Métaphase) Télophase)

 Étudiante: Julia Barbe Tutrice: Alexandra Bondaz (doctorante) Cheffe du laboratoire: Prof. Monica Gotta Le fuseau mitotique dans les divisions cellulaires Le but de l’expérience est de mieux comprendre la construction du fuseau lors de division cellulaire qui est encore peu connue. Pour cela nous allons analyser les deux premières divisions d’un embryon. Les expériences se font avec des vers Caenorhabditis
elegans (c. elegans), car ils sont facilement
manipulables.
Afin de mieux comprendre sa construction, nous avons
enlevé des protéines impliquées dans sa formation.
Théorie : Membrane)du)noyau)dissolue)
Kinétochore)
Chromosomes)
Centrosome)
Métaphase)
Les)centrosomes)sont)sur)des)côtés)
opposés)du)noyau)
Les)microtubules)s’a9achent)aux)
kinétochores)
Noyau)
Télophase)
Division'asymétrique'
Deux)cellules)asymétriques))
='donne'deux'cellules'de'tailles'différentes'
Dans la mitose normale de C. elgegans, après la dissolution du noyau, les centrosomes se mettent aux côtés opposés de celui-­‐ci. 1 Observation au microscope du fuseau de division grâce à une technique d’immunofluorescence. En bleu : les chromosomes En rouge : les centrosomes et les microtubules Vendredi
Méthode : Nous faisons l’expérience sur deux espèces de c. elegans, l’une pour le contrôle et l’autre un mutant avec la protéine lin-­‐5 en moins. Deux types de vers: -­‐N2 (« normaux ») -­‐lin-­‐5 (thermosensibles)à mutants lin-­‐5 empêche les centrosomes de se mettre sur les côtés opposés du noyau Vu que l’ARN est thermosensible et ne s’active que à une certaine température, ma tutrice a laissé les vers (mutés et normaux) grandir à 15°C et à mon arrivée lundi, nous les avons mis à 26°C afin d’activer l’ARN interférent. Lin-­‐5 désactivée Lin-­‐5 activée Samedi
15°C
Dimanche
Lundi
Mardi
26°C
Afin de supprimer une protéine en plus, il y a deux possibilités : soit de directement injecter l’ARN double brin dans les vers, soit de le mettre dans leur nourriture. Pour l’injecter il faut utiliser un microscope muni d’un système motorisé muni d’une aiguille avec laquelle on pique les vers portant des œufs pour déposer l’ARN. Deux couches de bactéries (nourriture): -­‐L4440 (contrôle) -­‐ knl-­‐2 (enlève la protéine knl-­‐2 aux vers) knl-­‐2 empêche les kinétochores de se former et donc de fonctionner correctement. 2 Après 24h à 26°C on peut observer: N2 (espèce normale) L4440 Contrôle Plein de L1, les œufs ont éclos
Knl-­‐2 ARNi
Œufs morts, quelques L1
Œufs morts, quelques L1
Œufs morts, quelques L1
Observer au microscope
Division symétrique decomposition du fuseau dans la cellule postérieur
-­‐> Oeufs m orts
Mutant thermosensible fonctionne
la plupart des oeufs sont morts
-­‐> division symétrique
Knl-­‐2 ARNi
Division asymétrique Embryons morts
L4440 Contrôle ARNi Les embryons vivants division asymétrique Lin-­‐5 (mutant; ts)
L1: l arve stade 1 Ts: Thermosensible ARNi: ARN interférant (attaque l’ARN messager) Lorsqu’ils sont adultes mais n’ont pas encore pondu, il faut en transférer une dizaine sur une lame, puis les couper en deux au niveau des œufs afin que les œufs qui n’ont pas encore commencé la mitose soient libérés (au moment de le ponte, les embryons ont déjà plus de trente cellules). A l’aide d’un microscope (grossissement : objectif 63x), on observe les premières divisions mitotiques de l’embryon en temps réelle. Cette observation se fait avec les quatre possibilités énoncées dans le graphique ci-­‐
dessus (type de vers + type de bactéries). Résultat : Lin-­‐5(ts);L4440 Résultats avec le vers muté et la bactérie de contrôle : 1. La mutation de la protéine lin-­‐5 empêche les centrosomes de se mettre des côtés opposés du noyau. Centrosomes 2. Les centrosomes parviennent à se mettre aux côtés opposés du noyau. Le fuseau se forme normalement et les chromosomes s’alignent. 3. Les chromatides se séparent correctement. 3 Lin-­‐5(ts);knl-­‐2 Résultats avec le vers muté ainsi que la bactérie supprimant la protéine knl-­‐2 : 1. La mutation de la protéine lin-­‐5 empêche les centrosomes de se mettre des côtés opposés du noyau. 2. Le fuseau se forme mais se déforme immédiatement après. 3. Les centrosomes collisionnent. On peut donc observer que les protéines lin-­‐5 et knl-­‐2 sont impliquées dans la formation du fuseau mitotique, si seulement une des deux protéines manquent le fuseau se forme normalement mais les embryons meurent, alors que si les deux protéines sont enlevées, le fuseau ne se forme plus et les deux centrosomes collisionnent. Lorsque les centrosomes tardent à se mettre sur les côtés opposés du noyau, les kinétochores sont nécessaires pour la formation du fuseau. La raison de la collision des centrosomes reste inconnue. Remerciements : Alexandra Bondaz, ma tutrice, Monica Gotta, cheffe du laboratoire et SJF 4