1-4 Les sucres (ou saccharides)

1-4 Les sucres (ou saccharides)
Fonctions des sucres
-Fonction énergétique (mono et poly)
-Sucres rapides (mono et di)
-Sucres de réserves (ex: glycogène)
-Fonction structurale (poly)
Ex:
-paroi des cellules végétales (cellulose)
-glycoprotéines
1-5 Les lipides
-Ce ne sont pas des polymères, mais des molécules assez grandes
-Propriété majeure: hydrophobes
-Fonctions majeures:
-Énergétique
-Constituent les membranes cellulaires
1-5-1 Il existe trois catégories de lipides; les triglycérides, les
phospholipides et les stéroïdes. Leurs structures et leurs
fonctions sont très différentes
Les triglycérides et les phospholipides ont en commun la présence d’acides gras dans leur structure
Structure de deux acides gras. Le palmitate est un acide gras à 16 carbones, saturé. L’oléate est un acide gras à 18
carbones, non saturé.
Structure des triglycérides (les huiles et les
graisses).
Le triacylglycérol contient 3 acides gras assemblés
sur un glycérol.
Fonction principale: réserve énergétique
Structure des phospholipides
Les phospholipides
contiennent deux acides gras
associés au glycérol. Le
glycérol lie aussi un groupe
phosphate, qui à son tour lie
souvent une autre petite
molécule comme la choline.
Dans la sphingomyéline, le
glycérol est remplacé par une
sérine.
Glycérol, phosphate et autre
molécule associée sont
hydrophiles, tandis que les
deux chaines d’acides gras
sont hydrophobes. La molécule
est donc amphiphile.
Fonction principale: formation
des membranes
Structure des stéroïdes. Les stéroïdes ne contiennent pas d’acide gras. Ils sont plus petits que les phospholipides,
mais ils sont également amphiphiles.
Le cholestérol est un composant important des membranes cellulaires. C’est aussi le précurseur des hormones
stéroïdes.
1-5-2 Organisation moléculaire des membranes
Les phospholipides s’organisent en bicouche, séparant deux compartiments aqueux
Perméabilité d’une bicouche lipidique articficielle. Elle est perméable uniquement aux petites molécules non
chargées.
Modèle de la structure de la membrane en mosaïque fluide. Les membranes sont constituées d’une bicouche de
phospholipides et de cholestérol dans laquelle sont enchâssées de nombreuses protéines, très souvent grâce à une
hélice alpha. Beaucoup de ces protéines sont glycosylées. Parmi ces protéines, certaines sont des transporteurs
d’acides aminés, de sucres, de nucléotides ou d’ions, d’autres sont des récepteurs pour des signaux de
l’environnement tels que des hormones.
1-6 Les acides nucléiques
Deux types:
-ADN (acide désoxyribonucléique), support du génome
-ARN (acide ribonucléique)
-molécule intermédiaire qui permet le passage du gène à la protéine
(ARNm)
-Molécules impliquées dans la synthèse des protéines (ARNt et ARNr)
Polymères de nucléotides
-4 nucléotides différents: A, T, G, C
-la séquence en nucléotides représente l’information génétique
1-6-1 Les acides nucléiques sont des polymères de nucléotides
Polymérisation des nucléotides. Un polymère de 4 nucléotides est
représenté. Les nucléotides adjacents sont reliés entre eux par des
liaisons phosphodiester qui lient le sucre d’un nucléotide au phosphate
du nucléotide suivant. Un acide nucléique est donc constitué d’un
squelette sucre phosphate et de bases qui émergent de ce squelette. Un
acide nucléique est polarisé avec deux extrémités différentes. Une des
extrémités porte un phosphate libre fixé au carbone 5’ du sucre. Cette
extrémité est appelée l’extrémité 5’. A l’autre extrémité, le nucléotide se
termine par une fonction OH portée par le carbone 3’ d’un sucre. Cette
extrémité est appelée l’extrémité 3’. Par convention, la séquence en
nucléotide d’un acide nucléiques est toujours représenté de 5’ vers 3’.
Dans l’exemple illustré, la séquence est donc G-A-T-C.
1-6-2 Structure de l’ADN en double hélice
La double hélice d’ADN. Une molécule d’ADN est formée par deux brins d’ADN qui s’associent en orientation
opposée, avec les bases orientées vers l’intérieur et les squelettes sucre-phosphate en surface. Les 2 brins
s’enroulent en double hélice. La double hélice est stabilisée par des liaisons hydrogène qui s’établissent entre les
bases: les bases A ne peuvent s’apparier qu’avec les bases T, et les bases C qu’avec les bases G. De ce fait, on dit
que les 2 brins d’ADN sont de séquence inverse complémentaire. L’enroulement en double hélice créé deux sillons,
un majeur et un mineur.
1-7 Principes des réactions chimiques ayant lieu dans la cellule
Différentes formes d’énergie utilisables par la cellule:
-Rupture d’une liaison covalente
-Transfert d’électrons (réactions d’oxydoréduction)
-Flux d’ions
Energie utilisée pour:
-Produire de la chaleur
-Produire du mouvement
-Synthétiser de la matière
Rôle particulier de l’ATP: un intermédiaire universel dans les réactions chimiques
L’énergie provenant de la dégradation des nutriments ou de la photosynthèse est utilisée pour créer une
liaison phosphoanhydre permettant de convertir un ADP (adénosine diphosphate) en ATP (adénosine
triphosphate). Inversement, l’ATP peut être converti en ADP en libérant de l’énergie qui servira par
exemple à la synthèse de macromolécules.
Dans la cellule, les réactions chimiques ont très peu de chance de se produire, mais…
Rôle particulier des enzymes = catalyseurs, non altérés par la réaction chimique
Principe de fonctionnement d’une enzyme.
(A) Une enzyme est une protéine, qui de par sa séquence et sa structure tertiaire ou quaternaire, possède
la capacité d’interagir avec une autre molécule et de la modifier chimiquement.
(B) Exemple du lysozyme capable de couper un polysaccharide. A la fin de la réaction, l’enzyme est
intacte et peut recommencer une autre réaction.
2- Les molécules d’ADN constituent le génome
2-1 La séquence d’ADN représente l’information génétique
Lettres: A, T, G, C
Mots: à 3 lettres (codons)
Phrase: gène (information pour synthétiser une protéine). Ponctuation
Livre: le génome (ensemble des gènes)
2-2 L’ADN peut se répliquer et se transmettre de génération en génération
Principe de la réplication de l’ADN. Dans ce processus chaque brin d’ADN est séparé (non montré) puis chaque
brin sert de matrice pour la synthèse d’un nouveau brin en orientation inverse et de séquence complémentaire.
On obtient donc deux molécules double brin strictement identiques.
DNA polymerase
La réplication de l’ADN est assurée par une ADN polymérase.
Les nucléotides du néobrin se positionnent en un ordre correspondant à la séquence inverse complémentaire de
celle du brin parental en s’appariant aux nucléotides du brin parental. L’ADN polymérase établit au fur et à mesure
les liaisons covalentes entre nucléotides, dans le sens 5’ vers 3’.
L’ADN polymérase ne sait synthétiser un nouveau brin d’ADN qu’à partir d’une amorce, qui est un petit ARN. Ce
petit ARN est synthétisé par une enzyme particulière appelée primase. Chez les bactéries, la primase synthétise
uniquement l’amorce ARN. Chez les eucaryotes, la primase est capable de synthétiser l’amorce ARN, puis une
petite longueur d’ADN, puis elle est relayée par l’ADN polymérase.
Ouverture de la double hélice par une hélicase (non représentée) au niveau d’une origine de réplication ou ORC
(une séquence particulière reconnue par l’hélicase), puis réplication bidirectionnelle par deux ADN polymérases.
Au niveau d’une fourche de réplication, la synthèse des
deux brins se fait un peu différemment.
(a) L’ADN polymérase synthétise l’ADN dans le sens 5’
vers 3’ uniquement. Donc un brin est synthétisé de
façon continue dans un sens au fur et à mesure de
l’ouverture de la double, tandis que l’autre brin est
synthétisé dans l’autre sens et donc obligatoirement
de façon discontinue et décalée après l’ouverture de
la double hélice.
(b) Détails de la synthèse du brin discontinu.
2-3 L’ADN peut-être manipulé
2-3-1 On peut couper l’ADN en des sites précis à l’aide
d’enzymes de restriction
Les enzymes de restriction sont extraites des bactéries. L’enzyme prise en exemple, EcoRI, reconnaît une séquence
précise (un palindrome de 6 paires de bases) puis coupe deux liaisons phosphodiester, de façon dissymétrique. Ce
clivage génère deux fragments d’ADN terminés par deux séquences simple brin. Ces deux séquences simple brin
étant de séquence inverse complémentaires, elles peuvent se réapparier. On appelle donc ces bouts des bouts
collants.
Quelques sites de restriction.
-Les enzymes de restriction reconnaissent des sites
palindromiques à 6 ou 4 paires de bases.
-Les enzymes de restriction génèrent des bouts
collants ou des bouts francs
2-3-2 Des fragments d’ADN de taille différente peuvent être
séparés par électrophorèse
Digestion d’ADN par EcoRI puis séparation des fragments de restriction par électrophorèse EcoRI clive l’ADN
représenté en 5 sites (flèches), générant six fragments de tailles différentes. Ces fragments sont séparés en fonction
de leur taille par électrophorèse en gel d’agarose. L’ADN, fortement chargé négativement (sur les groupes phosphate),
migre vers l’ électrode positive, dans l’agarose poreux. L’ADN passe dans les pores du gel d’autant plus facilement
qu’il est de petite taille. Après électrophorèse, l’ADN est révélé par un colorant fluorescent et le gel est photographié.
2-3-3 On peut hybrider des acides nucléiques
Dénaturation et renaturation de molécules d’ADN double hélice. Les deux brins d’une double hélice d’ADN peuvent
être désappariés par chauffage à 100°C. On appelle ce phénomène la dénaturation. En ramenant doucement la
température à 37°C, les deux brins peuvent se réapparier. Ainsi, dans un mélange de molécules d’ADN, les deux
brins de séquence complémentaire peuvent se reconnaître.
*T
*A
T
A
G
C
sonde
De façon générale, peuvent s’hybrider tous fragments d’acides nucléiques de séquence complémentaire:
- Deux brins d’ADN
- Deux brins d’ARN
- Un brin d’ADN et un brin d’ARN
Donc l’objet d’intérêt peut être un fragment d’ADN et la sonde peut être une sonde ADN ou ARN, ou un ARN et la
sonde peut être de l’ADN ou de l’ARN
2-3-4 Une séquence d’ADN particulière peut être mise en
évidence par la technique de Southern-blot
La technique de Southern-blot permet de détecter la présence de séquences particulières d’ADN.
L’ADN chromosomique, très long, est découpé par incubation en présence d’une enzyme de restriction. Les
fragments, appelés fragments de restriction, sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose en fonction de leur
taille. Dans l’exemple du schéma, la digestion a généré trois fragments de restriction, mais la technique permet de
repérer une séquence parmi des milliers d’autres. Ces fragments sont ensuite transférés sur un papier de
nitrocellulose, par capillarité. Les fragments d’ADN sont dénaturés par chauffage du papier. La présence d’une
séquence particulière est mise en évidence en incubant le papier dans une solution contenant des sondes de la
séquence recherchée, elles aussi dénaturées, et marquées radioactivement. La sonde s’hybride avec la séquence
sur le filtre. La présence de la radioactivité est révélée par autoradiographie
2-3-5 On peut coller deux fragments d’ADN
Ligation de fragments de restriction à bouts collants.
Dans cet exemple, les fragments de restriction de l’ADN I
obtenus par digestion par l’enzyme EcoRI (a’) sont
mélangés avec différents fragments de restriction de
l’ADN II obtenus par digestion par EcoRI (a), TaqI (b) et
HindIII (c). Les bouts collants a’ peuvent s’apparier avec
a, mais pas avec b ou c. On ajoute dans la solution une
ligase, une enzyme capable de créer une liaison
covalente entre deux nucléotides, pour coller les deux
fragments d’ADN. Cette technique permet donc de coller
deux fragments d’ADN de façon orientée. La ligase peut
aussi coller des extrémités franches, mais de façon
moins efficace, et non orientée.
2-3-6 Une séquence d’ADN particulière peut être amplifiée
2-3-6-1 par la technique du clonage
Principe général de clonage d’un fragment d’ADN dans un vecteur
plasmidique.
Un plasmide est un petit chromosome bactérien, autonome, qui
contient des gènes de résistance aux antibiotiques (non montré).
On sait extraire les plasmides des bactéries et les purifier. On y
insère in vitro le fragment d’ADN à cloner. On réintroduit le
plasmide recombinant dans des bactéries dépourvues de plasmide
par transfection. Les bactéries effectivement transfectées sont
sélectionnées grâce à leur résistance aux antibiotiques. Les
bactéries transfectées sont ensuite mise en culture de façon
individuelle. Chaque bactérie se multiplie sous forme d’un clone.
Le fragment d’ADN inséré a donc été amplifié.
Propriétés des vecteurs plasmidiques et
exemple de construction d’un
plasmide recombinant.
(a) Des plasmides ont été modifiés de
façon à faciliter l’insertion des
fragments d’ADN à cloner. Une des
modifications consiste à introduire
une séquence dite polylinker qui
contient plusieurs sites de restriction.
Les plasmides contiennent aussi une
origine de réplication (ORI) et un
gène de résistance à un antibiotique.
(b) Insertion d’un fragment de restriction
d’ADN génomique dans un vecteur
plasmidique. On choisit une enzyme
de restriction dont le site est présent
dans le polylinker ainsi qu’aux deux
extrémités du fragment d’ADN
génomique d’intérêt. Plasmide et
ADN génomique sont digérés par
cette enzyme ce qui génère des bouts
collants compatibles. L’incubation du
plasmide ouvert et de l’ADN
génomique morcelé en présence d’un
ligase permet d’obtenir le plasmide
recombinant.
2-3-6-2 par PCR (polymerase chain reaction)
L’ADN d’intérêt sera
amplifié à l’aide de primers
de séquence inverse
complémentaire de celles
des extrémités de la région
à amplifier, d’une ADN
polymérase thermostable
(la Taq) extraite de
bactéries vivant dans des
sources chaudes et de
nucléotides.
Les différentes réactions
de dénaturation,
hybridation des primers et
de synthèse par la Taq
nécessitant des
températures différentes,
les tubes réactionnels sont
placés dans des blocs
chauffants changeant la
température
automatiquement. Le fait
que la Taq soit extraite de
bactéries thermophiles la
rend résistante à 95°C, ce
qui évite de devoir en
rajouter dans le tube
réactionnel à chaque
cycle.
La PCR permet une
amplification exponentielle
de l’ADN, à partir de
quantités de départ très
petites.
2-4 L’ADN peut être séquencé
2-4-1 Principe du séquençage
Méthode de Chain termination.
(A) Cette méthode implique la synthèse
d’un brin d’ADN complémentaire du
brin à séquencer. Elle est réalisée à
l’aide d’un primer et d’une polymérase.
(B) Le milieu réactionnel contient, en plus
des primers et de la polymérase, des
nucléotides dont une petite fraction
sont des didésoxynucléotides. Les
didésoxynucléotides sont incorporés
dans l’ADN mais bloquent l’élongation.
Les didésoxynucléotides sont marqués
radioactivement.
(C) Si l’on met dans le tube réactionnel par
exemple des ddA, la réaction de
synthèse s’arrêtera à chaque T,
générant des fragments d’ADN de
différentes tailles se terminant tous par
un A. La longueur des ces fragments
donne donc la position des A dans la
séquence. La même réaction est faite
avec des ddC, ddG et ddT.
(D) Les produits des 4 réactions de
séquence sont séparés par
électrophorèse en gel de
polyacrylamide, dont la résolution
permet de séparer les fragments de
longueur différant par un seul
nucléotide. Les fragments d’ADN sont
ensuite révélés par autoradiographie.
La séquence se lit de bas en haut.
Séquençage automatique basé sur l’utilisation de didésoxynucléotides fluorescents.
(A) Une seule réaction de séquence est réalisée en mélangeant les 4 ddNTP, chacun marqué par un fluorochrome
de couleur différente. Les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. La
fluorescence de chaque bande sur le gel est détectée automatiquement par un lecteur optique.
(B) Le résultat de cette lecture est imprimé sous forme de pics dont la couleur représente le ddNTP.
2-4-2 Stratégies de séquençage des génomes
Tailles comparées de différents génomes. Les tailles des génomes sont données en paire de nucléotides par
génomes haploïdes.
La méthode du shotgun. L’ADN est fragmenté au hasard. Chaque fragment est amplifié puis séquençé. La
séquence totale est reconstituée grâce aux chevauchements recherchés par bioinformatique.
Limites de la méthode du shotgun.
(A) Problèmes dus à la présence de séquences répétées en tandem (exemple: séquence GATTA). En appliquant
simplement la reconstitution par chevauchements les séquences répétées internes risquent d’être omises.
(B) Problèmes dus à la présence de séquences répétées réparties dans le génome. De la même manière, en
appliquant le principe du chevauchement, les séquences situées entre les deux séquences répétées
risquent d’être omises.
Séquençage des grands génomes. Un génome constitué d’une molécule linéaire d’ADN de 2.5 Mb doit être
séquencé. On connaît dans ce génome la position de 8 marqueur (A-H).
La méthode du shotgun « génome entier » séquence d’abord des fragments au hasard, puis utilise la position
connue des marqueurs, en plus des chevauchements, pour l’assemblage final.
La méthode des « contigs » est basée sur une fragmentation ordonnée, puis sur le séquençage par la méthode
du shotgun de chaque fragment.
Exemple du séquençage du génome
d’Haemophilus influenzae.
H. influenzae est la bactérie responsable de la
méningite. Son génome a été séquencé en
1995. L’ADN a été fragmenté au hasard (par
sonication), ce qui génère des fragments de
1.6 and 2.0 kb. Ces fragments ont été séparés
par électrophorèse en gel d’agarose. Chaque
fragment est extrait du gel et amplifié par
clonage. 19 687 clones ont été générés.
Certains ont été séquencés plusieurs fois, ce
qui a généré 28 643 séquences. L’assemblage
de ces séquences par bioinformatique a pris
30 h. et a généré 140 contigs, c’est-à-dire 140
séquences continues. Restaient donc 139
trous!
Bilan: 5 personnes, 2 mois pour un génome bactérien
Etablissement du génome
complet d’Haemophilus
influenzae par recherche
des séquences manquantes
entre les contigs.
Deux méthodes sont possibles:
(à droite): Les fragments d’ADN
manquant vont être générés
par PCR à l’aide de primers
correspondant aux
séquences des extrémités
de chaque contig. Toutes
les combinaisons de
primers seront essayées.
Les combinaisons donnant
un produit de PCR
indiquent quels sont les
contigs voisins. Les
produits de PCR sont
ensuite extraits du gel et
séquencés.
(à gauche) On génère une
deuxième banque de
clones. Pour repérer et
séquencer uniquement les
clones correspondant aux
trous, on hydride la banque
avec des sondes
correspondant aux
extrémités de chaque
contig. Seuls les clones
s’hybridant avec deux
sondes correspondant à
une séquence entre deux
contigs; ils seront
séquencés
Séquençage du génome humain
-Décidé en 1980, initié en 1987 avec 400 marqueurs connus, soit 1/10 Mb
Méthode du shotgun applicable?
. il faudrait 70 106 séquences pour chevauchements suffisants
. Soit 70 séquenceurs automatiques, 1000 séquences par jour, 3
ans. Mais assemblage trop complexe
-En 1998: 1 marqueur/100 kb
. Fragments plus grands que séquences répétées
. Deux banques de clones, d’emblée: 300 000 clones avec au
moins un marqueur
. Chromosome par chromosome
- chromosome 22 publié en 1999
- chromosome 21 publié en 2000
- séquence complète en 2001
. Consortium international académique
. Société de Biotechnologie