Les centrosomes - Institut de recherches cliniques de Montréal
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Les centrosomes SMC6041/BIM6025 et 516-604D IRCM 12 février 2012 Vincent Archambault Chercheur principal, Institut de recherche en immunologie et en cancérologie Professeur sous octroi adjoint, Département de biochime Université de Montréal Le cycle de la division cellulaire eucaryote Plan du cours PARTIE I: Théorie sur les centrosomes et les cils 1- Découverte du centrosome 2- Fonctions des centrosome et des cils 3- Biogénèse des centrioles et des cils 4- Centrosomes et cils dans les maladies humaines 5- Les centrosomes: essentiels? facultatifs? nuisibles? PARTIE II: Présentation de recherche: Régulation du cycle cellulaire et des centrosomes par des kinase et phosphatases PARTIE I Théorie sur les centrosomes et les cils 1- Découverte du centrosome Theodor Boveri Découvreur du centrosome (1888), qu’il décrit comme “the especial organ of cell division”. Theodor Boveri Découvreur du centrosome (1888), qu’il décrit comme “the especial organ of cell division”. Le centrosome Bettencourt-Dias & Glover, 2007, NRMCB Structure d’un centrosome de vertébré Brito et al, 2012. Deconstructing the centriole: structure and number control. Current Opinion in Cell Biology. Brito et al, 2012. Deconstructing the centriole: structure and number control. Current Opinion in Cell Biology. 2- Fonctions des centrosomes et des cils Les centrosomes organisent les microtubules pour la formation d’un fuseau bipolaire en mitose L’assemblage des microtubules Kollman et al, 2011. Nat Rev Mol Cell Biol. Le complexe de la g-Tubuline (gTubulin Ring Comlex; gTuRC) Kollman et al, 2011. Nat Rev Mol Cell Biol. Nucléation des microtubules aux centrosomes par le gTuRC Kollman et al, 2011. Nat Rev Mol Cell Biol. Les centrosomes sont souvent associés à l’enveloppe nucléaire en interphase. Les centrosomes sont souvent associés à l’enveloppe nucléaire en interphase. Topology and functions of LINC complexes. Razafsky & Hodzic, 2009, JCB Le cycle cellulaire chez deux levures www.ncbi.nlm.nih.gov Mitose ouverte, mitose fermée, mitose semi-fermée Humains Mouches Güttinger et al, 2009. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Levures Champignons Levures bourgeonnantes Vertébrés Lim et al. 2009. Regulation of centrosome separation in yeast and vertebrates: common threads. Trends in Cell Biology. Le point de restriction du positionnement du fuseau (Spindle Orientation Checkpoint; SPOC) Caydasi et al, 2010, Cell Div Les centrioles permettent la formation des centrosomes et des cils engaged appendages Raff & Nigg. 2009. Cell 3-Biogénèse des centrioles et des cils Le cycle de duplication des centrioles Cdk2, Plk4 Raff & Nigg. 2009. Cell Le cycle de duplication des centrioles est régulé par la kinase Plk4. Plk4 degradé Plk4 activé Sillibourne & Bornens, 2010. Cell Division. Identification of SAS-6 as a key element of the centriolar cartwheel. (a) Immunolocalization of the SAS-6 protein (also known as Bld12p) to the central hub of the cartwheel in Chlamydomonas reinhardtii imaged by electron microscopy. Top images show longitudinal sections through wild-type centrioles; note the immunogold-labelling of the carthwheel by anti-SAS-6 antibodies (right). Bottom; immunogold-labelling of centriole in cross-section, showing that SAS-6 localizes to the central part of the cartwheel (right). Schematic representation (left) shows cartwheel in red. Scale bars,100 nm. Reproduced with permission from ref. 35. (b). Structural model of a SAS-6 oligomer (upper panel) and rotary-metal-shadowing electron micrographs of the same structure (lower right panel; schematic representation of structure is shown on the left). Both images emphasize the importance of SAS-6 for conferring ninefold rotational symmetry to the centriole. (Reproduced with permission from ref. 38). Nigg & Stearns, 2011. The centrosome cycle: Centriole biogenesis, duplication and inherent asymmetries. Nat Cell Biol. The centrosome cycle. Nigg, 2007. Trends in Cell Biology. Le point de restriction de l’assemblage du fuseau (spindle assembly checkpoint; SAC) Musacchio & Salmon, 2007, NRMCB Peters, 2006, NRMCB Régulation de la cohésion entre chromatides sœurs. Archambault & Glover, 2009, Nat Rev Mol Cell Biol. Coordination du cycle des centrosomes avec la ségrégation des chromosomes The dual use of cohesin ensures coordination of the chromosome- and the centrosome cycle. The model proposes that centrioles (shades of grey), in a similar way to sister chromatids (light blue), are held together by two pools of cohesin (red), that is, a prophase-responsive fraction and one protected by shugoshin 1 (dark blue). Consequently, centriole disengagement and sister-chromatid separation occur in highly similar fashions, with separase removing the last of cohesin by proteolytic cleavage of Scc1. 4- Centrosomes et cils dans les maladies humaines Problèmes de centrosomes et instabilité génomique Raff & Nigg. 2009. Cell Problèmes de centrosomes et maladies Raff & Nigg. 2009. Cell Problèmes de centrioles et maladies Raff & Nigg. 2009. Cell 5- Les centrosomes: essentiels? facultatifs? nuisibles? Fig 4. DSas-4S2214 Mutant Flies Are Morphologically Normal, but Lack Cilia Deux voies contribuent à la formation du fuseau mitotique ou méiotique Par les centrosomes Par les chromosomes femelle mâle embryon pupe Le cycle de vie de la drosophile (9 jours) larve 1 pré-pupe larve 2 larve 3 13 X S/M L’embryon de drosophile et la contribution maternelle Développement de l’embryon syncytial de la drosophile Les noyaux migrent vers le cortex lors de leurs divisions, poussés par une cage de microtubules. Archambault & Pinson (2010) Fly. Les microtubules astraux génèrent une poussée qui force les noyaux à migrer vers le cortex. Foe, Odell & Edgar in Textbook The Development of Drosophila melanogaster, Bate & Martinez‐Arias (1993). Embryon syncytial de drosophile Claudio Sunkel Deux voies contribuent à la formation du fuseau mitotique ou méiotique. Par les centrosomes Dans l’embryon de la mouche Par les chromosomes La méiose femelle chez la drosophile se fait dans un syncytium. Arrêt en métaphase I Métaphase II Anaphase II Deux voies contribuent à la formation du fuseau mitotique ou méiotique. Par les centrosomes Par les chromosomes Durant la méiose femelle de la mouche Fertilisation et première mitose chez la drosophile Foe, Odell & Edgar in Textbook The Development of Drosophila melanogaster, Bate & Martinez-Arias (1993). Références (Partie I) Archambault & Glover, 2009, Nature Reviews Molecular Cell Biology. Archambault & Pinson, 2010. Free centrosomes: Where do they all come from? Fly (Austin). Basto et al, 2006. Flies without centrioles. Cell. Bettencourt-Dias & Glover, 2007. Centrosome biogenesis and function: centrosomics brings new understanding. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Brito et al, 2012. Deconstructing the centriole: structure and number control. Current Opinion in Cell Biology. Caydasi et al, 2010. Monitoring spindle orientation: Spindle position checkpoint in charge. Cell Division. Foe, Odell & Edgar in Textbook The Development of Drosophila melanogaster, Bate & Martinez‐Arias (1993). Güttinger et al, 2009. Orchestrating nuclear envelope disassembly and reassembly during mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Kollman et al, 2011. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. Lim et al. 2009. Regulation of centrosome separation in yeast and vertebrates: common threads. Trends in Cell Biology. Nigg, 2007. Centrosome duplication: of rules and licenses. Trends in Cell Biology. Nigg & Stearns, 2011. The centrosome cycle: Centriole biogenesis, duplication and inherent asymmetries, Nature Cell Biology. Razafsky & Hodzic, 2009. Bringing KASH under the SUN: the many faces of nucleo-cytoskeletal connections. Journal of Cell Biology. Raff & Nigg, 2009. Centrioles, Centrosomes, and Cilia in Health and Disease. Cell. Sillibourne & Bornens, 2010. Polo-like kinase 4: the odd one out of the family. Cell Division. PARTIE II Présentation de recherche: Régulation du cycle cellulaire et des centrosomes par des kinase et phosphatases Anaphase Promoting Complex Interphase Ub Ub Ub Mitose Cycline Cdk inactive Cdk active Cycline Enveloppe nucléaire formée Chromosomes décondensés Microtubules interphasiques … P Substrats Substrats Bris de l’enveloppe nucléaire Condensation des chromosomes Assemblage du fuseau mitotique … Ub Ub Ub Anaphase Promoting Complex Interphase Mitose Cycline Cdk inactive Cdk active Cycline Enveloppe nucléaire formée Chromosomes décondensés Microtubules interphasiques … P Substrats Phosphatase(s) Substrats Bris de l’enveloppe nucléaire Condensation des chromosomes Assemblage du fuseau mitotique … Le moteur du cycle cellulaire Cyclin B-Cdk1 Activity APC Phosphatase ? time Mitotic exit Mitotic entry Interphase Mitosis Interphase - Interphase microtubules - Relaxed chrososomes - Nuclear envelope present - Other events - Mitotic spindle - Condensed chromosomes - Nuclear envelope breakdown - Other events - Interphase microtubules - Relaxed chromosomes - Nuclear envelope present - Other events La kinase Polo dans le cycle de la division cellulaire Prophase Prométaphase Métaphase M G2 Polo Anaphase Réplication de l’ADN (Phase S) G1 Télophase et Cytocinèse La kinase Polo, comme la plupart des régulateurs du cycle cellulaire, est conservé entre les espèces. Métaphase Cytocinèse Cellules de mouche Polo-GFP Microtubules ADN Cellules humaines GFP-Plk1 Microtubules ADN Embryon syncytial de drosophile Claudio Sunkel Un crible génétique pour des gènes qui fonctionnent avec polo + x polo- embryons viables mutation + x x polo- + embryons morts A ? C Polo ? ? B Identification de Scant/greatwall + x polo- Scant + Wild type Embryons morts polo- +/+ Scant Scott of the Antartic polo- +/+ Scant Archambault et al, 2007, PLoS Genetics 5 m -Tub, g-Tub, DNA La mutation Scant affecte le gène de la kinase greatwall. K97M = Scant * 57 205 Kinase N-term fonction inconnue 705 829 846 Kinase C-term Scant = forme hyperactive de Greatwall in vitro Greatwall (Gwl) collabore avec CyclinB-Cdk1 pour stimuler l’entrée en mitose dans des extraits d’oeufs de xénope. Gwl Entrée en mitose Cdk1 Gwl ? Polo Quel est le lien fonctionnel entre Gwl and Polo? La génétique nous disait que: Greatwall Polo Détachements de centrosomes, Mitoses détraquées, Mort Plusieurs modèles possibles 1 Gwl Polo 2 Polo Gwl X 4 Gwl X Polo 3 Gwl X 5 Gwl Polo X Y Event Polo X … Phénotypes observés avec différents allèles de greatwall Embryons Structures de l’adulte Gwl Gwl Défauts du développement des ailes, des yeux, etc Défauts des fuseaux mitotiques Ovaires Neuroblastes larvaires Gwl Gwl Défauts de condensation et ségrégation des chromosomes Perte de cohésion entre les chromatides soeurs en méiose femelle Qu’est-ce que Greatwall fait? On retourne à la génétique! Des détachements de centrosomes sont déjà observés chez les embryons provenant de femelles polo-/+. g-Tub & lamin B, DNA Prophase Prométaphase polo-/+ Combinées + ADN g-Tub & lamin B WT D -Tub Wang et al, 2011. Les centrosomes sont requis pour l’assemblage des fuseaux mitotiques et pour la migration des noyaux dans le syncytium. →Comment les embryons de mères polo-/+ arrivent-ils à se développer si leurs centrosomes se détachent des noyaux??? Réponse: Ils se détachent et se rattachent ensuite! polo-/+, GFP-D-TACC, H2A-RFP WT: T0 240 s 300 s 420 s ↓ Polo: 480 s 540 s 600 s 780 s 551 s →Bon fond génétique sensibilisé! Wang et al, 2011. Un crible génétique identifie twins en interaction avec polo et gwl. polo11/Balancer X polo11/+, Df/+ X Embryos hatch? Df/Balancer Wild-type Deficiency Cytoloc. % Hatching polo11/+ gwlScant/+ Df(2L)ED12527 28C4-28D3 Df(2L)ED1315 38B4-38F5 Df(3L)ED4483 69A5-69D3 Df(3L)ED4486 69C4-69F6 Df(3R)ED5330 85A5-85D1 Df(3R)ED5474 85F11-86B1 15 genes 2 1 40 53 13 0 4 9 28 16 5 0 twins Wang et al, 2011. Protéine Phosphatase 2A est une enzyme hétérotrimérique avec plusieurs sous-unités régulatrices alternatives. Sous-unité catalytique = B55, Twins Sous-unité structurale Sous-unité régulatrice Control of mitotic exit by PP2A regulation of Cdc25C and Cdk1 (Forester et al., 2007) Regulated activity of PP2A–B55δ is crucial for controlling entry into and exit from mitosis in Xenopus egg extracts. (Mochida et al., 2009) Polo interagit génétiquement avec Twins et Mts mais pas avec les autres sous-unités de PP2A. % Éclosion des embryons Structurale PP2A-29B/+; polo11/+ PP2A-B'/polo11 Régulatrices wdb/polo11 tws/polo11 Catalytique mts/+; polo11/+ PP2A-29B/+ PP2A-B'/+ wdb/+ mts/+ tws/+ polo11/+ OrR 0 20 40 60 80 100 Des interactions génétiques similaires ont aussi été observées entre gwlScant et tws ou mts. PP2A-Tws est un interacteur fonctionnel critique de Polo et Gwl dans l’embryon Wang et al, 2011. syncytial. Une augmentation de l’activité de la kinase Gwl est létale dans les embryons où l’activité de Tws est réduite. Surexpression de Gwl dans l’embryon Un excès d’activité de la kinase Gwl relativement à PP2A-Tws est létal. gwlScant ↑Gwl + ↓ PP2A-Tws = Surexpression Gwl Wang et al, 2011. La surexpression de Gwl combinée avec une réduction du niveau de Tws empêche la complétion de la méiose femelle. La majorité des œufs sont bloqués en méiose I. Quelques embryons initient des mitoses mais échouent rapidement et montrent beaucoup de détachements de centrosomes. Wang et al, 2011. Une réduction du niveau de Gwl restaure partiellement la viabilité des embryons de mères mts/+ ; polo-/+. PP2A Gwl PP2A Gwl Gwl PP2A Peut-être que Gwl agit normalement pour inhiber PP2A-Tws durant la mitose? Oui, et c’est conservé chez les vertébrés… Question: Gwl Comment? PP2A-Tws/B55 M Exit Cyclin B-Cdk1 Science, Dec 17, 2010: Gwl Endosulfine Arpp19 PLoS Genetics, Aug 11, 2011: PP2A-Tws/B55 Cyclin B-Cdk1 M Exit Modèle actuel: Chez les animaux, Greatwall phosphoryle Endos et Arpp19, qui deviennent des inhibiteurs de PP2A-B55/Tws, pour promouvoir la mitose. P Endos, Arpp19 Endos, Arpp19 Adaptation libre de: Gharbi-Ayachi, A. et al. Greatwall, un nouveau gardien de la mitose. Med Sci (Paris). 2011 Apr;27(4):352-4. Le moteur du cycle cellulaire Gwl fort Gwl faible Activité Cyclin B-Cdk1 Gwl faible APC PP2A-Tws/B55 temps Entrée en mitose Sortie de la mitose OK, mais quel est le lien avec Polo? twsP/+ polo11 +/+ twsP mts XE-2258 /+; polo11 /+ Combinés avec -Tub, ADN g-Tub & lamin Pourcentage des noyaux avec un ou deux centrosome(s) détachés OregonWT R polo11/+ polo11/+ Prophase-Métaphase Series3 mts/+ mtsXE-2258 /+ Series2 Anaphase-Télophase Series1 Karyocinèse-Interphase Des mutations dans tws ou mts augmentent les détachements de centrosomes dans les mutants de polo. twins/+ twsP/+ polo11/mts mtsXE-2258/+; polo11 /+ 0 5 10 15 20 Wang et al, 2011. Modèle d’une collaboration entre Polo et PP2A-Tws Gwl (Endos) PP2A-Tws Normal: anaphase Polo ? karyocinèse-interphase prophase (pro)métaphase Cohésion centrosomes-noyaux ↓ PP2A-Tws: ↓ Polo: ↓ Polo, ↓ PP2A-Tws: Wang et al, 2011. Références (Partie II) Archambault et al, 2007. Mutations in Drosophila Greatwall/Scant reveal its roles in mitosis and meiosis and interdependence with Polo kinase. PLoS Genetics. Boke & Hagan, 2011. Polo, greatwall, and protein phosphatase PP2A Jostle for pole position. PLoS Genetics. Gharbi-Ayachi et al, 2011. Greatwall, un nouveau gardien de la mitose. Médecine Science. Gharbi-Ayachi et al, 2010. The substrate of Greatwall kinase, Arpp19, controls mitosis by inhibiting protein phosphatase 2A. Science. Haccard & Jessus, 2011. Greatwall kinase, ARPP-19 and protein phosphatase 2A: shifting the mitosis paradigm. Results & Problems in Cell Differenciation. Mochida et al, 2010. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. Rangone et al, 2011. Suppression of scant identifies Endos as a substrate of greatwall kinase and a negative regulator of protein phosphatase 2A in mitosis. PLoS Genetics. Wang et al, 2011. PP2A-twins is antagonized by greatwall and collaborates with polo for cell cycle progression and centrosome attachment to nuclei in drosophila embryos. PLoS Genetics.
