Corrélation entre les anomalies centrosomiques et l`ADN

Article original
Ann Biol Clin 2011 ; 69 (2) : 181-9
Corrélation entre les anomalies centrosomiques
et l’ADN-ploïdie dans le cancer du sein
Are centrosomal abnormalities correlated to DNA ploidy in breast cancer?
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017.
Rita Sakr1
Jocelyne Fleury2
Claudie Prengel2
Patricia Roynard2
Émile Daraï1
Serge Uzan1
Roman Rouzier1
Jean-François Bernaudin2
1 Hôpital Tenon,
Service de gynécologie,
Paris
<[email protected]>
doi:10.1684/abc.2011.0525
2 Université Pierre-et-Marie-Curie,
Laboratoire d’histologie et de biologie
tumorale - UPRES 3499, Paris
Article reçu le 21 juillet 2010,
accepté le 28 octobre 2010
Tirés à part : R. Sakr
Résumé. Plusieurs études décrivent le rôle de l’ADN-ploïdie dans les instabilités génomiques des cellules cancéreuses et le pronostic. Le centrosome jouant
un rôle important dans le cycle cellulaire, de nouveaux facteurs pronostiques
pourront être introduits pour mieux cibler les traitements. L’objectif de ce travail
est de rechercher dans le cancer du sein une anomalie centrosomique et la corrélation avec l’ADN-ploïdie. Des lames sont réalisées à partir des échantillons de
prélèvements mammaires et des suspensions cellulaires (cellules mésothéliales
et lignées cellulaires MRC5, MCF7, T47D). L’immunofluorescence indirecte
est utilisée avec l’anticorps anti-␥-tubuline puis un fragment F(ab )2 conjugué
au fluoro-isothyanate. Les centrosomes sont quantifiés au microscope à fluorescence. L’ADN-ploïdie est définie par l’index d’ADN analysée par cytométrie
en flux. Les cellules mésothéliales normales (94 % des cellules avec un centrosome) et les cellules MRC5 diploïdes cyclantes (68 % avec deux centrosomes)
sont des contrôles de qualité des expériences. Une corrélation entre l’ADNploïdie et le nombre de centrosomes est retrouvé dans les lignées MCF7 (64 %
des cellules avec un nombre de centrosomes ≥ 3) mais pas dans les lignées T47D
et les dix échantillons de carcinome invasif du sein analysés dans cette étude.
L’absence de relation entre l’ADN-ploïdie et le nombre de centrosomes pourrait être due au petit nombre d’échantillons mammaires étudiés, aux empreintes
cellulaires ou au mécanisme tumoral. Un élargissement de l’étude sur un grand
nombre d’échantillons et de pathologies mammaires et l’étude des anomalies
morphologiques du centrosome sont prévus.
Mots clés : centrosome, ADN-ploïdie, cancer du sein
Abstract. ADN ploidy was shown to play a role in genomic instability of cancer
cells and prognosis. The implication of the centrosome in the cell cycle was also
described. Therefore, new prognostic factors could be suggested for a bettertailored therapy. The purpose of this study is to search for correlation between
centrosomal abnormality and ADN ploidy in breast cancer. Cell prints were
prepared from cell culture of mesothelial ascitis, fibroblast cell line MRC5 and
breast cancer cell lines MCF7 and T47D. Fresh cell prints were also obtained
from cases with invasive carcinoma. The centrosome was labelled by an indirect immunofluorescence assay using anti-␥-tubulin antibody and F(ab )2 FITC
before quantification with fluorescence microscopy. ADN ploidy was scored
with DNA index obtained by means of flux cytometry. The normal mesothelial
cells (94% of cells with only one centrosome) and the diploid cell line MRC5
(68% of cells with two centrosomes) were used as controls. DNA ploidy was
found to be correlated with centrosomal abnormality in MCF7 cell line (64%
of cells had more than three centrosomes) but not in the 10 cases of invasive
ductal carcinoma analysed in this study. The absence of correlation between
DNA ploidy and centrosomal abnormality in breast cancer samples may be due
to the small numbers of cases, the cell prints or tumorigenesis. Correlation analysis of a larger number of cases and types of breast lesions to numerical and
morphological abnormalities of the centrosome are ongoing.
Key words: centrosome, DNA ploidy, breast cancer
Pour citer cet article : Sakr R, Bernaudin JF, Daraï É, Fleury J, Prengel C, Rouzier R, Roynard P, Uzan S. Corrélation entre les anomalies centrosomiques et
l’ADN-ploïdie dans le cancer du sein. Ann Biol Clin 2011 ; 69(2) : 181-9 doi:10.1684/abc.2011.0525
181
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Article original
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la
femme. Environ 40 000 nouveaux cas par an sont diagnostiqués en France et c’est la première cause de décès par
cancer chez la femme entre 35 et 55 ans. Le dépistage et
le diagnostic reposent sur l’imagerie et l’examen anatomopathologique et la stratégie thérapeutique sur un contrôle
locorégional ainsi que général de la maladie [1]. Pour le
choix des stratégiques thérapeutiques, il s’est révélé important de définir des classes de pronostics différents afin de
mieux cibler les traitements tout en respectant le rapport
bénéfice/risque [2, 3]. Par ailleurs, même en tenant compte
des facteurs de pronostic les plus pertinents, un nombre non
négligeable de patientes vont rechuter, justifiant l’intérêt
d’élargir la liste des facteurs pronostiques et prédictifs déjà
identifiés.
L’évaluation de la cinétique cellulaire n’est pas standardisée, mais l’étude de la prolifération cellulaire s’est révélée
utile dans les choix thérapeutiques. Elle est évaluée par le
pourcentage de cellules en phase S ou fraction de cellules en
phase S (FPS) pouvant être estimée par cytométrie en flux
(CMF) et par l’étude d’antigènes associés au cycle cellulaire (Ki67). L’ADN-ploïdie étudiée en CMF est un reflet
des instabilités chromosomiques ou génomiques des cellules cancéreuses. Si la cellule ne possède plus le contrôle
signalant que la mitose est anormale, elle poursuit sa division et produit des cellules aneuploïdes. Des études récentes
ont montré le rôle important de l’ADN-ploïdie et de la FPS
comme facteurs prédictifs de rechute dans les cancers du
sein [4-10].
Le centrosome (centre de la cellule) est le centre organisateur des microtubules et se trouve près du noyau [11].
Il comprend deux centrioles organisés dans un matériel
péricentriolaire mal défini appelé matrice (␥-tubuline) et
le cycle du centrosome est distinct du cycle cellulaire. La
duplication du centrosome débute à la transition G1/S. Les
deux centrioles fils arrivent à maturité en taille et en structure à la fin de G2, parallèlement à la croissance de la matrice
péricentriolaire (MPC). À la mitose, les deux centrosomes
sont matures, ont acquis le maximum de MPC et peuvent
se séparer. Le cycle de division cellulaire dépend de l’aster
microtubulaire qui est organisé par le centrosome. Le centrosome joue un rôle important dans le contrôle de la ploïdie
des cellules filles ; comme l’ADN, il est dupliqué une seule
fois par cycle cellulaire sous la dépendance du point de restriction G1/S [12]. Avant son entrée en mitose, la cellule
doit contenir deux lots identiques d’ADN et deux centrosomes soit quatre centrioles. La présence d’anomalies du
centrosome provoquerait une aneuploïdie par défaut ou anomalie de formation du fuseau mitotique ou par défaut de
cytokinèse. Une aneuploïdie associée à un nombre anormal de centrosomes est souvent observée dans les cellules
tumorales [13, 14]. Dans les cancers du pancréas et du
sein, des anomalies de taille, de forme ou de nombre du
182
centrosome sont fréquemment observées [15, 16]. Malgré
ces différentes études corrélant les anomalies centrosomiques au processus tumoral, la relation cause à effet n’a
pas été encore clairement démontrée [17].
Il y a un siècle, Théodore Boveri avait prédit que la
moindre erreur au cours de la mitose pouvait aboutir à
une instabilité chromosomique à l’origine du cancer. Des
anomalies cellulaires comme l’augmentation du nombre
des centrosomes augmentent le risque de formation de
fuseaux multipolaires qui conduisent à l’aneuploïdie, instabilité génétique la plus fréquemment observée dans de
nombreux cancers chez l’homme et d’autres mammifères [18, 19]. Les cancers du sein et de la vessie ont
été les premiers pour lesquels les mesures de corrélation
entre l’aneuploïdie et la tumorigenèse ont été effectuées,
l’aneuploïdie étant associée à un mauvais pronostic dans
les carcinomes mammaires [20, 21]. Parmi les mécanismes
de contrôle de la mitose, nous venons de voir que le centrosome joue un rôle important. Cependant, il n’a pas encore
été démontré de relation entre les anomalies du centrosome
et l’agressivité des tumeurs. Par ailleurs, l’ADN-ploïdie
est un bon reflet de l’instabilité génomique et a été
démontrée liée aux facteurs de pronostic dans les cancers
du sein.
L’objectif de notre étude est, d’une part, l’analyse des anomalies du centrosome dans le cancer du sein et, d’autre part,
la recherche d’une relation entre le nombre de centrosomes
et l’ADN-ploïdie et les signes de prolifération cellulaire
comme la FPS, dans le but de rajouter des outils applicables
aux empreintes cellulaires.
Matériel et méthodes
Lignées cellulaires de contrôle
Dans l’objectif d’avoir un contrôle de cellules épithéliales
normales, du liquide d’ascite non carcinomateux est utilisé. Deux litres de liquide d’ascite sont répartis dans des
tubes de 50 mL et centrifugés. Les culots sont lavés plusieurs fois dans du PBS 10 % SVF après lyse des hématies
et les cellules sont mises en suspension dans du PBS. La
culture des différentes cellules étudiées se fait dans une
étuve à CO2 5 % à 37 ◦ C dans un milieu comprenant du
RPMI 1640 (Gibco) ou du DMEM 1880 (Gibco) supplémenté avec 10 % de SVF (Gibco), de la L-glutamine 5 mM
(Sigma), de la pénicilline 50 U/mL (Sigma), de la streptomycine 50 ␮g/mL (Sigma) et de l’hepes 20 mM (Gibco).
Le milieu de culture est renouvelé deux à trois fois par
semaine. Une fois arrivées au degré de confluence désiré,
les cellules sont trypsinées à 37 ◦ C pendant cinq à dix
minutes (trypsine-EDTA 1 X, Gibco) puis mises en suspension dans un volume égal de milieu de culture. Les
suspensions cellulaires sont ensuite centrifugées à 1 000 g
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein
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pendant quatre minutes à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension
dans du PBS. Pour la mise au point du marquage de
cellules diploïdes cyclantes et l’examen du cycle du centrosome, les lignées de fibroblastes MRC5 sont étudiées à
30, 60 et 90 % de confluence. Pour celle des cellules aneuploïdes, les lignées de cancer du sein MCF7 et T47D sont
cultivées.
Immunocytochimie
Des échantillons de tissu mammaire sont prélevés par
l’anatomopathologiste conformément à l’avis du Comité
de protection des personnes et sont conservés dans l’azote
liquide à - 80 ◦ C. Après décongélation des prélèvements,
des empreintes cellulaires sont réalisées sur lame. Une lame
est colorée par le MGG pour vérifier la qualité de la préparation cellulaire et les deux autres lames sont séchées à l’air
pendant 24 heures puis congelées à - 20 ◦ C sans fixation.
Les suspensions cellulaires sont concentrées à 106 cellules/mL. Des pastilles de cytocentrifugation sont préparées
avec 100 ␮L de cette suspension par lame (200 g pendant
six minutes). Pour chaque type cellulaire, une lame est colorée par le MGG pour contrôler la qualité cellulaire et, pour
le liquide d’ascite, confirmer la richesse en cellules mésothéliales. Les lames restantes de chaque type cellulaire sont
séchées à l’air pendant une nuit puis congelées à - 20 ◦ C
jusqu’à l’utilisation.
La méthode d’immunomarquage utilisée est une immunofluorescence indirecte. Les lames préparées (empreintes
ou pastilles de cytocentrifugation) sont décongelées pendant cinq minutes à température ambiante. Les cellules
mésothéliales ont servi de contrôle de cellules normales
diploïdes, les fibroblastes MRC5 de contrôle de cellules
diploïdes cyclantes pour l’étude de centrosomes dans le
cycle cellulaire et les lignées tumorales MCF7 et T47D
de contrôle de cellules tumorales ADN-aneuploïdes. Les
cellules d’intérêt sont entourées au stylo hydrofuge (DakoCytomation). Une fixation par l’acétone à froid (+ 4 ◦ C)
pendant dix minutes suivi d’un lavage dans du PBS 5 %
SVF pendant cinq minutes a montré les meilleurs résultats.
Les cellules sont ensuite perméabilisées avec du Triton®
X-100 à 0,1 % pendant cinq minutes à température
ambiante. Un anticorps (Ac) monoclonal de souris anti-␥tubuline (1,6 mg/mL) (Sigma) est utilisé pour le marquage
du centrosome. Les lames sont incubées avec du sérum AB
(SAB) humain (Bio West) à 30 % dans du PBS pendant
30 minutes puis avec l’Ac primaire à 1/300 pendant
60 minutes à température ambiante. L’isotype est une
IgG1,␬ non relevante (0,2 mg/mL) (Sigma). Après un
lavage dans du PBS 5 % SVF pendant dix minutes, les lames
sont incubées avec un Ac secondaire de chèvre anti-souris
marqué au FITC à 1/50 (FITC-IgG,F(ab )2 [1,4 mg/mL]
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
[Immunotech]), pendant 60 minutes à l’abri de la lumière.
Pour la contre-coloration des noyaux, un lavage des lames
dans du PBS pendant dix minutes est suivi par une incubation avec du DAPI pendant une minute à l’abri de la
lumière. Les lames sont ensuite montées dans Vectashield®
Mounting Medium (1,5 ␮g/mL) (Vector). L’observation
est faite à l’aide d’un microscope à fluorescence Leica
DM 4000B (Wetzlar, Allemagne) aux grossissements × 10,
× 60 et × 100 et utilisant un filtre bleu pour le DAPI
(␭ d’excitation = 359 nm ; ␭ d’émission = 461 nm) et un
filtre vert pour le FITC (␭ d’excitation = 490 nm ; ␭
d’émission = 525 nm). Le nombre de points verts (centrosomes) est compté dans chaque cellule sur au moins
100 cellules par lame. Les images sont numérisées à
l’aide d’une caméra refroidie CCD (Cool Snaps cf ) et d’un
logiciel d’acquisition d’image Genikon (Alphelys, Plaisir,
France).
Cytométrie en flux
La cytométrie en flux (CMF) est réalisée sur les échantillons tumoraux prélevés par l’anatomopathologiste dans
la région la plus représentative de la tumeur, congelés dans
l’azote liquide et conservés à - 80 ◦ C. Après décongélation
et réalisation d’empreintes permettant de confirmer la présence de cellules tumorales, les prélèvements sont dissociés
mécaniquement et les cellules recueillies sont réparties dans
deux tubes. Dans l’un des tubes, des lymphocytes humains
(2.105 lymphocytes pour 106 cellules tumorales) normaux
sont rajoutés comme témoins de la population diploïde. Les
cellules sont ensuite incubées avec l’iodure de propidium
(IP), [kit DNA prep, Beckman Coulter]. L’analyse d’un
minimum de 2,104 cellules est réalisée en utilisant un cytomètre en flux (Epics Elite® , Beckman Coulter) équipé d’un
laser Argon ((␭ = 488 nm) et d’un filtre rouge (␭ = 635 nm).
Les données sont enregistrées dans un fichier sous forme
de listmod (LMD). Le contenu en ADN et la FPS sont évalués à l’aide du logiciel Wincycle (Phoenix, États-Unis)
conformément aux recommandations et aux conférences
de consensus [4, 22]. Le contenu en ADN définit les cellules ADN-diploïdes ou ADN-aneuploïdes et le calcul de
la FPS les répartit en classes en fonction des terciles selon
les règles de validation établies par les consensus. L’ADNploïdie est définie par l’index d’ADN (ID) qui est le rapport
du canal moyen de fluorescence des cellules tumorales sur
celui des cellules diploïdes de référence : une tumeur dont
toutes les populations cellulaires ont un ID proche d’un
est dite ADN-diploïde alors qu’une tumeur ayant au moins
une population cellulaire avec un ID différent d’un est
dite ADN-aneuploïde. Par ailleurs, pour les tumeurs ADNdiploïdes, la phase S est dite basse (B) si la FPS inférieure
ou égale à 1,2 %, intermédiaire (I) si la FPS est supérieure
à 1,2 % et inférieure ou égale à 3 %, et haute (H) si la FPS
183
Article original
est supérieure à 3 %. Pour les tumeurs ADN-aneuploïdes,
la phase S est dite basse si la FPS inférieure ou égale à
3,85 %, intermédiaire si la FPS est supérieure à 3,85 % et
inférieure ou égale à 8,7 %, et haute si la FPS est supérieure
à 8,7 %.
Analyse statistique
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Le calcul des moyennes et des écarts types ainsi que les
histogrammes sont réalisés à l’aide du logiciel Statview® ,
Abacus, Berkeley.
Résultats
Immunofluorescence et quantification
du centrosome
La présence d’un centrosome correspond à un point brillant
vert de fluorescence et toutes les expériences ont été reproduites au moins cinq fois (300 lames au total). La majorité
des cellules mésothéliales diploïdes normales (94 %) ont un
seul point fluorescent (centrosome) par cellule (figure 1).
Dans quelques cellules (6 %), deux points fluorescents
sont observés correspondant probablement à des cellules en
cours de duplication. Lorsque les cellules MRC5 diploïdes
cyclantes atteignent 60 % de confluence, elles ont un taux
élevé de mitoses et de cellules en phase S (30 %) permettant d’étudier l’évolution du centrosome au cours du cycle
cellulaire, d’une part, en comptant le nombre de centrosomes et, d’autre part, en évaluant la distance séparant les
deux points d’une même cellule. Nous avons observé 32 %
de cellules avec un seul point fluorescent et 68 % de cellules avec deux points fluorescents (figure 1). Les cellules
des lignées tumorales MCF7 et T47D ont un, deux, trois
ou quatre points fluorescents (figure 1). Leur nombre est
détaillé dans le tableau 1. Dix prélèvements de carcinome
canalaire infiltrant du sein sont marqués avec l’Ac anti␥-tubuline (figure 2). Les résultats de la numération des
centrosomes sont présentés dans le tableau 2.
C
A
B
D
E
Figure 1. Immunomarquage avec l’anticorps anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100). A) Cellules mésothéliales
d’ascite. B) Lignée cellulaire de fibroblastes MRC5. C) Cellule de la lignée fibroblastique MRC5 en cycle. D) Lignée cellulaire de cancer
du sein MCF7. E) Lignée cellulaire de cancer du sein T47D. Bleu : noyau coloré par le DAPI ; vert : centrosome immunomarqué par FITC ;
: un point vert ; : deux points verts.
Tableau 1. Pourcentage de cellules des lignées MCF7 et T47D avec un, deux, trois et quatre centrosome(s).
MCF7
T47D
Cellules avec
1 centrosome (%)
24
25
Cellules avec
2 centrosomes (%)
12
52
Cellules avec
3 centrosomes (%)
60
21
Cellules avec
4 centrosomes (%)
4
2
ID
1,6
1,4
ID : index d’ADN.
184
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
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Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein
A
B
C
D
Figure 2. Empreintes cellulaires de carcinome canalaire infiltrant du sein. A) Cellules colorées par MGG. B) immunomarquage avec
l’anticorps anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : un centrosome. C) Immunomarquage avec l’anticorps
anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : trois centrosomes. D) Immunomarquage avec l’anticorps anti-␥tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : quatre centrosomes. Bleu : noyau coloré par le DAPI ; vert : centrosome
immunomarqué par FITC ; : un point vert ; : deux points verts.
Cytométrie en flux
Toutes les cellules mésothéliales sont ADN-diploïdes. Les
fibroblastes MRC5 sont ADN-diploïdes avec une FPS
variant en fonction du taux de confluence cellulaire dans
la boîte de Petri. La FPS est maximale (30) à 60 %
de confluence. Les lignées MCF7 et T47D sont ADNaneuploïdes avec ID à 1,6 et 1,4 respectivement. Trois cas
de carcinome canalaire infiltrant sont ADN-diploïdes et les
sept autres cas sont ADN-aneuploïdes, dont trois cas avec
un ID autour de 1,5 (proches triploïdes) et quatre cas avec
un ID autour de 1,8 (proches tétraploïdes). Un seul cas de
carcinome canalaire infiltrant a une FPS basse, deux cas ont
une FPS intermédiaire et cinq cas ont une FPS haute.
Corrélation entre le nombre de centrosomes
et l’ADN-ploïdie
Cellules normales
Dans les cellules diploïdes peu ou non cyclantes (cellules
mésothéliales), le nombre de cellules avec un seul centrosome est maximal (94 %). Dans les cellules diploïdes
cyclantes (fibroblastes MRC5) avec une FPS à 30 %, le
pourcentage de cellules avec un centrosome est de 32 %
et le pourcentage de cellules avec deux centrosomes est
de 68 %. Ces types cellulaires sont de bons témoins de
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
cellules normales et de cellules diploïdes cyclantes. Ces
résultats correspondent à ce qui est attendu dans les cellules normales cyclantes ou non et sont donc des contrôles
de qualité des expériences.
Lignées tumorales
Un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois
est considéré comme anormal. Dans la lignée MCF7,
100 % des cellules sont ADN-aneuploïdes avec un ID
à 1,6. Le pourcentage de cellules avec un nombre de
centrosomes supérieur ou égal à trois est de 64 % en corrélation avec l’ADN-aneuploïdie. Dans la lignée T47D,
100 % des cellules sont également ADN-aneuploïdes
avec un ID à 1,4. Le pourcentage de cellules avec un
nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois est de
23 %.
Carcinomes infiltrants du sein
Trois cas de carcinomes canalaires invasifs du sein sont
ADN-diploïdes. Sept cas de carcinomes canalaires invasifs
du sein sont ADN-aneuploïdes. Le pourcentage de cellules
avec un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois
est légèrement supérieur dans les cas ADN-aneuploïdes
par rapport aux cas ADN-diploïdes (15 ± 9,6 % versus
13,3 ± 5,7 %). Une analyse détaillée des corrélations est
illustrée par la figure 3.
185
B
I
H
H
H
H
I
H
1,53
1
1,81
1,76
1,66
1,84
1,89
1
1,57
1
Discussion
186
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
D : ADN-diploïde ; A : ADN-aneuploïde ; FPS : fraction de cellules en phase S ; B : basse ; I : intermédiaire ; H : haute ; ID : index d’ADN.
A
D
A
A
A
A
A
D
A
D
Cellules avec
3 centrosomes
(%)
16
8
10
9
6
31
7
17
6
7
Cellules avec
2 centrosomes
(%)
68
68
64
83
66
47
54
64
64
56
Cellules avec
1 centrosome
(%)
15
22
23
7
25
17
37
16
25
34
Tumeur no
Tableau 2. Résultats de l’étude de dix échantillons de carcinome infiltrant du sein.
Cellules avec
4 centrosomes
(%)
1
0
2
1
2
3
2
3
4
2
Cellules avec
5 centrosomes
(%)
0
2
1
0
1
2
0
0
1
1
ADN-ploïdie
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Cellules
aneuploïdes
(%)
85,5
0
17,0
28,0
56,5
72,0
31,5
0
13,5
0
FPS
ID
Article original
Les cellules cancéreuses possèdent fréquemment des anomalies chromosomiques qui portent sur leur structure ou sur
leur nombre. L’anomalie de nombre appelée aneuploïdie
est un facteur de mauvais pronostic. Il peut s’agir d’un
évènement précoce en relation avec la tumorigenèse ou
d’un évènement tardif en relation avec l’agressivité de la
tumeur. Plusieurs études récentes convergent aussi bien
pour comprendre ces mécanismes que pour déterminer de
nouveaux facteurs et outils d’analyse dans l’objectif de
mieux cibler les traitements.
Une « amplification » centrosomique a été impliquée dans
des aberrations mitotiques, des aneuploïdies et des instabilités génomiques. Chez l’homme, un dysfonctionnement
du centrosome conduirait à un dérèglement du fuseau
mitotique responsable d’anomalies chromosomiques et
d’ADN-aneuploïdie [14]. Des études récentes explorant
la relation entre l’aneuploïdie des cellules cancéreuses,
l’instabilité génomique et les aberrations centrosomiques
ont retrouvé des cellules avec anomalies du centrosome
dans une moyenne de 9,6 % au sein d’un groupe de carcinomes infiltrants [13]. Le but de notre étude est de
rechercher une relation entre les anomalies du centrosome,
l’ADN-ploïdie et la FPS, l’ADN-ploïdie et la FPS étant le
reflet à la fois de l’instabilité génomique et de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, certains auteurs ont rapporté
l’intérêt clinique de l’analyse d’ADN en CMF confirmant
le lien entre la FPS, l’ADN-ploïdie et le risque de rechute
chez des patientes atteintes de cancer du sein classé T1 ou
T2 [4, 5].
Pour toutes les cellules étudiées, l’autofluorescence a été un
obstacle dans l’observation de l’immunomarquage. Bien
que dans la littérature, le PFA soit le fixateur le plus utilisé en
raison d’une bonne qualité de la fixation, l’autofluorescence
induite par ce fixateur a gêné la reconnaissance du centrosome (point fluorescent ≤ 2 ␮m). En fait, le bruit de fond
et l’autofluorescence doivent être très minimes ou absents
pour une bonne discrimination d’un point fluorescent
correspondant à un centrosome. Certains auteurs ont également décrit une certaine autofluorescence produite par les
solutés à base de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde
[23]. Cette autofluorescence ayant disparu avec la modification du fixateur, nous avons donc choisi l’acétone comme
fixateur.
Nous avons étudié dans cette première étape la corrélation entre le nombre de centrosomes dans la cellule et
l’ADN-ploïdie.
Dans le choix des cellules normales de contrôle, nous avions
besoin de cellules normales peu cyclantes comportant
théoriquement un seul centrosome et de cellules cyclantes
comportant un ou deux centrosomes. Plusieurs types
cellulaires testés ont été abandonnés pour des problèmes
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein
A
B
100
100
90
80
Moyenne des cellules
Moyenne des cellules
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80
60
40
20
70
60
50
40
30
20
10
0
1 et 2
Centro
ADN-aneuploïde ;
≥3
Centro
ADN-diploïde
0
≥3
Centro
1 et 2
Centro
ID égal à 1 ;
ID proche triploïde ;
ID proche tétraploïde
Figure 3. Corrélation avec le nombre de centrosomes dans les dix cas de carcinome canalaire infiltrant en fonction de : A) l’ADN-ploïdie ;
B) l’index d’AND.
techniques ou d’autofluorescence et nous avons retenu les
cellules mésothéliales d’ascite et les lignées de fibroblastes
MRC5.
Les cellules mésothéliales normales diploïdes ont une majorité de cellules avec un seul centrosome. Les fibroblastes
MRC5 diploïdes cyclantes ont une majorité (68 %) de cellules avec deux centrosomes. Ces expériences ont permis
de déterminer les contrôles des cellules diploïdes normales
non cyclantes et des cellules diploïdes cyclantes.
Les résultats sur les cellules normales nous ont également
permis de valider la technique en raison de la présence d’un
centrosome par cellule dans des cellules peu cyclantes et
d’une majorité de cellules avec deux centrosomes dans des
cellules cyclantes. Le fait de n’avoir jamais observé plus
de deux centrosomes dans des cellules normales, valide la
méthode d’immunomarquage et de numération des centrosomes.
Les lignées de cellules tumorales MCF7 et T47D servent
de contrôle de cellules ADN-aneuploïdes. L’étude de la
lignée tumorale MCF7 retrouve 100 % de cellules ADNaneuploïdes avec 64 % des cellules ayant un nombre de
centrosomes égal ou supérieur à 3. Ces cellules ayant une
ADN-aneuploïdie et un ID proche de 1,6 confirment la
corrélation entre l’ADN-aneuploïdie et le nombre de centrosomes. En revanche, l’étude de la lignée tumorale T47D
retrouve 100 % de cellules ADN-aneuploïdes et un ID
proche de 1,5 avec une majorité de cellules ayant un ou
deux centrosomes. Bien que l’ID soit proche de 1,5, nous
Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011
retrouvons ici une dissociation entre l’ADN-ploïdie et le
nombre de centrosomes. Dans un premier temps, un caryotype doit être réalisé dans l’objectif de vérifier le nombre de
chromosomes dans chaque lignée et de vérifier que l’ADNaneuploïdie observée correspond bien à l’augmentation du
nombre de chromosomes.
Dans les carcinomes mammaires étudiés, nous n’avons pas
observé de corrélation significative entre l’ADN-ploïdie, la
FPS et le nombre de centrosomes. Dans les tumeurs ADNdiploïdes, nous retrouvons un taux non négligeable mais
relativement faible (13,3 %) de cellules ayant un nombre
de centrosomes égal ou supérieur à 3. Ce résultat pourrait être dû à un faible taux de cellules aneuploïdes non
détectées en CMF. Cependant, dans les tumeurs ADNaneuploïdes, le taux de cellules avec un nombre anormal de
centrosomes est également relativement faible (15 %), mais
légèrement supérieur à celui des tumeurs ADN-diploïdes.
Bien que non significative, la différence entre les pourcentages de cellules avec un nombre de centrosomes supérieur
ou égal à trois révèle un taux légèrement supérieur dans
la population ADN-aneuploïde par rapport à la population
ADN-diploïde. Parmi les sept tumeurs ADN-aneuploïdes,
les trois tumeurs « proches triploïdes » (ID autour de 1,5) ont
un taux faible de cellules avec un nombre de centrosomes
égal à 3 ; cependant, l’une de ces tumeurs n’a que 13,5 %
de cellules aneuploïdes. Les quatre tumeurs « proches tétraploïdes » n’ont pas un taux significativement plus élevé
de cellules avec deux ou quatre centrosomes que celui des
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Article original
autres tumeurs. Cette absence de relation peut être due au
petit nombre de cas étudiés. Elle peut être également due
aux échantillons tumoraux. En effet, les cellules présentes
sur les empreintes sont différentes de celles utilisées pour
la CMF. Certaines difficultés sont également rencontrées
dans l’observation des empreintes : cellules altérées ou peu
nombreuses. Le mécanisme tumoral lui-même peut aussi
être à l’origine de nos résultats : d’une part, le nombre
de centrosomes ne serait pas la conséquence de l’ADNaneuploïdie et, d’autre part, nous n’avons évalué que le
nombre de centrosomes et non pas sa taille ou ses anomalies
morphologiques.
La poursuite le travail est envisagée sur un grand nombre
d’échantillons et de pathologies mammaires, sur un plus
grand nombre de cellules par échantillon, ainsi que sur
l’étude des anomalies morphologiques et de taille du
centrosome.
Conclusion
Les anomalies du centrosome sont considérées comme des
marqueurs de carcinogenèse cellulaire. Une « amplification » centrosomique a été impliquée dans des aberrations
mitotiques, des aneuploïdies et des instabilités génomiques
de plusieurs lésions cancéreuses. Ces anomalies sont également recherchées dans le cancer du sein.
Cette étude préliminaire a permis la mise au point et la
validation d’une méthode cytologique de reconnaissance
et de comptage des centrosomes. Les premiers résultats
n’ont pas montré de corrélation entre l’ADN-aneuploïdie
et le nombre de centrosomes en raison du petit nombre
d’échantillons analysés et de l’absence d’étude des anomalies morphologiques des centrosomes. La poursuite
de l’étude permettra l’élargissement de l’échantillon et
l’introduction des méthodes de biologie moléculaire et de
cytogénétique.
Conflits d’intérêts : aucun.
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