
(AxioCam HRC, Zeiss) driven by AxioVision Release 4.2 software.
T cell proliferation assay
1. [3H] Thymidine (5 mCi; PerkinElmer, Boston, MA, USA) is stored at 4°C and added to the cells as
required for the 12 last hours of the culture.
2. Cells are harvested on fiberglass filters (Packard Instrument B.V. Chemical Operations, Groningen,
The Netherlands) using a harvester (Tomtec Inc. Hamden, CT, USA).
3. Radioactivity was measured by standard scintillation technique using a Top Count NXT cell
counter (PerkinElmer).
94
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Methods
Primary cultures of rat, mouse and porcine NSPCs
1. Rat embryos at 15 days of embryonic life (E15) were obtained from Sprague-Dawley rats (Centre
d’Elevage Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France) and mouse embryos at E13 from C57 Black mice
(Janvier). Animals were sacrificed in accordance with the institutional guidelines of the Institut
National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). Porcine embryos were obtained from
domestic Large White pigs, 28 days after artificial insemination. Animals were obtained from the
Institut National de la Recherche Agronomique (INRA, Nouzilly, France) and sacrificed in the
institute’s accredited slaughterhouse.
After hysterectomy, the embryos are collected and washed HBSS before dissection of the brain tissue.
Primary cultures of NSPCs are performed as previously described (16).
2. Dissection includes the isolation of the whole brain of the embryos, cutting from the
mesencephalon to the frontal cortex, above the eyes. Skin and mesenchymal layers are removed and
tissues are collected in a 15 ml Falcon tube containing 2 ml of ice-cold HBSS (see note 1).
3. Continue the protocol under tissue culture laminar flow hood and use strict sterile technique. Put
the brain tissues freed of meninges in a culture dish. Using a scalpel blade, mince tissue for ~30 sec.
4. Using 1000 µl plastic tips together with a Pipetman P1000 (Gilson, Middleton, WI) transfer all the
minced embryonic tissues in a total volume of 5 ml of base medium into a 50 ml Falcon tube.
5. Add 0.5 mg/ml of trypsin and incubate for 15 min in a 37°C water bath.
6. Return the tube to the hood and add 10 ml of complete medium (containing 10% FCS) to inhibit
the enzymatic process. Let the tube at room temperature (RT) for 5 min.
7. Add 0.1 mg/ml of DNase I and incubate the tube for 10 min in a 37°C water bath.
8. Dissociate mechanically the tissue digest with a 5 ml pipette, avoiding air bubbles.
9. Let the suspension settle for 5 min and transfer 10 ml of the cell suspension to a clean, labelled
tube, leaving 5 ml behind. To the latter, triturate again 10 times with a P1000. Let the suspension
settle for 5 min. Transfer all but 200 µL from this tube to the labelled tube, thus pooling the cells from
both trituration steps.
10. Pellet the cells by centrifugation at 50g for 10 min at RT.
11. Remove virtually all the supernatant, and gently resuspend the pellet in complete medium so as
to bring the total volume of the resulting cell suspension to 1 ml.
12. Plate the cells in 100x20 mm culture dishes (volume,) in order to have the quantity of cells
corresponding to 5 brains per dish and incubate in 10 ml of fresh complete medium.
13. Incubate at 37°C, 5% CO2 in a humidified incubator for 12 h.
95
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Splitting of the rat, mouse and porcine NSPCs
1. After 12 h in complete medium, transfer culture dishes to the hood. Using a 10 ml pipette, aspire
half of the medium and rinse 2 times to remove all the cells.
2. Collect the medium containing the floating cells into a 50 ml Falcon tube and pellet the cells by
centrifugation at 50g for 10 min at RT.
3. Suck off the supernatant and gently resuspend the cells in fresh serum-free defined medium.
4. Plate the cells in 100x20 mm culture dishes in order to have the quantity of cells corresponding to
1 brain per dish (1:5 split) and incubate in 10 ml of fresh defined medium.
5. Add bFGF at 25 ng/ml.
6. Incubate at 37°C, 5% CO2 in a humidified incubator.
7. Add bFGF every two days to stimulate the proliferation of NSPC as spherical clusters. These
primary neurospheres should be ready for subculture 5 days after initial plating.
8. At day 5, bring culture dishes to the hood. Collect the medium containing the neurospheres and
transfer it to a 50 ml Falcon tube, pulling the cells from each culture dish.
9. Pellet the cells by centrifugation at 50g for 10 min at RT and resuspend the neurospheres in 1 ml
of fresh defined medium. Dissociate mechanically the neurospheres by gently pipetting up and down
in order to get a homogenous cell suspension.
10. Plate the cells in new 100x20 mm culture dishes (1:2 split). Add bFGF as required and incubate in
10 ml of fresh defined medium.
11. Incubate at 37°C, 5% CO2 in a humidified incubator for another 5 days to allow the formation of
secondary neurospheres (Fig. 1). Renew the addition of bFGF at day 7.
Differentiation of rat NSPCs
1. In a tissue culture hood, place sterile glass coverslips in a 12 well plate (see note 2).
2. Incubate coverslips in 50 µg/ml poly-L-ornithine (PORN) in sterile water for 2 h at 37°C in a tissue
culture incubator.
3. Rinse PORN-coated coverslips with PBS and plate undissociated or mechanically dissociated rat
neurospheres onto PORN-coated coverslips at a density of 200 neurospheres/well or 2.105 cells/cm2,
respectively, in 1 ml of complete medium.
4. Incubate the plate in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2 and allow cells to adhere to the
coverslips for 12 h (a minimum of 2 h is usually required).
5. After 12 h, replace the complete medium with 1 ml of defined medium.
6. Incubate the plate in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2 and allow cells to differentiate. After
7 days, individual neurospheres should have dispersed in such a manner so as to appear as a
flattened monolayer of cells (Fig.1).
96
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
7. Proceed to fix the cells by adding 4% paraformaldehyde in PBS. After 15 min at room temperature,
wash the cells 3 times with PBS, and add 1 ml of PBS containing 0.1% Sodium Azide. Store the plate
at 4°C until the immunostaining is performed (see note 3).
Characterization of rat NSPCs by immunocytofluorescence (Fig.1).
1. Wash the cells once with PBS to eliminate the traces of sodium azide.
2. Incubate the cells with PBT-NGS, a permeabilizing/blocking solution (1X PBS, 4% BSA, 0.1%
Triton X-100, and 10% normal goat serum, NGS) for 1 h at RT (see note 4).
3. Dilute the primary antibodies in PBT (Nestin: 1/1000; GFAP: 1/800; TUJ-1: 1/1000; RIP: 1/3000).
Place 300 µl of diluted primary antibody per well and incubate at 4°C overnight.
4. Wash the cells 3 times with PBS, 5 min each time.
5. Dilute the secondary antibody in PBT (FITC-conjugated goat anti-mouse IgG: 1/250). Place 300 µl
of diluted secondary antibody per well and incubate 2 h at RT in the dark.
6. Wash the cells 3 times with PBS, 5 min each time.
7. Mount the coverslips on a slide with mounting medium (Dabco) to minimize photobleaching (10 µl
per 20 mm coverslip).
8. Analysis of the slides is performed on an Axioskop 2 plus microscope (Zeiss). Micrographs are
acquired with a 20x and 63x objectives using a digital camera (AxioCam HRC, Zeiss) driven by
AxioVision Release 4.2 software.
9. Slides are stored at -20°C.
Analyse of the impact of NSPCs on T cell proliferation (Fig.2)
1. Preparation of the assay plates. Prepare a 5 µg/ml solution of anti-CD3 in sterile PBS for the coating
of assay plates. Calculate the number of wells required for each experimental condition and consider
triplicate samples for each condition. Dispense 30 µl of the anti-CD3 antibody solution to each well of
a flat-bottom 96-well assay plate. Control wells are prepared by adding 30 µl of sterile PBS. Incubate
the plate 2 h at 37°C.
2. Isolation and purification of T cells. T cells are obtained from 6 to 8 week-old female SpragueDawley rats (Janvier). After sacrifice, the animals are splenectomised. The spleens are then placed in
sterile cold PBS before isolation and purification of rat T cells (17).
3. Under a sterile cell culture hood, pour the spleen and the medium in a cell culture dish. Cut the
spleen in several pieces using a scalpel and transfer them into a sterile 70 µm filter (BD Biosciences)
placed in a dish.
4. Using the plunger of a 5 ml syringe, grind the spleen until a fine suspension is obtained.
97
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
5. Transfer the spleen-cell suspension to a 50 ml Falcon tube and complete to 50 ml volume with
sterile PBS. Centrifuge at 900 g for 10 min at 4°C.
6. Eliminate the supernatant and resuspend the pellet with 8 ml of red cell lysis solution. Incubate for
8 min at 4°C.
7. Add 42 ml of PBS and centrifuge at 900 g for 10 min at 4°C. Resuspend the pellet with 10 ml of
PBS/ SVF (2%)/ EDTA (0.5 mM). Count the cells.
8. Incubate the cells for 15 min at 4°C with specific mAbs (clones 3.2.3 (0.7 µg/ml), HIS24 (1 µg/ml),
and OX42 (0.5 µg/ml) to deplete NK cells, B cells, and monocytes, respectively. Centrifuge the cells at
900 g for 10 min at 4°C.
9. Resuspend the pellet with 2.5 ml of PBS/SVF/EDTA and incubate the cells with 500 µl magnetic
anti-mouse IgG-coated Dynabeads (Invitrogen) for 20 min at 4°C on a wheel.
10. Preparation of irradiated NSPC. During this time, transfer the NSPCs to 50 ml Falcon tubes and
submit them to γ-irradiation (30 Gy). Irradiation is performed by the Etablissement Français du Sang
(EFS, Nantes). Centrifuge NSPCs at 50 g for 10 min at 4°C and gently resuspend the pellet with 1 ml of
defined medium using a P1000 to dissociate mechanically the neurospheres. Count the cells and
adjust the concentration to 2x106 cells/ml. Perform 1:4 dilution to obtain another set of irradiated
NSPCs at the concentration of 5x105 NSPCs/ml.
11. Preparation of T cell suspension. Collect purified T cells from splenocytes using a magnet and
centrifuge the cells at 900g for 10 min at 4°C. Resuspend the pellet in 1 ml RPMI medium. Count the
cells and adjust the concentration to 2x106 T cells/ml.
12. Preparation of the assay plates. Remove the anti-CD3 antibody solution of the flat-bottom 96-well
assay plate with a multi-channel pipettor. Rinse each well three times with 150 µl of sterile PBS.
Discard PBS.
13. Cocultures of T cells with increasing number of NSPCs. In each well, add 50 µl of T cell suspension
at 2x106 cells/ml. Then, performed a rising scale by adding no NSPCs (ratio NSCPCs/Tcells: 0/1), 50
µl of NSPCs at 5x105 cells/ml (ratio NSPCs /T cells: 1/4) or 50 µl of NSPC at 2x106 (ratio NSPC /T
cells: 1/1). Complete to a final volume of 200 µl with a mix of defined medium and RPMI medium
(vol/vol:1/1).
14. Stimulation of T cells. Add anti-CD28 antibody (final concentration: 5 µg/ml) to the wells
15. Incubate the plates for 72 h at 37°C with 5% CO2 in a humidified incubator.
16. Analyse of T cell proliferation. Add 25 µl of [3H]thymidine to each well (0.625 µCi/well) and
incubate the plates for 12 hours at 37°C, 5% CO2 in a humidified incubator. Harvest the cells on
fiberglass filters using a harvester (Tomtec) and measure radioactivity by standard scintillation
technique.
98
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Notes
1. The dissection should be performed as quickly as possible (within 2 h), as the tissue becomes soft
and sticky over time.
2. German glass coverslips are preferable for the culture of primary neural stem cells. To obtain
sterile coverslips, dip the coverslips in a culture dish containing a solution of 70% ethanol for 5 min.
Dry coverslips at RT for 30 min in a sterile cell culture hood.
3. When removing the solutions from the wells, be careful that suction does not dry out the cells.
4. As the antibodies are directed against intracellular antigens, the cell membranes are
permeabilized with a detergent (Triton X-100). Non-specific binding of the antibodies is prevented
by treating the cells with blocking agents such as BSA and NGS.
Acknowledgement
The authors are very grateful to Dr I. Anegon and Dr .Vanhove for their helpful advices. We also
gratefully acknowledge Dr P. Brachet and Pr. J-P Soulillou for their support and encouragement. We
also express special thanks to “Etablissement Français du Sang” (EFS, Nantes) that kindly irradiated
the NSPCs. The Nestin monoclonal antibody was developed by Susan Hockfield and obtained from
the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and
maintained by the University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. The
work was supported by the “Association Française contre les Myopathies” (AFM), the “Fédération
des Groupements de Parkinsoniens” and Progreffe. V.Bonnamain was supported by a fellowship from
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche.
99
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Fig 1. Culture of rat NSPCs. (A). Proliferation (a, b). NSPCs plated on uncoated dishes were grown as
floating neurospheres for 10 days in defined medium supplemented with bFGF. Optical microscopy
pictures were acquired with a 4x (a) or 10x (b) objectives. Differentiation (c, d). NSPCs plated onto
polyornithine-coated glass coverslips, were allowed to differentiate for 7 days in defined medium
free of growth factor. Optical micrographs were acquired after 4 days (c) or 7 days (d) of
differentiation using a 10x objective. Analyse of NSPC multipotency (B). After 10 days of
proliferation, whole neurospheres (a, c, e, g) or mechanically dissociated neurospheres (b, d, f, h)
were placed in differentiation conditions for 7 days to analyse the fate of rat NSPCs.
Immunocytofluorescence was performed using primary antibodies directed against Nestin (a, b),
GFAP (c, d), Tuj-1 (e, f) and RIP (g, h) and immunostaining was revealed with a FITC-conjugated antimouse IgG (a-h). Optical micrographs were acquired with 10x (a, c, e, g) or 63x (b, d, f, h) objectives
using a digital camera (Zeiss).
100
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Fig 2. Modulation of T cell proliferation by NSPCs. Purified rat T cells (105 cells/well) were
stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies in the absence (0/1) or the presence of 2.5 x 104 (1/4) or
105 (1/1) irradiated (30 Gy) mouse (a), rat (c) or pig (e) NSPC per well. T cell proliferation was
determined by analysing [3H]thymidine incorporation at day 3. Shown are means ± SEM of triplicate
wells from 6 (a), 17 (c) and 7 (e) independent experiments. Statistical analysis: Kruskal-Wallis test
followed by Dunn’s multiple comparison test. *: p<0,05 ; **: p<0,001 ; ***: p<0,0001 versus the
control (stimulated T cells in the absence of NSPCs.
101
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
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102
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Informations complémentaires
L’originalité du protocole de co-culture que nous avons mis au point pour étudier les
intéractions in vitro entre les lymphocytes T activés et les cellules souches/progénitrices neurales,
réside dans la composition particulière du milieu de culture. En effet, alors que dans la littérature la
majorité des protocoles de co-culture utilisent le milieu de culture classique des lymphocytes T
(RPMI 10% SVF), nous avons choisi de placer les cellules dans un milieu de culture hybride, composé
à 50% de RPMI 5% SVF et à 50% de milieu défini N2 (milieu de culture classique des CSPN). Au final,
notre co-culture se déroulait donc dans un milieu RPMI : N2 (1 :1) supplémenté avec 2,5% de sérum.
Notre objectif était de maintenir les lymphocytes T dans un environnement propice à leur survie et à
leur prolifération, tout en maintenant le caractère indifférencié des CSPN en réduisant au maximum
le pourcentage de sérum.
Afin de vérifier que notre milieu RPMI/N2 2.5% SVF n’était pas délétère pour la prolifération
des lymphocytes T activés, nous avons étudié, par incorporation de thymidine tritiée, la réponse
proliférative de lymphocytes T purifiés à partir de cellules spléniques de rat Sprague-Dawley, activés
par une stimulation anti-CD3/CD28 et cultivés pendant 72h dans leur milieu classique RPMI 10%
SVF. Nous avons alors comparé ces résultats à la réponse proliférative des mêmes lymphocytes T
purifiés et activés, mais cultivés pendant 72h dans notre milieu RPMI/N2 2.5% SVF (Fig. 24).
Figure 24 : Etude de la prolifération des lymphocytes T activés en fonction du milieu de
culture. Des lymphocytes T de rat Sprague-Dawley ont été purifiés à partir de cellules spléniques,
activés par stimulation anti-CD3/CD28, et cultivés pendant 72h dans du milieu RPMI 10% SVF (milieu
classique de culture des lymphocytes T), ou dans un milieu hybride composé à 50% de milieu RPMI 5%
SVF et à 50% de milieu N2 : milieu RPMI/N2 2.5%. La thymidine tritiée a été ajoutée pendant les 12
dernières heures de culture et son taux d’incorporation a été mesuré (cpm). n=3. Test statistique U de
Mann et Whitney.
103
________________________________________________________________
__________________________________________________________
__________________________ Matériels et Méthodes
Ces résultats nous ont permis de constater que le milieu RPMI/N2 2.5% SVF ne modifie pas
significativement
vement la prolifération des
de lymphocytes
hocytes T stimulés de rat, malgré une légère diminution
des cpm relevés dans cette condition.
Des photographies en microscopie optique ont été prises après 72h de co-culture
co
(Fig. 25).
Les lymphocytes
cytes T naïfs sont de petites cellules qui, sous l’effet d’une stimulation antigénique ou
polyclonale, se transforment
forment en de grandes cellules blastiques regroupées en clusters. L’observation
des puits de co-culture
culture de CSPN et de lymphocytes T a montré que les CSPN restaient bien sous
forme de neurosphères indifférenciées, probablement grâce à la faible teneur en sérum du milieu et à
l’absence de coating des puits. D’autre part, il a été observé que les lymphocytes T stimulés formaient
des clusters en périphérie
érie des neurosphères, suggérant l’établissement de contacts cellulaires entre
les deux types de cellules.
Figure 25 : Morphologie des lymphocytes T de rat naïfs ou stimulés, cultivés
cult
en présence ou
non de CSPN de rat irradiées (30 Gy),
Gy) après 72h de culture
ulture dans du milieu RPMI/N2 2.5% SVF.
Les photographies ont été prises en microscopie optique au grossissement x20 et sont représentatives de
3 expériences indépendantes.
Malgré les résultats obtenus en thymidine tritiée sur la prolifération non modifiée
modi
des
lymphocytes T de rat cultivés en condition RPMI/N2 2.5% SVF par rapport au milieu de culture
classique RMPI 10% SVF, nous avons tout de même étudié
étudi l’effet de notre milieu hybride sur une
éventuelle mort cellulaire par apoptose des lymphocytes T. Pour ce faire, des cellules T de rat
Sprague-Dawley
Dawley ont été purifiées à partir de la rate, stimulées par des anticorps anti-CD3/CD28,
anti
et
cultivées dans les deux différents milieux. Au bout de 72h, les cellules ont été collectées, et analysées
en cytométrie en flux
ux pour un double marquage Annexine V/Iodure de propidium (IP) (Fig. 26).
L’annexine V est une molécule capable de reconnaitre la phosphatidyl-sérine
sérine externalisée au cours
du processus apoptotique.. Dans les étapes plus tardives de l’apoptose, la membrane
memb
devient
perméable, ce qui permet à l’IP,
l’IP qui est un intercalant de l’ADN, de pénétrer dans le noyau. Ainsi le
marquage Annexine V+/IP- correspond à l’entrée en apoptose des cellules, tandis que les cellules
Annexine V+/ IP+ sont des cellules en apoptose
apopto très tardive ou en nécrose.
104
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Figure 26 : Etude de l’impact de la composition du milieu de culture sur la mort cellulaire des
cellules T activées. Les lymphocytes T de rat Sprague-Dawley purifiés à partir de la rate ont été
stimulés par des anticorps anti-CD3/CD28 et cultivés dans du milieu RPMI 10% SVF ou RPMI/N2 2.5%
SVF. Après 72h de culture, les cellules ont été doublement marquées par l’annexine V et l’iodure de
propidium (IP), et analysées en cytométrie en flux, afin de comparer le taux de cellules apoptotiques
dans les deux conditions. n=3.
Les analyses statistiques (Test U de Mann et Whitney) effectuées n’ont pas permis de mettre
en évidence une différence significative dans le pourcentage de cellules Annexine+/IP- entre les deux
conditions. Il en a été de même pour les cellules Annexine+/IP+, malgré une légère augmentation du
nombre de cellules dans un stade apoptotique tardif après culture dans le milieu RPMI/N2 2.5%.
Ces résultats ont été reproduits en utilisant des cellules issues de ganglions lymphatiques de
rats Lewis 1A (riches en lymphocytes T), activées par une stimulation mitogénique à la
Concanavaline A et cultivées pendant 72h dans du milieu RPMI 10% SVF, RPMI/N2 2.5% SVF et dans
du milieu N2 seul (Fig. 27). Le marquage Annexine V/IP n’a pas permis de mettre en évidence de
différences dans le taux d’apoptose des cellules cultivées dans les deux premiers milieux. En
revanche, lorsque les cellules ganglionnaires ont été cultivées en milieu N2 seul, nous avons obtenu
25% de cellules positives pour le marquage Annexine+/IP- et plus de 30% de cellules doublement
marquées. Ces résultats indiquent clairement que le milieu N2, approprié pour la culture de CSPN et
ne contenant pas de sérum, ne convient pas à la culture des lymphocytes T, qu’ils proviennent des
ganglions (Fig.27) ou de la rate (résultats non montrés).
105
__________________________________________________________________________________________ Matériels et Méthodes
Figure 27 : Etude de l’impact de la composition du milieu de culture sur la mort cellulaire des
cellules ganglionnaires activées. Les cellules ganglionnaires de rat Lewis 1A ont été stimulées par la
concanavaline A et cultivées dans du milieu RPMI 10% SVF, RPMI/N2 2.5% SVF ou N2 seul. Après 72h
de culture, les cellules ont été doublement marquées par l’annexine V et l’iodure de propidium (IP), et
analysées en cytométrie en flux, afin de comparer le taux de cellules apoptotiques dans les trois
conditions. n=1.
L’ensemble de ces expériences a confirmé que notre milieu hybride RPMI/N2 2.5% SVF est
tout à fait adapté pour analyser les interactions in vitro entre les lymphocytes T et les CSPN. En effet,
il permet de maintenir le caractère indifférencié des CSPN grâce à un faible taux de sérum, tout en
créant un environnement favorable à la survie et à la prolifération des lymphocytes T.
106
RESULTATS
107
ARTICLE 1
Trophic and immunoregulatory
properties of neural
stem/progenitor cells: benefit for
intracerebral transplantation
Delphine Michel-Monigadon*, Virginie Bonnamain*, Véronique Nerrière-Daguin,
Anne-Sophie Dugast, Xavier Lévèque, Martine Plat, Eric Venturi, Philippe Brachet,
Ignacio Anegon, Bernard Vanhove, Isabelle Neveu and Philippe Naveilhan.
* Contribution équivalente.
--- Soumis ---
108
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
1. Introduction
La transplantation neurale est une des stratégies envisagées pour le traitement des maladies
neurodégénératives, en particulier les maladies de Parkinson et de Huntington, qui sont
caractérisées sur le plan pathologique par la perte spécifique de cellules des ganglions de la base
(Björklund 2000). La thérapie cellulaire de remplacement pour ces maladies est passée du stade
expérimental aux essais cliniques chez l’homme, en utilisant des neuroblastes fœtaux humains
(Björklund & Lindvall 2000 ; Bachoud-Lévi et al. 2006). Cependant, les problèmes éthiques et
logistiques liés à la manipulation de tissu fœtal humain ont conduit à chercher des sources cellulaires
alternatives parmi lesquelles deux des plus prometteuses sont les cellules dérivées d’une autre
espèce que l’hôte (cellules xénogéniques), et les cellules souches (Björklund et al. 2003). La
transplantation neurale utilisant des cellules dérivées du cerveau porcin offre plusieurs avantages.
D’abord, la facilité d’élevage permet de surmonter les problèmes d’accessibilité à une quantité
suffisante de tissu nerveux. De plus, les avancées du génie génétique ont conduit au développement
de porcs transgéniques (porcs CTLA4-Ig) présentant une susceptibilité réduite au rejet de greffe par
production de CTLA4-Ig, une molécule immunosuppressive (Martin et al. 2005). Enfin, les neurones
porcins s’intègrent très bien dans le tissu hôte et émettent de longs prolongements axonaux qui
pourraient assurer une excellente restauration de la circuiterie nerveuse (Deacon et al. 1994).
Cependant, cette source cellulaire présente certains désavantages, comme l’éventuelle transmission
de zoonoses à l’hôte et surtout le rejet immunologique de la xénogreffe. En effet, la
xénotransplantation intracérébrale, en l’absence d’immunosuppresseurs, fait l’objet d’une puissante
réponse immunitaire qui conduit au rejet des cellules greffées (Barker et al. 2000) et ce, malgré
l’existence de la barrière hémato-encéphalique et du drainage non conventionnel des leucocytes dans
le SNC. L’inflammation provoquée par l’acte chirurgical est corrélée à l’activation rapide des cellules
microgliales résidentes du SNC. Dans les quelques jours qui suivent l’opération, elles adoptent un
phénotyope macrophagique et participent à la réponse inflammatoire en sécrétant différentes
cytokines et chimiokines, dont la protéine chimio-attractante des monocytes (MCP-1 ; Melchior et al.
2002). Cette dernière favorise l’infiltration des leucocytes circulants dans le SNC (Calvo et al. 1996).
Néanmoins, malgré cette synthèse précoce de chimiokines, les leucocytes ne sont pas détectés dans
le parenchyme cérébral de rat dans les premières semaines qui suivent la transplantation de
neurones fœtaux porcins, et c’est seulement entre 5 et 7 semaines post-transplantation que le
processus de rejet s’amorce et que la destruction du greffon se produit (Barker et al. 2000 ; Rémy et
al. 2001 ; Melchior et al. 2002). Cette réaction immune plus tardive est médiée par l’apparition
soudaine, dans le parenchyme cérébral greffé, de macrophages, de lymphocytes T et de cellules
dendritiques (Michel et al. 2006 ; Fig. 28).
109
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Figure 28 : Cinétique d’infiltration de la xénogreffe par les cellules immunitaires activées. En
l’absence de traitement immunosuppresseur, le rejet des neurones fœtaux xénogreffés dans le striatum
de rat fait intervenir les cellules de la lignée macrophagique. Après un pic d’activation de la microglie et
l’infiltration du greffon par des cellules dendritiques dans les premiers jours qui suivent la
transplantation, et qui est très probablement une conséquence de l’acte chirurgical, il se crée un état de
latence, pendant lequel le marquage microglial et dendritique (révélé par les anticorps ED1 et Ox62,
respectivement) devient périphérique au greffon et peut même disparaître entièrement. Autour de la
5ème semaine, le processus de rejet s’amorce brutalement et l’activation microgliale redevient très forte,
autour mais aussi à l’intérieur du greffon. Ce phénomène est corrélé à une infiltration dendritique et
lymphocytaire T massive. Les lymphocytes, qui sont en général indétectables dans un cerveau en
conditions physiologiques normales, peuvent détectés à partir de la 5ème semaine post-transplantation
grâce aux anticorps R73 (marquant le TCRαβ) et Ox39 (marquant le CD25 ou chaîne α du récepteur à
l’IL-2).
Ce rejet systématique des xénogreffes de neuroblastes issus de tissus fœtaux porcins pourrait
être évité en utilisant une source cellulaire indifférenciée moins immunogène, telle que les CSPN
(Armstrong et al. 2001). Notre groupe a donc entrepris d’étudier les éventuels avantages de la
xénogreffe de CSPN porcines, en comparant de façon parallèle la transplantation de neuroblastes
fœtaux et de CSPN de porc dans le striatum de rats sains, en l’absence de traitement
immunosuppresseur (Fig. 29). Pour ce faire, le mésencéphale ventral et le cortex ont été prélevés sur
des fœtus de porc à 28 jours de gestation. La suspension cellulaire de neuroblastes fœtaux porcins a
été préparée à partir du mésencéphale ventral juste avant la greffe, tandis que les CSPN corticales ont
été cultivées pendant 10 jours en présence de bFGF avant leur transplantation. Les protocoles de
préparation cellulaire et de greffe ont été décrits dans l’article présenté au niveau du chapitre
« Matériels et Méthodes » de ce manuscrit.
110
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Figure 29 : Schéma du protocole utilisé pour l’étude comparative de la xénotransplantation de
neuroblastes fœtaux porcins et de cellules souches/progénitrices neurales (CSPN) porcines dans le
cerveau de rat non lésé, non immunosupprimé.
Les animaux ont été sacrifiés à 8, 28, 42 et 63 jours après l’opération pour évaluer la survie
de la greffe et comparer la réponse immunitaire induite par les neuroblastes et les CSPN. Les
expériences de transplantation et de marquages immunohistochimiques des coupes de cerveaux ont
été réalisées par Delphine Michel-Monigadon, co-premier auteur de cet article. Les analyses ont
révélé une survie prolongée des greffes de CSPN comparée à celles des neuroblastes. En effet, 40%
des rats greffés avec des CSPN possédaient un greffe saine à J63, avec de nombreuses cellules
positives pour NF70 (neurofilament porcin, spécifique des neurones de porc), alors que toutes les
greffes de neuroblastes avaient été rejetées à ce stade. De plus, le comptage des cellules positives
pour la tyrosine hydroxylase (TH) à l’intérieur du greffon a montré que contrairement aux
neuroblastes, les CSPN se différencient très peu en neurones dopaminergiques. En effet, malgré
l’apparition de fines fibres nerveuses TH+ à J42 et de la présence d’un réseau dense de fibres TH+ à
J63, aucun corps cellulaire TH+ n’a pu être détecté au sein des greffons de CSPN. Puisque le striatum
est naturellement innervé par les axones des neurones dopaminergiques situés dans la substance
noire, il est possible que ces fibres proviennent de l’hôte et non de la différenciation des CSPN
transplantées. Ainsi, outre leur capacité de survie prolongée dans le cerveau d’un hôte xénogénique,
111
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
les CSPN porcines pourraient posséder des propriétés particulières de différenciation et surtout
exercer une forte activité neurotrophique.
Par ailleurs, aucun signe d’inflammation ni de prémisse d’infiltration lymphocytaire T n’a été
observé au sein des greffes de CSPN non rejetées comme l’indique l’absence de marquage ED1 et de
cellules R73+, ce qui suggère une différence dans la réponse immune induite par les neuroblastes et
les CSPN de porc. La réponse cellulaire T étant une composante majeure du rejet des xénogreffes
intracérébrales (Okura et al. 1997), nos observations associées au nombre croissant de travaux
imputant des propriétés immunomodulatrices aux cellules souches comme les cellules souches
mésenchymateuses et embryonnaires (Zappia et al. 2005; Fandrich et al. 2002), nous ont conduit à
étudier in vitro les éventuelles interactions existant entre les CSPN fœtales de porc et les
lymphocytes T de rat. Pour ce faire, nous avons établi un protocole original de co-culture de CSPN et
de lymphocytes T, dont la description détaillée est disponible en section « Matériels et Methodes » de
ce manuscrit.
112
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
2. Article
Trophic and immunoregulatory properties of neural stem/progenitor cells: benefit
for intracerebral transplantation
Delphine Michel-Monigadon1.2.3.6, Virginie Bonnamain1.2.3.6, Véronique Nerrière-Daguin1.2.3,
Anne-Sophie Dugast1.2.3, Xavier Lévèque1.2.3., Martine Plat4, Eric Venturi5, Philippe
Brachet1.2.3, Ignacio Anegon1.2.3, Bernard Vanhove1.2.3, Isabelle Neveu1.2.3.6 and Philippe
Naveilhan1.2.3.6.*.
1, INSERM, UMR643, Nantes, France.
2, CHU de Nantes, ITERT, Nantes, France.
3, Université de Nantes, UFR de Medicine, Nantes, France.
4,
INRA,
UMR85
INRA-CNRS-Université
de
TOURS-Haras
Nationaux,
P.R.C.,
Nouzilly, France
5, INRA, UEPAO, Nouzilly, France
6, equal contribution
Corresponding author: Naveilhan P., INSERM U643, 30 Bd Jean Monnet, 44 093 Nantes cedex
01,
France.
Tel :
+33
(0)240087414 ;
Fax :
+33
(0)240087411 ;
e-mail :
[email protected]
Key words: axonal growth, brain repair, differentiation, immunosuppression, rejection,
neural stem cells, T cells, neurotrophic, Parkinson’s disease, xenotransplantation
Title : 108
Abstract : 243 words
113
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Abstract
Intracerebral xenotransplantation of porcine fetal neuroblasts (pNB) is considered as an
alternative to human neuroblasts for the treatment of neurodegenerative diseases. However, pNB
are systematically rejected, even in an immunoprivileged site such as the brain. Within this
context, neural stem/progenitor cells (NSPC), which were suggested as exhibiting low
immunogenicity, appeared as a useful source of xenogeneic cells. To determine the advantage of
using pNSPC in xenotransplantation, pNB and pNSPC were grafted into the striatum of non
immunosuppressed rats. At Day 63, all the pNB were rejected while 40% of the rats transplanted
with pNSPC exhibited large and healthy grafts with numerous pNF70-positive cells. The absence
of inflammation at Day 63 and the occasional presence of T cells in pNSPC grafts evoked a weak
host immune response which might be partly due to the immunosuppressive properties of the
transplanted cells. T cell proliferation assays confirmed such a hypothesis by revealing an
inhibitory effect of pNSPC on T cells through a soluble factor. In addition to their
immunosuppressive effect, pNSPC display particular properties in terms of cell differentiation and
neurotrophic activities. Indeed, in contrast to pNB, very few pNSPC differentiated into tyrosine
hydroxylase-positive neurons but the cells triggered an intense innervation of the striatum by rat
dopaminergic fibers coming from the substantia nigra. Further experiments will be required to
optimize the use of pNSPC in regenerative medicine but here we show that their
immunomodulatory and neurotrophic activities might be of great interest for restorative
strategies.
114
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Introduction
Neural transplantation is a promising strategy to restore cell function in the human central
nervous system (CNS). However, the limited access to human fetal neurons and the ethical concerns
regarding their use have fuelled a search for alternative sources of transplantable cells. Among these,
cells derived from pig embryos are of great interest (1, 2). Fetal pig neurons have the capacity to
develop large axons (3) and small-scale clinical trials indicate that neural cells isolated from porcine
fetal brains integrate the host tissue after their transplantation into the brain of immunosuppressed
patients (4-6). For this reason, fetal porcine neurons have numerous advantages in addition to their
wide availability. Their use as donor cells is however highly limited by the host immune response. As
such, in the absence of immunosuppressors, fetal porcine neurons are rejected within 5-7 weeks
post-transplantation (7-9). The rejection process is accompanied by an infiltration of the graft by
microglial and dendritic cells, and a sudden appearance of T lymphocytes (7-9). This coincides with a
marked accumulation of transcripts encoding monocyte chemoattractants such as MCP-1 and
RANTES, as well as proinflammatory lymphokines and Th1 cytokines (7, 8, 10). Continuous exposure
to high doses of cyclosporine A or treatments with several immunosuppressors prolong the survival
of intracerebral xenografts (4, 5, 11, 12) but few xenogeneic neurons survive and systemic
treatments with immunosuppressors produce severe secondary effects (13). Progress has therefore
to be made in order to control cell rejection even in a relatively immunoprivileged site such as the
CNS (14).
Genetic modifications of porcine neurons are currently performed to evaluate the advantage
of a local production of immunosuppressive molecules such as CTLA4-Ig (15). Transplantation of
multipotent stem cells is another alternative. Xenogeneic mesenchymal stem cells or expanded
neural progenitors show long-term survival in the brain of immunocompetent animals (16, 17). Such
lengthy survival has been partially attributed to the low immunogenicity of multipotent cells (16,
18), but recent evidence points to the sizeable immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells
(for review, see (19-22)). Neural progenitor cells (NSPC) may also display such immunoregulatory
properties. In 2005, Pluchino et al., showed that syngeneic NSPC systemically injected in a mouse
model of multiple sclerosis promoted neuroprotection by immunomodulatory mechanisms (23, 24).
If porcine NSPC (pNSPC) exhibit such immunoregulatory properties, their use would be of great
interest for restorative strategies. In fact, NSPC derived from fetal or adult pig brains could be easily
expanded upon treatment with bFGF, providing an indefinite source of transplantable cells. Like
human NSPC, porcine NSPC are able to generate the three major neural lineages -oligodendrocytes,
astrocytes and neurons- both in vitro and following transplantation in vivo (25, 26). In addition,
experimental work on immunosuppressed rats has shown a good differentiation of pNSPC into
neurons with the formation of synapses and the extension of fibers (25).
115
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
In the present paper, we show that pNSPC are a valuable source of donor cells, displaying
immunosuppressive properties while also producing a trophic effect upon the host dopaminergic
system.
116
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Materials and Methods
Cell preparation
Porcine embryos were obtained from Large White domestic pigs, 28 days after artificial
insemination. Animals were obtained from the Institut National de la Recherche Agronomique (INRA,
Nouzilly, France) and killed in the institute’s accredited slaughterhouse. After hysterectomy, the
embryos were collected and washed in Hank’s balanced salt solution (HBSS; Life technologies Ltd)
before dissection of the brain tissue.
Porcine neuroblasts (pNB) were prepared from G28 brains as previously described (8). After
dissection, the pieces of brain tissues were kept in a hibernation medium for up to three days. One
hour before intracerebral transplantation and freed of meninges, the brain tissues were incubated in
0.5 mg/mL trypsin for 20 min at 37°C. After addition of 10% FCS, tissues were washed and incubated
for 10 min at 37°C in HBSS supplemented with 0.01% DNAse. Cells were dissociated by gentle
trituration, and centrifuged at 750 RPM for 10 min. The pellet was resuspended in HBSS containing
0.1 mg/ml DNAse I. The viability was assessed by eosin exclusion and the cell suspension was
adjusted to a concentration of 2x105 cells/µl.
Porcine progenitor cells (NSPC) were prepared and analyzed from G28 brains as previously
described (27). Briefly, brain tissues freed of meninges were incubated with 0.5 mg/mL trypsin
(Sigma-Aldrich) for 15 min at 37°C. Following addition of 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma-Aldrich),
tissues were exposed to 0.1 mg/ml of DNase I (Sigma-Aldrich) prior to mechanical trituration.
Aggregates were removed by decantation and cells were further purified from small debris by
centrifugation. NSPC were plated in uncoated dishes in basal culture medium composed of
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) and Ham’s F12 (1/1, v/v) (Life technologies Ltd.) with
33 mM glucose, 5 mM HEPES (pH 7.2), 2 mM L-glutamine, 5 µg/ml streptomycin and 5 UI/ml
penicillin (AS-basal medium), supplemented with 10% FCS (AS-FCS medium). The following day, the
floating cells were recovered, washed and resuspended in AS-basal medium supplemented with N2
(Invitrogen, Cergy Pontoise, France; AS-N2 medium). The cells were then plated in uncoated dishes
and expanded as neurospheres for 10 days in the presence of 25 ng/mL basic fibroblast growth
factor (bFGF) with a complete change of the N2 medium after 5 days of culture, and addition of bFGF
every 3 days. One hour prior to intracerebral transplantation, the cells were mechanically dissociated
and adjusted to a concentration of 2 x 105 cells/µl, as described for the porcine neuroblasts. To
analyze the fate of pNSPC in vitro, mechanically dissociated neurospheres were transferred to polyL-ornithine-coated (PORN, 50µg/ml, Sigma-Aldrich) glass coverslips and incubated in AS-FCS
medium overnight. The following day, the medium was changed and the cells were allowed to
differentiate for 7 days in AS-N2 medium without bFGF.
117
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Animals and surgical procedures
Male Lewis 1A rats (250 g) purchased from Janvier CERJ (Rouen, France) were manipulated in
compliance with the ethical rules and guidelines of the Institut National de la Santé et de la
Recherche Médicale (INSERM). These were housed at 22°C, under 12 hr light / 12 hr dark conditions
with ad libitum access to food and water. As previously described (9), animals were anesthetized
with an intramuscular injection of 2% Rompun (0.3 ml/kg) and 50 mg/ml ketamine (1.3 ml/kg)
(PanPharma, Fougères, France) before being held in a stereotaxic frame (Stoelting, Wood Dale, IL,
USA). After partial skull removal, pNB or pNSPC were transplanted unilaterally at the following
coordinates according to the bregma and the pial surface: anterior, +0.7 mm; lateral, -2.8 mm;
ventral, -5.4 mm and -5.8 mm; incisor bar, -3.3 mm. Cells were injected with a 10-µl Hamilton
syringe, mounted on an automated microinjector (Phymed, Paris, France). Each site received 1 µl of a
suspension at 2x105 cells/µl, over a period of 1 min. After 4 minutes, the syringe was gently
withdrawn, the pieces of cranial bone were replaced on the skull, and the skin incisions were sewn.
Animals received a total of 4 x 105 pNSPC or pNB per hemisphere.
A lesion of nigral dopaminergic neurons was induced by unilaterally injecting the neurotoxin 6hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle. The rats anesthetized with
intraperitoneal injection of Rompun/ketamine (1.6 ml/kg) were placed in a stereotaxic frame
(Stoelting, Wood Dale, IL). The neurotoxin dissolved in 0.1% ascorbate / saline (3 µg/µl) was then
injected unilaterally (0.5 µl/min) as a single dose of 12 µg at the following coordinates (in mm
relative to the bregma and the surface of the dura mater): anterior (A) = -4.4; lateral (L) = - 1.2;
ventral (V) = - 7.8; tooth bar at - 3.3. At the indicated times, the rats were deeply anesthetized to
perform transcardiac perfusion with 200 ml of 0.9% NaCl, followed by 200 ml of cold 4%
paraformaldehyde (PFA) in phosphate-buffered saline (PBS). Brains were cryoprotected by a
successive immersion in 15% and 30% sucrose. Following this, they were gently frozen in cold
isopentane (-35°C) and stored at
-80°C. Sections of 16 µm were prepared using a cryostat (Leica,
France). The slides were stored at -80°C.
Immunostaining
Immunocytochemistry. Cells plated onto poly-ornithine-coated coverslips were fixed with 4%
paraformaldehyde in PBS for 15 min, saturated for 30 min in PBT-NGS (1X PBS, 4% bovine serum
albumin 0.1% triton and 10% normal goat serum) and then incubated overnight at 4°C with
antibodies diluted in PBT raised against GFAP (Sigma-Aldrich, 1/500), NF70 (clone DP5; Université
Paris 7, France), or tyrosine hydroxylase TH (Pel Freeze, Rogers, Ark, USA). After several washes,
cells were incubated for 1h at room temperature with fluorescein (FITC)-conjugated anti-mouse or
118
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
anti-rabbit IgG (Jackson Immunoresearch, Cambridgeshire, United Kingdom) diluted in PBS-4% BSA.
The cells were then mounted in DABCO anti-fading medium (Sigma-Aldrich).
Immunohistochemistry. Adjacent sections were left for 10 min at RT and fixed for 15 min with
chilled 4% PAF in PBS, pH 7.4. After washes, endogenous peroxidases were saturated with H2O2 at
0.3% in PBS, at RT. After three further washes in PBS, slides were incubated for about 30 min in PBS
containing 4% bovine serum albumin and 10% normal goat serum. Slides were then exposed
overnight at 4°C to anti-NF70, anti-TH, anti-nestin (rat 401; Developmental Studies Hybridoma Bank,
Iowa City, IA), ED1 or R73 (European Collection of Cell Culture, Salisbury, UK) Abs. The antibodies
were diluted in PBS containing 4% BSA and 0.1% triton except for ED1 and R73 staining from which
the triton was omitted. After several washes, the slides were incubated with biotinylated anti-mouse
or anti-rabbit antibodies before their exposure to the avidin-biotin-peroxidase complex (Vectastain
ABC kit, Vector). For single labeling, the very intense purple (VIP, Vector ABC kit) was used as
substrate. For double labeling, we used diaminobenzidine (DAB, Vector) on its own (grey staining) or
with NiCl (Black staining). Slides were dehydrated and mounted with Eukitt (Labonord, Villeneuve
d’Ascq, France). Brain sections were observed using an Axioskop 2 plus microscope (Zeiss).
T cell proliferation assay
T cells were isolated from the spleens of Sprague-Dawley rats as previously described (28). For
polyclonal stimulation, T cells were incubated with 5 µg/ml anti-CD28 antibody in flat-bottom 96well plates previously coated with anti-CD3 (0.5 µg/ml; 2 h at 37°C). For the proliferation assay,
polyclonally stimulated T cells (105) were mixed with irradiated (30 Gy) or non irradiated porcine
NSPC seeded in triplicate in 96-well flat-bottom culture plates. The cells were cocultured for 3 days
in AS-N2 / RPMI 1640 (1:1) supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 0.1 mg/ml
streptomycin, 5% heat-inactivated FCS, 1% non essential amino acids, 5 mM HEPES, 1 mM sodium
pyruvate, and 1 µM 2-ME. [3H] thymidine (Amersham, 0.625µCi per well) was added to the medium
12 hours before collection of the cells from fiberglass filters using a harvester (Tomtec). For each
condition, [3H]thymidine incorporation was measured in three independent wells by a standard
scintillation technique.
A dose-response was performed by adding 2.5x104, 5x104, 105, or 2x105 irradiated NSPC/ well to 105
stimulated T cells in 96-well flat-bottom culture plates. Inhibition of nitric oxide synthases and
prostaglandin synthesis was performed by treating the cocultured cells with NG-monomethyl-Larginine (L-NMMA, 1.25 mM, Sigma-Aldrich) or indomethacin (10 µM, Sigma-Aldrich), respectively.
For transwell assays, 4 x 105 polyclonally stimulated purified T cells were plated in the lower
chamber of a 24-well Falcon transwell plate (BD Falcon) and cultured for three days with 8 x 105
119
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
irradiated (30 Gy) NSPC seeded in the upper chamber. T cell proliferation was measured as
described above.
Statistical analysis
The graft survival expressed as a percentage of NF70-positive graft in a given group of rats, was
analyzed using a one-side Fisher exact test. The host immune response expressed as the percentage
of graft infiltrated by R73+ cells was analyzed using the Student’s t test. The inhibitory effect of
pNSPC on anti-CD3/CD28-stimulated rat T lymphocytes was analysed using the Kruskal-Wallis test.
When a significant interaction was observed, the data were further analyzed with the Dunn’s
multiple comparison test using GraphPad Prism software (Prism Software Corporation, Orange
County, CA, USA). Differences were defined as statistically significant when p<0.05 (*); p<0.001 (**);
p<0.0001(***).
120
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Results
Survival of porcine neural progenitor cells in the rat brain.
Porcine neural progenitor cells (pNSPC) were isolated from the forebrain of G28 porcine
embryos and expanded as neurospheres for 10 days in the presence of bFGF (Fig. 1a). In
differentiating conditions, the cells attached to the poly-ornithine-coated coverslips and most of
them expressed cell-specific filament such as NF70 (Fig. 1b) or GFAP (Fig. 1c). Immunocytochemistry
using anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibodies indicated a low number of cells expressing this
dopaminergic marker (Fig. 1d).
To analyze the survival of pNSPC in the rat brain, the cells were transplanted into the striatum
of non-immunosuppressed rats. The animals were killed at Days 8, 28, 42 and 63 post-transplantation
(D8, D28, D42 and D63) to compare the survival of pNSPC to that of porcine fetal neuroblasts (pNB)
transplanted in the same conditions (Table 1). The first analyses were performed using a specific
antibody directed against porcine neurofilament (pNF70). As illustrated in Figure 2, the pNB grafts
contained a large number of NF70+ cells at early time-points (D8, Fig.2a) and a dense network of NF70+
fibers was observed at D28 (Fig. 2b) and D42 (Fig. 2c) in non-rejected pNB grafts. At D63 (Fig. 2d), we
did not detect any immunopositive labeling given that all the rats transplanted with pNB had already
rejected their graft at this stage (Table 1). Immunolabeling of the pNSPC grafts was very different. At
D8, very few NF70+ cell bodies were found in the pNSPC transplants and the cells did not extend
processes (Fig. 2e and insert). At D28, certain NF70+ fibers were present inside the graft (Fig. 2f) but
the highest amount of immunopositive fibers was observed at a later time-point such as D42 and D63
(Fig. 2g, h). The high amount of NF70+ fibers at D63 in pNSPC grafts might be partly explained by the
longer survival of these cells in the rat brain as compared to pNB (Table 1). 40% of the rats
transplanted with pNSPC displayed NF70+ grafts by D63 (Fig. 2h, i), while at this stage, all the rats
transplanted with pNB had already rejected their grafts (Fig. 2d, i). The difference in graft survival was
statistically significant at D63 (one-side Fisher exact test, n= 10, * p < 0.05) but certain animals
transplanted with pNB had already rejected their grafts as early as D28 and D42 (Fig. 2i and Table 1).
Characterization of the inflammatory and immune responses after the transplantation of pNSPC into
the rat brain
Rejection of pNB in the rat brain is accompanied by inflammatory and immune reactions (8,
9). As a consequence, immunohistochemical analyses were performed to characterize and compare
the host responses after the transplantation of pNSPC and pNB in the rat striatum. We first analyzed
the expression of nestin, an intermediate filament expressed by reactive astroglial cells (29). For this
purpose, we used the rat 401, an antibody that does not cross react with the porcine form of nestin
121
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
(data not shown). As shown in Figure 3, nestin+ cells were consistently found in the rats transplanted
with pNB on condition that the transplant was present. The immunopositive cells were confined to
the graft (Fig. 3a), but the nestin immunoreactivity spread throughout the striatum as rejection
occurred (Fig. 3b). Subsequently, the staining almost completely disappeared as the graft turned into
a scar (Fig. 3c). The same pattern was observed in the few pNSPC- rejecting grafts (data not shown).
In contrast, in the rats displaying a healthy pNSPC graft, although nestin+ cells were present within
the graft at D28 and 42 (Fig. 3d, e), their number significantly dwindled at later time-points and
almost no immunopositive cells were observed at D63 (Fig. 3f).
The same resting status of the pNSPC transplants was observed using the ED1 antibody
which labels activated macrophages/microglial cells (Fig. 4). After a first invasion of the pNSPC graft
by ED1+ cells at early time-points such as D8 (Fig. 4a), the staining greatly diminished and at D28, a
limited number of ED1+ cells was observed, mostly at the periphery of the transplant (Fig. 4b). The
staining further decreased, becoming very weak at D42 and being almost undetectable at D63 in non
rejecting transplants (n = 4/10; Fig 4c, d). This contrasted with the intense ED1 labeling observed at
D42 in rats rejecting their pNSPC graft (Fig. 4e) and after complete rejection, ED1+ cells were still
observed in the scar at D63 (Fig. 4f), as observed in the case of pNB transplants (data not shown).
Differences were also noticed using an anti-R73 antibody that labels T cells (Fig. 5). At early
time-points such as D8, T cells were rarely detected in the grafted striatum whatever the cell type
transplanted (Fig. 5e). In contrast, at later time-points such as D28 or D42, a massive infiltration of
R73+ cells was observed in numerous pNB-grafted rats (Fig. 5b, e) whereas the presence of T cells in
the striatum of pNSPC-grafted rats remained rare (Fig. 5a, e). At D28 and D42, R73+ cells were
observed in the brain of 40% and 90% of the pNB-transplanted rats respectively, while at the same
stages, no immunopositive cells was detected in the brain of 100% and 90% of the pNSPCtransplanted rats, respectively (Fig. 5e). At D42, only one of the 7 rats transplanted with NSPC
exhibited R73+ cells at the graft site and the complementary analyses clearly indicated that the
corresponding graft was undergoing cell rejection. At D63, only a scar with few R73+ cells persisted
in the rats transplanted with pNB (Fig. 5d). In contrast, the rats transplanted with NSPC exhibited
healthy and large grafts with no R73+ cells (Fig. 5c), except for one animal in which the NSPC-graft
was almost rejected (Fig. 5e). As a result, T cells were only found in two of the 22 rats transplanted
with pNSPC. A double labeling CD8+/R73 indicated that these R73+ cells corresponded to both CD8+
and CD4+ T cells (Fig. 5f).
Immunoregulatory properties of the neural progenitor cells.
The long survival of pNSPC in the rat brain and the weak infiltration of the graft by R73+ cells
raise the possibility that NSPC exert particular immunomodulatory properties. To test this
122
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
hypothesis, naive rat T cells stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies were incubated with
an increasing number of irradiated pNSPC for 3 days (Fig. 6a). A pulse of [3H]-thymidine was
performed during the last 12 hours. Analysis of the cells revealed that the uptake of thymidine by
stimulated T cells was significantly reduced in the presence of pNSPC. The effect was closely
correlated to the number of NSPC. Indeed, co-cultures (pNSPC/stimulated T cells) at ratios of 1:4;
1:2; 1:1 and 2:1 led to 47%, 65%, 87% and 98% inhibition of T cell proliferation, respectively (mean
of 10 experiments). As indicated in Figure 6a, the inhibition of T cell proliferation was statistically
significant for a minimum of 1 pNSPC for 2 T lymphocytes. The inhibitory effect was not due to cell
irradiation since 75% inhibition was observed using non irradiated pNSPC at a 2:1 ratio (Fig. 6c). To
further characterize the mechanisms underlying NSPC effects, the question was asked whether cell
contact was required to inhibit T cell proliferation. For this purpose, T cells were plated in the lower
chamber of a 24-transwell plate coated with anti-CD3 mAb and stimulated with anti-CD28 mAb.
Then, T cells were cultured for three days with irradiated NSPC seeded in the upper chamber. The
results described in Figure 6b show an 80% inhibition of T cell proliferation even if the cells were
separated by a semi-permeable membrane. This result favors the implication of a soluble factor in
the inhibition of T cell proliferation by pNSPC. Since prostaglandins and nitric oxide have been
recently suggested as being implicated in the immunosuppressive effect of a mouse NSPC line (30),
indomethacin, an inhibitor of prostaglandin synthesis or L-NMMA, an inhibitor of nitric oxide
synthase, were added to the co-culture. As described in Figure 6d and 6e, neither indomethacin nor
LNMMA reversed the T cell inhibition induced by pNSPC.
Neurotrophic effect of porcine NSPC
In addition to the differences in graft survival, major distinctions in the profile of TH
expression were also observed after the transplantation of pNSPC into adult rat striatum as
compared to the grafting of pNB (Fig.7). TH+ cells exhibiting a neuronal morphology (Fig. 7d) were
clearly present in all the healthy pNB grafts at D28 (Fig. 7a), while neither TH+ cells nor TH+ fibers
were detected in any pNSPC grafts at this time (data not shown). At D42, thin TH+ fibers were clearly
present inside the pNSPC grafts (Fig.7 b, e) but no TH+ cell body could be detected within or around
the transplants. At D63, the immunostaining was much stronger with a dense network of TH+ fibers
inside the pNSPC transplants (Fig. 7c, f) but, here again, no TH+ cell body could be detected inside the
grafts. Since the striatum is naturally innervated by dopaminergic fibers from the substantia nigra,
the TH+ fibers might come from the host and not from the differentiation of transplanted pNSPC. This
possibility was made more feasible by the absence of thin TH+ fibers inside the pNB transplants. To
clarify the origin of the TH+ fibers, dopaminergic neurons of the substantia nigra were lesioned by
unilaterally injecting 6-hydroxydopamine into the medial forebrain bundle. Three weeks after lesion
123
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
induction, pNSPC were grafted into the contralateral and ispilateral striatum. Immunohistochemical
analyses performed at day 42 post-transplantation clearly showed the presence of TH+ fibers in the
transplants localized on the non lesioned side (Fig. 7g), while no immunostaining was observed on
the lesioned side (Fig.7h). These data indicated that the TH+ fibers inside the pNSPC grafts were due
to the innervation of the striatum by rat dopaminergic fibers coming from the substantia nigra.
124
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Discussion
The intensity and rapidity of the rejection in the brain depend on the phylogenetic distance
between donor and host (6, 31, 32) but our present data emphasize the fact that the host immune
response is also influenced by the nature of the transplanted cells. Porcine aortic endothelial cells
(PAEC) implanted into the rat striatum are eradicated within 1-2 weeks (8) while pNB are rejected
within 5-7 weeks (7-10, 31). Here, we show that pNSPC survive even longer since large and healthy
NF70+ grafts were observed 9 weeks post-transplantation of these cells into the rat brain. The
prolonged survival of pNSPC in a xenogeneic host has been previously attributed to the low
immunogenicity of pNSPC (16). Here, we show that pNSPC have immunosuppressive and
neurotrophic properties that probably contribute to the lengthy survival of intracerebral xenografts.
The first immune response following cell transplantation in the brain is a strong infiltration
of the graft by ED-1+ cells (7-9, 16, 31). Since ED1-immunostaining was observed in non-rejecting
syngeneic grafts (33) or after injection of vehicle into the striatum (9), the early recruitment of
microglia/macrophages might be part of the inflammatory process induced by the surgical
procedure. This does not exclude more specific roles at later stages and studies suggest an
implication of ED-1+ microglial/macrophages as specific cytotoxic effectors (34-36), as innate
phagocytes (37, 38) or as antigen-presenting cells to lymphocytes (39). Here, we show a similar
activation of microglia/macrophages in response to the transplantation of pNB or pNSPC but the
temporal evolution over the following 9 weeks varied significantly. In fact, ED1+ cells were
consistently present inside and around all the pNB grafts while in the non rejecting pNSPC, their
amount progressively decreased and became almost undetectable by Day 63. The same difference
was observed using nestin as a marker ,i.e., an intermediate filament expressed by reactive astroglial
cells (29). Nestin+ cells were consistently observed in pNB grafts while very few nestin+ cells were
detected in non rejecting pNSPC grafts. Such observations are consistent with a resting status of the
pNSPC grafts, which contrasts with the residual inflammatory reaction consistently observed in pNB
grafts. The low immunogenicity of pNSPC might contribute to the weak host immune response (16),
but the fact that syngeneic NSPC can hamper inflammatory brain processes in experimental models
of multiple sclerosis (40) raises other possibilities. In these models, the beneficial outcomes were
partially due to the immunosuppressive effects exerted by NSPC on peripheral T cells (24, 41). The
absence of T cells in most pNSPC transplants and the inhibition of rat T cell proliferation by pNSPC
advocate an immunosuppressive role for pNSPC following intracerebral xenotransplantation. The
suppression was dose-dependent with 47% inhibition for a ratio of 1 NSPC to 4 T cells and 87 %
inhibition for a ratio of 1: 1. This immunoregulatory effect was stronger than the inhibitory activity
triggered by porcine mesenchymal stem cells on human peripheral blood lymphocytes as assessed
by the mixed lymphocyte reaction system (42). In an attempt to characterize the factors responsible
125
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
for the suppressive effect of pNSC, LNMMA or indomethacin were added to the co-cultures. Neither
of the two drugs was able to restore the proliferation of anti-CD3/CD28-activated T cells, indicating
that nitric oxide and prostaglandin E2 were probably not the main mediators of the
immunosuppressive effect triggered by pNSPC on rat T cells. These data contrast with the results of
Wang et al., showing that inhibition of nitric oxide and prostaglandin E2 production restored the
proliferation of Concanavalin A-activated T cells inhibited by co-cultures with the C17.2 mouse stem
cells (30). This discrepancy may be due to species differences but also to distinct experimental
parameters. In 2005, Rasmusson et al. showed that prostaglandins were significant in the inhibition
by mesenchymal stem cells when the T cells were activated by mitogens such as phytohemagglutinin
(PHA), but not by alloantigens (43). Further studies are required to fully elucidate the mechanisms
through which pNSPC suppress the proliferation of rat T cells, but our present study already
distinguishes a major role for soluble factors. An 80% decrease in the rate of T cell proliferation was
observed even when rat lymphocytes and pNSPC were separated by a semi-permeable membrane.
According to previous studies on the mechanisms of immunosuppression by mesenchymal stem cells
(44), several molecules are potential candidates for the induction of NSPC-mediated
immunosuppression, including soluble factors such as IL-10 or Transforming Growth Factor (TGFβ).
The induction of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) in NSPC may also contribute to their
immunoregulatory activity by depleting tryptophan from the local environment, which is an essential
amino acid for lymphocyte proliferation (45, 46). All these possibilities have to be investigated but it
is likely that diverse pathways contribute to the immunosuppressive activity of NSPC as shown for
mesenchymal stem cells (21, 47, 48).
In addition to their immunosuppressive effect, pNSPC exhibit particular properties in terms
of cell differentiation and neurotrophic activity. In fact, very few pNSPC extended processes and
expressed the NF70 neuronal marker at Day 8 post-transplantation in contrast with the high number
of NF70+ cell bodies in pNB grafts. This difference is probably due to the undifferentiated state of
pNSPC at the time of grafting and to the low amount of neurotrophic factors in the intact brain. Pretreatment of the cells with neurotrophic factors or transplantation in a favorable microenvironment
might be useful to hasten the differentiation of pNSPC since the early expression of neuronal markers
has been observed following the transplantation of bFGF/EGF expanded neural progenitors in a rat
model of Parkinson’s disease (16). However, the large amount of pNF70+ cells at D63 indicates that
such treatment should not be necessary, except if one particular neuronal phenotype is required.
Indeed, very few pNSPC differentiate into dopaminergic neurons as assessed by the low number of
TH+ cell bodies inside the graft. The low efficiency of dopaminergic neuron generation could not be
explained by the use of porcine embryos as a source of NSPC since the same problem has been
previously observed using rat, murine or human NSPC (49-51). As a result, the strategies developed
126
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
to control the fate of stem cells should be of great interest in promoting the differentiation of pNSPC
into dopaminergic neurons. For instance, the overexpression of transcriptional factors involved in
the commitment of the neural cells such as Nurr1 might favor the appearance of a dopaminergic
phenotype in association with astrocyte-derived factors (52, 53). Treatment with ascorbic acid (54)
or serum (49) as well as a combination of soluble factors such as fibroblast growth factor 8 (FGF8)
and sonic hedgehog (SHH) (55) or IL-1, IL-11, LIF and GDNF (51) might also increase the yield of TH+
neurons derived from the NSPC.
Another striking observation following the transplantation of pNSPC into an unlesioned rat
striatum was the large amount of TH+ fibers in the NSPC transplants, which contrasts to the low
number of TH+ cell bodies. One explanation is that nigral dopaminergic neurons extend TH+ fibers
upon contact with pNSPC implanted in the striatum. The absence of TH+ fibers in the NSPC grafts
after the lesion of nigral dopaminergic neurons by 6-OH dopamine bears out such a hypothesis. This
finding is of great interest for restorative strategies, since it raises the possibility of trophic activity in
addition to cell replacement. Such a bystander effect was previously suspected in animal models for
which motor recovery was observed without any evidence of cell differentiation of the transplanted
cells into the expected phenotype. Neuroprotection by human neural progenitor cells has been
observed in an experimental model of brain contusion (56) but here we show a specific neurotrophic
effect of pNSPC, which should be useful to trigger extra-innervation from the substantia nigra
towards the striatum in the case of partial loss of dopaminergic neurons. Of course, this impact on
fiber outgrowth does not rule out the possibility of a direct neuroprotective effect on dying
dopaminergic neurons. Further studies are required to fully characterize the neurotrophic effects of
NSPC but the increase in the density of TH+ fibers is probably due to the secretion of one or several
factors known for their effect on nigral dopaminergic neurons such as GDNF, BDNF, and stem cell
factor. Importantly, everything may depend on the pNSPC differentiation state. Lu et al., showed that
the NT3-induced differentiation of C17.2 cells led to the loss of GDNF expression and to an increased
production of BDNF (57). Another experimental work performed on a human immortalized cell line
indicated that undifferentiated NSPC protected mesencephalic dopaminergic neurons against 6hydroxydopamine neurotoxicity, probably through the production of the stem cell factor (58). For
this reason, a better definition of the underlying mechanism of the pNSPC neurotrophic effect should
include a careful analysis of whether the transplanted pNSPC exert their effect on dopaminergic
neurite outgrowth as undifferentiated or committed cells.
Porcine NSPC were introduced as a cell source for restorative therapy, but the present data
indicate that these cells might also contribute to host neural repair by controlling the host immune
reaction and by promoting neurite outgrowth and/or neuron rescue. Further experiments are
required to optimize their application in restorative therapy but like mesenchymal stem cells, pNSPC
127
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
appear as multifaceted immunomodulatory cells with promising perspectives for neural
transplantation in the case of neurodegenerative diseases.
Acknowledgments: The authors are grateful to Pr. Jean-Paul Soulillou for his support. We also
thank Joanna Ashton-Chess for critical reading the manuscript. The nestin antibody obtained from
the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) was developed by Susan Hockfield developed
under the auspices of the NICHD and maintained by the University of Iowa, Department of Biological
Sciences, Iowa City, IA 52242.The work was supported by the “Association Française contre les
Myopathies” (AFM) and by the “Fédération des Groupements de Parkinsoniens”. D. Michel and V.
Bonnamain were supported by fellowships from INSERM/Région Pays de Loire and Ministère de
l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, respectively.
128
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Table 1: Graft survival in rats grafted with pNB or pNSPC. Rejection of the graft was determined
by analyzing T cell infiltration (R73+) and the disappearance of the porcine neurons (NF70-) at Days
8, 28, 42 and 63 post-transplantation. Each rat was classified as NF70+/ R73-, NF70+/ R73+/-, NF70+/
R73+, NF70-/ R73+ or scar. R73+/- corresponds to a brain with 1-10 T cells per section.
129
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 1: Characterization of the pNSPC. (a) Bright field micrograph of pNSPC grown as neurospheres
in AS-N2 medium supplemented with 25 ng/ml of bFGF. (b-d) Fate of differentiated pNSPC. The
pNSPC plated on poly-ornithine coated coverslips were grown for 7 days in AS-N2 medium.
Immunocytofluorescence analyses indicate that pNSPC expressed NF70 (b) or GFAP (c) in
differentiating conditions. Some cells also expressed tyrosine hydroxylase (d). Scale bar: a, 100 µm;
b-d, 25 µm.
130
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 2: Immunohistochemical analyses of pNB (a-d) and pNSPC (e-h) grafts using anti-pNF70
antibody. pNB or pNSPC were transplanted into the striatum of healthy rats and the presence of
pNF70+ cells was analyzed at 8 (a, e) , 28 (b, f) , 42 (c, g) or 63 (d, h) days post-transplantation. (i)
Percentage of grafts with pNF70+ cells at 8, 28, 42 and 63 days post-transplantation. Asterisks denote
statistical significance (one-sided Fisher exact test,*.P< 0.05). The total number of rats for each time
point is reported in brackets. Scale bars: 133 µm ; insert, 15 µm.
131
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 3: Immunohistochemical analyses of pNB and pNSPC grafts using the rat 401 anti-nestin
antibody. The rats transplanted with pNB (a-c) or pNSPC (d-f) were killed at 28 (a, d), 42 (b, e) and
63 (c, f) days post-transplantation. Scale bars: a-f, 130 µm; insert, 15 µm.
132
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 4: Immunohistochemical analyses of pNB and pNSPC grafts using ED1 antibody. The rats
transplanted with pNSPC were killed at 8 (a), 28 (b), 42 (c, e) and 63 (d, f) days to analyze microglial
activation using the ED1 antibody. Representative micrographs of healthy (a-d), rejecting (e) and
rejected (f) grafts are presented. Scale bar: 150 µm.
133
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 5: Immunohistochemical analyses of pNB and pNSPC grafts using R73 antibody. The rats
transplanted with pNB (b, d) or pNSPC (a, c) were killed at 42 (a, b) or 63 (c, d) days to analyze
infiltration of the graft by R73+ T cells. (a-d) Representative low-magnification micrographs. (e)
Percentage of grafts infiltrated by R73+ cells (f) A double labeling CD8β (black) / R73 (brown)
indicated that the R73+ cells detected in a rat that rejected the pNSPC transplant at D63
corresponded to both CD8+ and CD4+ T cells. Scale bars: a-d, 133 µm; f, 25 µm.
134
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 6: pNSPC inhibit the proliferation of anti-CD3/CD28-stimulated rat T lymphocytes. (a)
Dose-response. Purified T cells (105 cells/well) were stimulated (Stim T) or not (T cells) with antiCD3/CD28 antibodies. Stim T cells were incubated for three days with various ratios of irradiated
(30 Gy) pNSPC. [3H]-thymidine was added 12 hours before cell collection. For each condition,
thymidine incorporation was measured in three independent wells. Data are mean cpm ± SD of 10
independent experiments. (b) T cells (4x105 cells/well) were placed in the lower chamber of a 24well Transwell plate and cultured with 8x105 irradiated (30 Gy) pNSPC plated in the upper chamber.
Data are mean cpm ± SD of 9 independent experiments. (c) T cells (105 cells/well) were incubated
with 2x105 non irradiated pNSPC. Data are mean cpm ± SD of 5 independent experiments. (d, e)
Suppression assays. T cells (105 cells/well) were incubated with 2x105 irradiated pNSPC in presence
of indomethacin (INDO, non selective COX inhibitor) or L-NMMA (non selective NOS inhibitor). Data
are mean cpm ± SD of 5 (d) or 3 (e) independent experiments. Statistical significance was evaluated
by the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn’s multiple comparison test (*: p<0.05; **: p<0.001;
***: p<0.0001).
135
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Fig. 7: Immunohistochemical analyses of pNB (a,d) and pNSPC (b, c, e, f) grafts using anti-TH
antibody. pNB or pNSPC were transplanted into the striatum of healthy rats. The animals were then
sacrificed at 28, 42 or 63 post-transplantation to perform tyrosine hydroxylase staining. Micrographs
of the whole graft (a, b) and high magnification (c-f) of a D28 pNB graft (a, d) or of D42 (b, e) and D63
(c,f) pNSPC grafts are presented. (g-h) To clarify the origin of TH+ fibers, pNSPC were grafted into the
striatum of rats unilaterally lesioned. Immunohistochemical analyses performed at day 42 clearly
showed the presence of TH+ fibers in the transplants on the non lesioned side (Fig.7 g) while no
immunostaining was observed on the lesioned side (Fig.7 h). Scale bars: a-c, g , h, 170 µm; d, 15 µm;
e-f, 70 µm.
136
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
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3. Discussion
Dans cette étude, notre groupe a montré que les CSPN dérivées du cortex cérébral de fœtus
de porc à 28 jours de gestation survivent significativement plus longtemps que les neuroblastes
porcins du mésencéphale ventral après transplantation dans le cerveau de rats sains, en l’absence de
traitement immunosuppresseur.
L’analyse histologique des greffes non rejetées de CSPN porcines à J63 a révélé que ces
dernières étaient beaucoup plus massives et volumineuses que les greffes de neuroblastes tolérées à
J28, ce qui semble indiquer que les CSPN ont été transplantées dans un environnement qui leur est,
au moins de façon transitoire, favorable. Ce phénomène peut également s’expliquer par la
susceptibilité réduite des CSPN à mourir suite au stress opératoire (Emgard et al. 1999 ; Rémy et al.
2001) et à leur capacité de prolifération temporaire après implantation (Ostenfeld et al. 2000 ;
Emgard et al. 2009). Il est toutefois à noter que nous avons choisi d’évaluer la survie des cellules
greffées par comptage des cellules NF70+ trouvées au sein du greffon, sous-entendant ainsi que les
cellules porcines NF70- étaient des cellules mortes. Cependant il n’est pas à exclure que les cellules
d’origine porcine, après transplantation in vivo dans un microenvironnement xénogénique
particulier, se différencient et ne puissent plus exprimer NF70. Il serait intéressant d’essayer
d’identifier les cellules porcines se trouvant dans cette situation, en marquant, préalablement à la
transplantation, les neuroblastes et les CSPN au Hoechst 33342 (un intercalant ADN fluorescent ;
Sprick 1991) ou en greffant des cellules issues d’un porc transgénique exprimant la GFP (protéine
verte fluorescente ; Yang et al. 2009).
Outre l’évaluation de la survie des greffons, le marquage NF70 nous a également permis de
mettre en évidence un retard dans la différenciation neuronale des CSPN, comparé aux neuroblastes.
En effet, les rats greffés avec les CSPN porcines présentaient un marquage NF70 très faible jusqu’à
J42, tandis que de nombreuses fibres NF70+ ont pu être détectées dans les greffons de neuroblastes
dès J28. Cette différence pourrait être attribuable au statut indifférencié des CSPN au moment de la
greffe, qui mettraient ainsi plus de temps à exprimer les marqueurs neuronaux matures. Néanmoins,
il est à noter que si les CSPN porcines issues de différentes zones du cerveau sont équivalentes dans
leur capacité de différenciation neuronale, la différenciation dopaminergique des CSPN, in vitro et in
vivo, est un phénomène très rare, même lorsque celles-ci proviennent du mésencéphale ventral et
même lorsqu’elles sont greffées dans l’environnement cérébral approprié (Ficker et al. 1999). Ces
observations sont en accord avec nos résultats relatant une très faible différenciation des CSPN en
neurones exprimant la tyrosine hydoxylase, in vitro et après transplantation, et mettent en lumière
une question très intéressante soulevée par l’immunomarquage TH à J63. En effet, chez les rats ayant
subi une transplantation des CSPN, de fines fibres TH+ apparaissent dès J28 à l’intérieur du greffon et
140
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
s’organisent en un réseau dense à J63. Etant donné la faible différenciation dopaminergique des
CSPN porcines ainsi que l’absence de corps cellulaires TH+ autour ou à l’intérieur du greffon, il est
tout à fait envisageable que ces fibres nerveuses dopaminergiques aient pour origine la substance
noire de l’hôte. Afin de confirmer cette hypothèse, les neurones dopaminergiques de la substance
noire ont été détruits chez des rats par injection unilatérale de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) au
niveau du faisceau médian du télencéphale. Trois semaines après l’induction de la lésion, les CSPN de
porc ont été greffées dans le striatum controlatéral (côté opposé à la lésion) et ispsilatéral (du même
côté que la lésion). A J42 post-transplantation, les animaux ont été sacrifiés et des analyses
immunohistochimiques ont clairement montré la présence de fibres TH+ dans le greffon situé du côté
intact du striatum, alors qu’aucun marquage n’a été détecté du côté de la lésion à la 6-OHDA. Ces
données suggèrent que les fibres TH+ observées au sein des greffes de CSPN proviennent de
l’innervation du striatum par les fibres dopaminergiques de l’hôte, et que les CSPN de porc exercent,
dans ces conditions, une forte action trophique sur la croissance axonale. Ce phénomène est tout-àfait possible puisque les CSPN sont capables de produire différents facteurs neurotrophiques tels que
le BDNF ou le GDNF (Lu et al. 2003b). Des expériences in vitro sont actuellement en cours au
laboratoire pour confirmer cette hypothèse et pour tenter d’identifier le ou les facteurs responsables
de l’effet neurotrophique bénéfique des CSPN. Un système de co-culture en Transwell est notamment
utilisé, permettant de séparer par une membrane semi-perméable les neuroblastes de rat cultivés
dans la chambre inférieure du Transwell, et les CSPN de porc ensemencées dans la chambre
supérieure, tout en laissant la possibilité aux molécules sécrétées de passer d’un compartiment à
l’autre. Le but de cette séparation physique des deux types cellulaires est de confirmer que les CSPN
porcines sont capables, via la libération d’une ou plusieurs molécules, de stimuler la croissance
axonale des neuroblastes de rat, in vitro. L’identification des facteurs solubles impliqués se fera par
ajout dans la co-culture d’anticorps bloquants dirigés contre certains facteurs neurotrophiques, en
particulier le GDNF. En effet ce dernier a été montré comme étant très impliqué dans la survie des
neurones dopaminergiques (qui expriment les récepteurs du GDNF : Ret et GDNFR) ainsi que dans la
croissance des fibres nerveuses issues de la différenciation des CSPN transplantées (Sinclair et al.
1996).
L’analyse de la réponse immune provoquée par les xénogreffes de neuroblastes et de CSPN de
porc a révélé une infiltration lymphocytaire T peu fréquente dans le striatum des rats greffés avec les
CSPN puisque des cellules R73+ ont été détectées dans le greffon de seulement 2 rats parmi les 22
transplantés. Cette observation contraste avec le grand pourcentage de rats présentant une
infiltration lymphocytaire à J28 et J42 suivant la greffe de neuroblastes porcins (40 % et 90 %,
respectivement). La présence de lymphocytes T dans le cerveau de deux rats greffés avec des CSPN
indiquent que ces cellules immunes peuvent être impliquées dans le rejet de xénogreffe de CSPN. En
141
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
revanche, le faible nombre d’animaux présentant une telle infiltration soulève différentes questions
qui nécessiteraient des investigations supplémentaires afin de s’assurer que ces cellules sont
effectivement impliquées dans le rejet des xénogreffes de CSPN. En effet, l’absence de détection des
lymphocytes T entre J28 et J42 ou entre J42 et J63 pourrait être simplement attribuable à une
réaction immunitaire très rapide et une analyse sur des intervalles plus courts que 14 et 21 jours
serait donc opportune.
Par ailleurs, le pourcentage non négligeable de rats qui ont rejeté leur greffe de CSPN
porcines avant J63 (60%), indique que ces cellules ne bénéficient pas d’une totale immunité. Dès lors,
pourquoi certaines greffes de CSPN sont-elles encore intactes à J63 ?
Une différence dans la différenciation des CSNP serait une première explication. En effet, la
faible immunogénicité des CSPN est en partie attribuée à leur état indifférencié. La différenciation
des cellules suite à l’arrêt des mitogènes et à l’implantation dans le cerveau modifie forcément ce
paramètre. Il est alors fort probable que les cellules implantées expriment progressivement des
antigènes susceptibles de déclencher une réponse immunitaire. Suivant la vitesse et le type de
différenciation, la réponse immune serait alors plus ou moins rapide, voire inexistante. Pour
confirmer cette hypothèse, il faudrait pouvoir caractériser en détail le phénotype cellulaire de
chacune des greffes, analyser l’expression d’antigènes connus pour leur implication dans la réaction
de rejet (les molécules du CMH en particulier) et étudier la survie des greffes à long terme.
Une hétérogénéité des propriétés immunosuppressives des différents greffons serait une
autre explication. En effet, nos travaux montrent clairement que les CSPN sont tout à fait capables
d’inhiber la prolifération des cellules T mais que l’efficacité de l’inhibition est directement liée au
ratio lymphocytes T : CSPN. Les neurosphères présentant une certaine hétérogénéité, il se peut que,
dans certains cas, la proportion de CSPN soit trop faible pour assurer une inhibition totalement
efficace.
Enfin, étant donné le déclin progressif de la survie des greffons jusqu’à J63, on peut se
demander si tous les rats ayant été transplantés avec des CSPN finiraient finalement par rejeter leur
greffe et il serait intéressant d’inclure dans notre étude des temps de sacrifices post-transplantation
plus longs. Une survie au-delà de 120 ou 180 jours laisserait supposer l’induction d’un état de
tolérance ou d’ignorance qu’il resterait bien entendu à démontrer.
Dans cette optique, il serait particulièrement intéressant de déterminer le rôle que joue
l’immunogénicité des deux types cellulaires dans la cinétique du rejet de la xénogreffe. Plusieurs
auteurs ont montré que la composition cellulaire de la suspension transplantée pouvait altérer le
profil du rejet (Litchfield et al. 1997 ; Rémy et al. 2001). Dans le cas des xénogreffes porcines de
142
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
neuroblastes fœtaux et de cellules endothéliales aortiques (PAEC) chez le rat par exemple, les
mécanismes de rejet apparaissent différents (Rémy et al. 2001). En effet, alors que les cellules
endothéliales sont rejetées en quelques jours par une intervention majoritaire des macrophages, les
neuroblastes survivent plus longtemps (quelques semaines) à l’intérieur de l’hôte et leur rejet
requiert l’implication des lymphocytes T (Rémy et al. 2001). De même, le groupe de Hàkan Widner a
montré que la présence de cellules immunogènes parmi la suspension cellulaire à greffer, telles que
des composants des lignées astrocytaire et macrophagique qui expriment les molécules du CMH de
classe II, favorisait le rejet des neuroblastes, que ce soit dans un contexte allogénique (Duan et al.
1997) ou xénogénique (Brevig et al. 1999). A l’inverse, l’étape de culture in vitro des CSPN sous
forme de neurosphères permettrait de s’affranchir de la présence de ces cellules contaminantes dans
la suspension cellulaire transplantée. Dès lors, que ce soit la faible immunogénicité des CSPN ou
l’absence de cellules immunogènes dans la suspension cellulaire transplantée, ou les deux, le rejet
retardé des greffes de CSPN pourrait s’expliquer par une diminution et/ou un retard de l’induction
de l’expression des molécules du CMH de classe II à leur surface. Cela se traduirait par conséquent en
un décalage de leur reconnaissance par les cellules immunitaires de l’hôte.
Afin de clarifier le statut immunogène des neuroblastes et des CSPN de porc, des expériences
d’immunisation de rats sont actuellement en cours au laboratoire. Des lysats cellulaires sont
préparés à partir de neuroblastes ou de CSPN issus du cortex cérébral de fœtus de porc à 28 jours de
gestation. Cinquante µg de protéines de l’un ou l’autre des lysats sont dilués dans de l’adjuvant
complet de Freund (CFA) avant d’être injectés à des rats Lewis 1A par voie intraplantaire. L’injection
de 50 µg de cellules endothéliales aortiques de porc (PAEC) dans du CFA fournit le contrôle positif de
l’expérience. Les ganglions lymphatiques drainants sont collectés 11 jours après l’injection, et les
cellules issues de ces derniers sont mises en culture dans du milieu RPMI supplémenté avec 5 mM
HEPES (pH 7.2), 100 U/ml de penicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1 mM
de pyruvate de sodium, 1 µM de 2-Mercaptoethanol, 1% acides aminés non essentiels and 10% de
sérum de veau fœtal (SVF), en présence de 0 à 50 µg/mL du lysat protéique correspondant. Après
72h d’incubation, 0.625 µCi de [3H]thymidine sont ajoutés dans chaque puits pendant 12h, avant de
récolter les cellules et de quantifier l’incorporation de radioactivité par une méthode standard de
scintillation (Fig. 30).
143
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Figure 30 : Résultats préliminaires d’immunisation de rats Lewis 1A. PAEC: cellules endothéliales
aortiques porcines ; pNB : neuroblastes corticaux porcins ; pCSPN : cellules souches/progénitrices
neurales de porc. Cpm : count per minute, traduisant l’incorporation de [3H]thymidine. (n=1).
Les résultats préliminaires ont montré que les protéines issues des PAEC, cellules
différenciées exprimant le CMH de classe II, sont capables de stimuler la prolifération des
lymphocytes T pré-activés in vivo. A l’inverse, aucune prolifération n’a été observée après incubation
des lymphocytes T avec des protéines issues des neuroblastes ou des CSPN de porc. Ces résultats
confirment la faible immunogénicité de ces deux types cellulaires et soulignent la nécessité
d’expérimentations complémentaires pour conclure quant à une réelle différence d’immunogénicité
entre les CSPN et les neuroblastes porcins.
Au vu de ces résultats et du nombre croissant de publications concernant les propriétés
immunomodulatrices des cellules souches (Fandrich et al. 2002 ; Zappia et al. 2005 ; Pluchino et al.
2005b ; Einstein et al. 2007), nous avons entrepris de vérifier si, dans notre modèle, la faible
infiltration lymphocytaire T observée dans le cas des xénogreffes de CSPN porcines était le résultat
d’un contrôle actif de la réponse immunitaire par ces dernières. Pour cela, des lymphocytes T
spléniques de rat ont été stimulés avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 et co-cultivés avec des
quantités croissantes de CSPN porcines (CSPNp) irradiées (30 Gy). Les tests de prolifération à la
thymidine tritiée ont clairement démontré que les CSPN de porc étaient capables d’inhiber la
prolifération des lymphocytes T de façon dose-dépendante. Ce résultat a également été reproduit en
utilisant des CSPNp non irradiées, ce qui exclut un potentiel effet négatif de l’irradiation sur la
prolifération des cellules T.
Si une activité immunosuppressive exercée par les CSPN de souris (Pluchino et al. 2005b), de
rat (Einstein et al. 2003) et récemment humaines (Kim et al. 2009b), a déjà été relatée dans la
littérature, nous sommes les premiers à décrire de tels effets pour les CSPN de porc, d’autant plus
dans un contexte xénogénique. De plus, les propriétés immunomodulatrices des CSPN avaient
surtout été mises en évidence dans des modèles de maladies inflammatoires comme l’EAE (Pluchino
144
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
et al. 2005b ; Einstein et al. 2007). Notre présent travail révèle que les propriétés des CSPN
pourraient également être utiles pour les stratégies de transplantation de façon générale.
Afin de déterminer si le contact direct avec les cellules T est nécessaire pour l’effet
immunosuppresseur des CSPN porcines (CSPNp), des expériences de Transwell ont été réalisées. Les
résultats ont montré que lorsque les deux types cellulaires sont physiquement séparés par une
membrane semi-perméable, l’effet inhibiteur est similaire à celui obtenu par contact cellulaire direct.
Cela suggère que la libération d’un ou de plusieurs facteurs solubles est suffisante pour inhiber la
prolifération des lymphocytes T. La question de savoir si ces facteurs sont constitutivement sécrétés
par les CSPNp ou induits par la communication moléculaire s’établissant avec les lymphocytes
demeure pour l’instant non résolue, tout comme leur identification. Nos résultats ont cependant
permis d’écarter l’implication des prostaglandines, de même que celle de la NO synthase (NOS), ces
deux molécules ayant pourtant déjà été identifiées dans la littérature comme actrices de la réponse
immunosuppressive des cellules souches mésenchymateuses et neurales (Sato et al. 2007 ; Wang et
al. 2009b). Par ailleurs, nous avons réalisé des expériences de RT-PCR sur les CSPNp après 10 jours
de culture in vitro en présence de bFGF. Nous avons ainsi pu mettre en évidence pour la première
fois l’expression constitutive par les CSPNp des transcrits codant pour les hème-oxygénases 1 et 2
(HO-1, HO-2 ; Fig. 31a). Ces iso enzymes, notamment HO-1, possèdent de puissantes propriétés antiinflammatoires et contribuent à la prévention du rejet des greffes allogéniques (Slebos et al. 2003).
Néanmoins, dans nos conditions de co-culture, l’utilisation d’un inhibiteur non spécifique des hèmeoxygénases (SnPP ; tin protoporphyrin ; 50 µM) n’a pas permis de restaurer la prolifération des
lymphocytes T supprimée par les CSPNp (Fig. 31b).
Figure 31 : Expression des transcrits des hèmeoxygénases 1 et 2 et implication dans l’effet
immunosuppresseur des CSPNp. (a). RT-PCR. HPRT :
Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transférase (gène
de référence). (b) Test de suppression. Les cellules T
stimulées (105 cellules/puits) ont été incubées avec 2x105
CSPNp irradiées (30 Gy), en présence de SnPP (inhibiteur
non sélectif de HO ; 50 µM). n=5. Test statistique :
Kruskal-Wallis suivi du test de comparaison multiple de
Dunn (**: p<0.001; ***: p<0.0001).
145
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 1
Les expériences de suppression in vitro n’ont jusqu’alors pas permis d’identifier le ou les
facteurs solubles responsables de l’immunosuppression médiée par les CSPNp dans nos conditions.
Néanmoins, pour poursuivre la caractérisation de ce phénomène, nous avons entrepris d’étudier le
phénotype des cellules T après 72h de co-culture avec les CSPNp. En effet, une étude de Maccario et
al. en 2005 a montré que les cellules souches mésenchymateuses pouvaient orienter la
différenciation des cellules T CD4+ vers un phénotype de cellules régulatrices CD4+/CD25+ (Maccario
et al. 2005). Ainsi, après 72h de co-culture avec des CSPNp irradiées, les lymphocytes T marqués par
l’anticorps R73 (reconnaissant le TCR) ont été analysés en cytométrie en flux afin de déterminer le
pourcentage de cellules CD4+, CD8+, CD25+ et celui des cellules T régulatrices CD4+/CD25+ (Fig. 32).
Figure 32 : Analyse du phénotype des lymphocytes T après 72h de co-culture avec les CSPNp
irradiées. Les lymphocytes T cultivés seuls (T stim) ou en présence de différents ratios de CSPNp (1/1 et
1/2) ont été marqués par l’anticorps R73 (TCRαβ) et caractérisés par cytométrie en flux pour évaluer le
pourcentage de cellules CD4+, CD8+, CD25+ et CD4+/CD25+ (n=2). Test statistique : Kruskal-Wallis suivi
du test de comparaison multiple de Dunn (non significatif dans toutes les conditions).
Ces expériences n’ont pas permis de mettre en évidence une différence significative dans le
phénotype des lymphocytes T en fonction de l’absence ou de la présence de CSPNp. L’effet
immunosuppresseur des CSPN de porc ne semble donc pas résulter de l’induction d’une population
de lymphocytes CD4+/CD25+ suppressive.
Une autre explication serait la secrétion par les CSPN de molécules qui induiraient la mort
des lymphocytes par apoptose. Nous sommes actuellement en train d’étudier cette possibilité.
146
ARTICLE 2
In vitro characterization of the
immunosuppressive properties of
neural stem/progenitor cells:
a role for HO-1
Virginie Bonnamain, Reynald Thinard, Paméla Thébault, Véronique NerrièreDaguin, Ignacio Anegon, Bernard Vanhove, Isabelle Neveu and Philippe Naveilhan.
--- En préparation ---
147
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
1. Introduction
La transplantation de CSPN a démontré des effets thérapeutiques bénéfiques dans plusieurs
modèles animaux de maladies ou affections du SNC comme la maladie de Parkinson (Redmong et al.
2007 ; Yasuhara et al. 2006), la maladie de Huntington (Lee et al. 2005b), la sclérose en plaques
(Einstein et al. 2006) ou encore l’hémorragie intracérébrale (Jeong et al. 2003 ; Lee et al. 2007). Ce
phénomène serait apparemment lié à l’aptitude des CSPN transplantées à engager divers
mécanismes d’action adaptés aux microenvironnements spécifiques dans lesquels elles se
retrouvent, in vivo (Martino & Pluchino 2006). De fait, si les CSPN transplantées dans le cerveau ou la
moelle épinière montrent des capacités de prolifération, de migration et de différenciation (Tamaki
et al. 2002 ; Snyder et al. 1997 ; Park et al. 1999 ; Riess et al. 2002), de plus en plus d’études
suggèrent que leur action thérapeutique ne serait pas majoritairement liée au remplacement
cellulaire à proprement dit, mais plutôt à des effets bénéfiques parallèles de neuroprotection et
d’immunomodulation (Pluchino et al. 2009). En effet, il a été montré que les CSPN peuvent migrer
vers les sites inflammatoires et améliorer la biodisponibilité des principales neurotrophines (Lu et al.
2003a ; Ryu et al. 2004 ; Richardson et al. 2005). Par ailleurs, il semblerait que les CSPN régulent
aussi activement les réponses immunes en interagissant avec plusieurs cellules du système
immunitaire, en particulier les lymphocytes T (Einstein et al. 2007). De tels effets semblent pouvoir
se dérouler à la fois à l’intérieur du SNC, au niveau des niches péri-vasculaires atypiques (Pluchino et
al. 2005a), ainsi que dans les organes lymphoïdes secondaires tels que les ganglions lymphatiques
(Einstein et al. 2007) ou la rate (Lee et al. 2008). Ainsi, il a été montré que l’injection
intraventriculaire de CSPN syngéniques à des rats présentant une EAE aiguë (Einstein et al. 2003) et
à des souris avec une EAE chronique (Einstein et al. 2006) permettait d’atténuer significativement la
maladie par une diminution de la réponse inflammatoire. Les CSPN administrées par voie systémique
peuvent diminuer la sévérité de l’EAE par un mécanisme d’immunomodulation qui s’exercerait sur
les lymphocytes T encéphalitogéniques, dans le cerveau (Pluchino et al. 2005b) et/ou dans le
système immunitaire périphérique (Einstein et al. 2007).
Malgré
les
immunosuppresseur
études
de
des
CSPN,
plus
en
plus
notamment
nombreuses
en
utilisant
visant
des
à
caractériser
systèmes
de
l’effet
co-culture
CSPN/lymphocytes T in vitro (Einstein et al. 2003 ; Fainstein et al. 2008), celui-ci n’est toujours pas
clairement défini, et les mécanismes décrits jusqu’alors demeurent controversés. Le groupe de
Stefano Pluchino a rapporté que les CSPN induisent une augmentation de la mort par apoptose des
lymphocytes encéphalitogéniques de type TH1, via l’engagement sélectif des récepteurs de mort à
leurs ligands (FasL, TRAIL, Apo3L) exprimés à la surface des CSPN (Pluchino et al. 2005b). A
l’inverse, d’autres études ont montré que l’immunosuppression médiée par les CSPN ne serait pas
148
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
liée à une induction de l’apoptose des cellules T, mais plutôt à une suppression de la prolifération de
ces dernières (Einstein et al. 2007 ; Fainstein et al. 2008).
Parallèlement à ces observations, des travaux récents ont commencé à mettre à jour
l’existence de facteurs paracrines impliqués dans l’activité immunosuppressive et les effets
protecteurs d’autres types de cellules souches somatiques. C’est par exemple le cas pour les cellules
souches mésenchymateuses (CSM), dont les propriétés permettent notamment de prévenir le rejet
des greffes allogéniques de peau (Xu et al. 2007). Plusieurs molécules ont été décrites comme étant
impliquées dans l’immunosuppression médiée par les CSM : l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO ;
Meisel et al. 2004), le TGF-β (Groh et al. 2005), les prostaglandines E2 (PGE2 ; Aggarwal & Pittenger
2005), le monoxyde d’azote (NO ; Sato et al. 2007) et l’hème-oxygénase 1 (HO-1 ; Chabannes et al.
2007). Concernant les CSPN, des études commencent également à avancer l’hypothèse d’une
immunomodulation médiée par un fort effet paracrine, non spécifique d’un tissu. Ceci a été décrit
pour des CSPN de rat dont la transplantation systémique par voie intraveineuse a permis d’améliorer
une condition d’ischémie-reperfusion rénale (Wang et al. 2009a), ainsi que dans une étude in vitro
utilisant des CSPN et des cellules T humaines (Kim et al. 2009b). Néanmoins, dans les deux cas,
l’identité du ou des facteurs solubles impliqués n’a pas été identifiée. A l’inverse, dans une étude
réalisée cette année (Wang et al. 2009b), l’équipe de Nancy Cox a pu mettre en évidence l’implication
du monoxyde d’azote et des prostaglandines E2 dans l’effet suppresseur d’une lignée murine de
CSPN exprimant le gène rapporteur LacZ (clone C17.2).
Malgré ces avancées considérables, les mécanismes moléculaires et cellulaires précis à la
base de l’effet thérapeutique exercé par les CSPN in vivo restent loin d’être totalement élucidés et
caractérisés. Dans cette optique, nous avons entrepris d’étudier in vitro les interactions se produisant
entre les CSPN et les lymphocytes T activés de rats Sprague-Dawley, et ceci dans le but d’identifier les
mécanismes régissant les propriétés immunosuppressives des CSPN.
149
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
2. Article
In
vitro
characterization
of
the
immunosuppressive
properties
of
neural
stem/progenitor cells : a role for HO-1.
Virginie Bonnamain1.2.3, Reynald Thinard1.2.3, Paméla Thébault1.2.3, Véronique NerrièreDaguin1.2.3, Ignacio Anegon1.2.3, Bernard Vanhove1.2.3, Isabelle Neveu1.2.3 and Philippe
Naveilhan1.2.3.
1, INSERM, UMR643, Nantes, France.
2, CHU de Nantes, ITERT, Nantes, France.
3, Université de Nantes, UFR de Medicine, Nantes, France.
Corresponding author: Naveilhan P., INSERM U643, 30 Bd Jean Monnet, 44 093 Nantes cedex
01,
France.
Tel :
+33
(0)240087414 ;
Fax :
+33
(0)240087411 ;
e-mail :
[email protected]
Key words: neural stem cell, neural progenitor, T cell, immunosuppression, in vitro, nitric
oxide synthase, heme oxygenase
Title : 93
Abstract : 237 words
150
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Abstract
Neural Stem/Progenitor Cells (NSPCs) derived from embryonic or adult nervous system are able of
self-renewal and give rise to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. These properties initially
made them an interesting source of cells for neural repair after injury or disease. However, the
beneficial transplantation of NSPCs in animal models of immune-related diseases like multiple
sclerosis indicates that these cells also possess immunoregulatory properties. However the
mechanisms underlying these effects remain unresolved. In the present paper we described the
interaction between rat NSPCs and T cells, in vitro. NSPCs inhibited polyclonally stimulated T cell
proliferation but not activation. The characterization of this inhibition revealed that NSPCs did not
exert their immunomodulatory effect by an induction of suppressive regulatory T cells, but rather
through the release of molecules known to interfere with the immune response, as confirmed by
Transwell experiments. Recent data suggested the implication of prostaglandins or nitric oxide (NO)
in this phenomenon, but the role of heme oxygenases in the mechanism of NSPC-mediated T cell
suppression has never been investigated. RT-PCR and immunocytochemistry experiments revealed
an expression of heme oxygenase 1 and 2 by NSPCs. Suppression assays using HO inhibitor,
combined with NO Synthase (NOS) inhibitor, highlighted the implication of these two enzymes. We
conclude that the in vitro immunosuppressive activity of NSPCs is partially mediated through the HO
activity, alone or in combination with NO production, a finding that could be relevant to assess in
vivo.
151
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Introduction
During the past few decades, stem cell biology has become one of the fastest growing research fields
due to the potential for regenerative therapies in many biomedical disciplines such as cardiology or
neurobiology. Stem cells are defined by their ability to self renew, to proliferate to give rise to
daughter stem cells, and to differentiate into a range of mature cell types.
Among them, multipotent Neural Stem Cells (NSCs), derived from embryonic or adult nervous
systems, can be cultivated in vitro as neurospheres, a mixture of Neural Stem/Progenitor Cells
(NSPCs), in presence of growth factors such as b-FGF (Vescovi et al., 1993; Gritti et al., 1996) and EGF
(Reynolds and Weiss, 1992). Withdrawal of growth factors induces their differentiation into neurons,
astrocytes and oligodendrocytes (Reynolds and Weiss, 1992; Reynolds et al., 1992). These properties
make them an interesting source of cells for neural repair after injury or disease. Over their
differentiation, NSPCs seem to have a selective advantage for their survival when transplanted in the
brain. In a xenotransplantation context, Armstrong et al. and our group demonstrated that porcine
NSPCs were able to survive longer than porcine neuroblasts when grafted into the striatum of non
immunosuppressed rats (Armstrong et al., 2001; Michel-Monigadon et al. submitted). As NSPCs were
reported to express no or low levels of MHC molecules (Klassen et al., 2001; Hori et al., 2003), this
phenomenon was firstly linked to a lesser immunogenicity of these cells compared to more mature
cells (Odeberg et al., 2005). However, immunogenic properties of NSPCs can not totally justify their
delayed rejection, and recent studies confirmed the expression of MHC I and MHC II by NSPCs, under
normal or inflammatory conditions (Sergent-Tanguy et al, 2006; Yin et al, 2008; Johansson et al,
2008).
In addition to the immunogenic state of NSPCs, accumulating evidence suggest that stem cells, like
mesenchymal stromal cells (MSCs) or embryonic stem cells, could interact with components of the
immune system, leading to the modulation of many effector functions (Zappia et al., 2005; Fandrich
et al., 2002). For instance, MSCs are known to suppress T cell proliferation in vitro (Di Nicola et al.,
2002) and to induce long term graft survival in an allogeneic context (Bartholomew et al., 2002;
Chabannes et al., 2007). Concerning NSPCs, a growing number of studies highlighted their
immunomodulatory properties, in vitro and in vivo. It was clearly demonstrated that NSPCs were able
to attenuate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) when injected centrally or
peripherally (Einstein et al., 2003; Pluchino et al., 2005; Einstein et al., 2007). If the site of action (i.e.:
CNS or lymph nodes) is not clearly defined, NSPCs have the capacity to inhibit the proliferation of
lymphe nodes-derived T cells, in response to either Concanavalin-A (ConA) or to myelin
oligodendrocyte glycoprotein, in vitro (Einstein et al., 2003). As transplantation of NSPCs was shown
to be beneficial in animal models of autoimmune disease like multiple sclerosis (Einstein et al.,
2003), it could be hypothesized that NSPCs exert their immunomodulatory effect through a strong
152
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
paracrine mechanism. Previous studies revealed the expression of immune molecules like TGFβ-1 by
NSPCs (Klassen et al., 2003), or inducible nitric oxide synthase (iNOS) and prostaglandin E2 in NSPC
cell line (Wang et al., 2009). Even if the implication of some of these molecules in the
immunosuppressive effect of NSPC cell line have already been suggested (Wang et al., 2009), the
mechanism of the in vitro inhibition of T lymphocyte proliferation by these cells is still poorly
understood.
In the present paper we sought to better describe the in vitro interaction between rat NSPCs and
purified rat T lymphocytes from the spleen. We showed that NSPCs were clearly able to suppress T
cell proliferation in a dose dependent way. The characterization of this inhibition revealed that
NSPCs did not exert their immunomodulatory effect by an induction of suppressive regulatory T
cells, but rather through the release of molecules known to interfere with the immune response.
Suppression assays using non specific inhibitors of heme oxygenase 1 and 2 (HO1, HO2) and NOS
allowed us to highlight the implication of these two enzymes and to conclude that the in vitro
immunosuppressive activity of NSPCs is partially mediated through the heme oxygenase activity,
alone or in combination with nitric oxide production.
153
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Materials and Methods
Antibodies
The following mouse anti-rat monoclonal antibodies (mAbs) obtained from the European Collection
of Cell Culture (ECCC) were used for cell depletion, T cell stimulation and FACS studies after coupling
if necessary to Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 647 (Bioatlantic, Nantes, France): R7.3 (TCRαβ), OX42
(CD11b/c), OX39 (CD25, IL-2Rα chain) and 3.2.3 (NKR-P1A). mAbs HIS24 (CD45R), G4.18 (CD3),
OX35-PECy7 (CD4), OX39-PE (CD25) and OX8-PE (CD8) were obtained from BD Pharmingen. FoxP3APC Ab was from eBioscience. The JJ319 mouse hybridoma producing anti-rat CD28 antibody was
kindly provided by T. Hüning (University of Würzburg, Germany).
Preparation of neural stem/progenitor cells (NSPCs)
Primary cultures of NSPCs were established from the whole brain of E15 Sprague-Dawley rat
embryos as previously described (Sergent-Tanguy et al., 2006). Briefly, tissues freed of meninges
were incubated with 0.5 mg/mL trypsin for 15 min at 37°C. Following addition of 10% fetal calf
serum (FCS, Sigma-Aldrich, Saint-Gentin, Fallavier, France), tissues were exposed to 0.1 mg/mL of
DNase I prior to mechanical trituration. Agregates were removed by decantation and cells were
further purified from small debris by centrifugation. Cells were resuspended and plated for one night
in medium composed of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) / Ham’s F12 (1/1, v/v), 33mM
glucose, 5mM HEPES (pH 7.2), , 100 U/ml penicillin, 0.1 mg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine and
supplemented with 10% FCS (serum-supplemented medium). The next day, the floating cells were
recovered, washed and resuspended in a serum-free medium supplemented with N2 (Invitrogen,
Cergy Pontoise, France). The cells were then plated in uncoated dishes and expanded as
neurospheres for 10 days in the presence of 25 ng/mL basic fibroblast growth factor (b-FGF) with a
complete change of the N2 medium after 5 days of culture, and addition of b-FGF every 3 days.
Immunocytofluorescence
After 10 days of culture, neurospheres were collected, enzymatically dissociated with trypsin-EDTA
and submitted to mechanical trituration to give a single-cell suspension. Cells were plated at a
concentration of 2x105 cells/cm2 onto poly-L-ornithine-coated glass coverslips (50µg/mL, Sigma) in
serum-supplemented medium for 1h. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 15 min
at room temperature, washed three times with phosphate-buffered saline (PBS), and incubated for
154
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
1h at RT in PBT-DNS (1X PBS, 4% bovine serum albumine (BSA), 0,1% Triton, and 10% donkey
normal serum (DNS)). The cells were subsequently exposed overnight at 4°C to primary antibodies
diluted in PBT : polyclonal anti-HO-1 and anti-HO-2 (1/300 and 1/250 respectively, StressGen),
monoclonal anti-Nestin (1/1000, rat 401; Developmental Studies Hybridoma Bank (DHSB), Iowa
City, IA), polyclonal anti-Nestin (1/500, Covance), monoclonal anti-human Lap-1 (1/200, ECCC)
coupled to Alexa Fluor-588 (Bioatlantic, Nantes, France). After washing, cells were incubated for 2h
at RT with fluorescein (FITC)-conjugated anti-mouse IgG (Jackson Immunoresearch, Cambridgeshire,
United Kingdom; 1/250) and Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit (Invitrogen, 1/1000) diluted in
PBT. After 3 washes in PBT, nuclear staining was performed with DAPI (1/3000) for 5 min at RT.
Cells were washed in PBS and mounted in an anti-fading medium (Dako) for analysis on an Axioskop
2 plus microscope (Zeiss). Pictures were acquired with 63x objective using a digital camera
(AxioCam HRC, Zeiss) driven by AxioVision Release 4.2 software.
T cell proliferation assay
T cells were purified as previously described (Dugast et al, 2008). Briefly, T cells from SpragueDawley rat spleens were prepared by depletion of NK cells, B cells, and monocytes using specific
mAbs (clones 3.2.3, HIS24, and OX42, respectively), followed by anti-mouse IgG-coated Dynabeads
(Invitrogen). Polyclonally stimulated purified T cells (105) and irradiated (30 Gy) or non irradiated
rat NSPCs (2.5x104; 5x104; 105; 2x105) were seeded in triplicate in 96-well flat-bottom culture plates
and were cocultured for 3 days in (1:1) N2 medium/RPMI 1640 medium supplemented with 2 mM Lglutamine, 100 U/ml penicillin, 0.1 mg/ml streptomycin, 5% heat-inactivated FCS, 1% non essential
amino acids, 5 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, and 1 µM 2-ME. In some experiments, T cells were
incubated for 3 days with supernatants from NSPCs cultures at 24, 48, 72, 96 and 120h of culture,
replacing 50% of the culture medium. For polyclonal stimulation, T cells were stimulated with 5
µg/ml anti-CD28 antibody in flat-bottom 96-well plates previously coated with anti-CD3 (5 µg/ml; 2
h at 37°C). Proliferation was measured by addition of 0.625 µCi [3H]thymidine (PerkinElmer, Boston,
MA, USA) per well. Cells were harvested on fiberglass filters using a harvester (Tomtec) and
radioactivity was measured by standard scintillation technique.
For transwell assays, 4x105 polyclonally stimulated purified T cells were placed in the lower chamber
of a 24-well cell culture insert companion plate (BD Falcon) and cultured for 3 days with irradiated
(30 Gy) NSPCs (105; 2x105; 4x105; 8x105) seeded in the upper chamber. T cell proliferation was
measured as described above.
155
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Suppression assay
In suppression assays, NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA, Sigma-Aldrich) was used at 1.25 mM,
1-methyl-D,Ltryptophan (1-MT; Sigma-Aldrich) at 200 µM, tin protoporphyrin (SnPP; Frontier
Scientific) at 50 µM, recombinant human interleukin-2 (hIL-2) at 100 U/mL, anti-TGFβ1 (2G7, ECCC)
at 50 µg/mL, indomethacin (Sigma) at 10 µM, ketoprofen (Sigma) at 50 µM, human Neuropetide Y
and human Peptide YY (NPY and PYY, Sigma) at 10-8 M and 10-6M.
Cytokine production assay
The production of IFN- γ in the supernatants was assessed by ELISA using kit from BD Biosciences
according to the manufacturer’s instructions. Culture conditions were the same as those used for
thymidine incorporation experiments.
RNA analysis
RNA extraction and retrotranscription.
To extract total RNA, NSPCs after 10 days of culture as neurospheres, stimulated T cells and mixed
stimulated T cells/NSPCs after 3 days of culture were disrupted in Trizol® reagent (Invitrogen, Life
Technologies, Carlsbad, CA) and homogenized using syringe and needle according to the
manufacturer's specifications. Potential genomic DNA contamination was removed by treatment
with Turbo™ DNase (Ambion Inc., Austin, TX). RNA was quantified using ND-1000 UV-Vis
Spectrophotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) and RNA integrity was controlled on
agarose gel. cDNA was synthesized from 5 µg of RNA using the Moloney Murine Leukemia Virus
reverse-transcriptase kit (Invitrogen, San Diego, CA) as previously described (David et al., 1998) and
diluted to a final concentration of 100 ng cDNA/µl.
Give rise to transcripts (PCR)
Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene was used as endogenous control gene. The
primer sets used and the amplification size are shown in Table 1. Amplifications were performed on
the Gene Amp PCR system 9700 (Applied Biosystems (AB), Foster City, CA). TGFβ and IL-10 mRNA
amplifications were realized using 1 µl of RT (100 ng cDNA) and the AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase (AB) in a total volume of 25µl. Cycling condition was as followed: 10 min at 95°C and 40
cycles of 15 sec at 95ºC and 1 min at 60ºC. Other mRNAs were amplified using 1 µl of RT (100 ng
cDNA) and the Taq DNA Polymerase (Invitrogen) in a total volume of 25 µl. Cycling condition was as
156
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
followed: 10 min at 94°C and 35 cycles of 30 sec at 94ºC, 30 sec at 56°C and 1 min at 72ºC with a final
elongation of 7 min at 72°C and storage at 4°C. The PCR products were resolved on agarose gels and
stained with ethidium bromide.
mRNA expression levels (Q-PCR)
Analyses of transcripts were performed with a GenAmp 7700 sequence detection system (AB) using
SYBR Green PCR core reagents (AB). Oligonucleotides sequences are listed in Table 1. The PCR
method and the 2-∆∆Ct quantification method, after normalization to HPRT values, have been
previously described (Livak and Schmittgen, 2001). The mRNA expression level is defined as the fold
change in mRNA levels in a given sample relative to levels in a calibrator. The calibrator is the 1X
expression of each gene. The mRNA expression level is calculated as follows: mRNA expression level
= 2-∆∆Ct where ∆∆Ct = (CtTarget - CtHPRT)sample - (CtTarget - CtHPRT)CB. Specific amplifications were checked
by amplicon melting curves
(Table 1).
Flow cytometry analysis
After coculture, cells were harvested and incubated with OX35-PECy7, OX8-PE, OX39-Alexa Fluor
647, Ox39-PE, R73-Alexa Fluor 488 and FoxP3-APC for 20 min at 4°C. Fluorescent labeling was
measured using a FACS LSR II (BD Biosciences) and analyzed with FlowJo software (Tree Star, Inc.,
Ashland, OR, USA).
Statistics
Data from several experiments were pooled to obtain the mean±SEM and were analysed using the
one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post hoc tests. Results were considered significant if p values were <0.05.
157
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Results
T cell suppression by NSPCs
In order to investigate the direct effect of NSPCs on T cell proliferation, purified rat T cells derived
from spleens were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 mAbs and mixed with increasing number of
irradiated (30 Gy) NSPCs. After 3 days of co-culture, [3H]thymidine was added for the last 12 hours to
evaluate the proliferation rate of T lymphocytes. As presented in Fig. 1A, NSPCs were able to induce a
dose-dependent decrease of T cell proliferation. This effect was statistically significant with a
reduced proliferation of 27%, 64% and 93% at NSPC/T cell ratios of 1/2, 1/1 and 2/1, respectively.
Similar results were obtained when Concanavalin-A, a non-T cell receptor (TCR)-mediated mitogenic
stimulus, was used (data not shown). As the stimulation of T cells also induces the release of
cytokines, we investigated by ELISA the concentration of INFγ released in the media after 3 days of
co-culture. As shown in Fig. 1B, IFNγ concentration decreased in a dose-dependent manner in
presence of NSPCs and this inhibition was strongly correlated to the reduced T cell proliferation. To
exclude the possible influence of NSPC irradiation in the immunosuppressive activity, the
[3H]thymidine incorporation assay was performed in presence of non irradiated NSPCs. In the same
way, NSPCs were able to decrease proliferation of stimulated T cells showing that irradiation did not
influence the effect (Fig. 1C). To assess whether the immunosuppression was only cell-contact
dependent or if it could be mediated through soluble molecules released by NSPCs, media
conditioned by NSPCs for 0 to 120 hours were mixed with stimulated T cells in a 50% ratio of the
total volume. As presented in Fig. 1D, conditioned-media were able to inhibit T cell proliferation
depending on their time of conditioning, from 29% of inhibition at 48h to a complete loss of
proliferation at 96h and 120h. In the same way, the secretion of INF was significantly altered in this
condition (Fig. 1E). To confirm the implication of soluble factors in the immunosuppressive effect of
NSPCs, transwell experiments, designed to prevent cell-cell contact, were performed (Fig. 1F). NSPCs
separated by the high pore density translucent PET membrane (0,4 µm) of the transwell system
significantly reduced the proliferation of T cells for the highest dose of NSPCs used (80% of
inhibition). However, this indirect suppressive effect of NSPCs was less efficient than when T cells
and NSPCs were in direct contact. Taken together, these data suggest that NSPCs are clearly able to
inhibit T cell proliferation in a dose dependent way and that this immunosuppressive activity is
partially mediated by soluble factors.
158
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Characterization of NSPCs’ induced T cell suppression
As NSPCs were able to inhibit the proliferation of anti-CD3, anti-CD28 stimulated T cells, we next
assessed whether this effect was due to interference in the TCR-dependent signalling pathway.
Analysis of the expression of the T cell activation marker CD25 on R73 positive cells in the different
conditions by flow cytometry did not reveal any differences (Fig. 2A), suggesting that T cell activation
is not a direct target of NSPCs’ induced suppression. However when we looked at the phenotype of
R73 positive T cells, we observed an increase of CD4+/CD25+ cells (Fig. 2B) and a decrease of
CD8+/CD25+ cells (Fig. 2C) in T cells co-cultured with NSPCs at 1/1 and 1/2 ratios, compared to T
cells cultured alone. Quantification of this phenomenon revealed a significant increase of 56% (1/1
ratio) and 65% (1/2 ratio) of the CD4+ T cells (Fig. 2E) and a significant decrease of 37% (1/2 ratio)
of the CD8+ T cells (Fig. 2F) within the R73+/CD25+ cell population, suggesting that an increased
number of NSPCs could modify the expression of CD25 among T cell subpopulations. The
predominant expression of CD25 by CD4 positive T cells in the coculture led us to examine the
expression of the regulatory T cell marker FoxP3. Flow cytometry analyses didn’t reveal any
differences in the percentage of CD25+/FoxP3+ cells among the CD4 positive T cell subset within the
different conditions (Fig. 2D,G), suggesting that the suppressive effect of NSPCs was not mediated
through the induction of regulatory T cells.
Production of immunomodulatory molecules by NSPCs
Since maximal inhibition of T cell proliferation was obtained at a NSPC concentration of 2x105 (ratio
of 1 T cell/ 2 NSPCs), this concentration was used for all the following in vitro experiments, unless
specified.
To evaluate if, in our conditions, rat NSPCs could produce cytokines or enzymes known to have
immunomodulatory function, total RNAs from NSPCs were collected and submitted to RT-PCR (Fig.
3A). Analyses revealed that NSPCs were able to express mRNAs for pro-inflammatory interleukins
such as IL-6 and p35 subunit of IL-12, but there was no gene expression of anti-inflammatory
interleukins such as IL-10. However, mRNAs of both iso-enzymes of heme-oxygenase HO-1 and HO-2,
molecules known to interfere with T cell proliferation, as well as mRNA for the potent antiinflammatory cytokine TGFβ-1, were detected. An expression of these three molecules by NSPCs was
confirmed at the protein level by performing a double immunocytofluorescence using antibodies
directed against HO-1, HO-2 or Lap-1 (Latent Associated Peptide of TGFβ-1), and Nestin, an
intermediate filament expressed by NSPCs (Fig. 4). Interestingly, the transcripts for the neuroactive
molecule neuropeptide Y (NPY), known to influence immune response (data not shown), and the
neuronal nitric-oxide synthase (nNOS) were detected in NSPCs in the absence of T cells, but not the
159
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
inducible form (iNOS) nor indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) (Fig. 3A). We also analysed the mRNA
expression of these molecules in stimulated T cells or in the co-cultured cells. The major differences
in between the different conditions is the clear appearance of IL-4, IDO and iNOS transcripts and the
down regulation of nNOS mRNA in the co-culture. Quantification of IL-4, IDO, HO and NOS were
performed by Q-PCR (Fig. 3B). Concerning IL-4, IDO and HO-2 mRNAs, the levels of expression in the
co-culture were not statistically different from the basal condition. However, significant differences
were detected for HO-1 and iNOS mRNAs which were increased in the co-culture compared to NSPCs
cultured alone or T cells cultured alone. These results suggest that NSPCs are constitutively able to
produce immunomodulatory molecules that could potentially influence the proliferation of T
lymphocytes, and also that a dynamic cross-talk between NSPCs and T lymphocytes seems to favour
the transcription of some of these possible suppressive factors.
Molecules implicated in NSPCs’ induced T cell suppression
Before analysing the possible implication of the different molecules described above, we sought to
verify whether inhibition of T cell proliferation was reversed by the administration of IL-2.
Stimulated T cells in presence of NSPCs were incubated with 100 U/mL of recombinant human IL-2
and T cell proliferation was assessed by [3H]thymidine incorporation. T cell reactivity was not
retrieved by administration of IL-2 (Fig. 5A), suggesting that NSPC-treated T cells were not in a state
of anergy. As growing evidence suggests that NPY could play an important role in the induction of
various immune responses, we checked if NPY was able to interfere with T cell proliferation in our
conditions. NPY (10-8M) added either on stimulated T cells in absence or presence of NSPCs did not
modify the [3H]thymidine incorporation profile of T lymphocytes (Fig. 5B) and was unable to restore
NSPCs’ induced inhibition of T cell proliferation (Fig. 5C). Same result was obtained with the
pancreatic peptide PYY (Fig. 5B, C) and when using a higher concentration (10-6M) of both peptides
(data not shown). As PYY exerts its action through NPY receptors and that Y1 receptor seems to play
a fundamental role in the immune system, we next checked the mRNA expression of the cloned NPY
receptors Y1, Y2 and Y5 by naïve or polyclonally stimulated rat T cells using RT-PCR (Fig. 5D). Even if
T cells expressed transcripts for NPY, we were unable to detect Y1, Y2 or Y5 mRNAs, suggesting that
NPY was not implicated in the proliferative or anti-proliferative events in those particular conditions.
We next assessed IDO function with its specific inhibitor 1-Methyl-D,L-tryptophan (1-MT) and the
role of TGFβ-1 using the blocking mAb 2G7, but none of these molecules were able to significantly
reverse the inhibitory effect of NSPCs on T cell proliferation (Fig. 5E,F). In the same way, suppression
assays using indomethacin (Fig. 5G) or ketoprofen (data not shown), both non selective inhibitors of
cyclooxygenase (COX) 1 and 2, demonstrated that prostaglandins were not implicated in the
immunosuppressive activity of NSPCs in our conditions. Nitric oxide (NO) is known to be involved in
160
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
several mechanisms of immunosuppression and was recently described as a potential mediator of
the immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells in combination with HO-1 (Chabannes et
al., 2007). As iNOS gene expression was up-regulated in our co-cultures and that we detected HO-1
and HO-2 in NSPCs, we asked whether these enzymes could play a role here (Fig. 5H). Although NGmonomethyl-L-arginine (L-NMMA, non selective inhibitor of NOS) used alone was unable to block the
suppressive activity of NSPCs against activated T lymphocytes, tin protoporphyrin (SnPP, inhibitor of
Heme Oxygenase) partially reversed the inhibition of T cell proliferation. This action of SnPP cannot
be attributed to a noxious effect on NSPCs as the 2 hours pre-treatment of NSPCs with SnPP did not
alter the cell viability or the potential to form neurospheres (data not shown). Interestingly, when
both inhibitors were used in combination, restoration of T cell proliferation was significantly
increased compared to SnPP alone but still remained partial (Fig. 5H). These results suggest that HO,
alone or in combination with NOS, plays a role in the immunosuppressive activity of rat NSPCs.
161
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Discussion
NSPCs are of great interest for a use in cell therapy to treat neurodegenerative diseases and immune
disorders. During the past few years, intracerebroventricular or intravenous injection of NSPCs were
shown to attenuate the course of centrally occurring autoimmune diseases such as EAE (Einstein et
al., 2003; Pluchino et al., 2003; Pluchino et al., 2005; Einstein et al., 2007). NSPCs seem to exert their
beneficial effects both in the central nervous system (Pluchino et al., 2005) and peripherally in
secondary lymphoid organs (Einstein et al., 2007; Lee et al., 2008), where they were shown to inhibit
lymph node-derived T lymphocyte proliferation (Einstein et al., 2007). If the immunosuppressive
properties of NSPCs are now well established, the mechanisms underlying the immunomodulatory
effects of these cells remain a critical and only partially resolved question. In the present work, we
sought to better describe the in vitro interactions between NSPCs and T cells. We demonstrated that,
in our conditions, NSPCs were able to suppress T lymphocyte proliferation in a dose dependent
manner. NSPCs were shown to be extremely sensitive to irradiation which induces a G1 cycle cell
arrest and triggers apoptosis through Fas/CD95 in those cells (Semont et al., 2004), possibly
inducing the production of proapoptotic molecules. As NSPCs were also shown to promote apoptosis
of effector cells expressing death receptors (encephalitogenic Th1 cells) (Pluchino et al., Nature,
2003; Pluchino et al., Nature, 2005), we sought to verify whether the immunosuppresion mechanism
exerted by NSPCs was linked to the irradiated state of these cells. This was not the case as non
irradiated NSPCs inhibited T cell proliferation in a similar way. The suppression activity of NSPCs
affected T-cell proliferative response against both TCR-dependent (anti-CD3/CD28 antibodies) and –
independent polyclonal (Concanavalin-A) stimuli but did not affect T cell activation since the
suppression was not abrogated upon in vitro administration of IL-2 and that we were unable to
detect changes in the expression of the T cell activation marker CD25. However the CD4+/CD25+ T
cell population was increased compared to the CD8+/CD25+ one when NSPCs and T lymphocytes
were cocultured, leading us to look at the induction of regulatory T cells, which is another level at
which NSPCs may modulate immune responses. In the case of MSCs, mitogen-stimulated peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) cultures in the presence of MSCs displayed an increased number of
CD4+/CD25+/FoxP3+ T cells (Maccario et al., 2005; Nauta and Fibbe, 2007). In our conditions, we
didn’t observed any differences in the percentage of CD25+/FoxP3+ cells among the CD4 positive T
cell subset when T cells and NSPCs were cocultured, suggesting that the suppressive effect of NSPCs
was not mediated through the induction of regulatory T cells. In the present work, we demonstrate
that soluble factors are involved in this phenomenon because separation of T cells and NSPCs by a
Transwell system did not prevent the inhibition of T cell proliferation. Supernatants from rat NSPCs
cultures showed inhibitory effect, suggesting that the suppressive factors seem to be constitutively
secreted by NSPCs and did not require a dynamic cross-talk between NSPCs and T lymphocytes.
162
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
NSPCs are known to be able to produce several immunoregulatory molecules according to the
species (Klassen et al., 2003). We showed by RT-PCR that these cells express transcripts for the proinflammatory interleukin IL-12 (only p35 unit, not p40), and we also confirmed the expression of IL6 and TGFβ-1 mRNAs. TGFβ has a strong antiproliferative activity on T cells in vitro (Kehrl et al.,
1986). However TGFβ blockage did not reverse the inhibition of T cell proliferation induced by
NSPCs in our conditions, showing that this molecule did not play a dominant role in this setting or
was not present in its active form. Some studies have demonstrated a role for NPY in the regulation
of immune responses (Wheway et al., 2007), in particular in EAE, in which the administration of NPY
or PYY, an agonist to the Y1 receptor, suppressed the course of the disease in mice (Bedoui et al.,
2003). Our results showed that the addition of NPY or PYY in stimulated T cells cultures did not
modify the proliferation rate of these cells. RT-PCR on naïve or polyclonally stimulated T cells RNA
revealed that although NPY transcripts were expressed, none of the receptors mRNAs could be
detected, which may explain the lack of action of this molecule in our conditions. The tryptophan
catabolising enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) suppresses immune responses through the
depletion of the essential amino acid tryptophan coupled with the production of immunosuppressive
kynuric metabolites and has been identified as a key mediator of MSC-based immunosuppression
(Jones et al., 2007; Meisel et al., 2004). Although IDO mRNA was not expressed by NSPCs cultured
alone, it was detected in the coculture. The use of 1-MT, IDO specific inhibitor, was unable to restore
T cell proliferation, leading us to search for other molecules involved in NSPCs’ induced suppression.
A recent study from Wang and colleagues highlighted the implication of nitric oxide (NO) and
prostaglandin E2 in the modulation of immune responses by NSPCs (Wang et al., 2009). In our work,
indomethacin or ketoprofen (COX inhibitors), added in the coculture, both failed to restore T cell
proliferation. This discrepancy concerning the involvement of prostaglandins between Wang study
and ours may be due to different experimental conditions or the origin of NSPCs. Regarding NO, we
observed by RT-PCR that iNOS mRNA was expressed when T cells and NSPCs were cocultured. We
also showed for the first time that NSPCs expressed transcripts for both iso-enzymes HO-1 and HO-2.
As iNOS can regulate the expression of HO-1 (Hill et al., 2005), we quantified by Q-PCR the amount of
HO-1 mRNA in the coculture and the latter appeared strongly upregulated. Since HO-1 could mediate
immunosuppression induced by MSCs (Chabannes et al., 2007), we decided to investigate its role.
Inhibition of HO, alone or in combination with inhibition of NOS, partially reversed NSPCs’ induced
inhibition of T cell proliferation. Heme oxygenases are the rate-limiting enzymes implicated in heme
degradation, catalyzing the cleavage of the heme molecule to form ferrous iron Fe2+, carbon
monoxide (CO) and biliverdin (Choi and Alam., 1996). The latter is then enzymatically reduced to
bilirubin (Ryter et al., 2006). Two main isoforms of HO have been described: the inducible form HO-1
and the constitutively expressed form HO-2 (Maines et al., 1986; McCoubrey et al., 1997). Growing
evidence suggests that the HO-1/CO pathway may act as a major inhibitor of inflammatory processes
163
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
(Ryter et al., 2006). Despite its known toxicity to living organisms exposed to critical doses, CO was
shown to inhibit T cell proliferation without affecting cell viability (Pae et al., 2004). In addition, HO
as well as NO have been implicated in the suppressive effect of MSCs and were able to modulate the
survival of grafted organs in allogenic conditions (Chabannes et al., 2007; Ren et al., 2008; Song et al.,
2003; Bouche et al., 2002). In the same way HO-1 is implicated in long term survival of cardiac
xenografts (Soares et al., 1998; Sato et al., 2001; Chabannes et al., 2007; Ren et al., 2008).
Interestingly, in a xenogenic context, NSPCs transplanted in the striatum are able to survive longer
than porcine neuroblasts (Armstrong et al., 2001). However the mechanism of this phenomenon is
still unknown and considering the new insights provided by the present work, it would be interesting
to investigate the HO-dependent NSPC-mediated immunosuppression in vivo.
Conclusion
In the present work, we examined interactions between T cells from rat spleen, and NSPCs isolated
from fetal rat brain. We showed that, in vitro, NSPCs significantly inhibited proliferation of T cells. As
revealed by supernatants and Transwell experiments, NSPC-mediated suppression of T cells involved
the action of one or many soluble factors, constitutively expressed by NSPCs or induced upon an
inflammatory context. HO inhibitor alone or in combination with NOS inhibitor partially blocked the
immunosuppressive potential of NSPCs on T cells, suggesting that these molecules may be significant
mediators of the immunomodulatory effects of NSPCs in vitro. This is the first report demonstrating
the implication of the heme oxygenase iso-enzymes in the NSPCs’ induced suppression mechanism, a
finding that would possibly contribute to a better understanding of this phenomenon in vivo.
Acknowledgments: The authors are very grateful to Dr I. Anegon and Dr .Vanhove for their helpful
advices. We also gratefully acknowledge Dr P. Brachet and Pr. J-P Soulillou for their support and
encouragement. We also express special thanks to “Etablissement Français du Sang” (EFS, Nantes)
that kindly irradiated the NSPCs. The Nestin monoclonal antibody was developed by Susan Hockfield
and obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the
NICHD and maintained by the University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA
52242. The work was supported by the “Association Française contre les Myopathies” (AFM), the
“Fédération des Groupements de Parkinsoniens” and Progreffe. V. Bonnamain was supported by a
fellowship from the Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche.
164
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Region
Forward primer
Reverse primer
Product
size (bp)
rat HPRT
TTCCTCCTCAGACCGCTTTT
CTTATAGCCCCCCTTCAGCA
262
rat IL-2
TGCCTGGAAAATGAACTCGG
GATGATGCTTTGACAGATGGCTAT
218
rat IL-4
CGGTATCCACGGATGTAACG
CGGTGCAGCTTCTCAGTGAG
287
rat IL-6
GCAAGAGACTTCCAGCCAGTT
CATCATCGCTGTTCATACAATCA
229
rat IL-10
TGCTATGTTGCCTGCTCTTACTG
TCAAATGCTCCTTGATTTCTGG
312
rat IL-12 p35
TGATGATGACCCTGTGCCTT
GCATGGAGCAGGATACAGAGC
250
rat IL-12 p40
TCATCAGGGACATCATCAAACC
CGAGGAACGC ACCTTTCTG
210
rat IL-13
ACACAAGACCAGAAGACTTCCCT
ACTGGGCTACTTCGATTTTGG
213
rat IL-17a
TGCTGTTGCTGCTACTGAACC
AACTTCCCCTCAGCGTTGAC
292
rat TGFβ
CTC AAC ACC TGC ACA GCT CC
ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC T
349
rat IFNg
TGGATGCTAT GGAAGGAAAG A
GATTCTGGTG ACAGCTGGTG
313
rat HO-1
CCACAGCTCGACAGCATGTC
GTTTCGCTCTATCTCCTCTTCCA
195
rat HO-2
CACCACTGCACTTTACTTCA
AGTGCTGGGGAGTTTTAGTG
331
rat IDO
ATCCAGACACCTTTTTCCACG
CAGCAGATCCTTCACCAACG
200
rat nNOS
ACAGCGACAATTTGACATCCA
AGGCGGTTGGTCACTTCATAC
441
rat iNOS
GACCAAACTGTGTGCCTGGA
TACTCTGAGGGCTGACACAAGG
220
Table 1: Sequences of oligonucleotides and amplicons size.
165
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Figure 1. Rat NSPCs inhibit rat-derived splenic T cell proliferation. (A-C) Cell-cell contact.
Purified T cells (105 cells/well) were stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies in the presence of
the indicated ratios (2.5x104, 5.104, 105, 2.105 cells/well) of irradiated rat NSPCs (30 Gy). (A)
[3H]thymidine incorporation was measured after 3 days. Shown are means ± SEM of triplicate wells
from 17 independent experiments (n=17). (B) After 3 days of coculture, cell supernatants were
collected and analysed for IFN-γ production by ELISA (n=3). (C) To assess the role of irradiation on
the immunosuppressive effect of NSPCs, same experiment as in A was performed using non
irradiated rat NSPCs at the indicated ratios (n=3). (D-F) Soluble factors. To determine if cell-cell
contact was required for NSPC-mediated suppression, purified T cells (105 cells/well) stimulated
with anti-CD3/CD28 antibodies were cultured for 3 days in the presence of media conditioned by
NSPCs for 0 to 120 h in a 50% ratio of the total volume. (D) [3H]thymidine incorporation was
measured to evaluate T cell proliferation (n=3) and (E) cell supernatants were collected and
analysed for IFN-γ production by ELISA (n=3). (F) Transwell chambers were used to prevent direct
cell contact between anti-CD3/CD28-stimulated T cells placed in the lower chamber (4x105
cells/well) and irradiated rat NSPCs (30 Gy) seeded in the upper chamber (105, 2x105, 4x105, 8x105
cells/well). Proliferation was assessed in the lower chamber by [3H]thymidine incorporation after 3
days of culture. Shown are means ± SEM of 3 independent experiments.
Statistical analysis: *: p<0.05 ; **: p<0.001 ; ***: p<0,0001 versus the control (stimulated T cells in the
absence of NSPCs).
166
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Figure 2. NSPCs do not interfere with T cell activation and do not induce regulatory T cells. (AF) Rat T cells (105 cells/well) were stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies in the presence of
irradiated rat NSPCs (30 Gy) at 1/1 and 1/2 ratios of T cells/NSPCs for 3 days. Flow cytometry
experiments were performed to evaluate the expression of the T cell activation marker CD25 among
the R73+ cell population (A), to analyse the percentage of CD4+/CD25+ (B) and CD8+/CD25+ (C) T
cells among the R73+ cell population, and to evaluate the proportion of regulatory T cells through the
expression of CD25 and FoxP3 markers within the R73+/CD4+ T cells (D), in the different conditions.
Quantification of the results revealed a significant increase of 56% (1/1 ratio) and 65% (1/2 ratio) of
the CD4+ T cells (E) and a significant decrease of 37% (1/2 ratio) of the CD8+ T cells (F) within the
R73+/CD25+ cell population. The percentage of FoxP3+ cells among the R73+/CD4+ T cells
remained unchanged when stimulated T cells were cultured in the presence of NSPCs, compared to T
cells alone (G). (A, E-G) Results are means of duplicates from 3 independent experiments. (B-D) Flow
cytometry dot plots are from one representative experiment out of three. Stastistical analysis : *:
p<0,05 ; **: p<0,001 ; ***: p<0,0001 versus the control (stimulated T cells in the absence of NSPCs).
167
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Figure 3. NSPCs express transcripts for a range of immunomodulatory molecules. Total RNA
from NSPCs cultured for 10 days as neurospheres and from anti-CD3/CD28-stimulated T cells
cultured alone or in the presence of irradiated (30 Gy) NSPCs at a ratio of 1 T cell for 2 NSPCs for 3
days were collected and submitted to RT-PCR (A) and quantitative real-time PCR (Q-PCR) (B), to
assess the expression of a range of immumodulatory molecules at the transcriptional level (n=3).
Stastistical analysis: *: p<0,05 ; ***: p<0,0001.
168
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Figure 4. NSPCs constitutively express HO-1, HO-2 and TGFβ-1. After 10 days of culture, NSPCs
grown as neurospheres were dissociated and plated at a concentration of 2x105 cells/cm2 onto polyL-ornithine-coated coverslips. Immunocytochemistry was performed using primary antibodies
directed against HO-1 and HO-2 and a FITC-coupled antibody against Lap-1 (Latent Associated
Peptide of TGFβ1). The immunostaining was revealed using a FITC-conjugated anti-mouse IgG
(green) and an Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit (red). Nuclei were counterstained with DAPI
(blue). Scale bar: 10 µm. Pictures are from one representative experiment out of three.
169
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Figure 5. Investigation of the molecular mechanism of NSPC-mediated T cell suppression.
Anti-CD3/CD28-stimulated T cells were cultured alone or in the presence of irradiated (30 Gy)
NSPCs at a ratio of 1 T cell for 2 NSPCs. A range of molecules and inhibitors were added to the
cultures and proliferation was measured after 3 days by [3H]thymidine incorporation. Data are mean
cpm ± SEM of triplicate wells from independent experiments (A-C, E-H). (A) Recombinant human IL2 (100 U/mL) did not antagonize the immunosuppressive activity of NSPCs (n=3). (B,C) NPY and PYY
at 10-8M added either on stimulated T cells in absence or presence of NSPCs did not modify the
[3H]thymidine incorporation profile of T lymphocytes (B) and were unable to restore NSPCs’ induced
inhibition of T cell proliferation (C), n=3. (D) RT-PCR was performed on naïve or anti-CD3/CD28
stimulated rat T cells RNA to investigate the mRNA expression of NPY, PYY and the cloned NPY
receptors Y1, Y2 and Y5. (E-G) 1-MT (200 µM, n=5), anti-TGFβ blocking mAb (50 µg/mL, n=3) and
indomethacin (INDO, 10 µM, n=3) were added to the cultures to assess the role of IDO (E), TGFβ-1
(F) and prostaglandins (G), respectively, but none of these molecules were able to significantly
reverse the inhibitory effect of NSPCs on T cell proliferation. (H) SnPP (Sn, 50 µM) or L-NMMA (LN,
1.25 mM), the specific enzyme inhibitors of HO and NOS, respectively, were added alone or together
to the culture (n=11). SnPP alone or in combination with L-NMMA partially reversed the inhibition of
T cell proliferation. Stastistical analysis: *: p<0,05 ; **: p<0,001 ; ***: p<0,0001.
170
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
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173
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
3. Discussion
L’étude des mécanismes régissant l’efficacité de la transplantation de CSPN dans plusieurs
modèles animaux de maladies du SNC comme la sclérose en plaques (Pluchino et al. 2005b ; Einstein
et al. 2007), mais également d’affections périphériques comme l’ischémie-reperfusion rénale (Wang
et al. 2009a), a permis de mettre en lumière un possible rôle immunomodulateur de ces cellules. La
réponse cellulaire T étant une composante majeure du rejet de greffe, des expériences in vitro de coculture entre CSPN et lymphocytes T ont été entreprises afin d’étudier les interactions s’établissant
entre ces deux types cellulaires. Plusieurs groupes ont ainsi pu décrire un effet suppresseur par les
CSPN de la prolifération des cellules T activées (par une stimulation TCR-dépendante ou
polyclonale). Ces données ont été obtenues avec des CSPN de rongeurs dans un contexte syngénique
(Pluchino et al. 2005b ; Einstein et al. 2007), avec des CSPN humaines dans un contexte allogénique
(Kim et al. 2009b), et avec des CSPN de porc dans un contexte xénogénique (Article 1). Néanmoins,
malgré les avantages évidents que représenterait la possibilité de contrôler ce phénomène dans une
optique thérapeutique, le mécanisme moléculaire sous-jacent à l’immunosuppression médiée par les
CSPN demeure peu compris et a, de fait, été l’objet des travaux présentés dans l’article 2 de la partie
Résultats de ce manuscrit.
Dans cette étude, nous avons choisi de travailler in vitro, dans un système allogénique, avec
des CSPN fœtales issues du cerveau total de fœtus de rats Sprague-Dawley à 15 jours de vie
embryonnaire. Ce choix fut motivé par des raisons pratiques liées à l’obtention du tissu fœtal, très
accessible chez le rat, de même que tous les outils moléculaires nécessaires à la conduite de l’étude
(séquences pour la RT-PCR et la Q-PCR, anticorps…). Par ailleurs, l’allotransplantation de CSPN
fœtales chez l’homme, malgré les interrogations éthiques qu’elle soulève, pourrait être une stratégie
thérapeutique de choix dans les affections du SNC, notamment celles présentant une composante
inflammatoire comme les maladies neurodégénératives ou la sclérose en plaques. Il nous paraissait
ainsi important de développer notre étude dans un contexte allogénique, les CSPN et lymphocytes T
de rats Sprague-Dawley différant principalement par l’expression des alloantigènes du complexe
majeur d’histocompatibilité.
Afin d’étudier les propriétés immunomodulatrices des CSPN de rat, des lymphocytes T de rat,
stimulés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28, ont été mis en présence d’une quantité croissante
de CSPN. Les analyses ont révélé que les CSPN de rat inhibent in vitro la prolifération cellulaire T de
façon dose dépendante. Contrairement aux cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui peuvent
induire une immunosuppression à des ratios CSM/cellules T très faibles de l’ordre de 1/20 (Ye et al.
2008), les CSPN ne commencent à exercer un effet inhibiteur de la prolifération lymphocytaire T qu’à
un ratio de 1 CSPN pour 2 cellules T. Cette différence d’efficacité pourrait résulter de la composition
174
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
très hétérogène des neurosphères. En effet, seulement 10 à 20% des cellules constituant les
neurosphères seraient de « vraies » cellules souches neurales (Reynolds & Weiss 1996), le reste étant
des cellules progénitrices, des précurseurs et même des cellules neurales différenciées (Gage et al.
2000). De ce fait, si l’effet suppresseur est attribuable aux seules « vraies » cellules souches neurales,
les ratios considérés dans nos conditions ne reflètent pas la réalité des évènements se déroulant dans
la co-culture, puisque l’efficacité des CSPN serait sous-estimée d’environ un facteur 10.
L’immunosuppression exercée par les CSPN serait alors, dans cette hypothèse, d’une puissance
semblable à celle décrite pour les CSM. Ceci souligne également la nécessité de découvrir un
marqueur protéique fiable (de préférence extracellulaire), permettant d’identifier, de caractériser et
de sélectionner avec certitude les cellules souches neurales, ou au moins de les discriminer parmi des
populations de cellules neurales plus différenciées, afin de les trier préalablement aux expériences.
Par ailleurs, la suppression de la prolifération des cellules T par les CSPN ne semble pas
résulter d’une inhibition de l’activation ou d’une induction de l’apoptose à un stade précoce, quelque
soit le type de stimulation : TCR-dépendante (anti-CD3/CD28) ou polyclonale (Concanavaline A). En
effet, étant donné que la privation d’IL-2 conduit à l’apoptose des lymphocytes T par la voie
intrinsèque (Lenardo et al. 1999) et l’arrêt du cycle cellulaire (Pape et al. 1998), notre première
approche a été de tester l’implication de cette cytokine dans l’immunosuppression médiée par les
CSPN. D’après nos expériences de RT-PCR, les CSPN n’inhibent pas la synthèse des transcrits IL-2 par
les lymphoctes T stimulés dans la co-culture. Même si un dosage protéique de l’IL-2 par ELISA serait
intéressant pour mettre en évidence une éventuelle différence dans la production de cette cytokine
lorsque les lymphocytes T et les CSPN sont en contact, nous avons constaté que l’addition d’IL-2
exogène ne permettait pas de réverser l’effet suppresseur des CSPN de rat. Ces premières données
suggèrent que, dans nos conditions, les CSPN de rat n’induiraient pas un éventuel état d’anergie
(normalement réversible par ajout d’IL-2 exogène) chez les lymphocytes T en empêchant leur
activation.
Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons évalué le pourcentage de cellules T portant le
marqueur d’activation CD25 (chaîne α du récepteur à l’IL-2) par cytométrie en flux. Nous n’avons pas
détecté de différence significative dans l’expression de CD25 par les lympocytes T stimulés, en
présence ou pas de CSPN, suggérant que les CSPN n’exercent pas leur effet suppresseur par blocage
de l’activation cellulaire T. En revanche, nous avons observé que parmi les cellules T CD25+, le
nombre de cellules CD4+ était augmenté par rapport aux cellules CD8+ lorsque les lymphocytes T
stimulés étaient cultivés en présence de CSPN. Ces résultats nous on donc conduit à analyser une
éventuelle induction de lymphocytes T suppressifs dans la co-culture. Néanmoins, contrairement aux
CSM (Maccario et al. 2005 ; Nauta & Fibbe 2007 ; Ye et al. 2008), l’implication des cellules T
175
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
régulatrices CD4+/CD25+/FoxP3+ dans l’immunosuppression médiée par les CSPN n’a pas pu être
mise en évidence dans nos conditions.
Parmi les données disponibles dans la littérature concernant le mécanisme suppresseur des
CSPN, l’induction de l’apoptose des lymphocytes T par ces cellules reste un fait controversé (Pluchino
et al. 2005b ; Einstein et al. 2007). Nos expériences préliminaires de marquage Annexine V/ Iodure
de propidium des lymphocytes T après 72h de co-culture en présence de CSPN de rat irradiées ont
montré une augmentation significative de 30% des cellules Annexine+/IP- (apoptose précoce)
lorsque les cellules T sont co-cultivées avec les CSPN à un ratio de : une cellule T pour deux CSPN
(1/2). Néanmoins, concernant le marquage Annexin+/IP+ (apoptose tardive/nécrose), aucune
différence significative entre les conditions n’a été observée (Fig. 33).
Comme le suggèrent les résultats de la figure 33, il se pourrait que les CSPN mettent en place,
au moins de façon partielle, un mécanisme immunosuppresseur rapide, conduisant à l’arrêt de la
prolifération des cellules T et, par voie de conséquence, à la mort de ces cellules. Des expériences de
cinétique d’inhibition de la réponse proliférative T par les CSPN de rat irradiées à 24h et 48h sont
actuellement en cours au laboratoire afin de tenter d’éclaircir ce point.
Figure 33: Etude de la mort cellulaire des lymphocytes T de rat cutivés en présence ou non de
CSPN de rat. Les lymphocytes T ont été stimulés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 et cultivés
pendant 72h en présence de CSPN de rat à différents ratios (0/1 : T stim ; 1/1 et 1/2). Les lymphocytes T
ont ensuite été marqués par un anticorps anti-TCR (R73) puis par un anticorps anti-annexine V couplé
au fluorochrome APC et contre-marqués juste avant la lecture au cytomètre de flux avec un intercalant
de l’ADN, l’iodure de propidium (IP). Le marquage annexine+/IP- correspond aux cellules en apoptose
précoce, tandis que le marquage annexine+/IP+ révèle les cellules en apoptose tardive et en nécrose. n=5.
Test statistique : Kruskal-Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn (*: p<0.05; ***:
p<0.0001).
176
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Le bénéfice des cellules souches en transplantation a aussi été associé à une suppression de la
réponse immune à travers la modulation des fonctions des lymphocytes T (Krampera et al. 2003),
des lymphocytes B (Djouad et al. 2003) et des cellules NK (Spaggiari et al. 2006). Ainsi, un effet
modulateur paracrine des CSPN est tout à fait plausible. Ces médiateurs solubles peuvent agir comme
des modulateurs fonctionnels du système immunitaire périphérique et de l’inflammation locale, et
être un mécanisme par lequel les CSPN de rat exerceraient leur effet bénéfique parallèle
d’immunomodulation.
L’effet suppresseur de médiateurs solubles dans nos conditions a été suggéré par des
expériences de Transwell et a été confirmé par l’effet inhibiteur de l’addition de surnageants de CSPN
de rat à différents temps de culture sur la prolifération des cellules T. Ces résultats sont en accord
avec de précédentes études dans lesquelles l’ajout de surnageants provenant de cultures de CSPN de
rongeurs induisait l’inhibition de la prolifération de lymphocytes T syngéniques (Einstein et al.
2003 ; Einstein et al. 2007). Nous ne pouvons toutefois pas écarter la contribution d’un éventuel
contact cellulaire dans cet effet, puisque l’intensité de la suppression en Transwell est inférieure à
celle que nous avons détectée dans les expériences de co-culture directe. Cependant, il est probable
que la contribution des facteurs solubles dans l’immunosuppression médiée par les CSPN de rat soit
plus forte que celle du contact cellulaire direct. En effet, les facteurs solubles sont plus à même de
contrôler la réponse inflammatoire dans le cerveau in vivo, étant donné la probabilité assez faible que
des CSPN transplantées par voie intracérébrale ou systémique soient en contac direct avec des
lymphocytes T dans le parenchyme cérébral.
Afin d’évaluer si, dans nos conditions, les CSPN de rat pouvaient synthétiser des cytokines ou
des enzymes connues pour interférer avec la prolifération des lymphocytes T, les ARN totaux issus
des CSPN de rat ont été collectés et analysés en RT-PCR. Les analyses ont révélé la présence d’ARNm
codant pour les Hème-oxygénases de type 1 et de type 2 (HO-1 et HO-2). Une expression au niveau
protéique de ces deux iso-enzymes a été confirmée en réalisant une double immunocytofluorescence
avec des anticorps anti-HO-1 ou HO-2 et un anticorps anti-nestine, un filament intermédiaire
exprimé par les cellules nerveuses indifférenciées. Les analyses ont également révélé la présence de
transcrits TGFβ-1 et NO synthase neuronale (nNOS), et une absence d’ARNm codant pour la forme
inductible de NOS (iNOS) ou pour l’indoléamine 2,3-dioxygenase (IDO) dans les CSPN cultivées en
l’absence de cellules T. En revanche, lors de co-cultures CSPN/cellules T, nous avons observé une
induction de l’expression des ARNm codant pour IDO et iNOS ainsi qu’une diminution de l’expression
de l’ARNm codant pour nNOS. Afin de connaître l’origine cellulaire de ces molécules, des expériences
de RT-PCR sont actuellement réalisées à partir de transcrits issus de CSPN et de lymphocytes T cocultivés en Transwell.
177
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
Une éventuelle implication de ces molécules dans les effets immunomodulateurs des CSPN a
été étudiée grâce à l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Par cette démarche, nous avons montré
pour la première fois que la voie HO-1/CO était impliquée dans l’activité immunosuppressive des
CSPN de rat, seule ou en association avec la voie NOS/NO.
Le monoxyde d’azote (NO ; Sato et al. 2007) est un gaz à diffusion rapide et une molécule
bioactive (Stamler et al. 1992). Le NO et les espèces réactives nitrées dérivées du NO peuvent
interagir avec plusieurs enzymes, canaux ioniques et récepteurs (Edwards & Rickard 2007). La
production de NO est catalysée par les nitric oxide synthases (NOS) pour lesquelles il existe trois
gènes : iNOS, inductible principalement dans les macrophages ; nNOS dans les neurones ; et eNOS
dans les cellules endothéliales. L’expression d’iNOS est inductible et joue un rôle majeur dans la
régulation immunitaire. Le NO intervient dans la fonction des macrophages, et a récemment été
montré comme affectant la signalisation du TCR, l’expression des récepteurs aux cytokines, et le
phénotype des cellules T (Niedbala et al. 2006). A haute concentration, le NO inhibe la prolifération
des cellules T dépendante du TCR ainsi que la production de cytokines (Hoffman et al. 2002 ;
Niedbala et al. 2006).
HO-1 dégrade l’hème, aboutissant à 3 catabolites : le monoxyde de carbone (CO), l’ion Fe2+ et
la biliverdine (rapidement convertie en bilirubine). Malgré sa toxicité reconnue sur les organismes
vivants exposés à des doses critiques, le CO a été montré comme inhibant la prolifération des cellules
T sans en affecter la viabilité (Pae et al. 2004), et de nombreuses études suggèrent que la voie HO1/CO est impliquée de façon majeure dans l’inhibition des processus inflammatoires (Ryter et al.
2006). De plus, HO ainsi que NOS, deux enzymes intracellulaires, interviennent directement dans
l’effet immunosuppresseur des CSM et sont capables de moduler la survie des organes greffés en
conditions allogéniques (Chabannes et al. 2007; Ren et al. 2008; Song et al. 2003; Bouche et al. 2002)
et xénogéniques (Soares et al. 1998 ; Sato et al. 2001 ; Chabannes et al. 2007 ; Ren et al. 2008). Le
mécanisme par lequel HO-1 est capable d’inhiber la prolifération des lymphocytes T allogéniques
activés par une stimulation mitogénique n’est pour l’instant pas identifié. Ce phénomène pourrait
résulter d’une inhibition de l’activation des Toll-like recepteurs (Chauveau et al. 2005 ; Shen et al.
2005) et/ou d’effets cytoprotecteurs (Nakahira et al. 2006). Dans de prochaines expériences de
transplantation intracérébrale allogénique de CSPN chez le rat sain, il serait intéressant de
cartographier in vivo la présence de HO-1, avant la greffe dans des conditions physiologiques
normales, mais aussi après la transplantation lorsque le processus inflammatoire démarre et que les
cellules immunitaires commencent à envahir le parenchyme cérébral. Par ailleurs, l’implication de
HO-1 dans les effets immunosuppresseurs des CSPN de rat pourrait été confirmée en injectant in vivo
la molécule tin-protoporphyrin IX (SnPP), un inhibiteur d’HO, dans la suspension cellulaire
transplantée. Néanmoins, les métalloporphyrines synthétiques ne traversant pas la barrière hémato-
178
_____________________________________________________________________________________________ Résultats : Article 2
encéphalique (Koeppen & Dickson 2002), la mise en place d’un protocole efficace pour vérifier cette
hypothèse risque d’être compliquée.
De façon intéressante, dans un contexte xénogénique, des CSPN de porc transplantées dans le
striatum d’un rat sain en l’absence de traitement immunosuppresseur sont capables de survivre plus
longtemps que des neuroblastes porcins (Armstrong et al. 2001 ; Article 1). Nous avons montré que
HO-1 n’était pas impliquée dans le mécanisme immunosuppresseur des CSPN de porc et cette
enzyme ne semble donc pas être impliquée dans la prolongation de la survie de la greffe dans ces
conditions. La disparité des résultats entre les CSPN de rat et de porc concernant HO-1 pourrait
s’expliquer par des différences physiologiques intrinsèques entre les différents types de cellules
souches des différentes espèces. En effet, pour les CSM de rat par exemple, il a été décrit que le SnPP
ne suffisait pas à abolir l’effet suppresseur d’une réponse allogénique alors que pour les CSM
humaines c’est le cas, à 60% (Chabannes et al. 2007).
En conclusion, bien que des études plus approfondies soient nécessaires pour identifier
toutes les molécules impliquées dans l’immunosuppression médiée par les CSPN ainsi que leur mode
d’action, notre étude suggère que HO-1, sécrétée par les CSPN de rat, pourrait jouer un rôle dans une
future stratégie thérapeutique, en transplantation et pour traiter des affections neurologiques,
notamment celles présentant une composante inflammatoire. Ces résultats viennent complèter une
étude récente publiée par le groupe de Stefano Pluchino. Ces travaux ont révélé que les CSPN
pouvaient interférer sur l’activation des cellules dendritiques myéloïdes via la sécrétion de
régulateurs de cellules souches majeurs comme les morphogènes BMP-4 ou Sonic HedgeHog (Shh),
ainsi que Noggin et Ténascine C, une protéine de la matrice extracellulaire (Pluchino et al. 2009).
Ainsi,
il
apparaît
important
de
poursuivre
les
études
mécanistiques
du
processus
immunosuppresseur des CSPN impliquant d’autres cellules immunitaires comme les cellules T
régulatrices, les cellules NK, les cellules B ou encore les cellules dendritiques, de façon à obtenir une
vision d’ensemble de ce phénomène complexe.
179
RESULTATS
COMPLEMENTAIRES
Etude des effets de l’interleukine-2 sur
la prolifération et la différenciation des
cellules souches/progénitrices
neurales
180
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
1. Introduction
De nombreuses études disponibles dans la littérature ont démontré l’effet thérapeutique des
CSPN dans plusieurs modèles animaux de maladies du SNC (Lee et al. 2005b ; Yasuhara et al. 2006 ;
Einstein et al. 2006 ; Redmong et al. 2007), notamment via une activité suppressive exercée par ces
cellules sur la prolifération des lymphocytes T activés (Pluchino et al. 2005b ; Einstein et al. 2007 ;
Articles 1 et 2). Néanmoins, de nombreuses clés manquent encore pour ouvrir la porte à des
applications cliniques. Parmi ces clés figurent l’identification précise des interactions s’établissant
entre les CSPN et les cellules immunitaires ainsi que la compréhension approfondie de la biologie
fondamentale des CSPN. En effet, peu d’informations sont disponibles concernant le
microenvironnement dans lequel les CSPN évoluent au sein des niches neurogéniques ou atypiques,
sur l’identification des facteurs leur permettant de maintenir leur statut de cellules indifférenciées et
quiescentes, mais également sur ceux les orientant vers une différenciation neuronale.
Lors de travaux conduits en 2003, Tamir Ben Hur a étudié l’effet de cytokines proinflammatoires sur la croissance, le devenir et la motilité des CSPN multipotentes. Il a notamment
observé que les CSPN de rat exprimaient les récepteurs pour le TNFα et l’IFNγ, deux cytokines TH1
plus particulièrement synthétisées par les lymphocytes T dans des conditions inflammatoires (Ben
Hur et al. 2003). De plus, cette étude a montré, par des tests d’incorporation de thymidine tritiée et
de BrdU, que le TNFα et l’IFNγ inhibaient la prolifération des CSPN cultivées sous forme de
neurosphères. Dans des conditions de culture induisant la différenciation des neurosphères, aucune
de ces deux cytokines n’influençait le devenir des CSPN en terme de lignage cellulaire, mais à
l’inverse, elles se sont montrées capables de stimuler in vitro la migration périphérique des CSPN à
partir des neurosphères (Ben Hur et al. 2003). Cette étude fut donc la première à mettre en évidence
une communication indirecte s’établissant, via des médiateurs de l’inflammation, des lymphocytes T
vers les CSPN.
De façon intéressante, lors de l’étude de Solène Sergent-Tanguy en 2006 sur la caractérisation
par cytométrie en flux de nouveaux marqueurs extracellulaires pour les CSPN (Sergent-Tanguy et al.
2006b), nous avons pu mettre en évidence l’expression, par les CSPN issues du cerveau fœtal de rat,
de l’antigène CD25 correspondant à la chaîne α du récepteur à l’interleukine 2 (IL-2 ; Tableau 2, Fig.
34).
181
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Figure 34 : Analyse par cytométrie en flux de
l’expression de CD25 dans une culture de CSPN de rat
après 10 jours de prolifération en présence de bFGF.
L’histogramme représentant le nombre d’évènements
comptés en fonction de la fluorescence émise révèle que 15,3
% des CSPN de rat dans nos conditions sont immunopositives
pour la chaîne α du récepteur à l’IL-2. Sergent-Tanguy et al.
2006b.
L’IL-2 est une cytokine de type TH1, très rapidement sécrétée lors de l’activation des
lymphocytes T. Dans des expériences de co-culture in vitro entre des lymphocytes T activés et des
CSPN de rat, il a été montré une diminution de la synthèse des transcrits IL-2 par les lymphocytes T,
sans toutefois que ce phénomène soit impliqué dans l’immunosuppression médiée par les CSPN
(Einstein et al. 2007). Dans nos conditions particulières de co-culture, nous avons pu montrer une
expression transcriptionnelle de cette cytokine par les lymphocytes T activés cultivés seuls, et par les
lymphocytes T activés et cultivés avec des CSPN de rat. Bien qu’une quantification par Q-PCR de
l’ARNm IL-2 dans nos différentes conditions de culture n’ait pas été effectuée, l’hypothèse d’une
diminution de la synthèse d’IL-2 par les CSPN pour expliquer leur mécanisme immunosuppresseur a
également été écartée par notre groupe (Article 2). Néanmoins, étant donné la présence de l’IL-2
dans le milieu de co-culture (actuellement en cours de quantification au laboratoire par des dosages
ELISA) et l’expression par les CSPN de la chaîne α de son récepteur (CD25), un rôle de cette cytokine
dans la communication moléculaire s’établissant entre les CSPN et les lymphocytes T ne peut être
exclu (Ben-Hur et al. 2003b). En effet, si l’IL-2 est connue pour son action pro-proliférative et
activatrice sur certaines cellules du système immunitaire et du SNC, ses effets sur les CSPN n’avaient
jusqu’alors jamais été investigués. Nous avons donc entrepris d’analyser in vitro les effets de l’IL-2
sur la prolifération et la différenciation des CSPN de rat.
182
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Présentation du système IL-2 / récepteur à l’IL-2
1.1. Structure de l’IL-2 et de son récepteur
L’interleukine-2 est une des cytokines les plus activement étudiée. Elle a été décrite pour la
première fois en 1976 (Morgan et al. 1976) et clonée en 1983 (Taniguchi et al. 1983). L’IL-2 humaine
consiste en une chaîne peptidique simple de 133 acides aminés correspondant à un poids
moléculaire de 15,42 kDa. L’IL-2 mature est libérée à partir d’un précurseur de 153 acides aminés,
après clivage de la partie N-terminale de 20 acides aminés. Des processus post-traductionnels
conduisent à la formation d’un pont disulfure entre les cystéines 58 et 105, ainsi qu’à l’ajout de
carbohydrates sur la thréonine 3. L’intégrité du pont disulfure est crucial pour la bioactivité de la
cytokine, tandis que la glycosylation n’apparaît pas être essentielle puisqu’une IL-2 recombinante
non glycosylée montre des effets biologiques similaires à l’IL-2 naturelle (Thompson & Di Sabato
1988).
Le récepteur à l’IL-2 (IL-2R) est composé de trois sous unités : IL-2Rα (aussi connue comme
CD25 ou Tac), IL-2Rβ (p75, CD122) et IL-2Rγ (γ commun, γc, p64, CD132). Ces unités travaillent de
concert pour coordonner et transmettre des signaux spécifiques. La combinaison trimérique αβγ
représente le complexe IL-2R de haute affinité (Fig. 35).
Figure 35: Schéma du récepteur à l’interleukine-2.
L’interleukine-2 (IL-2) est une cytokine sécrétée qui se lie à un
récepteur hétérodimérique préformé de haute affinité
comprenant la chaîne α propre à l’IL-2R (IL-2Rα), la chaîne β
de l’IL-2/15R (IL-2Rβ) et la chaîne commune aux récepteurs
aux cytokines (γc). Adapté de Waldmann 2006.
IL-2Rα, seule, lie la cytokine avec une faible affinité et ne contribue pas directement à la
transmission du signal, du fait de sa courte queue intra cytoplasmique (Leonard et al. 1985). A
l’inverse, IL-2Rβ et IL-2Rγ sont nécessaires et suffisantes pour un signal effectif (Nakamura et al.
1994). Les chaînes β et γ seules ne lient pas l’IL-2 de façon détectable, mais elles s’associent pour
former un dimère fonctionnel qui lie l’IL-2 avec une affinité intermédiaire. Une des caractéristiques
de l’IL-2R est que d’autres récepteurs aux cytokines partagent ses sous-unités. Alors que CD25 est
183
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
propre à l’IL-2R, IL-2Rβ forme une partie essentielle du récepteur trimérique à l’IL-15. La chaîne γc
fait quant-à elle partie des complexes récepteurs à l’IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 et IL-21 (Ozaki & Leonard
2002).
1.2. Activités biologiques de l’IL-2
L’IL-2 exerce ses effets sur de nombreux types cellulaires, mais principalement sur les
lymphocytes T. En effet, une des conséquences les plus rapides de l’activation des cellules T à travers
leur récepteur à l’antigène est la synthèse de novo d’IL-2. Ce phénomène est rapidement suivi par une
augmentation de l’expression de l’IL-2R à haute affinité, et d’une expansion rapide et sélective des
populations cellulaires T CD4+ et CD8+ activées par l’antigène (Lenardo et al. 1999). La nature
transitoire de la sécrétion d’IL-2 dépend de son induction trancriptionnelle par les signaux
provenant du TCR (récepteur aux cellules T) et de la stabilisation de l’ARN messager (ARNm) IL-2
par les signaux de costimulation, suivi de l’extinction transcriptionnelle du gène de l’IL-2 et de la
rapide dégradation du transcrit (Shaw et al. 1988; Fraser et al. 1991). Une boucle d’autorégulation
classique dans laquelle l’IL-2 inhibe sa propre production a récemment été décrite (Villarino et al.
2007; Gong & Malek 2007). Cette boucle d’autorégulation dépend de l’activation de Stat-5 et de
l’induction, dépendante de l’IL-2, du répresseur de transcription Blimp-1. Ainsi, après activation par
l’antigène d’une cellule T naïve, l’IL-2 est produite et l’IL-2R à haute affinité est alors exprimé. L’IL-2
sécrétée se lie alors à son récepteur, ce qui active Stat-5 qui induit Bimp-1et finalement conduit à la
répression du gène de l’IL-2 (pour revue : Malek 2008).
La prolifération induite par l’IL-2 intervient via des signaux pro-prolifératifs médiés par les
proto-oncogènes c-myc et c-fos, en association avec des signaux anti-apoptotiques médiés par les
membres de la famille Bcl-2 (Miyazaki et al. 1995). Plus récemment, il est apparu qu’en plus des
signaux anti-apoptotiques, l’IL-2 favorisait la survie à long terme des cellules T grâce à son action sur
le métabolisme cellulaire et la glycolyse (Frauwirth & Thompson 2004). Paradoxalement à ces
résultats, il a été observé que les souris knock-out (KO) pour l’IL-2 développaient une autoimmunité
(Huang et al. 2009). Ceci suggère donc que l’IL-2 pourrait intervenir en inhibant certaines réponses
immunes. Les mécanismes de cette inhibition n’ont pas clairement été démontrés, mais les travaux
de Refaeli et al. indiquent que l’IL-2 serait capable d’activer une voie de signalisation proapoptotique dans les cellules T activées via l’augmentation de l’expression de Fas Ligand (FasL ;
Refaeli et al. 1998). Par ailleurs, les résultats de Malek et al. suggèrent que l’IL-2 pourrait prévenir le
développement d’une autoimmunité en contrôlant l’éducation des cellules T régulatrices CD4+ CD25+
lors du développement du thymus (Malek et al. 2002).
184
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
En plus de ses effets sur les cellules T, l’IL-2 est, avec l’IL-15, un facteur de croissance pour les
cellules natural killer (NK). Il a également été montré qu’un traitement des cellules NK par l’IL-2
stimulait leur production de cytokines comme le TNFα, l’IFNγ et le GM-CSF (facteur stimulant la
formation de colonies de granulocytes macrophages).
Un certain nombre de fonctions de l’IL-2 sur les cellules B ont aussi été identifiées, la plupart
étant relatives à la sécrétion d’anticorps. En effet, en synergie avec l’IL-15, l’IL-2 contrôle l’activation
des lymphocytes B et leur différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps (Jelinek et al. 1986).
Comme dans les cellules T, cette cytokine promeut l’expression de CD25 par les cellules B,
augmentant ainsi leur réponse à l’IL-2. Enfin, les cellules lymphokine-activated killer (LAK), les
monocytes et les macrophages répondent à l’IL-2 par une augmentation de leur activité ou de leur
prolifération (Minami et al. 1992).
1.3. Rôles physiologiques de l’IL-2 et applications cliniques
Les études sur les souris knock-out (KO) pour l’IL-2 et l’IL-2R indiquent un rôle important de
l’IL-2 pour le maintien de l’homéostasie immune. En effet, cette cytokine stimule l’expansion de
pratiquement tous les types de cellules T activées et, bien que d’autres cytokines soient partiellement
redondantes avec l’IL-2 sur ce point, cette dernière est vitale pour la détermination de l’amplitude et
de la durée des réponses immunes primaires et mémoires (Malek 2008). L’IL-2 joue également un
rôle central dans la diminution des réponses immunitaires et son absence résulte en une
autoimmunité sévère due à l’impossibilité d’éliminer les cellules T activées (Kündig et al. 1993).
Enfin, des études récentes suggèrent un rôle du complexe IL-2/IL-2R dans l’éducation et la fonction
des cellules T régulatrices (Zheng et al. 2007).
De part son action sur la prolifération et l’activation des populations cellulaires T, l’IL-2 a
trouvé ses premières applications cliniques dans les années 1980 pour le traitement des tumeurs.
Actuellement, l’IL-2 recombinante possède deux applications cliniques principales : une utilisation
comme thérapie anti-tumorale pour le mélanome et le carcinome rénal (Glaspy 2002), ainsi qu’une
utilisation comme thérapie immunitaire chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience
humaine (VIH) (Kovacs et al. 1996). La façon dont l’IL-2 fonctionne précisément comme thérapie
anticancéreuse n’est pas claire. Néanmoins, il semble que l’IL-2 exogène soit capable de promouvoir
une réponse anti-tumorale médiée par les lymphocytes T cytotoxiques (Glaspy 2002). Par contre, il a
été observé un nombre accru de cellules T CD4+ chez les patients infectés par le VIH et traités par de
l’IL-2. Des études visant à caractériser cette population ont montré une expansion périphérique
sélective des cellules T naïves CD4+ CD25+ (Sereti et al. 2002).
185
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Malgré ses effets bénéfiques, un traitement par l’IL-2 n’est pas dénué d’effets secondaires
graves au niveau périphérique mais également au niveau du système nerveux central. Ces derniers
incluent en particulier des anomalies neuroendocrines ainsi que des symptômes neurologiques et
neuropsychiatriques (Tartour et al. 1992; pour revue : Hanisch & Quirion 1995). Ces effets
secondaires ne sont pas surprenants puisque l’IL-2 administrée en systémique peut atteindre
certaines régions du cerveau. Il a été rapporté que l’IL-2 peut traverser la barrière hématoencéphalique par des mécanismes de transport saturable et non-saturable (Saris et al. 1988;
Waguespack et al. 1994). L’IL-2 et l’IL-2R ont été détectés dans le SNC (Lapchak et al. 1991) et l’IL-2
endogène produite par le cerveau pourrait jouer un rôle important dans la médiation des effets
neurorégulateurs et dans les affections du SNC. Ainsi, en plus d’être un facteur immunorégulateur,
cette cytokine agirait également comme modulateur des fonctions neuroendocrines et neurales
(Hanisch & Quirion 1995).
1.4. IL-2 et système nerveux central
Il existe peu de données sur les effets de l’IL-2 dans le SNC, mais il a été montré de façon
claire une immunoréactivité anti-IL-2 ainsi que l’expression de transcrits IL-2-like, à la fois dans
certains tissus cérébraux et dans des cellules neurales en culture (Jiang & Lu 1998). Dans le cerveau
des rongeurs, l’expression de l’IL-2 a été localisée dans des régions spécifiques incluant
l’hippocampe, le cortex fronto-pariétal, le striatum, le septum et l’hypothalamus. Au niveau cellulaire,
des neurones et des cellules gliales, en particulier les astrocytes, apparaissent capables de
synthétiser l’IL-2 et les protéines constituant l’IL-2R, in vivo (Hanisch & Quirion 1995). Des
expériences d’immunomarquage pour IL-2Rα ont montré une distribution neuroanatomique
semblable à celle de l’IL-2, et une expression par tous les types cellulaires du cerveau. En revanche,
les sites de liaisons de l’IL-2 marquée par l’iode 125 ([125I]IL-2) n’ont été détectés que dans
l’hippocampe et la couche moléculaire du cortex cérébelleux, où IL-2Rβ semble aussi être exprimée
(Lapchak et al. 1991; Petitto & Huang 1994). Concernant la chaîne γc, les données relatives à sa
synthèse dans les cellules et tissus du SNC sont assez rares. Des expériences de PCR suggèrent une
expression des
transcrits codant pour IL-2Rγ
dans des
lignées cellulaires humaines
d’oligodendrogliome (TC620.6A2) et d’astrocytome (U251) mais néanmoins cette expression n’a pu
être confirmée par Northern Blot ni dans TC620.6A2, ni dans diverses régions du cerveau humain
adulte (Otero & Merrill 1995). Petitto et al. ont cloné et séquencé la région codante de l’ADN
complémentaire IL-2Rγ à partir de cerveaux humain et murin (Petitto et al. 1998). Cette même étude
indique que IL-2Rγ interviendrait dans la toxicité induite par l’IL-15 sur les neurones hippocampaux.
Ces données suggèrent que, comme pour les lymphocytes, IL-2Rγ pourrait jouer un rôle essentiel
186
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
dans le cerveau en tant que chaîne commune pour plusieurs récepteurs aux cytokines. D’un point de
vue fonctionnel, il a été rapporté que l’IL-2 stimule la prolifération des oligodendrocytes alors qu’elle
n’a apparemment pas d’effets mitogènes sur les astrocytes (Benveniste & Merrill 1986). Une
augmentation de l’expression de la protéine basique de la myéline (MBP) a également été observée
après un traitement par l’IL-2 d’oligodendrocytes de rat en culture (Benveniste & Merrill 1986), mais
en revanche cette cytokine semble être cytotoxique pour ce type cellulaire dans certaines conditions
particulières (Curatolo et al. 1997). Un effet de l’IL-2 sur la survie a été montré dans des cultures de
cellules microgliales et de neurones néocorticaux de rat (Shimojo et al. 1993). Elle régulerait aussi
l’activité des neurones et la libération de nombreux neurotransmetteurs et neuropeptides (pour
revue : de Araujo et al. 2009). Enfin, elle semble jouer un rôle modulateur dans la transmission
cholinergique au sein de l’hippocampe (Petitto & Huang 1994), mais aussi dans la sécrétion de
certains facteurs et hormones au niveau hypothalamique et pituitaire, tels que le CRF (facteur de
libération de l'hormone corticotrope), l’AVP (arginine vasopressine) ou encore l’ACTH (hormone
adrénocorticotrope ; Cambronero et al. 1992). Du fait de ses actions sur les cellules gliales,
neuronales et neurosécrétrices, il apparaît clairement que l’IL-2, tout comme d’autres cytokines, est
un agent important de la communication moléculaire s’établissant entre le SNC et le système
immunitaire.
187
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
2. Résultats
L’analyse de l’expression de différents antigènes extracellulaires dans des cultures de CSPN
de rat par cytométrie en flux a révélé l’existence d’une sous-population cellulaire immunoréactive
pour OX39, un anticorps spécifique de la chaîne α du récepteur à L’IL-2 (Jacques et al. 1988). L’effet
de cette cytokine sur les CSPN étant, à ce jour, encore inconnu, nous avons entrepris d’analyser l’effet
de l’IL-2, in vitro, sur la prolifération et la différenciation des CSPN.
2.1. Effet direct de l’IL-2 sur la prolifération des CSPN
Les CSPN issues de cerveaux totaux de fœtus de rat à 15 jours de vie embryonnaire ont été
préparées selon le protocole décrit dans la section Matériels et Méthodes de ce manuscrit. Dans ce
cas précis, les CSPN ont été cultivées dans des puits de plaques 6 puits (volume : 3 mL) à une
concentration de 20 000 cellules/mL, en l’absence de facteurs de croissance (milieu N2 seul), en
présence de bFGF à 25 ng/mL (condition de référence), ou en présence d’interleukine-2. Plusieurs Il2 ont été testées : IL-2 naturelle de rat O-glycosylée (5 U/mL), IL-2 recombinante humaine Oglycosylée (0.25 ng/mL), IL-2 recombinante humaine non glycosylée (Proleukin®, 100 U/mL) et IL-2
recombinante de rat non glycosylée (5 U/mL). Après 5 jours de culture, le taux de prolifération des
CSPN des différentes conditions a été évalué par incorporation de thymidine tritiée durant les 12
dernières heures de la culture (Fig. 36a), et par un comptage de la totalité des neurosphères
présentes dans chaque puits (Fig. 36b). L’analyse des données a montré que seule l’IL-2 naturelle de
rat était capable de stimuler la prolifération des CSPN, d’une manière toutefois beaucoup moins
efficace que le bFGF (Fig. 36a). Par contre, de façon intéressante, le même nombre de neurosphères
formées avait pu être compté dans chacune des deux conditions (Fig. 36b). Cet effet pro-prolifératif
commun mais néanmoins de puissance inégale sur les CSPN suggère que le mode d’action de ces
deux facteurs de croissance est différent.
188
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Figure 36 : Effet de l’interleukine-2 sur l’incorporation de thymidine tritiée (a) et sur le
nombre de neurosphères formées (b) dans une culture de cellules souches/progénitrices
neurales à 5 jours. Les CSPN ont été cultivées sans facteur de croissance (N2, contrôle négatif), en
présence de b-FGF à 25 ng/mL (FGF, contrôle positif) ou en présence de différents types d’interleukine2 : IL-2 naturelle de rat O-glycosylée à 5 U/mL (IL2 nat), IL-2 recombinante humaine O-glycosylée à
0.25 ng/mL (IL2 hcx), IL-2 recombinante humaine non glycosylée à 100 U/mL (hIL2) et IL-2
recombinante de rat non glycosylée à 5 U/mL (rIL2). n=3. Test statistique : Kruskal-Wallis suivi du test
de comparaison multiple de Dunn (*: p<0.05; ***: p<0.0001, par rapport à la condition FGF).
Après avoir déterminé le type d’IL-2 permettant de stimuler la prolifération des CSPN, nous
avons réalisé des expériences de dose-réponse afin de déterminer la concentration optimale d’IL-2
naturelle de rat à utiliser (Fig. 37a). Cinq concentrations différentes d’IL-2 ont été testées sur une
culture de CSPN de rat (0.1 U/mL, 1 U/mL, 5 U/mL, 10 U/mL et 100 U/mL). Après 5 jours de
prolifération, le nombre total de neurosphères présentes dans les puits de chaque condition a été
évalué par une méthode de comptage et comparé à celui obtenu pour le contrôle positif (bFGF) et le
contrôle négatif (N2 seul). Les analyses ont montré que le nombre de neurosphères primaires
formées varie en fonction de la concentration en IL-2. Le nombre maximal de neurosphères a été
obtenu pour une concentration de 10 U/mL. Cette dernière semble être une concentration plateau
puisqu’une diminution de 50 % de la quantité de neurosphères comptées a été observée à 100 U/mL
d’IL-2. Au vu de ces résultats, nous avons choisi d’adopter, pour les expériences suivantes, une
concentration d’IL-2 de 5 U/mL. En effet, celle-ci permet d’obtenir un nombre de neurosphères non
significativement différent de celui obtenu en présence de bFGF (Fig. 37a), ce qui pourrait permettre
une comparaison plus aisée des effets dispensés par ces deux molécules sur les CSPN.
Des études de cytométrie en flux menées au laboratoire avaient révélé l’expression de la
chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25) à la surface de CSPN cultivées 10 jours en présence de bFGF.
Nous avons ainsi voulu analyser l’expression de CD25 lors d’un traitement des CSPN par l’IL-2
naturelle de rat à 5 U/mL après 5 jours de culture, au niveau transcriptionnel par RT-PCR (Fig. 37b)
189
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
et protéique par immunocytofluorescence (Fig. 37c). Les résultats ont mis en évidence la présence
d’ARNm CD25 ainsi que celle de cellules positives pour CD25 après une culture en IL-2, ce qui a
également été confirmé par cytométrie en flux.
Figure 37 : Analyse dose réponse de l’effet de l’IL-2 sur le nombre de neurosphères primaires
formées dans une culture de CSPN (a). Mise en évidence par RT-PCR (b) et
immunocytofluorescence (c) de l’expression de la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25) par
des CSPN de rat cultivées en présence d’IL-2. (a) Comptage des neurosphères formées après 5 jours
de culture de CSPN en l’absence de facteurs de croissance (N2), en présence de 25 ng/mL de bFGF ou de
concentrations croissantes d’IL-2 naturelle de rat (0.1 ; 1 ; 5 ; 10 et 100 U/mL). n=3. Test statistique :
Kruskal-Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn (*: p<0.05; ***: p<0.0001, par rapport à la
condition FGF). (b) Après 5 jours de prolifération en présence de 5 U/mL d’IL-2 naturelle de rat, les
neurosphères ont été collectées et les ARN totaux extraits et soumis à une rétro-transcription. Les ADNc
obtenus ont été amplifiés par PCR et analysés sur gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium (BET).
L’hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) a été utilisée comme gène de référence. (c)
Les neurosphères ont été projetées sur lame de verre par cytospin (800 tour/min, 4 min). Les cellules ont
été incubées avec l’anticorps OX-39 anti-CD25 puis avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris
couplé au FITC. Les flèches blanches représentent les cellules immunomarquées.
Les neurosphères cultivées en présence d’IL-2 ne présentent pas de différences
morphologiques majeures comparativement à celles cultivées en présence de bFGF (Fig. 38a). Afin de
déterminer si les neurosphères primaires obtenues par l’ajout d’IL-2 dans le milieu de culture
résultent bien d’une prolifération cellulaire et non d’une simple agrégation, du BrdU a été ajouté au
troisième jour de culture, à raison de 10 µg/mL. A 5 jours de culture, les neurosphères ont été
collectées et projetées sur lame de verre par cytospin. L’intégration du BrdU dans l’ADN des cellules
a ensuite été analysée par immunocytochimie à l’aide d’un anticorps anti-BrdU (Fig. 38b). Bien que le
marquage soit plus faible que celui obtenu pour les conditions de culture en présence de bFGF, ce qui
est cohérent avec nos expériences d’incorporation de thymidine tritiée (Fig. 36a), le nombre de
190
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
cellules positives pour le BrdU après exposition à l’IL-2 est conséquent. Une quantification précise de
ce marquage sera réalisée par cytométrie en flux.
Les lames de cytospin des neurosphères cultivées pendant 5 jours en présence d’IL-2 ont
également été utilisées pour analyser l’expression de la nestine par immunocytofluorescence. Les
résultats ont montré que les neurosphères résultant d’une culture en présence d’IL-2 sont bien
immunopositives pour la nestine, ce qui confirme leur statut d’entité cellulaire majoritairement
indifférenciée (Fig. 38c).
Figure 38 : Analyse de la morphologie (a), de la prolifération (b) et de l’expression de la
nestine (c) des neurosphères primaires après 5 jours de culture en présence de bFGF ou d’IL2 naturelle de rat. Les CSPN de rat ont été ensemencées à une densité de 20 000 cellules/mL en
présence de b-FGF (25 ng/mL) ou d’IL-2 (5 U/mL). Après 5 jours de prolifération, les neurosphères
formées ont été observées en microscopie optique aux grossissements x40 et x200 (a), puis collectées et
projetées sur lame de verre par cytospin (800 tour/min, 4 min). Le marquage immunocytochimique a
été réalisé avec un anticorps anti-BrdU suivi d’une incubation avec un anticorps secondaire anti-IgG de
souris couplé à la biotine. Le marquage a été amplifié par la streptavidine couplée à la péroxydase puis
révélé par le kit DAB (b). L’immunofluorescence a été réalisée par incubation des cellules avec un
anticorps monoclonal anti-nestine suivi d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé au FITC (c).
Dans l’objectif de comprendre pourquoi les neurosphères formées en présence
d’interleukine-2 sont de même morphologie (Fig. 38a) et aussi nombreuses que celles formées avec
le bFGF (Fig. 36b), mais moins prolifératives d’après les analyses d’incorporation de thymidine tritiée
(Fig. 36a) et de BrdU (Fig. 38b), nous avons entrepris de caractériser la taille des neurosphères dans
les deux conditions, ainsi que le nombre de cellules vivantes après dissociation mécanique (Fig. 39).
191
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Figure 39 : Analyse du diamètre moyen des neurosphères formées (a) et du nombre de
cellules vivantes après dissociation mécanique (b), en fonction des conditions de culture des
CSPN. Après 5 jours de prolifération en présence de bFGF à 25 ng/mL ou d’IL-2 naturelle de rat à 5
U/mL, la taille des neurosphères formées a été évaluée en estimant en microscopie optique le diamètre
moyen de chaque neurosphère à l’aide d’une règle micrométrique (a). Après dissociation des
neurosphères issues des deux conditions de culture, le nombre de cellules vivantes a été déterminé par
comptage cellulaire sur lame de Burker dans l’éosine (b). n=3. Test statistique : Two-way ANOVA suivi
du test post-hoc de Bonferroni (a) et test U de Mann et Whitney (b) (*: p<0.05, par rapport à la
condition FGF).
Il s’est avéré que les neurosphères obtenues en présence de bFGF et d’IL-2 ne diffèrent pas
significativement au niveau de leur taille (Fig. 39a). La majorité d’entre elles ont un diamètre moyen
inférieur à 100 µm, plus précisément compris entre 50 et 100 µm (données non montrées). Pour
autant, il est à noter que l’on retrouve plus de neurosphères de petite taille après une culture en
présence d’IL-2 et que cette cytokine ne permet pas la formation de grosses neurosphères de plus de
200 µm de diamètre. De même, après dissociation mécanique des neurosphères des deux conditions,
les cellules vivantes ont été comptées sur lame de Burker en éosine (Fig. 39b). Il est apparu que pour
une même quantité de neurosphères, le nombre de cellules vivantes est significativement plus faible
après une culture en présence d’IL-2. Ceci, à la lueur des résultats obtenus sur la prolifération des
CSPN en thymidine tritiée (Fig. 36a), pourrait signifier que l’IL-2 stimule la prolifération des cellules
souches neurales très précocement, de façon à initier la formation des neurosphères, mais qu’ensuite
son action diminue. Il se peut en effet qu’elle ne puisse plus stimuler la prolifération des cellules
souches neurales se trouvant au sein de la neurosphère, ou qu’elle agisse spécifiquement sur une
population de cellules progénitrices beaucoup moins prolifératives, influençant ainsi le nombre de
cellules engendrées et, indirectement, la taille des neurosphères.
192
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
2.2. Effet indirect de l’IL-2 sur la différenciation des CSPN
Si l’ajout d’IL-2 dans une culture de CSPN permet, comme le bFGF, d’induire la prolifération
des cellules sous forme de neurosphères exprimant la nestine, il est néanmoins possible que ces deux
molécules influent différemment sur le devenir des CSPN en conditions de différenciation. Après des
conditions classiques de culture en présence de bFGF, les CSPN peuvent se différencier dans les trois
types cellulaires majeurs du SNC, que sont les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes (Gage
2000). Néanmoins, il est à noter que la différenciation en astrocytes est très majoritaire (Reynolds &
Weiss 1992). Nous avons donc entrepris d’étudier le phénotype des cellules différenciées à partir de
CSPN cultivées en présence d’IL-2.
Après 5 jours de prolifération en présence de bFGF (25 ng/mL) ou d’IL-2 (5 U/mL), les
neurosphères, soit entières soit dissociées enzymatiquement à la trypsine, ont été récupérées et
ensemencées sur lamelles de verre préalablement traitées à la polyornithine (50 µg/mL), dans du
milieu complet (10% SVF) pendant une nuit pour laisser les cellules adhérer. Le lendemain, le milieu
a été remplacé par du milieu défini N2, sans bFGF ou IL-2, afin de permettre l’engagement du
processus de différenciation. Le protocole détaillé de la mise en différenciation des CSPN est
disponible dans la section Matériels et Méthodes de ce manuscrit. Après 5 jours de différenciation,
des photographies ont été prises en microscopie optique afin de comparer la morphologie des
neurosphères différenciées après culture en bFGF ou IL-2. Des marquages immunocytochimiques
avec des anticorps contre TUJ-1, la GFAP et RIP (marqueurs de neurones, d’astrocytes et
d’oligodendrocytes, respectivement) ont également été réalisés sur les cellules issues des
neurosphères IL-2 différenciées, afin d’en examiner le phénotype (Fig 40).
193
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Figure 40 : Comparaison de la morphologie des neurosphères et du phénotype des cellules les
constituant en conditions de différenciation, après une culture en présence de bFGF ou d’IL-2.
Après 5 jours de prolifération, les neurosphères ont été collectées et mises à différencier, intactes ou
après dissociation enzymatique sur lamelles de verre préalablement traitées à la polyornithine (50
µg/mL). Après 5 jours de différenciation, la morphologie des neurosphères a été observée par
microscopie optique, et des marquages immunocytochimiques ont été réalisés sur les cellules dissociées.
Ces dernières ont été incubées avec les anticorps monoclonaux anti-GFAP, TUJ-1 et RIP, puis avec un
anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la biotine. Le marquage a été amplifié par la
streptavidine couplée à la péroxydase puis révélé par le kit DAB (Vector). Des photographies des
neurosphères et des cellules immunomarquées ont été prises lors de l’observation par microscopie
optique aux grossissements x40 et x100.
Ces expériences ont mis en évidence une différence de morphologie très nette des
neurosphères bFGF et IL-2 après 5 jours de différenciation. Alors que les neurosphères résultant
d’une culture en bFGF présentent une morphologie étalée, avec des cellules isolées migrant en
périphérie, les neurosphères issues d’une culture en IL-2 émettent des prolongements plus longs,
fins et ramifiés, qui rayonnent en périphérie alors que le cœur de la neurosphère semble, lui, rester
indifférencié (Fig. 40). Les marquages immunocytochimiques réalisés sur les cellules différenciées
issues de la dissociation des neurosphères cultivées en IL-2 a permis de démontrer la présence de
194
________________________________________________________________
_____________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
cellules positives pour les marqueurs classiques
classiques d’astrocytes, de neurones et d’oligodendrocytes,
tout comme ce qui est observé pour les cellules issues des neurosphères cultivées en bFGF (Fig. 40).
Ces résultats indiquent
quent que la culture de CSPN en présence d’IL-2
d’IL 2 permet de conserver la capacité
capacit de
multipotence de ces cellules.
Nous avons ensuite voulu vérifier, par des marquages immunocytofluorescents sur
neurosphères entières après 5 jours de différenciation (Fig. 41) si le profil d’expression des
marqueurs de cellules neurales par les neurosphères
neurosphères différenciées issues d’une culture de CSPN en
IL-2
2 était identique à celui obtenu pour la condition classique de culture en bFGF (présentant de
façon intrinsèque une différenciation majoritaire en astrocytes).
Figure 41 : Etude par immunocytofluorescence
immunocytofluorescence de la différenciation des neurosphères issues
d’une culture en présence de bFGF (25 ng/mL) ou d’IL-2 (5 U/mL). Après 5 jours de
différenciation sur lamelles de verre coatées à la polyornithine (50 µg/mL), les neurosphères ont été
doublement marquées
rquées par un anticorps polyclonal anti-GFAP
anti GFAP (astrocytes) et un anticorps monoclonal
TUJ-1
1 (neurones). Les cellules ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires anti-IgG
anti
de lapin
couplé à l’Alexa-568
568 (en rouge) et anti-IgG
anti
de souris couplé au FITC
TC (en vert). Les neurosphères ont été
observées en microscopie optique à fluorescence au grossissement x20.
Ces résultats démontrent que dans les deux conditions (bFGF et IL-2),
IL 2), des cellules positives
pour la GFAP et TUJ-1
1 se différencient au sein d’une
d’une même neurosphère. Néanmoins, il apparaît
qu’après culture en présence d’IL-2,
d’IL 2, les neurosphères se différencient de façon très importante en
des cellules d’un phénotype neuronal, positives pour TUJ-1
TUJ (Fig. 41).
). Ces cellules d’un point de vue
strictement qualitatif
itatif semblent plus nombreuses que les cellules positives pour la GFAP. Ainsi la
195
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
culture de CSPN en présence d’IL-2 perturberait la balance astrocytes/neurones après
différenciation des cellules, cette balance étant normalement en faveur d’une différenciation
astrocytaire dans les conditions classiques de culture en bFGF.
Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons débuté des expériences de quantifications par
cytométrie en flux. Après 5 jours de prolifération des CSPN en présence de bFGF (25 ng/mL) ou d’IL2 naturelle de rat (5 U/mL), les neurosphères dissociées par traitement enzymatique ont été placées
en conditions de différenciation pendant 5 jours. Les cellules ont ensuite été collectées,
immunomarquées avec des anticorps anti-nestine, anti-GFAP et TUJ-1 puis analysées en cytométrie
en flux. Les résultats préliminaires ont montré que le pourcentage de cellules TUJ-1+ était
significativement augmenté dans la condition IL-2 par rapport à la condition bFGF (Fig. 42), sous
toutefois mettre en évidence de différences pour les marquages Nestine et GFAP. Ces observations
restent à confirmer en renouvelant les expériences de quantification par cytométrie en flux, et
également en réalisant des comptages cellulaires en microscopie optique à fluorescence après
immunomarquage des cellules dissociées mises à différencier sur lamelles de verre.
Figure 42 : Quantification par cytométrie en flux de l’expression des marqueurs Nestine, GFAP
et TUJ-1 par des cellules issues de la différenciation de neurosphères cultivées en présence de
bFGF ou d’IL-2. La condition bFGF sert de référence et les résultats pour la condition IL-2 sont
exprimés en pourcentage de la condition bFGF. n=3. Test statistique : Kruskal-Wallis suivi du test de
comparaison multiple de Dunn (***: p<0.0001, par rapport à la condition FGF).
196
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
3. Discussion
Avec les tumeurs cérébrales et les maladies vasculaires, les maladies dégénératives
constituent les affections les plus fréquentes du système nerveux central. Leur relative fréquence, la
sévérité de leurs atteintes et l'absence de thérapeutique efficace en font un problème majeur de
santé publique. Parmi les voies de recherche explorées, les stratégies de restauration des populations
neuronales perdues par greffe intracérébrale de CSPN sont porteuses d’espoir. Toutefois cette
approche présente un inconvénient notoire puisque les CSPN se différencient préférentiellement en
cellules gliales, plus particulièrement en astrocytes, peu en oligodendrocytes et de façon très
minoritaire en neurones (Reynolds & Weiss 1992). Dès lors, il est important de rechercher des souspopulations cellulaires présentant une robuste capacité proliférative et/ou une forte propension à
générer des neurones ainsi que des molécules pouvant permettre d’orienter la différenciation des
CSN vers un phénotype neuronal. Par ailleurs, la greffe intracérébrale n’est pas sans effet sur le
système immunitaire du receveur, malgré le statut immuno-particulier du SNC. Il est donc important
d’approfondir les études visant à caractériser les interactions cellulaires et moléculaires entre les
cellules neurales et les cellules du système immunitaire, et en particulier entre les CSPN (source
cellulaire possible pour la greffe) et les lymphocytes T (cellules jouant un rôle prédominant dans le
rejet de greffe).
Des études préliminaires au laboratoire ont montré l’existence, au sein d’une culture de CSPN
de rat, d’une population cellulaire minoritaire exprimant la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25).
Cette cytokine étant connue pour son action pro-proliférative et activatrice de plusieurs populations
cellulaires dans le système immunitaire (en particulier les lymphocytes T) mais également dans le
SNC (microglie, neurones et oligodendrocytes dans certaines conditions), nous avons entrepris
d’étudier son action sur les CSPN, in vitro.
Nous avons montré, en premier lieu, que l’ajout d’IL-2 naturelle de rat à 5 U/mL dans une
culture de CSPN de rat permet la formation de neurosphères dont la morphologie est semblable à
celle des neurosphères obtenues en conditions bFGF. La différence principale entre l’IL-2 naturelle
de rat et les IL-2 recombinantes humaine et de rat utilisées concerne la O-glycosylation. Cette
modification post-traductionnelle qui se traduit par l’ajout de carbohydrates sur la thréonine en
position 3 est présente sur l’IL-2 naturelle de rat mais absente sur les IL-2 recombinantes (hIL-2 et
rIL-2 utilisées). Bien que la signification fonctionnelle de la glycosylation de l’IL-2 soit inconnue, cette
modification n’apparaît pas essentielle pour son activité biologique, et ne semble pas perturber sa
fonction dans les tests biologiques standards (Robb et al. 1981). Néanmoins, l’existence de plusieurs
variants d’IL-2 dont les différences de masse moléculaire et de charge ont été attribuées à la Oglycosylation (Grabenhorst et al. 1993) ainsi que la variabilité d’activité rapportée pour deux formes
197
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
d’IL-2 de rat ne présentant pas la même glycosylation (Thompson & Di Sabato 1988), nous a conduit
a vérifier ce paramètre pour expliquer la disparité de nos résultats en fonction du type d’IL-2 utilisé.
Pour ce faire, nous avons testé l’effet d’une IL-2 recombinante humaine (IL-2 hcx) produite par des
cellules humaines permettant ainsi une O-glycosylation similaire à celle de la cytokine naturelle. L’IL2 hcx n’a pas permis de stimuler la prolifération des CSPN de rat dans nos conditions, suggérant que
le statut de glycosylation de la cytokine n’est peut être pas l’unique paramètre impliqué dans la
disparité d’action observée. Une étude publiée en 1993 a montré qu’une transglutaminase du nerf
optique du poisson était capable de catalyser la dimérisation de l’IL-2 humaine, rendant cette
dernière toxique pour des cultures d’oligodendrocytes issus du cerveau de rat nouveau-né (Eitan &
Shwartz 1993). De plus, il a été montré que l’IL-2 recombinante humaine pouvait spontanément se
dimériser lorsqu’elle se trouve pré-incubée dans une solution aqueuse au moins deux jours avant
l’ajout dans la culture et ainsi exercer un effet cytotoxique sur les oligodendrocytes (Curatolo et al.
1997). Au vu de ces travaux, nous projetons d’analyser nos différentes interleukines par WesternBlot, afin de tester si l’effet non-prolifératif obtenu avec les IL-2 recombinantes dans nos conditions
pourrait être lié à un phénomène d’agrégation de la cytokine similaire à celui déjà décrit dans la
littérature.
Des expériences de marquage de l’ADN à la thymidine tritiée et au BrdU ont montré que les
neurosphères obtenues après culture en présence d’IL-2 naturelle de rat résultent bien d’un
phénomène de prolifération et non d’une simple agrégation cellulaire, bien que l’incorporation des
ces deux molécules soit significativement plus faible que celle obtenue pour les neurosphères bFGF.
Cette observation est néanmoins en accord avec les propriétés pro-prolifératives de l’IL-2 retrouvées
à la fois au niveau périphérique sur les populations cellulaires T (Lenardo et al. 1999) mais aussi
dans le SNC où cette cytokine stimule notamment la prolifération et la survie des oligodendrocytes
matures (Shimojo et al. 1993). Des études ont montré que la différenciation et la viabilité des cellules
neuronales et gliales en culture peuvent varier en fonction de la concentration d’IL-2 (Hanisch et
Quirion. 1996), avec des conséquences activatrices ou inhibitrices, selon les cas. Afin de déterminer
si la variation de concentration d’IL-2 influe sur la formation de neurosphères dans une culture de
CSPN et dans le but de déterminer la concentration optimale d’IL-2 à utiliser, nous avons réalisé des
expériences de dose-réponse de la cytokine (0.1, 1, 5, 10 et 100 U/mL). Il est apparu que l’IL-2
naturelle de rat stimule la formation de neurosphères à partir de 1 U/mL pour un effet maximal à 10
U/mL, cette concentration étant la seule permettant d’obtenir significativement plus de
neurosphères qu’en condition bFGF. Le nombre de neurosphères formées en présence d’IL-2 à 5
U/mL ne différant pas significativement de celui obtenu en présence de bFGF à 25 ng/mL, c’est cette
concentration qui a été retenue pour la suite des expériences (Fig. 37).
198
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
Des analyses quantitatives du marquage BrdU par cytométrie en flux sont actuellement au
cours au laboratoire afin d’appuyer les résultats obtenus concernant l’incorporation de thymidine
tritiée (Fig. 36a). Malgré un nombre équivalent de neurosphères formées (Fig. 36b), les CSPN en
présence d’IL-2 prolifèrent moins qu’en présence de bFGF et en conséquence sont de plus petite
taille (Fig. 37). Ceci pourrait résulter d’une action très précoce de l’IL-2, qui pourrait favoriser la
formation rapide de neurosphères mais dont les cellules ne prolifèreraient plus par la suite à cause
d’une diminution éventuelle de la biodisponibilité de la cytokine, ou d’une inhibition de l’expression
de son récepteur. De part son mode d’action autocrine et paracrine, l’IL-2 serait, comme pour les
cellules T et B, susceptible de promouvoir l’expression de IL-2R par les CSPN, en particulier la chaîne
CD25, augmentant ainsi leur réponse à l’IL-2 de façon précoce (Gaffen et al. 1996 ; Lenardo et al.
1999). Or, les expériences de marquage immunocytofluorescent du CD25 et de mise en évidence de
cette chaîne par cytométrie ne semblent pas aller dans ce sens. En effet, l’expression du CD25 à la
surface des cellules d’une culture de CSPN demeure faible à la fois dans les conditions de culture en
présence d’IL-2 et dans les conditions classiques en bFGF, et est même plus faible dans le cas de l’IL-2
(10,8% contre 15,3% pour le bFGF, résultats non montrés).
Ces observations soulèvent alors la question de l’internalisation du récepteur à l’IL-2. En
effet, la fixation de l’IL-2 à son récepteur de haute affinité sur des cellules T entraîne son
internalisation et diminue la demi-vie de CD25 à la membrane (Fujii et al, 1986). De plus, in vivo, la
chaîne γc apparaît être régulée négativement après une expansion clonale des cellules T, ce qui
corrèle avec l’expression réduite de Bcl-2 et donc la susceptibilité sous-jacente à la mort par
apoptose (Li et al, 2001). Les mécanismes d’internalisation de l’IL-2R ne sont pas clairement définis
mais il a été montré un rôle majeur de la chaîne γc dans ce processus (Morelon & Dautry-Varsat
1998) alors que la chaîne β ne semble pas être impliquée (Furse & Malek 1993). Bien que les
résultats soient encore très préliminaires, les expériences de RT-PCR que nous avons réalisées
montrent une expression des chaînes α, β et γ par les CSPN de rat cultivées en présence de bFGF ou
d’IL-2. Une analyse en Q-PCR nous permettrait de déterminer d’éventuelles différences dans le taux
d’expression de ces différentes chaînes selon les conditions. Par ailleurs, il est à noter que chez la
souris, la chaîne γc a été détectée à forte concentration dans le sérum et, sous cette forme soluble,
elle serait un inhibiteur capable de moduler les réponses immunitaires (Meissner et al. 2001). De
plus, le CD25 peut être clivé de façon enzymatique et relargué à partir de la surface des cellules qui
l’expriment (Robb & Kutny 1987), modifiant ainsi la signalisation médiée par l’IL-2. Il pourrait donc
être intéressant de rechercher ces formes solubles de l’IL-2R dans le milieu de culture des CSPN, à
l’aide de techniques d’immunoprécipitation par exemple.
La caractérisation des neurosphères avec un anticorps anti-nestine a révélé un marquage
comparable après culture des cellules en présence de bFGF ou d’IL-2 (Fig. 38c). Des expériences
199
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
préliminaires de cytométrie en flux ont montré que le nombre de cellules exprimant la nestine dans
les deux conditions n’est pas significativement différent (Fig. 42). Cette première observation
suggère qu’une culture de CSPN en présence d’IL-2 ne modifie pas fondamentalement l’expression de
la nestine, une des caractéristiques principales des CSPN. Une autre caractéristique des CSPN est la
capacité d’auto-renouvellement et de prolifération pratiquement indéfinie en culture. Toutes les
expériences menées jusqu’à maintenant concernaient des neurosphères primaires, et il sera donc
nécessaire d’essayer de les reproduire sur des neurosphères secondaires résultant de plusieurs
passages cellulaires, afin de vérifier l’effet de l’IL-2 sur ces deux paramètres.
Des marquages immunocytochimiques réalisés sur les cellules différenciées issues de la
dissociation de neurosphères d’une culture en présence d’IL-2 indiquent une immunopositivité pour
TUJ-1, GFAP et RIP (Fig. 40). Cette observation démontre que l’IL-2 permet de maintenir le caractère
multipotent des CSPN, comme dans le cas d’une culture en présence de bFGF. Par ailleurs, lorsque les
neurosphères cultivées en présence d’IL-2 sont placées en conditions de différenciation, on constate
l’apparition de prolongements très fins et ramifiés que l’on ne retrouve pas au cours de la
différenciation des neurosphères cultivées en conditions bFGF (Fig. 40). Ces prolongements
rappellent les extensions neuritiques observées dans une culture primaire de neurones et nous ont
conduit à réaliser des marquages immunocytofluorescents avec l’anticorps TUJ-1 (marqueur de
neurones immatures) pour en vérifier le phénotype. Il s’est en effet avéré que le marquage TUJ-1
pour les neurosphères IL-2 est supérieur à celui observé pour les neurosphères bFGF (Fig. 41), ce qui
a été confirmé par quantification du nombre de cellules TUJ-1+ par cytométrie en flux (Fig. 42). Si ces
résultats encore préliminaires sont reproduits, il restera à déterminer si la prolifération des CSPN en
présence d’IL-2 accélère le processus de différenciation de certaines cellules en stimulant
notamment la poussée neuritique ou si elle favorise spécifiquement l’émergence de progéniteurs
neuronaux. Cette dernière possibilité serait particulièrement intéressante car, à ce jour, la
différenciation astrocytaire spontanée des CSPN reste un frein considérable à leur utilisation en
thérapie cellulaire restauratrice. A ce sujet, il est à noter qu’une augmentation de la croissance
neuritique et une meilleure survie ont été observées après un traitement d’une culture de neurones
par l’IL-2 (Sarder et al. 1993).
Une caractérisation plus approfondie des effets de l’IL-2 sur la prolifération et la
différenciation des CSPN in vitro est nécessaire mais il serait également intéressant d’analyser le
devenir in vivo des CSPN cultivées en présence d’IL-2 et greffées par stéréotaxie dans le cerveau
intact ou lésé de rat. En effet, une culture des neurosphères en présence d’IL-2 préalablement à la
greffe permettrait d’orienter la différenciation des CSPN vers un phénotype neuronal et ainsi
pourrait peut être stimuler ou améliorer leur différenciation neuronale et leur survie in vivo. Par
200
_____________________________________________________________________________ Résultats complémentaires : IL-2
ailleurs, ces résultats originaux sur les effets de l’IL-2 sur les CSPN permettront peut être de
progresser dans la caractérisation des interactions existant entre les CSPN et les lymphocytes T, et
d’un point de vue plus général, d’améliorer la compréhension des mécanismes neuroprotecteurs
associés à certaines situations inflammatoires du SNC.
201
DISCUSSION
ET
PERSPECTIVES
202
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Au cours de ce travail de thèse, nous nous somme attachés à étudier in vitro les interactions
cellulaires et moléculaires entre les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN) et les
lymphocytes T, in vitro. Le point de départ de ces études a été la comparaison de la xénogreffe de
CSPN et de neuroblastes de porc dans le cerveau de rat sain, en l’absence de traitement
immunosuppresseur. Nos résultats ont montré une survie prolongée des greffons de CSPN chez 40%
des rats greffés, associée à une faible infiltration du parenchyme cérébral et de la greffe par les
lymphocytes T, ce qui nous a conduit à nous intéresser plus précisément à la communication
s’établissant entre le système immunitaire et le SNC dans ce contexte.
Les cellules immunitaires pénètrent dans le SNC au cours des maladies autoimmunes comme
la sclérose en plaques mais ce phénomène fait aussi partie de la réponse physiologique aux
dommages tissulaires après un traumatisme, un AVC ou le passage d’une aiguille lors d’une
transplantation cellulaire. Les interactions entre les cellules immunitaires infiltrées et les cellules
résidentes du SNC sont cependant complexes puisque de plus en plus d’études suggèrent que
l’inflammation au sein du SNC peut, en plus des effets neurotoxiques bien décrits, exercer une
neuroprotection (Rapalino et al. 1998 ; Moalen et al. 1999 ; Serpe et al. 1999 ; Hammarberg et al.
2000). La microglie, en particulier, semble avoir une influence complexe, qui n’est pas restreinte à sa
seule participation au processus neurodégénératif. Dans un modèle de lésion de la moelle épinière,
les CSPN greffées ont été montrées comme interagissant étroitement avec les cellules microgliales
activées endogènes, déclenchant la production par ces dernières de facteurs neurotrophiques,
contribuant ainsi à une récupération fonctionnelle significative (Ziv et al. 2006). Concernant les
lymphocytes T, plusieurs études ont montré un effet suppresseur de la prolifération de ce type
cellulaire, médié par les CSPN in vitro (Pluchino et al. 2005b; Einstein et al. 2007). En effet ces
dernières apparaissent capables d’inhiber la prolifération des cellules T activées, selon un
mécanisme qui n’est que partiellement compris (Wang et al. 2009).
L’intense communication existant entre les systèmes nerveux et immunitaire pourrait
possiblement expliquer ces données (Kerschensteiner et al. 2003). Ces deux systèmes produisent
une variété de facteurs (cytokines, chimiokines, facteurs neurotrophiques) qui modulent la
prolifération et la différenciation cellulaire. Il apparaît clairement que les facteurs sécrétés par le
système immunitaire et le SNC se recoupent et que ni les cytokines ni les facteurs neurotrophiques
ne sont totalement exclusifs d’un seul système donné (Kerschensteiner et al. 2003).
Après transplantation, le phénotype acquis par les CSPN dépend de la localisation de ces
dernières dans le cerveau et du type de cellules dont la région spécifique a besoin. Puisqu’une
réponse immunitaire se met en place lors de lésions, de maladies du SNC ou suite à une
203
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
transplantation cellulaire, il est possible que des molécules inflammatoires aient un impact
déterminant sur le potentiel de différenciation des CSPN. Les travaux de Luc Vallières ont montré
que des souris transgéniques jeunes, surproduisant de l’IL-6 par les cellules microgliales,
présentaient une diminution globale de 63% de la neurogénèse dans le gyrus denté de l’hippocampe
(Vallières et al. 2002). Une autre étude a montré que l’administration de LPS inhibait la neurogénèse
dans l’hippocampe, phénomène totalement réversé par l’utilisation d’un inhibiteur non sélectif de la
cyclo-oxygénase, une enzyme permettant la formation de prostaglandines à partir de l'acide
arachidonique. (Monje et al. 2003). En revanche, d’autres molécules inflammatoires jouent un rôle
pléiotrope dans la neurogénèse, du moins en ce qui concerne les CSPN préparées à partir de
l’hippocampe de rat fœtal (Harada et al. 2004). Ainsi, la réponse immunitaire innée apparaît capable
de moduler positivement ou négativement la neurogénèse dans le SNC ainsi que le devenir des CSPN
transplantées, en fonction de cytokines et facteurs de croissance exprimés de façon prédominante
par l’environnement cellulaire.
Objectifs des travaux de thèse
La réponse cellulaire T étant une caractéristique majeure du rejet des xénogreffes
intracérébrales, il est à supposer que les cellules T établissent des contacts avec les CSPN
transplantées, qui se trouvent alors dans un environnement fortement inflammatoire. Nous avions
donc, pour ce travail, fixé deux objectifs :
- d’une part, approfondir la caractérisation des échanges in vitro régissant la communication entre les
CSPN et les lymphocytes T.
- d’autre part, étudier in vitro l’effet de l’interleukine-2, cytokine proinflammatoire sécrétée par les
cellules T activées, sur le comportement des CSPN.
Rôle de l’hème-oxygénase 1 dans l’activité suppressive des CSPN
Concernant le premier objectif, nous avons pu reproduire les résultats obtenus par d’autres
groupes et confirmer une immunosuppression médiée par les CSPN de rat, dépendante du ratio
cellulaire, dans un contexte allogénique. Par contre, nous sommes les premiers à avoir démontré les
propriétés immunomodulatrices des CSPN de porc dans un contexte xénogénique. L’immunogénicité
204
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
réduite des CSPN associée à leurs propriétés immunosuppressives en font une source cellulaire
thérapeutique potentielle très attirante pour la médecine régénérative. Cependant les mécanismes
sous-jacents à cette immunosuppression n’ont toujours pas été identifiés et leur nature précise
demeure, à ce jour, obscure.
Grâce à des expériences de co-culture en Transwell, nous avons mis en évidence l’implication
de facteurs solubles dans l’immunosuppression médiée par les CSPN de rat et de porc. Bien que
l’identité du ou des facteurs responsables de cet effet soit toujours inconnu pour les CSPN de porc,
nous avons, pour la première fois, pu mettre en évidence le rôle de l’hème oxygénase 1 (HO-1) dans
l’activité suppressive des CSPN de rat. HO est une enzyme largement distribuée dans les tissus des
mammifères, et sa principale fonction est associée à la dégradation de l’hème en fer, monoxyde de
carbone (CO) et biliverdine, cette dernière étant convertie en bilirubine par la biliverdine réductase,
une enzyme cytosolique (Maines, 1997). La voie de signalisation HO-1 semble jouer un rôle clé dans
la conservation de l’intégrité tissulaire contre le stress oxydatif, contribuer in vivo à la modulation
des réponses inflammatoires, et agir de concert avec d’autres systèmes enzymatiques cruciaux pour
le maintien de l’homéostasie cellulaire (Foresti & Motterlini 1999 ; Otterbein et al. 2000 ; Otterbein et
al. 2003). Des effets bénéfiques de HO-1 ont été démontrés dans de nombreux modèles de
transplantation, à travers une cytoprotection médiée par l’élimination des radicaux libres, des
propriétés anti-inflammatoires et anti-apoptotiques (Tang et al. 2005 ; Silva et al. 2006). Il a par
exemple été montré que la surexpression de HO-1 dans des cellules souches mésenchymateuses
augmentait la survie des ces dernières après transplantation dans un modèle murin d’ischémie
cardiaque (Tang et al. 2005). Par ailleurs, des études ont mis en évidence un rôle de HO-1 dans
l’immunosuppression médiée par les cellules ES humaines, et les cellules souches mésenchymateuses
humaines et de rat (Trigona et al. 2007 ; Chabannes et al. 2007).
Bien que nos résultats aient mis en lumière un nouveau rôle pour HO-1 dans
l’immunosuppression médiée par les CSPN de rat, de plus amples recherches seront nécessaires pour
élucider les voies impliquées dans la régulation de l’expression de HO-1 et pour confirmer in vivo le
rôle de HO-1 dans la protection des CSPN. Par exemple, il serait intéressant de réaliser des
marquages immunohistologiques afin d’une part de cartographier l’expression de HO-1 dans le
cerveau sain, et d’autre part de vérifier l’expression de cette enzyme après transplantation de CSPN.
De plus, alors que beaucoup pensent que les cellules différenciées sont plus appropriées pour des
stratégies restauratrices in vivo, de plus en plus de travaux suggèrent que les cellules indifférenciées
peuvent également être utiles dans certaines circonstances, notamment grâce à leur capacité de
migration vers les sites lésionnels (Ben-Hur et al. 2003a). Cette propriété, associée à la faible
immunogénicité des CSPN ainsi qu’à leur capacité suppressive de la réponse cellulaire T via HO-1 en
font de bonnes candidates à la transplantation intracérébrale. La surexpression de HO-1 par transfert
de gène via un vecteur lentiviral a permis à des progéniteurs myogéniques porcins de prolonger leur
205
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
survie après transplantation autologue dans un des muscles squelettiques de l’animal (Laumonier et
al. 2008). Il serait donc très intéressant d’essayer de surexprimer HO-1 par la même technique de
transfert de gène dans les CSPN de porc afin de profiter à la fois des avantages de la
xénotransplantation de CSPN porcines et du potentiel immunosuppresseur local de HO-1.
Par ailleurs, l’expression de HO-1 a été rapportée comme étant diminuée in vitro au fur et à
mesure des passages cellulaires (Chabannes et al. 2007). Cependant, nous pourrions vérifier si
l’expression de HO-1, ainsi que son effet protecteur, s’étendent aux cellules différenciées dérivées des
CSPN, ce qui serait d’un intérêt certain pour une immunosuppression en thérapie restauratrice. Cela
permettrait en effet de combiner les avantages de la greffe de cellules pré-différenciées dans un
phénotype neuronal avec celui du contrôle local de l’inflammation via HO-1, et donc espérer retarder
voir supprimer le rejet des cellules transplantées.
Effet in vitro de l’IL-2 sur la prolifération et la différenciation des CSPN
La plupart des applications potentielles pour la transplantation de CSPN concerne le
remplacement de cellules différenciées. En effet, les neurones fœtaux transplantés peuvent
remplacer les cellules différenciées perdues tout en possédant des propriétés de plasticité suffisantes
pour s’intégrer dans les réseaux neuronaux de l’hôte. Cependant, il y a plusieurs limites à l’utilisation
du tissu fœtal en médecine régénérative, comme l’hétérogénéité de la suspension cellulaire,
l’incapacité à obtenir une quantité suffisante de matériel tissulaire du fait du nombre limité de
donneurs, et la difficulté logistique de la préparation des échantillons. Une stratégie alternative serait
donc de propager des CSPN in vitro, de les soumettre à des traitements conçus pour induire
l’engagement vers un lignage neuronal ainsi que les premières étapes de différenciation. Ces cellules
pré-différenciées in vitro pourraient ensuite être implantées in vivo.
La caractérisation du microenvironnement dans lequel vont se retrouver les CSPN est un
élément important pour l’identification de facteurs influant sur le comportement des CSPN. Notre
hypothèse étant que les CSPN interagissent avec les lymphocytes T pour supprimer la réaction
inflammatoire, nous avons choisi d’étudier les effets de l’IL-2, cytokine activement sécrétée par les
lymphocytes T activés, sur les CSPN. Le choix d’étudier l’IL-2 en particulier a été motivé par la
découverte de l’expression de CD25 à la surface des CSPN de rat. De plus, certaines cytokines ont déjà
été décrites dans la littérature comme influençant le comportement in vitro des CSPN. En effet, des
études ont montré que le TNFα et l’IFNγ, deux cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-2,
inhiberaient la prolifération des CSPN cultivées sous forme de neurosphères (Ben-Hur et al. 2003b).
Par contre, dans des conditions de culture induisant la différenciation des neurosphères, aucune de
206
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
ces deux cytokines n’influenceraient le devenir des CSPN en terme de lignage cellulaire. A l’inverse,
l’IL-6, une cytokine exerçant des effets anti- ou pro-inflammatoires selon les conditions, orienterait la
différenciation des CSPN vers un phénotype astrocytaire (Taga & Fukuda 2005).
Dans nos conditions de culture de CSPN de rat, l’ajout d’IL-2 naturelle de rat dans le milieu à
la place du bFGF classiquement utilisé, a induit la prolifération des CSPN sous forme de
neurosphères, in vitro. Néanmoins, cette prolifération était significativement plus faible que celle
obtenue en bFGF, associé à une taille plus petite des neurosphères et un pourcentage de cellules
vivantes plus faible dans la culture. Lorsque nous avons placé les neurosphères issues de l’étape de
prolifération en présence d’IL-2 dans des conditions de culture favorables à leur différenciation
(milieu défini facteur de croissance), nous avons observé une différenciation neuronale supérieure à
celle obtenue après une culture des neurosphères en bFGF. La caractérisation de ce phénomène est
actuellement en cours au laboratoire, et il sera intéressant de rechercher l’apparition de sous-types
neuronaux de phénotypes neurochimiques particuliers comme les neurones dopaminergiques,
glutamatergiques ou cholinergiques. Ces résultats sont encore préliminaires, mais ouvrent des
perspectives très intéressantes pour la transplantation intracérébrale restauratrice s’ils sont
confirmés.
Les études in vitro concernant la différenciation des CSPN cultivées sous forme de
neurosphères en conditions classiques (en présence de bFGF et/ou d’EGF) ont largement démontré
la capacité à dériver des cellules gliales, en particulier des astrocytes, à partir de ces cellules. La
différenciation astrocytaire a même fréquemment été décrite comme la voie principale de devenir
des CSPN (Reynolds & Weiss 1992). Etant donné le rôle secondaire des astrocytes dans les activités
nerveuses centrales, la différenciation in vivo des CSPN en astrocytes a longtemps été vue comme une
limite inévitable à l’obtention expérimentale de neurones fonctionnels. Néanmoins, des résultats
favorables ont été relatés dans plusieurs études réalisées avec des CSPN dans des modèles animaux
de lésions ou maladies du SNC, malgré une différenciation astrocytaire préférentielle des cellules
transplantées. Ainsi, dans un modèle d’ischémie focale, une diminution des déficits sensorimoteurs a
été obtenue en greffant des CSPN, malgré une différenciation massive de ces dernières en astrocytes
(Chu et al. 2004). De plus, une différenciation prédominante en astrocytes des CSPN après
transplantation dans un modèle d’hémorragie cérébrale a été associée à une amélioration des
performances fonctionnelles (Jeong et al. 2003). Dans un modèle de maladie de Parkinson induite
par injections de MPTP chez le primate, les CSPN ont montré des capacités de protection des
neurones de la voie nigro-striée contre le phénomène dégénératif intense. Puisque seulement une
minorité des CSPN transplantées se sont différenciées en cellules exprimant la tyrosine hydroxylase
et les récepteurs à la dopamine, cet effet protecteur a été attribué à la génération d’astrocytes
produisant du GDNF le long de la circuiterie nerveuse du système nigro-strié (Redmond et al. 2007).
207
_____________________________________________________________________________________ Discussion et perspectives
Dans des souris EAE, en plus de générer des oligodendrocytes, une grande proportion de CSPN a été
montrée comme se différenciant en astrocytes dotés d’une capacité de suppression de la
prolifération des cellules inflammatoires (Einstein et al. 2003). Ainsi, étant donné les effets
bénéfiques de la différenciation astrocytaire, en plus de ceux largement démontrés de la
différenciation neuronale dans des modèles animaux d’affections diverses du SNC in vivo, il serait
intéressant de préparer une suspension cellulaire transplantable à partir de deux cultures de CSPN
issues du même donneur. La moitié des cellules pourrait être cultivée en présence de bFGF sous
forme de neurosphères afin de conserver le caractère indifférencié et la susceptibilité intrinsèque de
différenciation astrocytaire, et l’autre moitié en présence d’IL-2 afin d’initier l’engagement des
cellules vers une voie de différenciation neuronale. Ceci pourrait peut être permettre de combiner
deux mécanismes bénéfiques et d’aboutir à une restauration cellulaire plus efficace.
Bilan
Comme nous l’avons déjà mentionné dans l’introduction, la thérapie cellulaire de
remplacement peut être réalisée de deux façons. La première concerne la transplantation directe des
cellules souches suivie par leur différenciation spontanée in vivo en cellules du phénotype requis
(Bjorklund et al. 2002). La seconde passe par la différenciation in vitro des cellules souches dans le
type cellulaire désiré préalablement à la transplantation des cellules pré-différenciées dans la région
à traiter (Kim et al. 2002). Les résultats que nous avons obtenus au cours de ce travail de thèse dans
le cadre de la transplantation de CSPN visant à restaurer le SNC endommagé s’intègrent donc, à leur
façon, dans chacune de ces deux stratégies. En effet, HO-1 est impliquée dans les propriétés
immunomodulatrices des CSPN indifférenciées in vitro (Article 2) et pourrait favoriser une
immunosuppression directement au niveau de la lésion grâce à la capacité de migration des CSPN
vers les sites lésionnels. L’IL-2, quant-à elle, pourrait favoriser la pré-différenciation neuronale des
CSPN en culture ce qui pourrait être un moyen de les engager dans la voie de différenciation
neuronale voulue avant transplantation (Résultats complémentaires).
208
_______________________________________________________________________________________________________Conclusion
CONCLUSION
Des progrès rapides dans la caractérisation de la biologie des cellules souches adultes ont
généré un enthousiasme considérable pour le développement de stratégies thérapeutiques visant les
affections du SNC. De nombreux travaux ont modifié la vision que les CSPN transplantées
n’induisaient un bénéfice thérapeutique qu’au travers de mécanismes de remplacement neuronal. En
effet, étant donné les processus complexes impliqués dans la différenciation des CSPN dans un
lignage neuronal spécifique et dans l’intégration de ces cellules dans le réseau neuronal de l’hôte, il
est apparu que des mécanismes alternatifs devaient être impliqués dans l’effet thérapeutique
démontré de la transplantation de CSPN. Parmi eux, l’activité suppressive de la réponse cellulaire T
exercée par ces cellules semble jouer un rôle prédominant.
Les études réalisées au cours de ce travail de thèse nous ont donc permis de progresser dans
la compréhension des mécanismes régissant les propriétés immunosuppressives des CSPN, in vitro,
et de façon plus large, dans la connaissance des interactions réciproques entre le SNC et le système
immunitaire. La neuroimmunologie et la biologie des cellules souches étant des domaines de
recherche novateurs, il apparaît donc indispensable de tirer tous les enseignements des données
dont nous disposons mais de garder la plus grande prudence quant à leur interprétation. En effet,
avant d’envisager une application thérapeutique dans des affections neurologiques humaines, de
nombreux problèmes devront être résolus. Même si les CSPN ont été très bien caractérisées après
des étapes de culture in vitro, l’utilisation de différentes méthodes de prélèvement et de conditions
de culture, ainsi que l’utilisation de lignées ont conduit à des résultats variables et parfois divergents
dans la littérature. Il y a un besoin évident de standardisation de ces méthodes, et bien que plusieurs
protéines aient été examinées pour identifier et caractériser strictement les CSPN, aucun marqueur
universel n’a encore été défini.
Par ailleurs, des études in vivo chez l’animal sont nécessaires pour élucider les mécanismes
sous-jacents aux effets immunosuppresseurs des CSPN de façon à optimiser les applications
thérapeutiques potentielles, notamment dans le cadre de pathologies à composante immune forte
comme la sclérose en plaques. Néanmoins, il convient de garder à l’esprit que la grande majorité des
travaux sur les cellules souches sont porteurs d’espoir, et que quoiqu’il arrive, chaque étude, chaque
expérience, chaque résultat, constituent un pas supplémentaire vers leur utilisation efficace et
maîtrisée en médecine régénératrice.
209
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245
ANNEXES
246
_________________________________________________________________________________________________________Annexe 1
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Soumis.
Bonnamain V, Neveu I
immunoregulation. Soumis.
and
Naveilhan
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Neural
stem/precursor
cell
and
Rémy S, Tesson L, Usal C, Ménoret S, Bonnamain V, Nerrière-Daguin V, Rossignol J,
Boyer C, Nguyen TH, Naveilhan P, Lescaudron L, Anegon I. New lines of GFP transgenic
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Bonnamain V, Ziavra D, Thinard R, Naveilhan P. Impact of glucose concentration on
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Angibaud J, Baudouin SJ, Bonnamain V, Le Verche V, Dournaud P, Naveilhan P, Boudin H.
Distribution of CD3zeta in the developing rat brain: from expression in newly-born
neurons to synaptic aggregation in mature neurons; En préparation.
247
_________________________________________________________________________________________________________Annexe 2
ANNEXE 2
PROJET de POST-DOCTORAT
Ayant acquis de solides bases dans le domaine de la NeuroImmunologie au cours de mon
Doctorat, c’est tout naturellement que je me suis tournée vers une thématique de recherche portant
sur la sclérose en plaques pour mon stage post-doctoral.
Mon laboratoire d’accueil, dirigé par le Dr Gareth John (Corinne Goldsmith Dickinson Center
for Multiple Sclerosis, Department of Neurology, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA) est
spécialisé dans la recherche visant à comprendre les mécanismes qui contrôlent la formation des
lésions ainsi que les processus de remyélinisation. En effet, dans la sclérose en plaques, la perte de la
myéline autour des axones des neurones du cerveau et de la moelle épinière mènent à l’échec de la
conduction nerveuse, associée à l’apparition de symptômes neurologiques. A l’inverse, la réparation
de la gaine de myéline aboutit à la restauration de la conduction de l’influx nerveux ainsi qu’à la
récupération des fonctions perdues. Ce processus de remyélinisation est médié par les cellules
progénitrices oligodendrocytaires (OPC), et de récentes études ont montré que des cellules à un
stade plus indifférencié, telles que les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN) pouvaient
aussi générer des oligodendrocytes permettant de réparer les régions démyélinisées. Le nombre et la
maturation des OPC et des CSPN déterminent ainsi la capacité de formation de nouvelles gaines de
myéline. Les mécanismes impliqués dans ces deux paramètres font donc l’objet d’intenses
investigations au sein de la recherche sur la sclérose en plaques.
Récemment, le groupe du Dr John a mis en évidence l’activation, au sein des lésions, d’un
mécanisme connu pour réguler le pool d’OPC et la maturation des CSPN au cours du développement
cérébral. Ce phénomène est médié par la liaison de ligands comme Jagged1 aux récepteurs Notch-1 et
Notch-2. Dans ce contexte, mon projet de post-doctorat consistera à comprendre le rôle de Notch-1
dans la régénération de la myéline dans des modèles de souris, dans le but de promouvoir, à terme, le
processus de remyélinisation des lésions démyélinisantes aiguës et chroniques, associé au
recouvrement des fonctions neurologiques perdues chez des patients atteints de sclérose en plaques.
248
INTERACTIONS CELLULES SOUCHES/PROGENITRICES NEURALES – LYMPHOCYTES T :
ETUDE IN VITRO ET PERSPECTIVES POUR LA TRANSPLANTATION
Malgré son statut immunologique particulier, le système nerveux central (SNC) entretient
une communication bidirectionnelle étroite avec le système immunitaire. Ce paramètre doit donc
être pris en compte pour optimiser les stratégies thérapeutiques restauratrices du SNC. En effet,
en l’absence de traitement immunosuppresseur, les xénogreffes de cellules neurales porcines
dans le SNC sont systématiquement rejetées, ce rejet étant principalement médié par les
lymphocytes T (LT). Dans ce contexte, les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN)
décrites comme ayant une immunogénicité réduite et un pouvoir suppresseur de la réponse
cellulaire T, pourraient être une alternative intéressante à la greffe de neuroblastes fœtaux.
La survie prolongée du greffon et la faible infiltration lymphocytaire T après xénogreffe
de CSPN dans le cerveau de rat en l’absence d’immunosuppression nous ont conduit à étudier les
interactions in vitro entre les CSPN et les LT. Nous avons montré, par des expériences de coculture, que les CSPN de porc et de rat inhibent la prolifération des LT de rat, par la libération de
facteurs solubles. Les mécanismes à la base de l’effet immunorégulateur des CSPN porcines
restent à déterminer, mais nos analyses ont clairement mis en évidence un rôle de l’hème
oxygénase 1 (HO-1) dans l’activité suppressive des CSPN de rat. Nous avons également montré
que l’interleukine-2 (IL-2), une cytokine proinflammatoire sécrétée par les LT activés, oriente le
devenir des CSPN de rat vers un phénotype neuronal, in vitro. Ces résultats confirment
l’importance de la communication entre le SNC et le système immunitaire et soulignent l’intérêt
des CSPN en transplantation.
Mots-clés :
Réponse immunitaire, Xénogreffe, Lymphocyte T, Cellule souche neurale, Cellule
progénitrice, in vitro.
INTERACTIONS BETWEEN NEURAL STEM/PROGENITOR CELLS AND T LYMPHOCYTES:
IN VITRO STUDY AND PROSPECTS FOR TRANSPLANTATION
Despite its status of immune privileged organ, the central nervous system (CNS)
maintains a close bidirectional communication with the immune system. This parameter must be
taken into account to optimize the therapeutic strategies aiming at restoring the neuronal loss in
case of lesions or degenerative diseases in the CNS. Indeed, in the absence of
immunosuppression, pig neural cells xenografted into the CNS are systematically rejected, this
rejection being primarily mediated by T lymphocytes (TL). In this context, neural
stem/progenitor cells (NSPC) described as having reduced immunogenicity and a potent
suppressive effect on T cell responses appear as a suitable alternative cell source to fetal
neuroblasts.
The prolonged survival of xenografts and the low T cell infiltration following the
transplantation of NSPC in the brain of non-immunosuppressed rats prompted us to study the in
vitro interactions between NSPC and TL. We showed by co-culture experiments that pig and rat
NSPC inhibit the proliferation of rat TL through the release of soluble factors. The mechanisms
triggering the immunoregulatory effects of porcine NSPC remain to be determined, but we clearly
demonstrated a role for the heme oxygenase 1 (HO-1) in the suppressive activity of rat NSPC.
Interestingly, we also found that Interleukin-2 (IL-2), a proinflammatory cytokine secreted by
activated TL, directs the in vitro fate of NSPC rat towards a neuronal phenotype. These results
confirm the bidirectional communication between the CNS and the immune system, and highlight
the interest of NSPC for cell transplantation.
Key words :
Immune response, Xenograft, T Lymphocyte, Neural stem cell, Progenitor cell,
in vitro.