Étude des mécanismes moléculaires précoces de la réponse neuro

Étude des mécanismes moléculaires précoces de la réponse
neuro-immunitaire dans des modèles de la maladie de Parkinson
Mémoire
Catherine Fontaine-Lavallée
Maîtrise en neurobiologie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Catherine Fontaine-Lavallée, 2016
Résumé
Ce mémoire porte sur l’étude des mécanismes d’action de la neurotoxine MPTP et sur les processus
menant à l’activation des cellules immunitaires innées. Dans un premier volet, une étude sur la
chronologie des évènements immunitaires prenant place dans ce contexte expérimental a été menée
grâce à l’utilisation des souris transgéniques cis-NF-ĸBeGFP, CX3CR1GFP et lysMeGFP montrant une
activité inflammatoire très précoce dans ce tissu. Dans un deuxième volet, une étude mécanistique
portant sur la capacité des cellules immunitaires à transporter la toxine a été réalisée en utilisant
l’analogue fluorescent du MPP+, l’APP+. Les cellules immunitaires peuvent transporter cet analogue,
et donc pourraient être modulables par la neurotoxine. Finalement, dans un troisième volet, un
protocole de conditionnement in vitro avec des monocytes et des neurones dopaminergiques a
permis de montrer l’importance d’une combinaison entre l’effet du MPP+ sur les neurones
dopaminergiques et un environnement pro-inflammatoire pour engendrer des altérations de ces
neurones.
iii
Abstract
This thesis focuses on the study of the mechanisms of action of the neurotoxin MPTP and the
process leading to innate immune cells activation. In the first part, a study of the chronology of
immune events taking place in this experimental context was performed using the transgenic mice
cis-NF-ĸBeGFP, CX3CR1GFP and lysMeGFP showing very early inflammatory activities in the myenteric
plexus. In a second phase, a mechanistic study on immune cells ability to carry the toxin was
conducted using the fluorescent analog of MPP+, APP+. Immune cells can indeed carry this analog,
and therefore may be modulated by the neurotoxin. Finally, in a third aspect, an in vitro conditioning
assay with monocytes and dopaminergic neurons showed the importance of a combination of the
effect of MPP+ on dopaminergic neurons and a pro-inflammatory environment to generate alterations
in these neurons.
v
Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................................... iii
Abstract ............................................................................................................................................................... v
Table des matières ............................................................................................................................................. vii
Liste des tableaux .............................................................................................................................................. ix
Liste des figures ................................................................................................................................................. xi
Liste des abréviations et sigles ......................................................................................................................... xiii
Remerciements ................................................................................................................................................. xv
Introduction ......................................................................................................................................................... 1
I. Maladie de Parkinson .................................................................................................................................. 1
I.1 Épidémiologie ........................................................................................................................................ 1
I.2 Symptômes............................................................................................................................................ 1
I.3 Description de la pathologie .................................................................................................................. 2
I.4 Forme familiale ...................................................................................................................................... 6
I.5 Traitements............................................................................................................................................ 7
II. Hypothèse de Braak ................................................................................................................................... 9
III. Régions étudiées ..................................................................................................................................... 11
III.1 Le système nerveux entérique........................................................................................................... 11
III.2 Le système nerveux central ............................................................................................................... 14
IV. Système immunitaire inné ....................................................................................................................... 15
IV.1 Introduction ....................................................................................................................................... 15
V. Modèle MPTP ........................................................................................................................................... 20
VI. Historique du laboratoire ......................................................................................................................... 22
VII – Mon projet de recherche....................................................................................................................... 23
Résultats ............................................................................................................................................................. 1
I. Étude du décours temporel de la réponse immunitaire au sein du plexus myentérique ............................ 25
I.1 Chronologie de la réponse immunitaire au sein du plexus myentérique ............................................. 25
II. Étude mécanistique .................................................................................................................................. 33
II.1 Étude in vitro avec le traceur fluorescent APP+ .................................................................................. 33
II.2 Étude in vitro de la distribution intracellulaire de l’APP+ ..................................................................... 35
II.3 Étude in vitro de conditionnement de monocytes et neurones DAergiques humains ......................... 39
II.4 Étude ex vivo avec l’APP+ .................................................................................................................. 42
Discussion ........................................................................................................................................................... 1
Perspective ....................................................................................................................................................... 51
Références ........................................................................................................................................................ 53
vii
Liste des tableaux
Tableau 1 - Symptômes non-moteurs de la maladie de Parkinson ..................................................................... 2
Tableau 2 - Médicaments traitant les symptômes moteurs de la MP. ................................................................. 7
Tableau 3 - Lignées cellulaires utilisées dans l’étude in vitro du traceur fluorescent APP+ ............................... 34
Tableau 4 - Marqueurs fluorescents.................................................................................................................. 36
Tableau 5 - Lignées cellulaires utilisées dans l'étude de la distribution de marqueurs fluorescents ................. 36
Tableau 6 - Traitements utilisés pour le protocole de conditionnement ............................................................ 40
ix
Liste des figures
Figure 1 - Progression de la maladie de Parkinson............................................................................................. 1
Figure 2 - Biosynthèse des neurones catécholamiques ...................................................................................... 3
Figure 3 - Voies dopaminergiques du SNC ......................................................................................................... 3
Figure 4 - Dégénérescence des neurones DAergiques de la substance noire ................................................... 4
Figure 5 - Ganglions de la base .......................................................................................................................... 4
Figure 6 - Schématisation de la communication entre les ganglions de la base chez le patient parkinsonien.... 5
Figure 7 - Activation microgliale chez le patient parkinsonien ............................................................................. 6
Figure 8 - Catabolisme de la dopamine .............................................................................................................. 8
Figure 9 - Stades de Braak ............................................................................................................................... 10
Figure 10 - Corps de Lewy dans la paroi de l’estomac ..................................................................................... 11
Figure 11 - Hypothèse de Braak ....................................................................................................................... 11
Figure 12 - Structure histologique de la paroi intestinale .................................................................................. 12
Figure 13 - Axe cerveau-intestin ....................................................................................................................... 14
Figure 14 - Voie nigro-striée chez l'homme et chez la souris ............................................................................ 14
Figure 15 - Origine des monocytes et macrophages......................................................................................... 16
Figure 16 - Voies de signalisation menant à la polarisation des macrophages ................................................. 16
Figure 17 - Vie d'un neutrophile: de la différenciation au site de l'inflammation ................................................ 19
Figure 18 - Mécanismes des inflammasomes ................................................................................................... 20
Figure 19 - Hypothèse ....................................................................................................................................... 24
Figure 20 - Réponse NF-κB dans le temps ....................................................................................................... 28
Figure 21 - Étude du dynamisme cellulaire chez la souris CX3CR1-GFP......................................................... 30
Figure 22 - Étude du dynamisme cellulaire chez la souris lysMeGFP .................................................................. 32
Figure 23 - Étude par FACS de la toxicité de l'APP+ sur différents types cellulaires dans le temps ................. 34
Figure 24 - Étude par FACS de la cinétique de capture de l'APP+ par différents types cellulaires ................... 35
Figure 25 - Étude mécanistique in vitro sur des cellules N2A avec des marqueurs fluorescents...................... 37
Figure 26 - Étude mécanistique in vitro sur des cellules RAW.267 avec des marqueurs fluorescents ............. 37
Figure 27 - Comparaison du stress oxydatif suite au traitement à la LPS et au MPP+ chez les cellules SHSY5Y ................................................................................................................................................................. 38
Figure 28 - Comparaison du stress oxydatif suite au traitement à la LPS et au MPP+ chez les cellules
RAW.267 ........................................................................................................................................................... 38
Figure 29 - Protocole de conditionnement ........................................................................................................ 39
Figure 30 - Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la production de nitrite suite à un conditionnement de
cellules THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de LPS. ........................................................................... 41
Figure 31 - Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la production de nitrite suite à un conditionnement de
cellules THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de MPTP ......................................................................... 41
Figure 32 - Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la production de nitrite suite à un conditionnement de
cellules THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de MPP+ .......................................................................... 42
Figure 33 - Étude ex vivo de la capacité des neurones et des macrophages résidents à capter l’APP+ .......... 43
Figure 34 - Schématisation des effets du MPP+ sur les cellules THP-1 et SH-SY5Y ....................................... 48
xi
Liste des abréviations et sigles
1-méthyle-4-phényle-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP)
1-méthyle-4-phényle-4-propionoxypiperidine (MPPP)
1-méthyle-4-phénylepyridinium (MPP+)
Iodure de 4-(4-Diméthyle-amino)phényle-1méthylepyridinium (APP+)
Absent in melanoma 2 (AM2)
Acide désoxyribonucléique (ADN)
Acide L-aminé aromatique décarboxylase (L-AADC)
Acide nitrique (NO)
Acide γ-aminobutyrique (GABA)
Activation alternative (M2)
Activation classique (M1)
Activator protein 1 (AP1)
Adénosine triphosphate (ATP)
Aldéhyde déshydrogénase (AD)
Anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS)
Apoptosis-associated speck-like protein (ASC)
Arginase 1 (Arg1)
Axe hypothalamique-pituitaire-surrénalien (HPS)
C-AMP response element-binding protein (CREB)
catéchole-O-méthyle transférase (COMT)
CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPβ)
Cellule dendritique (DC)
Cellule progénitrice érythro-myéloïde (EMPs)
Chitinase 3-like 3 (Ym1)
Common lymphoid progenitor (CLP)
Common monocyte progenitor (CMoP)
Corps de Lewy (CL)
Danger-associated molecular patterns (DAMPs)
Dérivés réactifs de l’oxygène (ROS)
Dopamine (DA)
Dopamine β-hydroxylase (DBH)
Dopaminergique (DAergique)
Enhanced green fluorescent protein (eGFP)
Ganglions de la base (GB)
Granulocyte-monocyte progenitor (GMP)
Hematopoietic stem cell (HSC)
Heure (h)
Interferon gamma (IFNγ)
Interferon gamma receptor (IFNγR)
Interferon-regulatory factor (IRF)
Interleukine (IL)
Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2)
Lipopolysaccharide (LPS)
Lymphocyte antigen 6C (ly-6C)
Complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (MCH II)
Maladie de Parkinson (MP)
Mannose receptor 1 C-type (Mrc1)
Monocyte/macrophages and dendritic celles precursor
(MDP)
Monoamine-oxydase-B (MAO-B)
Myeloid progenitor (CMP)
Nerf glosso-pharyngien (IX)
Nerf vague (X)
Neurite de Lewy (NL)
Oxide nitrique synthase (NOS)
NLR family, CARD domain containing 4 (NLRP4)
NOD-like receptor family, pyrin domain containing 1
(NLRP1)
NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3
(NLRP3)
Noyau thalamique ventral antérieur (VA)
Noyau thalamique ventral latéral (VL)
Nuclear factor kappaB (NF-ĸB)
Paraformaldéhyde (PFA)
Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)
Peptide vasoactif intestinal (VIP)
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
(PPARγ)
Peroxyde d’hydrogène (H2O2)
Phényléthanolamine N-méthyltransférase (PNMT)
Protéine adaptatrice MyD88 (Myd88-/-)
PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)
Resistin-like-alpha (Fizz1)
Sérotonine (5-HT)
Signal transducer and activator of transcription (STAT)
Substance noire pars compacta (SNpc)
Superoxyde (O2-)
Symptômes non-moteurs (SNM)
Système immunitaires inné (SII)
Système nerveux autonome (SNA)
Système nerveux central (SNC)
Système nerveux entérique (SNE)
Système nerveux parasympathique (PΣ)
Système nerveux sympathique (Σ)
Tampon phosphate salin (PBS)
Toll-like receptors (TLRs)
Transporteur de la dopamine (DAT)
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α)
Tyrosine hydroxylase (TH)
α-synucléine (α-syn)
xiii
Remerciements
Pour commencer, j’aimerais remercier mon directeur de recherche, le Dr Denis Soulet, pour m’avoir
prise comme étudiante à la maîtrise dans son équipe. J’ai rapidement compris que notre équipe était
privilégiée d’avoir un directeur de recherche aussi présent et disponible. L’importance que tu
accordes au cheminement scolaire et professionnel de tes étudiants est très appréciée, et tu es très
généreux de ta personne pour nous conseiller sur ces sujets. Ton but est que nous réussissions, et
ça paraît. J’ai grandement apprécié être envoyée dans un congrès international en Allemagne et
développer mes qualités en communication tout le long de ma maîtrise avec les Journal Club. Merci
pour tout.
J’aimerais aussi remercier mes collègues de travail, Mélissa Côté, Andrée-Anne Poirier et Benoît
Aubé, pour leur aide, leur support et leur bonne humeur. Être une petite équipe a ses avantages
puisque ça a fait en sorte que nous soyons tissés serrés. Je donne une mention spéciale à Mélissa
puisqu’elle était non seulement doctorante, mais aussi technicienne, professionnelle de recherche et
professeure. Franchement, qu’aurais-je fait sans toi!? Je vous souhaite à tous de continuer votre
passion des sciences (incluant la paléontologie et la mixologie) et une belle vie personnelle et
professionnelle. De toutes manières, on reste en contact!
Aussi, il importe que je remercie ma famille et mon chum, qui m’ont supporté dans les moments de
stress. La science est une grande montagne russe avec ses hauts et ses bas. Merci à mon chéri de
me pardonner pour les fins de semaine passées au laboratoire plutôt qu’à la maison. Je pense que
ça en valait la peine!
Finalement, un mot pour remercier Benoît Mailhot, le «Master d’ImageJ», pour son aide très
appréciée pour éditer mes nombreuses images et vidéos.
Encore une fois, merci à tous!!!
xv
Introduction
I. Maladie de Parkinson
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui est caractérisée par
l’atteinte préférentielle et progressive des neurones dopaminergiques (DAergiques) de la voie nigrostriée1. Cependant, il est maintenant largement accepté que ce système neuronal ne soit pas le seul
à être atteint dans le cadre de cette pathologie. À ce jour, l’étiologie de la MP reste incomprise et la
maladie est incurable2.
I.1 Épidémiologie
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative en importance après la
maladie d’Alzheimer3. Au Canada, 1 à 3% de la population âgée de plus de 65 ans souffre de cette
maladie4,5. De plus, celle-ci toucherait plus de 5 millions de personnes à travers le monde, un nombre
en constante croissance puisqu’il est lié au vieillissement de la population6. En effet, la prévalence de
cette maladie augmente avec l’âge, et est plus importante chez la classe des 60-69 ans (428 pour
100 000) par rapport à la classe inférieure des 55-64 ans (173 pour 100 000)7. L’âge est aussi en lien
avec le nombre de nouveaux patients parkinsoniens annuels, une incidence moyenne de 13,4 pour
100 000 selon une étude américaine8. De manières intéressantes, plusieurs études ont montré une
différence entre les hommes et les femmes, les hommes étant en fait plus nombreux à être atteints
de la maladie de Parkinson5,7.
I.2 Symptômes
I.2.1 Symptômes moteurs
Le dysfonctionnement de la voie nigro-striatale est une caractéristique importante de la MP.
En effet, les patients parkinsoniens souffrent de symptômes moteurs liés, entre autres, à l’atteinte de
ce système. Ceux-ci se manifestent principalement par des tremblements au repos, de la
bradykinésie et de la rigidité musculaire9. Cependant, l’apparition de ces manifestations physiques
fait suite à une perte importante, entre 60 et 80%, des neurones dopaminergiques de la substance
noire pars compacta (SNpc)2. Ce délai dans l’émergence des conséquences de la
neurodégénérescence est dû à la mise en place d’un mécanisme de compensation au niveau de ces
neurones10. La progression de la
maladie est schématisée dans la figure
1 ci-contre.
Figure 1 - Progression de la maladie de
Parkinson
Modifié de Miller et O’Callaghan (2015)2
L’apparition des symptômes moteurs ne se fait
qu’après une perte neuronale importante de la
substance noire pars compacta. Cette perte se fait
de manière chronique sur une longue période de
temps. Le diagnostic de la maladie se fait donc
tardivement.
1
I.2.2 Symptômes non-moteurs
Bien qu’étant une caractéristique importante de la maladie de Parkinson, les neurones
DAergiques ne sont pas les seules cellules neuronales du système nerveux central (SNC) à être
touchées au sein de cette pathologie11. En effet, plusieurs études ont montré l’atteinte d’autres
populations neuronales telles que noradrénergiques12, sérotoninergiques13, cholinergiques14 et
hypocrétines15. Cette neurodégénérescence hétérogène, incluant les neurones DAergiques, donne
lieu à l’apparition de divers symptômes dits non-moteurs (SNM) chez les gens souffrant de la
maladie de Parkinson16.
En effet, les patients parkinsoniens peuvent souffrir de jusqu’à 12 SNM, dépendamment de
l’avancement de la maladie, dont les principales catégories sont classées dans le tableau suivant
avec des exemples :
Symptômes non-moteurs
Désordres
psychiatriques
Désordres
cognitifs
Troubles du
sommeil
Dysfonction du système
autonome
Troubles
sensoriels
Divers
Dépression
Anxiété
Troubles
cognitifs légers
Démence
Insomnie
Parasomnie
Constipation
Incontinence urinaire
Dysfonction sexuelle
Hypotension orthostatique
Dysfonction
olfactive
Fatigue
Perte de
poids
Douleur
Tableau 1 - Symptômes non-moteurs de la maladie de Parkinson
Tiré de Jankovic (2008)17, Chaudhuri (2008)18
Cette multitude de symptômes de natures différentes complique le diagnostic des patients. Depuis
plusieurs années, un travail de conscientisation est fait afin d’informer la population de la complexité
de la maladie de Parkinson, et une grille d’évaluation des SNM a été créée pour les cliniciens19.
Aussi, il est intéressant de noter que certains de ces symptômes peuvent apparaître plusieurs
années avant les premiers symptômes moteurs18. La section sur l’hypothèse de Braak, plus loin dans
ce mémoire, traitera de ce sujet plus en détail.
I.3 Description de la pathologie
I.3.1 Neurones dopaminergiques
L’étude des neurones catécholaminergiques, c’est-à-dire des neurones utilisant un
neurotransmetteur dérivé de la tyrosine20, remonte aux années 196021 où les neurones
noradrénergiques et dopaminergiques ont été identifiés grâce aux nouveaux outils d’immunofluorescence22. Outre ces deux types neuronaux, cette famille inclue aussi les neurones
adrénergiques.
Les neurones catécholaminergiques se différencient entre eux par la présence, ou l’absence,
d’enzymes nécessaires à la transformation de la tyrosine au niveau de leurs synapses. Comme
illustré par la figure 2, le neurone DAergique possède deux enzymes : la tyrosine hydroxylase (TH) et
l’acide L-aminé aromatique décarboxylase (L-AADC). Le produit final de ces réactions est la
2
dopamine. Les neurones noradrénergiques possèdent en plus l’enzyme dopamine β-hydroxylase
(DBH) qui convertie la dopamine en noradrénaline. Finalement, les neurones adrénergiques
possèdent toutes les enzymes mentionnées précédemment ainsi que l’enzyme phényléthanolamine
N-méthyle transférase (PNMT) qui ajoute un groupement méthyle à la noradrénaline pour la convertir
en adrénaline23.
Figure 2 – Biosynthèse des neurones catécholamiques
Catherine Fontaine-Lavallée (2015)©
Enzymes participant à la synthèse des neurotransmetteurs catécholaminergiques selon le type de neurone.
Abréviations: TH ; tyrosine hydroxylase, L-AACD ; L-aminé aromatique décarboxylase, DBH ; dopamine β-hydroxylase, PNMT ;
phényléthanolamine N-méthyltransférase.
Les neurones DAergiques sont principalement présents au niveau de la substance noire SNpc ainsi
que dans l’aire tegmentale ventrale (ATV)24, deux structures du mésencéphale. Ceux-ci forment trois
voies principales ascendantes au sein de notre système nerveux central : la voie nigro-striatale, la
voie méso-corticolimbique et la voie tubéro-infundibulaire25. Ces voies sont illustrées par la figure 3.
Figure 3 - Voies dopaminergiques du SNC
Catherine Fontaine-Lavallée (2015)©
Schéma représentant les trois voies dopaminergiques du SNC.
Bleu pâle. Voie méso-corticolimbique dont les projections
DAergiques trouvent leur origine dans l’ATV du mésencéphale et
dont la cible est 1) le système limbique et 2) le cortex frontal.
Bleu foncé. Voie nigro-striée dans laquelle les neurones
DAergiques de la substance noire innervent le striatum. Vert.
Voie tubéro-infundibulaire où la dopamine joue un rôle hormonal
dans l’axe hypothalamo-hypophysaire. Cette voie prend
naissance dans l’hypothalamus et les prolongements DAergiques
sont projetés sur l’éminence médiane où la dopamine est
relâchée dans la veine porte antéhypophysaire.
La diversité des voies DAergiques crée un éventail de fonctions neuro-modulatrices de la dopamine.
En effet, la dopamine intervient, par exemples, dans le comportement26, la motivation27, le système
de récompenses28,29, le sommeil30 et le système moteur31-33. Son dérèglement quant à lui donne lieu
à diverses maladies telles que la MP, mais aussi la schizophrénie34 et l’addiction35.
Dans la MP, nous nous intéressons particulièrement aux neurones DAergiques de la substance noire
puisque ce sont ces derniers qui sont touchés par cette pathologie. Effectivement, une
dégénérescence de ceux-ci est visible chez les patients atteints comme indiqué dans la figure 436.
3
Figure 4 – Dégénérescence des neurones DAergiques
de la substance noire
Dauer et al (2003)36
Densité neuronale de la substance noire pars compacta ainsi que
l’illustration de la voie nigro-striée. A. Cerveau d’une personne
saine. B. Cerveau d’un patient atteint de la MP chez lequel la
densité des neurones DAergiques de la SNpc est diminuée de
manière importance ce qui affecte les prolongements de ces
neurones vers le striatum.
La dysfonction de la voie nigro-striatale affecte le système moteur, plus précisément les fonctions
des noyaux gris centraux, ou ganglions de la base (GB), avec lesquels cette voie est connectée. Les
GB sont un système composé de plusieurs structures corticales dont la substance noire elle-même,
le striatum, le globus pallidus et les noyaux sous-thalamiques37. Les différentes structures formant les
GB sont représentées par la figure 5 ci-dessous38.
Figure 5 - Ganglions de la base
Modifié de Purves et coll., Neuroscience, Sinauer Associates Inc, 3e édition, 200438
Schéma anatomique montrant les différentes structures et noyaux faisant partie des ganglions de la base.
Abréviations: VA ; noyau thalamique ventral antérieur, VL ; noyau thalamique ventral latéral.
4
La figure 6 schématise les effets de la dégénérescence des neurones DAergiques de la SNpc sur la
transmission et l’intégration des informations motrices par les GB.
Figure 6 - Schématisation de la
communication entre les ganglions de la
base chez le patient parkinsonien
Purves et al, Neuroscience, Sinauer Associates
Inc, 3e édition, 200438
A. Chez le patient parkinsonien, les
informations provenant de la SNpc sont
diminuées, rendant difficile l’inhibition du
globus pallidus par le noyau caudé et le
putamen (striatum). La réponse du noyau
sub-thalamique en est augmentée, ce qui
mène à une inhibition plus importante du
thalamus et, finalement, à une diminution
de l’excitation du cortex frontal.
I.3.2 Alpha-synucléine
La MP est aussi caractérisée par la présence d’inclusions à l’intérieur des corps cellulaires
de neurones DAergiques survivants36, ainsi qu’au niveau d’autres types neuronaux39. Ces inclusions,
appelées corps de Lewy (CL), et neurites de Lewy (NL) si retrouvés au niveau des prolongements
neuronaux, sont composées, entre autres, d’agrégats d’α-synucléine (α-syn) et d’ubiquitine36.
L’α-syn est une protéine de 14 kDa et de 140 amino-acides qui est observée dans les terminaisons
synaptiques, le noyau40 ainsi que liée à des membranes cellulaires41. Bien que son rôle à l’intérieur
de la cellule ne soit pas encore bien défini, cette protéine est suspectée d’avoir un lien important
avec la MP. Effectivement, en conditions pathologiques, cette protéine adopte un changement de
conformation qui facilite son agrégation sous forme d’oligomères et de fibrilles à l’intérieur des
cellules42. Ces formes toxiques peuvent ensuite avoir des effets néfastes sur les neurones touchés
via différents mécanismes hypothétiques :




Empêcher les fonctions normales de la protéine et affecter ainsi la relâche de dopamine
(DA)43,44;
Altérer les structures mitochondriales et l’activité du complexe I en plus de leur dynamisme
et autophagie45,46;
Interrompre le transport vésiculaire entre l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique ce
qui résulterait en un stress oxydatif47,48;
Altérer les mécanismes de dégradation protéiques49.
5
I.3.3 Système immunitaire
Une autre caractéristique de la MP est l’activation chronique du système immunitaire, tant au
niveau des systèmes nerveux central que périphérique50. Des cellules microgliales activées ont en
effet été détectées chez des patients parkinsoniens51, en plus de l’augmentation de cytokines
inflammatoires notoires telles que l’interleukine (IL) -1β, IL-6 et tumor necrosis factor (TNF)-α dans le
liquide céphalo-rachidien, dans la substance noire et enfin dans le putamen 52,53. La figure 7 cidessous illustre d’ailleurs un exemple de cette activation microgliale chez l’humain.
Figure 7 - Activation microgliale chez le patient parkinsonien
Adapté de Ouchi et al (2005)51
Tomographie par émission de positrons avec un traceur radioactif,
[11C] (R)-PK11195, pour les microglies activées. Le rouge
représente la plus haute valeur alors que le violet foncé représente
la plus faible.
Bien que le niveau de potentiels de liaison soit faible chez le
contrôle sain, celui-ci est largement augmenté chez le patient
parkinsonien, indiquant une activation des cellules microgliales.
Plus précisément, cette activation est importante au niveau du
putamen et corrèle positivement avec la sévérité des symptômes
moteurs du patient.
En périphérie, la réponse inflammatoire du tractus intestinal a fait l’objet de récentes études tant chez
l’humain54,55 que chez des modèles animaux parkinsoniens56. Il est cependant difficile d’interpréter le
rôle des cellules immunitaires dans la dégénérescence neuronale, à savoir, par exemple, si cette
dernière est une cause ou une conséquence de la pathologie.
I.4 Forme familiale
Bien que la majorité des cas de MP soient idiopathiques, environ 5 à 10% des cas peuvent être
associés à des mutations génétiques57. Ainsi, plusieurs gènes ont été identifiés comme étant des
facteurs de risque de la MP. Cette section détaille certains des gènes impliqués dans cette dernière.
Un des gènes associés à la MP est celui codant pour la protéine α-syn : le SNCA. Une mutation à
l’intérieur de celui-ci peut mener à une forme autosomale dominante de la maladie58. D’autres gènes
inclus PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) et parkine, des gènes liés à la mitophagie59, qui
induisent une forme autosomale récessive lorsque mutés60,61. Puisque la MP est caractérisée par
une inflammation chronique et un stress oxydatif important, le lien génétique avec les mitochondries
est fort intéressant62. Le gène leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) muté induit une forme
autosomale dominante, et est un facteur de risque important de la MP 63. De manière intéressante,
des mutations de ce gène ont aussi été liées à la maladie de Crohn, une forme de maladie
inflammatoire chronique intestinale64. Ainsi, la MP et la maladie de Crohn pourraient partager
certaines composantes étiologiques. Finalement, certains gènes mentionnés plus haut auraient des
effets inflammatoires au sein de la MP dont les gènes LRRK2 et parkine65. De plus, le gène de la
protéine déglycase DJ-1 dont les mutations peuvent mener à une forme autosomale récessive de la
MP serait aussi lié au système immunitaire66.
6
I.5 Traitements
I.5.1 Traitements existants
Comme mentionné précédemment, la MP est à ce jour incurable, et les traitements existants
ne permettre qu’une atténuation relative des symptômes ressentis par les patients atteints. En effet,
malgré les traitements disponibles, la majorité des patients développent progressivement des
handicaps liés à leur condition9.
Pour ce qui a trait aux traitements des symptômes moteurs, peu de développements thérapeutiques
sont survenus au cours de la dernière décennie si ce n’est de l’amélioration de la livraison des
médicaments à leurs cibles, leurs dosages ainsi que l’utilisation de thérapies combinées 67. Parmi les
traitements disponibles, trois stratégies pharmacologiques sont à noter :
Livraison de 3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) au cerveau
La L-DOPA est le précurseur de la dopamine, et cette molécule est utilisée plutôt que la
dopamine puisque celle-ci est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique pour être
délivrée dans le SNC des patients. Il s’agit du traitement le plus efficace indépendamment des stades
de la maladie68. Le traitement le plus utilisé consiste à donner des comprimés renfermant deux
molécules : la lévodopa (L-DOPA) et la carbidopa69. Cette dernière est un inhibiteur de l’enzyme LAADC responsable de la conversion de la L-DOPA en dopamine et empêche ainsi cette réaction de
se produire en périphérie70.
Inhibiteurs de la mono-oxydase-B (MAO-B)
Cette stratégie consiste à empêcher la conversion de la dopamine du SNC en ses
métabolites afin de la garder disponible pour les neurones DAergiques. Pour se faire, des inhibiteurs
de la MAO-B sont utilisés71. De plus, il existe des inhibiteurs pour une autre enzyme qui, elle,
dégrade la dopamine : l’enzyme catéchole-O-méthyle transférase (COMT). Deux exemples de ces
inhibiteurs disponibles sur le marché sont le tolcapone (Tasmar©) et l’entacapone (Comtan©)72.
Agonistes de la dopamine
Enfin, des agonistes des récepteurs DAergiques, tels que le pramipexole (Mirapex©) et le
ropinirole (Requip©), peuvent être utilisés pour contrer le manque de dopamine dans la MP. Ces
différentes molécules ont des effets sur des récepteurs DAergiques spécifiques73.
Les principaux types de molécules pharmacologiques sur le marché sont classés dans le tableau 2
ici-bas selon leur mode de fonctionnement.
L-DOPA
Agonistes dopamine
Molécule
Nom
commercial
Molécule
Lévopoda/
carbidopa
Sinemet©
Ropinirole
Pramipexole
Nom
commercial
Requip©
Mirapex©
Inhibiteurs MAO-B
Inhibiteurs COMT
Molécule
Nom
commercial
Molécule
Nom
commercial
Rasagiline
Azilect©
Entacapone
Comtan©
Tableau 2 - Médicaments traitant les symptômes moteurs de la MP.
7
Ces diverses stratégies sont combinées entre elles afin d’obtenir des effets bénéfiques optimaux et
des effets néfastes minimaux chez les patients, dépendamment, entre autres, de l’âge des patients
ainsi que du stade de développement de la pathologie73,74. En effet, chez de jeunes patients,
l’utilisation d’agonistes de la dopamine ou d’inhibiteurs de la MAO-B sera privilégiée avant celle de la
lévodopa/carbidopa puisque ce dernier traitement induit généralement le développement de
fluctuations motrices et de dyskinésie6.
Le catabolisme de la dopamine est détaillé par la figure 8 afin de comprendre le site d’action des
différentes molécules mentionnées précédemment75.
Figure 8 - Catabolisme de la dopamine
Catherine Fontaine-Lavallée (2015)©
Schéma représentant les deux voies enzymatiques menant à la synthèse finale de l’acide homovanillique à partir de la dopamine.
Abréviations: COMT; catéchole-O-méthyle transférase, MAO; monoamine-oxydase, AD; aldéhyde déshydrogénase.
Comme expliqué plus haut, les symptômes moteurs ne sont que la pointe de l’iceberg de la MP
puisque les patients parkinsoniens souffrent aussi d’un grand nombre de SNM. Cette complexité
symptomatique complique le traitement médicamenteux de ceux-ci. En effet, bien qu’il existe sur le
marché des médicaments pour contrer les SNM, certains peuvent entrer en interaction avec les
traitements des symptômes moteurs en diminuant, par exemple, leur efficacité. De plus, le patient
devra prendre plusieurs types de médicaments, dépendamment de ses symptômes, qui ont pour
certains des effets secondaires qui s’ajoutent à leurs conditions de base et affectent la qualité de vie
de ces patients76-78.
I.5.2 Stratégies futures
Greffe de cellules dopaminergiques
Cette stratégie consiste à remplacer les neurones DAergiques dégénérés du SNC chez les
patients en greffant des cellules progénitrices de ceux-ci. Plusieurs essais ont déjà été faits, mais les
résultats sont mitigés79. En effet, bien que ce traitement permette un soulagement des symptômes
moteurs à long-terme (jusqu’à 18 ans après la greffe)80, les « nouveaux » neurones DAergiques
peuvent montrer des signes de vieillissement précoce chez certains patients greffés. Plus
précisément, la présence de CL81,82 et d’accumulation d’α-syn soluble dans le cytoplasme de
neurones greffés ont été observés dans des tissus post-mortem de patients ayant reçu une greffe de
cellules fœtales neuronales83.
8
Immunothérapie
Cette stratégie thérapeutique vise 2 composantes importantes de la MP : la protéine α-syn84
et le système immunitaire85. Des vaccins sont effectivement en développement pour l’une ou l’autre
de ces cibles, et certains sont même déjà testés sur des modèles animaux. Pour l’α-syn, il s’agit de
créer une réponse prophylactique qui induit la destruction de cette protéine par le système
immunitaire alors que la stratégie est différente pour la seconde option. En effet, un vaccin ciblant le
système immunitaire créera une réponse thérapeutique puisqu’elle module la réponse immunitaire
qui se déclenche dans un contexte pathologique en la rendant, par exemple, tolérante85.
Traitements anti-inflammatoires
En réponse à l’activation du système immunitaire dans le cadre de la MP, plusieurs études
ont été réalisées concernant le rôle potentiellement thérapeutique, ou préventif, des molécules antiinflammatoires déjà sur le marché. Ce traitement pourrait être jumelé avec d’autres types de
traitements tels que ceux favorisant la régénérescence neuronale86. Une réduction du risque d’être
atteint de la MP a été observée chez des patients parkinsoniens ayant pris des anti-inflammatoires
non-stéroïdiens (AINS) autres que l’aspirine, p. ex. l’ibuprofène, mais ces données sont
préliminaires. De plus, les connaissances sur les effets de différentes molécules individuelles sont
insuffisantes pour recommander leur utilisation de manière préventive87,88. Malgré le peu de résultats
concrets, cette stratégie est intéressante et doit être explorée. De plus, il est important d’étudier la
réponse immunitaire dans la MP afin de trouver des cibles plus précises à viser par ce genre de
thérapies.
II. Hypothèse de Braak
Depuis quelques années, un nombre croissant d’études chamboule la conception de la
communauté scientifique sur la maladie de Parkinson : l’origine de la MP pourrait-elle se trouver
ailleurs que dans le SNC ?
Ceci découle de l’évolution des connaissances sur la pathologie depuis les dernières décennies,
montrant que la MP est une maladie neuronale complexe touchant, de ce fait, des types neuronaux
autres que DAergiques. En parallèle, des études sur les SNM de la MP ont complété le tableau en
démontrant leurs importances, aux côtés des symptômes moteurs, pour décrire cette pathologie
complexe89. De manières intéressantes, tel que mentionné précédemment, il a été rapporté que
certains SNM peuvent apparaître plusieurs années avant les symptômes moteurs chez les patients
parkinsoniens. Parmi ceux-ci, les problèmes gastro-intestinaux sont prédominants90, comme une
déficience de la vidange gastrique et la constipation91-93.
L’hypothèse de Braak fait suite aux travaux d’un chercheur allemand, le Dr Heiko Braak, qui a voulu
étudier la progression spatio-temporelle des agrégats d’α-syn chez les patients parkinsoniens. Dans
une étude de 2002, Braak et son équipe concluaient que l’origine de la MP ne se trouvait pas dans la
SN puisque des agrégats d’α-syn étaient présents dans des types neuronaux autres que DAergiques
avant l’atteinte de cette région. Les neurones touchés se localisaient, entre autres, au niveau des
9
noyaux moteurs dorsaux des nerfs glosso-pharyngien (IX) et vague (X), de la zone réticulaire
intermédiaire ainsi que du complexe cœruleus/sub-cœruleus du tronc cérébral94.
Un an plus tard, Braak et son équipe publiaient une nouvelle étude où ils classifiaient la MP en six
stades de progression, les stades de Braak, qui concordent avec l’apparition des SNM95. Ceux-ci
sont illustrés dans la figure 9 tirée de Doty et coll. (2012)96 ici-bas.
Figure 9 - Stades de Braak Images illustrant l’avancement de la MP telle que divisée en stades dits «de Braak». Les stades 1 et 2
Doty (2012)96
correspondent à la phase symptomatique pré-motrice où les CLs sont présents au niveau du tronc
cérébral, mais peu dans le cortex. Les stades suivants montrent la colonisation des zones cervicales
profondes (3 et 4) et finalement celle du cortex (5 et 6).
Les stades 1 et 2 de Braak correspondent à la phase symptomatique pré-motrice de la MP dans
laquelle des perturbations de l’olfaction et du système nerveux autonome (SNA) sont observées.
Telle qu’illustrée, la présence des corps de Lewy débute dans la partie basse du SNC, plus
précisément au niveau du tronc cérébral, avant de progresser et coloniser les zones cérébrales plus
profondes et les zones corticales du SNC dans les stades de Braak suivants13,95.
L’observation de corps de Lewy à l’intérieur du noyau moteur dorsal du nerf X permet de faire un lien
intéressant avec le tractus intestinal dans lequel des corps de Lewy ont été identifiés auparavant97 et
qui est connecté au nerf X. Effectivement, des agrégats d’α-syn ont été observés dans des neurones
des parois gastrique et intestinale appartenant aux deux plexus neuronaux du système nerveux
entérique (SNE) : les plexus de Meissner et d’Auerbach98,99. Le SNE sera décrit plus en détail dans
une partie ultérieure de ce mémoire. La figure 10 qui suit illustre d’ailleurs ces observations faites
dans la paroi gastrique de patients parkinsoniens.
10
Figure 10 - Corps de Lewy dans la paroi de l’estomac
Braak et al (2006)98
Immuno-histochimie avec un anticorps contre l’α-syn réalisée dans la paroi gastrique de
patients parkinsoniens.
a. Inclusions présentent dans des axons à l’intérieur d’un nerf périphérique (section
transverse) passant à travers le fundic advantitia. b-d. NLs et CLs dans le plexus
myentérique. c. Agrégation d’α-syn (flèches) dans le corps cellulaire de 2 neurones du
SNE dans le fundus. d. NLs, tels des fils, à l’intérieur des fibres interconnectant les
ganglions du plexus myentérique. e. Quelques fibres immuno-réactives générées dans le
plexus myentérique. A. Bifurquent de manière répétée et se séparent en ramifications
terminales le long des cellules du muscle lisse de la couche musculaire adjacente (m). f.
Faisceau d’une fibre nerveuse du plexus sous-muqueux évoluant à travers la sousmuqueuse gastrique.
Le fait que les différents noyaux touchés dans la MP soient interconnectés entre eux par des voies
neuronales connues rend possible l’idée que la pathologie se propagerait à l’intérieur de notre
organisme95. Ceci, combiné avec la connexion du nerf X et du SNE, nous amène à l’hypothèse de
Braak : une toxine ou bien un pathogène pourrait traverser la muqueuse intestinale et entrer en
contact avec les neurones du SNE, d’abord ceux du plexus de Meissner puis ceux du plexus
d’Auerbach, pour remonter via un transport rétrograde du nerf X vers le SNC98.
Figure 11 - Hypothèse de Braak
Braak et al (2006)98
Schéma montrant les connexions entre le SNE et
le SNC via le nerf vague. Les 2 plexus du SNE
sont en effet interconnectés, puis des
informations provenant de leur réseau remontent
ensuite par le nerf vague vers le SNC en passant
par le noyau moteur dorsal du bulbe rachidien.
III. Régions étudiées
III.1 Le système nerveux entérique
Le système nerveux entérique (SNE) est le réseau neuronal de l’appareil digestif à l’intérieur
duquel plusieurs circuits neuronaux régulent les fonctions motrices, le débit sanguin local, ainsi que
le transport et les sécrétions à travers la muqueuse intestinale 100. Il s’agit plus précisément d’une
sous-division du SNA, tout comme les systèmes nerveux sympathique (Σ) et parasympathique (PΣ)
qui l’innervent101. Ses boucles réflexes lui confèrent une autonomie qu’aucun autre système nerveux
ne possède vis-à-vis du SNC. Il est d’ailleurs communément surnommé le «deuxième cerveau» en
lien avec cette autonomie, mais aussi en lien avec le grand nombre de neurones qui le compose, c.à-d. environ le même nombre que dans la moelle épinière soit environ 100 millions de neurones102.
11
Le SNE est formé de deux plexus principaux : les plexus myentérique et sous-muqueux. Ces
derniers consistent chacun en un feuillet composé de petits regroupements de neurones connectés
entre eux dans la paroi du tube digestif103. La figure 12 schématise la structure histologique de ce
dernier104. Les types neuronaux retrouvés dans le SNE sont nombreux ; sa composition neuronale
étant en fait aussi diversifiée que celle du SNC105. Cependant, certains types neuronaux jouent des
rôles prédominants dans ses diverses fonctions, tels que ceux décrits dans les sections suivantes.
Figure 12 – Structure histologique de la
paroi intestinale
Modifié de Low et Benarroch (2008)104
Schéma de la paroi intestinale et de ses
composantes structurelles. Le plexus
myentérique se retrouve entre les couches
de muscle longitudinale et circulaire. Le
plexus sous-muqueux se situe, quant à lui,
entre la couche de muscle circulaire et la
couche sous-muqueuse du tube digestif.
III.1.1 Plexus sous-muqueux
Le plexus sous-muqueux, ou de Meissner, forme un réseau neuronal continu entre la
muqueuse intestinale et le muscle circulaire du tube digestif à partir du duodénum jusqu’au sphincter
anal, avec en plus quelques ganglions au niveau de l’estomac105. Il a un rôle important concernant la
sécrétion glandulaire ainsi que la régulation chimique de la paroi intestinale. Cela est possible grâce
au contrôle des neurones sécréto-moteurs, dont les corps neuronaux sont généralement retrouvés
dans ce plexus, qui modulent la perméabilité de la muqueuse intestinale à l’eau et aux électrolytes.
En effet, alors que les neurones cholinergiques (32%) du PΣ ont un effet d’activation sur ce système,
les neurones vipergiques (42%), c.-à-d. qui utilisent le peptide vaso-actif intestinal (VIP), ont au
contraire un effet inhibiteur sur celui-ci via des synapses inhibitrices du SNΣ. L’activité du SNΣ est,
elle, modulée par les changements de la pression sanguine et du volume sanguin sous le contrôle
des centres réflexes du SNC. De plus, certains neurones VIP forment des prolongements vers le
plexus myentérique permettant ainsi, possiblement, une connexion entre les fonctions de sécrétion et
de motilité de la paroi intestinale105,106.
III.1.2 Plexus myentérique
Le plexus myentérique, ou d’Auerbach, se retrouve entre les couches musculaires
longitudinale et circulaire tout le long du tube digestif, soit de l’œsophage au sphincter anal105. Il joue,
12
quant à lui, un rôle dans la régulation de la motilité de l’intestin, et est aussi impliqué dans le
péristaltisme. Le fait que celui-ci soit collé à la couche musculaire longitudinale nous permet de
l’isoler en micro-disséquant la paroi intestinale et étudier ainsi ses caractéristiques dans le cadre de
nos études. Il s’agit d’ailleurs du principal site d’investigation du laboratoire pour les raisons
suivantes :
D’abord, cette décision fait suite à l’hypothèse de Braak sur la propagation des CLs de régions
périphériques vers les régions corticales. Le SNE est en effet innervé par le nerf vague dans lequel
des CLs ont été observés dans la phase symptomatique pré-motrice. De plus, des CLs ont été
rapportés dans le SNE dès 1984107, alors que Lebouvier et coll. (2010)108 ont montré l’intérêt
d’étudier des biopsies de patients parkinsoniens comme outil de diagnostic pré-mortem de la MP en
plus de donner des informations quant à la progression de la maladie. Par ailleurs, les symptômes
gastro-intestinaux sont les SNM les plus fréquents109, dont la gastroparésie et la constipation
retrouvées chez environ 70% et 59% respectivement des patients parkinsoniens110. Les
dysfonctionnements gastro-intestinaux peuvent être liés à l’altération des neurones DAergiques du
SNE, et plus précisément du plexus myentérique. Une étude de Singaram et coll. (1995) avait
effectivement montré qu’il y avait une baisse en DA au niveau du plexus myentérique dans des
biopsies de colon de patients parkinsoniens, sans cependant mesurer une diminution du nombre de
neurones DAergiques ou de métabolites111. Finalement, la présence d’un nombre très important de
cellules immunitaire dans la paroi intestinale, environ 70% de celles-ci, fait du SNE un site
d’interactions riches entre le système immunitaire et le microbiote112. De plus, une augmentation de
la perméabilité de l’épithélium intestinal a été observée chez des patients parkinsoniens où une
infiltration d’Escherichia coli a été mesurée dans des biopsies de colon113.
La motilité intestinale est nécessaire à la digestion en permettant aux aliments d’être brassés afin de
les exposer aux enzymes digestives et aux microvillosités intestinales qui absorbent les nutriments.
De plus, celle-ci permet le déplacement des aliments ingérés le long des différents segments du tube
digestif. Cette fonction motrice est créée par le contrôle en alternance des neurones excitateurs et
inhibiteurs qui innervent les muscles de la paroi intestinale105. Les principaux neurones excitateurs
sont des neurones ayant comme co-transmetteurs l’acétylcholine et la tachykinine alors que les
neurones utilisant l’acide nitrique (NO) et le VIP sont les principaux neurones inhibiteurs 106.
Finalement, des neurones DAergiques sont aussi présents à l’intérieur de ce plexus, mais leurs rôles
au sein du SNE et dans la motilité intestinale sont encore mal compris114.
III.1.3 Axe cerveau-intestin
Tel qu’expliqué plus haut, une communication bidirectionnelle existe entre le SNC et le SNE
grâce à des innervations neuronales dont le nerf vague. Cependant, cette communication est aussi
possible à d’autres niveaux, entre autres via des médiateurs cellulaires liés au système immunitaire
ainsi qu’à l’axe hypothalamique-pituitaire-surrénalien (HPS)115. En effet, l’axe cerveau-intestin est
d’une grande complexité, avec des interactions entre les systèmes nerveux central, autonome et
entérique ainsi que les systèmes lymphatique et neuroendocrinien50. La figure 13 illustre d’ailleurs les
liens entre les principaux acteurs de cet axe.
13
Figure 13 - Axe cerveau-intestin
Modifié de Collins et coll. (2012)50
Schéma représentant l’axe
cerveau-intestin, comprenant des
interactions entre le microbiote et le
SNC.
Le microbiote est au centre des
interactions entre différents
systèmes de l’organisme puisque
les bactéries sécrètent différentes
molécules agissant sur ceux-ci.
Abréviations: 5-HT; sérotonine, DC;
cellule dendritique, GABA; acide γaminobutyrique.
Les interactions entre ces différents systèmes sont connues depuis plusieurs décennies, mais
l’importance du microbiote intestinal n’a été prise en compte que très récemment. Aujourd’hui, et
depuis quelques années déjà, la population de bactéries commensales de l’intestin est le sujet de
nombreuses recherches démontrant les effets systémiques de la fluctuation du microbiote116. Ainsi, il
a été montré que le microbiote module différentes réponses neuronales, immunitaires et endocrines
et serait lié à diverses maladies telles que l’obésité, le diabète, l’autisme et l’athérosclérose 117,118.
III.2 Le système nerveux central
Afin de faire un parallèle avec ce qui se passe au niveau périphérique, certaines zones du
SNC peuvent être étudiées dans le cadre de mon projet de recherche. Nous nous intéressons
particulièrement à la SNpc et au striatum, c’est-à-dire aux structures de la voie nigro-striée.
La SN est un noyau situé dans le mésencéphale dont les neurones, de la SNpc spécifiquement,
innervent la structure sous-corticale qu’est le striatum. Celui-ci fait partie des GB dont il a été
question plus tôt dans le texte. La figure 14 illustre la voie nigro-striée chez l’homme en
comparaison à celle de la souris, le modèle animal utilisé par le laboratoire.
Figure 14 - Voie nigro-striée chez l'homme et chez
la souris
Catherine Fontaine-Lavallée (2015)©
Schéma anatomique détaillant la voie nigro-striée
chez l’humain en comparaison à celle de la souris.
14
IV. Système immunitaire inné
IV.1 Introduction
Notre système immunitaire se divise en deux systèmes de défense complémentaires : les
systèmes immunitaires inné (SII) et adaptatif. Le SII correspond à la première ligne de défense,
après la peau, pour contrer les pathogènes. Effectivement, les cellules leucocytes qui le composent
patrouillent notre organisme, prêts à agir en réponse à un stimulus119,120. Ce chapitre porte plus
particulièrement sur deux familles de cellules immunitaires innées : les monocytes, macrophages et
microglies, et les neutrophiles.
IV.1.1 Monocytes, macrophages et microglies
Les monocytes, les macrophages et les microglies sont des leucocytes phagocytaires, c.-à-d.
des phagocytes, qui se différencient entre eux par leur localisation dans notre organisme, ainsi que
par leurs caractéristiques morphologiques et génétiques distinctes.
Classiquement, il était accepté que les monocytes circulent dans le sang puis, suite à un signal
inflammatoire, infiltrent le tissu endommagé pour se différencier en macrophages. Ces derniers étant
en effet les phagocytes résidents des tissus, alors que les microglies se retrouvent spécifiquement
dans le SNC. Cependant, plusieurs études ont démontré la complexité de la relation monocytemacrophage de par les origines multiples des macrophages durant le développement, mais aussi
durant la vie adulte.
IV.1.1.1 Origine
Monocytes
Les monocytes dérivent de cellules progénitrices myéloïdes des organes lymphoïdes primaires, tels
que la moelle osseuse et le foie fœtal, durant l’hématopoïèse embryonnaire et adulte. Aussi, il
semble qu’une production de monocytes puisse se faire à partir de la ratte en conditions
inflammatoires chez la souris121,122.
Macrophages
Les macrophages peuvent être de deux sources différentes : (1) Dérivés de monocytes ayant infiltrés
le tissu cible ou (2) dérivés de cellules progénitrices lors du développement121. Ces deux voies de
différenciation sont illustrées par la figure 15 à la page suivante. En complément, Perdiguero et coll.
(2015) ont montré que les macrophages résidents des tissus, dont les microglies, proviennent de
cellules progénitrices érythro-myéloïdes (erythtro-myeloid progenitors, EMPs), et ne seraient que
marginalement remplacées par des cellules souches hématopoïétiques (HSC) après le
développement chez la souris123.
Microglies
Des études récentes ont montré que les microglies sont ontologiquement différentes des monocytes
et des macrophages dérivés de la moelle osseuse et retrouvés en périphérie 124. Ces cellules
proviendraient de macrophages primitifs, provenant de HSC123, ayant migrés du sac vitellin via le
15
système circulatoire afin de coloniser ce qui deviendra le SNC. Ceci se passe très tôt dans le
développement, avant le jour embryonnaire 8.5 chez la souris125.
Figure 15 - Origine des monocytes et macrophages
Pittet et al (2014)121
Abréviations: HSC; hematopoietic stem cell, CMP; myeloid progenitor,
GMP; granulocyte-monocyte progenitor; MDP, monocyte/ macrophages
and dendritic cells precursor, CMoP; common monocyte progenitor, Ly6C; lymphocyte antigen 6C.
Carte topo-ontogénique des macrophages/monocytes
et de leurs cellules souches. Dans la moelle osseuse,
les HSCs produisent différentes populations de
cellules souches intermédiaires, lesquelles perdent
progressivement leur capacité à s’auto-régénérer alors
qu’elles deviennent une lignée cellulaire donnée. Les
monocytes dérivés des HSCs sont retrouvés dans le
sang et dans un réservoir splénique. Les premiers
peuvent ensuite migrer vers différents tissus et se
différencier en macrophages. Finalement, la majorité
des macrophages résidents123 se développent dans
l’embryon (sac vitellin/foie fœtal) avant l’apparition des
HSCs et sont maintenus indépendamment de la
moelle osseuse.
IV.1.1.2 Phénotype
Ces trois phagocytes mononucléaires décrits précédemment ont la capacité de se polariser
vers des phénotypes complexes, mais relativement semblables entre ces types cellulaires, en
réponse aux signaux de leur microenvironnement. L’activation de récepteurs membranaires, tels que
les toll-like receptors (TLRs) ou les récepteurs aux cytokines, déclenche des voies de signalisation
spécifiques et une activation de la cellule immunitaire126. Ces changements occurrent tels un
continuum dans lequel deux polarisations extrêmes peuvent être identifiées : l’activation classique
(M1) ou l’activation alternative (M2)127,128.
Le phénotype de type M1 est considéré comme étant pro-inflammatoire, ce dernier faisant suite à
une activation via des médiateurs de
l’inflammation comme le tumor
necrosis factor (TNF)-α, l’IL-1β et le
NO129. Le phénotype de type M2,
quant à lui, joue un rôle antiinflammatoire, ou pro-réparateur, en
facilitant les réparations tissulaires
post-inflammatoires et le retour à
l’homéostasie du microenvironnement touché130.
Figure 16 - Voies de signalisation menant à la polarisation des macrophages
Liu et coll. (2014)126
Schématisation de diverses voies de signalisation cellulaires polarisant la cellule immunitaire vers un phénotype M1 ou M2.
Abréviations: IFNγ; interferon gamma, IFNγR; IFNγ receptor, LPS; lipopolysaccharide, TLR4; toll-like receptor 4, TNF; tumor necrosis factor, IL;
interleukine, STAT; signal transducer and activator of transcription, IRF; interferon-regulatory factor, NF-κB; nuclear factor kappa B, PPARγ;
peroxisome proliferator-activated receptor gamma,AP1; activator protein 1, CREB; C-AMP response element-binding protein, NOS; Oxide nitrique
synthase, C/EBPβ; CCAAT/enhancer binding protein beta, Arg1; arginase 1, Mrc1; mannose receptor 1 C-type, MHC II; Complexe majeur
d’histocompatibilité de classe II, Ym1; chitinase 3-like 3, Fizz1; resistin-like-alpha
16
La figure 16 ci-haut illustre certaines voies signalétiques menant à la polarisation vers l’un ou l’autre
de ces phénotypes cellulaires126.
La majorité des nouveaux monocytes circulant dans le sang sont de type M1, et sont ainsi prêts à
agir immédiatement à des signaux inflammatoires131,132. Cependant, il est important de noter que
cette nomenclature ne permet pas de représenter de manière fidèle l’hétérogénéité des populations
de phagocytes mononucléaires qui est fort complexe. Malheureusement, celle-ci est effectivement
simplifiée par rapport à la réalité, et même les chercheurs à l’origine de cette nomenclature mettent
en garde la communauté scientifique contre l’ultra-simplification des interprétations liées à ces
immuno-phénotypes133.
Finalement, même si la majorité des modèles étudiés ont montré les effets néfastes des cellules M1
et les effets protecteurs des cellules M2, certaines exceptions s’appliquent. Par exemple, bien que
les macrophages pulmonaires M2 jouent un rôle bénéfique dans la réparation tissulaire et la
régulation de l’homéostasie du poumon en cas d’asthme, une population excessive de ces
macrophages alimente une réponse inflammatoire accrue, une augmentation de la sécrétion de
mucus et une augmentation de la déposition de collagène126,134,135.
IV.1.1.3 Rôles dans SNC et SNE
IV.1.1.3.1 SNC
Les microglies sont considérées comme étant les macrophages résidents du parenchyme
cérébral, et sont le type cellulaire de l’immunité innée le plus nombreux du SNC où elles représentent
10% à 15% du nombre de cellules totales136. Il n’est pas surprenant donc que les microglies jouent
un rôle de première ligne dans l’immunité du SNC, ayant d’abord un rôle de surveillance en
conditions normales, puis d’initiation de la réponse immunitaire lors d’attaques pathogènes137.
En conditions normales, les microglies montrent un phénotype quiescent, avec leur petit corps
cellulaire et leurs longues ramifications qui font contact dynamiquement avec les neurones et les
astrocytes qui les voisinent. Elles veillent à l’homéostasie de leur microenvironnement, grâce à leur
fonction de pinocytose138 et à la présence de nombreux récepteurs membranaires137,139. Une fois
activées par des signaux inflammatoires ou des pathogènes, elles prennent une forme amiboïde
active afin de générer une réponse inflammatoire. Elles ont, par exemple, la capacité de produire des
cytokines, des chimiokines et du NO en réponse à l’activation de leurs TLRs140,141, en plus de se
déplacer vers la zone touchée et de phagocyter les débris142.
Par ailleurs, il semble que les microglies soient importantes pour des fonctions autres
qu’immunologiques au sein du parenchyme cérébral. En effet, des rôles dans la survie neuronale 143
et la synaptogénèse144,145 ont été rapportés grâce à l’excrétion de facteurs trophiques par les
microglies. Aussi, les microglies auraient la capacité d’induire l’apoptose planifiée chez les neurones
durant le développement du SNC pour ensuite phagocyter les débris cellulaires146.
17
IV.1.1.3.2 SNE
L’intestin est le site de la plus grande présence de cellules immunitaires de l’organisme de
par sa proximité avec un large bassin d’antigènes132. En effet, le microbiote et les matières digérées
ne sont séparés du parenchyme intestinal que par l’épithélium intestinal et son mucus 147.
Deux groupes de macrophages résident dans la paroi intestinale : les macrophages de la muqueuse,
et ceux des muscles (muscularis). Les premiers sont en contact avec les antigènes traversant la
barrière épithéliale, et agissent de concert avec les cellules de l’immunité adaptatives pour éliminer
les menaces pathologiques. En effet, ces macrophages ont la capacité de présenter des antigènes
aux lymphocytes T naïfs des organes lymphatiques à proximité de l’épithélium, mais n’ont pas une
grande activité phagocytaire148,149. La deuxième population se retrouve au niveau de la couche
musculeuse, loin de la lumière intestinale150. Ces macrophages ont des caractéristiques inverses des
premiers, puisqu’ils ont une grande activité phagocytaire, peu d’habilité à imprégner les lymphocytes
T naïfs et sont absents des organes lymphatiques148,149,151.
IV.1.2 Neutrophiles
Le neutrophile est le type de leucocyte retrouvé en plus grand nombre dans le sang chez
l’homme, avec 50% à 70% des cellules circulantes152. Une machinerie biologique importante est
mise en place pour fournir notre organisme en neutrophiles, avec une production de 1011 cellules par
jour153. Ce chiffre fort impressionnant est dû à la vie très courte du neutrophile, entre 8 et 12 heures
en circulation et jusqu’à 48 heures dans les tissus, qui doit être remplacé rapidement154. Cependant,
une étude récente de Pillay et coll. (2010) a montré que ces chiffres sont véridiques chez la souris,
mais que la durée de vie de certains types de neutrophiles serait bien plus longue chez l’humain : 5,4
jours155!
IV.1.1.1 Origine
Les neutrophiles proviennent des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse 156. Ceux-ci
resteront dans cet organe jusqu’à leur maturation pour être ensuite relâchés dans la circulation
sanguine. La figure 17 à la page suivante résume les différentes étapes de différenciation
nécessaires à la formation des neutrophiles ainsi que leur recrutement en cas d’inflammation ou
d’infection157.
IV.1.1.2 Phénotype
Les neutrophiles sont des cellules très difficiles à étudier de par leur courte durée de vie
dans l’organisme et en culture157. Alors que l’hétérogénéité de ce type cellulaire est connue depuis
plusieurs années158, de récentes études apportent de nouvelles preuves de ce concept en montrant
une hétérogénéité marquée des phagosomes159 et des granules160 exprimés par les neutrophiles.
IV.1.1.3 Rôles dans SNC et SNE
Tel qu’illustré par la figure 17, les neutrophiles en circulation dans le sang peuvent traverser
l’endothélium des vaisseaux sanguins afin de se déplacer vers la source d’une infection ou d’une
inflammation grâce au chimiotactisme. Arrivés au site de la réponse inflammatoire, ces cellules sont
en mesure de procéder à l’élimination de la menace par phagocytose, dégranulation et NETose 161.
18
Figure 17 - Vie d'un neutrophile: de la différenciation au site de l'inflammation
Eyles et al (2006)157
Schématisation des étapes de la vie d’un neutrophile, de son développement jusqu’à sa mort ou son rôle immunitaire. Dans la
moelle osseuse, un type de cellule souche donne lieu à des cellules souches intermédiaires qui, suite à plusieurs différenciations,
donnent naissances aux neutrophiles. Ceux-ci sont relâchés dans la circulation sanguine où, si aucune alerte immunologique ne
se produit, ils entreront en apoptose après quelques heures. Si au contraire une alerte est lancée, les neutrophiles seront
recrutés et, par extravasation, pénétreront le tissu vers le site d’inflammation ou d’infection afin de contrôler ces dernières par
leurs effets anti-microbiaux.
Abréviations: CLP; common lymphoid progenitor, CMP; myeloid progenitor, GMP; granulocyte-monocyte progenitor.
En effet, les pathogènes ou autres molécules seront phagocytés, puis des agents nocifs comme des
dérivés réactifs de l’oxygène162 et des granules intracellulaires163 seront déversés dans le
phagosome afin de tuer et digérer les éléments phagocytés161.
De plus, les neutrophiles peuvent utiliser une fonction « kamikaze », la NETose, où la cellule déverse
son contenu intracellulaire qui forme alors un filet où sont emprisonnés les pathogènes. Ces filets
contiennent, entre autres, des complexes d’acide désoxyribonucléique (ADN) et de molécules antimicrobiennes125. D’autres cellules immunitaires, telles que les macrophages et cellules dendritiques,
seront ensuite activées par ces filets et veilleront à l’élimination des pathogènes162,164.
À ces fonctions d’extermination, s’ajoute un rôle des neutrophiles dans l’orchestration de la réponse
immunitaire grâce à la relâche de médiateurs inflammatoires dans le tissu cible165.
IV.1.3 Voie de l’inflammasome
Cette section a pour but d’introduire la voie de l’inflammasome par laquelle les cellules immunitaires
peuvent être activées suite à divers signaux. L’inflammasome est un complexe de protéines qui se
construit autour de protéines particulières, telles que NOD-like receptor family, pyrin domain
containing 3 (NLRP3), et dont l’activation mène au clivage de la caspase-1 conduisant à la sécrétion
de l’IL-1β par la cellule immunitaire, ou tout autre type cellulaire possédant cette machinerie
19
cellulaire, comme les neurones166,167. De plus, cette voie peut mener vers une forme de mort
cellulaire particulière : la pyroptose168,169.
Les signaux reconnus par l’inflammasome diffèrent selon le type d’inflammasome, c.-à-d. la protéine
particulière dont est composé l’inflammasome. Parmi ces signaux figurent les pathogen-associated
molecular patterns (PAMPs) et les danger-associated molecular patterns (DAMPs)170. D’ailleurs, le
stress oxydatif et les dysfonctions mitochondriales peuvent mener à l’activation de cette voie171,172.
Figure 18 - Mécanismes des
inflammasomes
Walsh et coll. (2014)170
Schéma
illustrant
les
mécanismes d’activation de
différents types d’inflammasome
menant à la sécrétion de l’IL-1β
et de l’IL-18.
Abréviations: NF-ĸB; nuclear
factor ĸB, ASC; apoptosisassociated speck-like protein,
NLRP3; NOD-like receptor
family, pyrin domain containing
3, NLRC4; NLR family, CARD
domain containing 4, NLRP1;
NOD-like receptor family, pyrin
domain containing 1, AIM2;
absent in melanoma 2.
V. Modèle MPTP
Notre laboratoire travaille avec un modèle de neurotoxine, utilisant plus précisément la
neurotoxine 1-méthyle-4-phényle-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Celle-ci est un dérivé issu de la
synthèse de la desmétyleprodine, une drogue synthétique de la famille des opioïdes ayant des
propriétés similaires à celles de la morphine173. Son ingestion accidentelle chez l’humain cause des
symptômes très proches de ceux de la MP et ainsi, un syndrome parkinsonien irréversible174. Les
caractéristiques motrices principales de la MP sont d’ailleurs incluses dans ces symptômes, dont la
rigidité, la bradykinésie, l’instabilité posturale et les tremblements au repos175. De plus, des
symptômes non-moteurs tels que des problèmes gastro-intestinaux étaient rencontrés par certains
patients176.
Il s’agit d’un modèle largement utilisé chez les rongeurs et les primates non-humains de par la
possibilité de comparer les résultats expérimentaux avec ceux observés chez les patients humains
ayant été en contact avec celle-ci et de par la proximité des symptômes engendrés par la
neurotoxine avec ceux de la MP177. De plus, certaines caractéristiques biologiques spécifiques à
cette maladie peuvent être observées chez ce modèle telles que la perte de neurones DAergiques
dans la SN ainsi qu’une déplétion en dopamine dans le striatum178 en plus de la présence d’une
20
inflammation tant au niveau central que périphérique 11. Cependant, les mécanismes entraînant
l’atteinte de la voie nigro-striée diffèrent entre le modèle MPTP et la MP puisque le premier fait suite
aux effets toxiques du MPTP alors que la deuxième consiste à un processus de
neurodégénérescence chronique179. Par contre, puisque la MP comporte une composante
environnementale dans laquelle une toxine pourrait être liée à cette pathologie, l’étude en vue de
comprendre les mécanismes immuno-modulateurs dans ce modèle animal est pertinente. De plus, le
modèle MPTP possède certains avantages en termes d’utilisation expérimentale comme d’être
rapide et fortement reproductible180.
V.3.1 Mécanistique
Dans la littérature, il est accepté que la neurotoxine MPTP soit métabolisée par l’enzyme
MAO-B, retrouvée majoritairement chez les astrocytes, en 1-méthyle-4-phényle-4propionoxypiperidine (MPPP) puis en 1-méthyle-4-phénylepyridinium (MPP+). Cette dernière forme
est alors libérée dans le milieu extracellulaire puis captée par le transporteur de la DA (DAT) des
neurones DAergiques, de par la similitude de structures entre le MPP + et la DA, où elle ira se
localiser au niveau de la membrane mitochondriale181. Finalement, le MPP+ causera l’inhibition du
complexe I de la chaîne de la respiration cellulaire, entraînant ainsi une crise énergétique au sein de
la cellule suite à la diminution de la concentration en adénosine triphosphate (ATP). Cette crise
cellulaire se traduit par une augmentation du stress oxydatif par la production de dérivés réactifs de
l’oxygène (ROS) tels que le super oxyde (O2-) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2)182,183.
Les paramètres concernant les doses de MPTP ainsi que le régime auquel elles sont administrées
sont fortement variables d’une équipe de recherche à une autre. En modulant ceux-ci, il est possible
de simuler différents stades de la MP selon le but recherché. Les sections suivantes décrivent les
effets biologiques induits par les traitements utilisés durant ma maîtrise.
V.3.2 Effets d’un traitement avec faibles doses de MPTP
Ce type de traitement a été utilisé dans le but de simuler un stade précoce de la MP.
Effectivement, cette dose de MPTP considérée comme faible cause l’atteinte des innervations
DAergiques de la voie nigro-striée tout en engendrant un minimum de dommage aux corps
cellulaires de ces neurones situés dans la SN184. Plus précisément, une perte d’environ 50% des
terminaux DAergiques dans le striatum est observée chez les souris traitées avec le MPTP en
comparaison avec les souris contrôles injectées avec le véhicule (saline)11. De plus, aucune
altération significative dans le nombre de neurones DAergiques n’a été observée dans la SN11.
V.3.3 Effets d’un traitement avec fortes doses de MPTP
Ce second régime de traitement a été utilisé afin d’obtenir un modèle de stade avancé de la
MP, avec des dommages notoires à la voie nigro-striée. D’abord, une diminution de jusqu’à 90% de
la concentration en dopamine du striatum peut être mesurée 185. De plus, une perte neuronale
DAergique de 59% est observée dans la SNpc ainsi qu’une diminution de 64% de la densité optique
liée aux fibres TH positives vers le striatum186.
21
VI. Historique du laboratoire
Le laboratoire du Dr Soulet, installé au pavillon CHUL du centre de recherche du CHU de
Québec depuis 2009, s’intéresse, entre autres, au rôle du système immunitaire dans l’atteinte des
neurones dopaminergiques du plexus myentérique dans un modèle parkinsonien de neurotoxine.
VII.4.1 Résultats antécédents du laboratoire
Comme mentionné précédemment, notre laboratoire s’intéresse au rôle du système
immunitaire dans la perte neuronale au niveau du SNE. En effet, bien que plusieurs études
supportent le rôle de l’inflammation dans l’altération de neurones du SNC tant chez des modèles
aigües que chroniques, peu d’études ont été portés sur le rôle de la réponse immunitaire dans
l’intestin. Cette section introduit différents résultats expérimentaux publiés par notre laboratoire afin
de mettre en contexte mon projet de maîtrise.
Article 1
Un article publié en 2011 par Côté et coll.56 a montré, grâce à un modèle de souris déficiente
pour la protéine adaptatrice MyD88 (Myd88-/-), le rôle de la réponse immunitaire dans la
dégénérescence des neurones DAergiques du plexus myentérique suite à des lésions causées par le
MPTP. Effectivement, les souris Myd88-/- traitées avec le MPTP étaient protégées contre la
dégénérescence neuronale contrairement aux souris sauvages chez lesquelles une diminution de
50% de l’immuno-réactivité à la TH était observée.
La protéine MyD88 est impliquée dans la voie des TLRs dont l’activation entraîne une cascade
moléculaire menant à la réponse du système immunitaire inné. Des investigations par immunohistochimie et immunofluorescence ont par la suite montré que la déficience en MyD88 abolissait la
réponse des macrophages au MPTP avec une densité de ces derniers beaucoup plus faible dans le
plexus myentérique des souris MyD88-/- que des souris sauvages. De plus, malgré le fait que le
MPTP promeut l’infiltration de neutrophiles dans ce tissu, la densité en neutrophiles était moins
marquée chez les souris MyD88-/- que chez les souris sauvages, toujours avec le traitement MPTP.
Finalement, l’altération de cette voie réduit aussi l’infiltration de monocytes dans le plexus
myentérique de souris mutées traitées au MPTP et, de manière intéressante, favorise la polarisation
des macrophages résidents vers un phénotype pro-réparateur suite au traitement avec la
neurotoxine.
Ces résultats soulignent le rôle de l’inflammation, et particulièrement la voie des TLRs dépendante
de MyD88, dans la dégénérescence des neurones DAergiques du plexus myentérique suite à un
traitement avec le MPTP.
22
Article 2
Un second article, publié en 2015 par Côté et coll.11 a démontré le rôle essentiel de la
réponse immunitaire dans l’altération des neurones DAergiques du plexus myentérique suite à un
traitement MPTP.
À partir d’un protocole utilisant des liposomes clodronate chez des souris 187,188, ce papier a montré
que le traitement de liposome clodronate prévient la polarisation des monocytes vers un phénotype
pro-inflammatoire induit par la neurotoxine MPTP. Cependant, la diminution de la population de
monocytes M1 ne suffit pas à prévenir les dommages aux prolongements nigro-striés DAergiques
induits par le MPTP. Pourtant, la déplétion partielle de cette population grâce aux liposomes
clodronate protège les neurones DAergiques du plexus myentérique contre les altérations causées
par le MPTP.
Les résultats indiquent que : 1) le MPTP génère une réponse pro-inflammatoire forte qui prend place
en premier dans le plexus myentérique et ensuite dans le SNC, avec une activité plus prononcée
dans le striatum 2) la déplétion partielle en monocyte M1 ne modifie pas les réponses neuroinflammatoires induites par le MPTP à l’intérieur du SNC alors que la réponse du système
immunitaire inné est complètement inhibée dans le plexus myentérique.
Finalement, une étude in vitro sur des monocytes humains a montré que le MPTP, et sa forme
toxique le MPP+, peuvent agir directement sur les monocytes et promouvoir une réponse proinflammatoire. Cette activation résulte en une production de nitrite et de cytokines proinflammatoires. De plus, cette réponse immunitaire est partiellement dépendante de la voie de
signalisation MyD88/NF-κB.
VII – Mon projet de recherche
VII.1 Problématique
La maladie de Parkinson est à ce jour incurable, les traitements ne permettant qu’un soulagement
restreints des symptômes dont souffrent les patients. De plus, le diagnostic des patients
parkinsoniens se fait tardivement en prenant en compte majoritairement les symptômes moteurs, qui
apparaissent souvent après les symptômes non-moteurs de la maladie. Il faut d’abord comprendre
l’origine et l’évolution de cette maladie afin de trouver des cibles moléculaires capables d’enrayer
efficacement celle-ci. Aussi, il importe de trouver des bio-marqueurs précoces de la MP enfin d’agir à
temps pour contrer l’avancement de la maladie.
VII.2 Hypothèse
L’altération des neurones dopaminergiques du plexus myentérique serait un effet de l’activation des
cellules immunitaires telles que les monocytes infiltrant et les macrophages résidents par le sousproduit de la neurotoxine MPTP : le MPP+.
23
Figure 19 – Hypothèse
Catherine Fontaine-Lavallée (2015)©
La forme active de la neurotoxine MPTP, MPP+ pourrait agir directement sur les cellules immunitaires et leur activation serait par la
suite dommageable pour les neurones DAergiques du plexus myentérique.
VII. 3 Objectifs
Les objectifs de mon projet de maîtrise sont les suivants :
x Comprendre la dynamique de l’inflammation dans la dégénérescence neuronale
parkinsonienne ;
x Valider de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
VII.4 Participation de l’étudiante au projet de recherche
J’ai participé à tous les protocoles menés dans le cadre de ce projet de recherche, de leur
élaboration jusqu’aux analyses et montage des figures (pour la majorité). J’ai cependant obtenu
l’aide de Mélissa Côté, doctorante dans l’équipe de recherche du Dr Soulet, sur quelques-uns de ces
protocoles. D’ailleurs, certaines figures de ce mémoire ont été montées par elle puisqu’elle possédait
certaines données brutes. Mon directeur de recherche m’a évidemment guidé à travers le projet qu’il
avait en tête et l’organisation de mes résultats. Je dois dire qu’il avait une présence importante et
appréciée. De plus, je lui dois la figure finale du mémoire.
24
Résultats
I. Étude du décours temporel de la réponse immunitaire au sein du plexus
myentérique
I.1 Chronologie de la réponse immunitaire au sein du plexus myentérique
La mort des neurones DAergiques en périphérie est controversée chez l’humain. En effet, il
n’y a pas consensus parmi les diverses équipes de recherche ayant investigué ce sujet. De plus,
leurs résultats sont difficiles à comparer puisqu’elles ont utilisé des techniques différentes dans leurs
études. Singaram et coll. (1995) ont mesuré une diminution du nombre de neurones DAergiques des
plexus myentérique et sous-muqueux, ainsi qu’une diminution de la concentration en DA, dans des
biopsies de colon de patients111. Quant à Lebouvier et coll. (2010) et Corbillé et coll. (2014), ils n’ont
observé aucune différence dans le nombre de neurones positifs à la TH du plexus sous-muqueux
dans des biopsies de colon de patients108,189.
Un ensemble croissant d’études appuie le fait que le système immunitaire soit activé dans l’intestin
de patients parkinsoniens. Cela avait d’ailleurs été rapporté en 1995 par Singaram et coll. qui
observaient la présence de cellules inflammatoires dans le SNE de biopsies de colon de patients 111.
D’autres études ont par la suite montré une augmentation de l’expression de certaines cytokines proinflammatoires telles que le TNF-α, l’IFN-γ, l’IL-6 et l’IL-1β chez les patients parkinsoniens54,190, en
plus d’une augmentation de marqueurs de cellules gliales 54. Finalement, un article de Forsyth et coll.
(2011) a décrit une augmentation de la perméabilité de l’épithélium intestinale chez les patients
parkinsoniens. Cette hyperperméabilité augmente l’exposition du SNE, ainsi que du système
immunitaire, aux bactéries intestinales ainsi qu’aux endotoxines contenues dans la lumière de
l’intestin telles qu’Escherichia coli 113. En plus, une étude récente a fourni des évidences montrant
des altérations de la morphologie de la barrière épithéliale intestinale chez les patients
parkinsoniens191.
Ces éléments montrent la pertinence d’étudier la réponse immunitaire au sein du plexus
myentérique, dans un modèle parkinsonien, dans l’optique du rôle du tractus gastro-intestinal dans
l’initiation et/ou la progression de la MP.
I.1.1 But
Comprendre les évènements immunitaires prenant place dans le plexus myentérique suite
aux injections de MPTP afin de les caractériser et d’établir leur chronologie dans le temps.
I.1.2 Hypothèse
1. Le MPTP active directement les cellules du système immunitaire inné puis celles-ci induisent
des dommages chez les neurones DAergiques. Cette activation précèderait les dysfonctions
neuronales, et se passerait donc à des temps précoces.
25
I.1.3 Matériel et méthodes
Dans le cadre de notre étude, nous avons utilisé trois lignées de souris transgéniques :
Souris transgéniques cis-NF-κBeGFP
Cette souris knock-in exprime le gène enhanced green fluorescent protein (eGFP) sous le contrôle
transcriptionnel des éléments cis du facteur de transcription NF-ĸB (souris cis-NF-ĸBeGFP)192. Les
souris ont été obtenues du laboratoire du Dr Christian Jobin (Floride, États-Unis).
Souris transgéniques lysMeGFP
Cette souris knock-in exprime le gène eGFP sous le contrôle transcriptionnel du gène associé au
lysozyme M (souris lysMeGFP)193. Les souris ont été obtenues du laboratoire du Dr Steve Lacroix
(Québec).
Souris transgéniques CX3CR1GFP
Cette souris knock-in exprime le gène GFP sous le contrôle transcriptionnel du gène associé au
récepteur à la fractalkine (CX3CR1) (souris CX3CR1GFP)194. Les souris ont été achetées chez le
laboratoire Jackson (Maine, États-Unis).
Les animaux ont été mis en cage et nourris ad libitum au Centre de recherche du CHU de Québec.
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité Universitaire de protection des animaux de
l’Université Laval et conduites en accord avec le guide canadien du Conseil canadien de protection
des animaux.
Traitements expérimentaux et préparation des échantillons
Les souris mâles ont été injectées par voie intra-péritonéale avec le traitement souhaité : 4 injections
de 8 mg MPTP/kg de poids corporel ou 20 mg MPTP/kg de poids corporel (dilué dans de la saline
0,9%) espacées de 2 heures, 1 injection de 10 mg LPS/kg de poids corporel113,195 (dilué dans de la
saline 0,9%) ou le même nombre d’injection de saline 0,9% que le traitement actif. Les souris ont été
euthanasiées par translocation cervicale suite à une injection de xylazine/kétamine à différents temps
tels qu’illustrés sur les figures 20-22. L’intestin a été récupéré, puis une partie de l’iléon a été mis de
côté alors que le reste de l’intestin a été mise dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) 4% pour
24 heures avant d’être remplacée par un tampon phosphate salin (PBS) pour sa conservation. Le
morceau d’iléon a été micro-disséqué afin d’enlever la couche de microvillosités, puis incubé avec du
DRAQ5™ 5 µM afin de marquer les noyaux cellulaires (Abcam, États-Unis).
Imagerie ex vivo de l’iléon
Les échantillons d’iléon, incubés dans du milieu de culture (Dulbecco’s modified eagle medium ;
DMEM, avec 10% de sérum fœtal bovin), dans une boîte de Pétri, à l’intérieur d’une boîte de
conditionnement avec un circuit d’eau et de CO2 à 37°C, ont été imagés avec un microscope à
balayage laser confocal (Olympus IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été
acquises avec un objectif 40x par un balayage laser non-séquentiel et une séparation spectrale
optimale grâce à des filtres multispectraux.
26
Traitements expérimentaux, mesures de phagocytose et préparation des échantillons
Trois souris CX3CR1GFP par groupe ont été injectées avec de la saline ou du MPTP (même dosage
que pour le dynamisme cellulaire. Les souris ont été injectées dans la veine de la queue avec du
dextran TexasRed™ 2,5% 1 heure avant d’être sacrifiées, 5 jours après le traitement. Elles ont par la
suite été perfusées avec de la PFA 4%. Des échantillons d’iléons ont été micro-disséqués afin
d’isoler le plexus myentérique. Ces sections ont été marquées avec du DAPI afin de marquer les
noyaux cellulaires (Life techonologies, États-Unis) puis montées sur lame.
Imagerie de l’activité de phagocytose
Les échantillons d’iléon ont été imagés avec un microscope à balayage laser confocal (Olympus
IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises par un balayage
séquentiel avec un objectif 40x à immersion. Les images ont été analysées avec le logiciel Imaris™
(Bitplane, Zurich, Suisse) où l’intensité en GFP ou en TexasRed™ a été mesurée à l’intérieur du
volume de cellules CX3CR1GFP.
Mesure des trajectoires des cellules
La mesure des trajectoires des cellules telles que présentées dans les figures 20C, 21F et 22C a été
faite avec le logiciel ImageJ en utilisant l’extension MTrackJ.
Analyses statistiques
Lorsque nécessaire, un test Mann-Whitney a été fait avec le logiciel GraphPad Prism 5.0d
(GraphPad Software Inc., Ca, USA). Une valeur de p < 0,05 était requise pour que le résultat soit
considéré comme statistiquement significatif.
I.1.4 Résultats expérimentaux
Cette expérimentation a permis d’établir une chronologie des évènements cellulaires prenant
place dans le plexus myentérique de l’iléon de souris transgéniques suite à un traitement MPTP.
Dans un premier temps, nous avons voulu étudier la voie NF-κB de par son rôle dans la réponse
immunitaire innée menant, entre autres, à la sécrétion d’une cytokine pro-inflammatoire, l’IL-1β.
L’activation de cette voie peut être observée dans le tissu 24 heures (h) après la première injection
de MPTP (Fig. 20A), alors qu’aucun signal n’est observé chez la souris sacrifiée après 6h ni chez la
souris traitée avec de la saline (données non-montrées). Les cellules GFP positives correspondent
morphologiquement à des macrophages, avec un pic d’intensité de GFP au temps 48h. Après 96h, le
signal est encore présent chez ces cellules (Fig. 20A). De plus, nous observons l’activation des
cellules endothéliales avec une forte intensité de celles-ci à 48h. Chez les souris traitées avec la
lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine bactérienne connue pour induire une réponse
inflammatoire, l’activation de la voie NF-κB semble être plus rapide, avec déjà un signal important au
temps 24h (Fig. 20B). Cette dernière induit elle aussi une activation des cellules endothéliales en
plus de celle des macrophages. À partir de 48h, une diminution de l’intensité de GFP est visible dans
le tissu. Lors d’un traitement MPTP plus agressif, nous pouvons observer une infiltration massive de
neutrophiles dans le plexus myentérique à 24h (Fig.20C).
27
Figure 20 - Réponse NF-κB dans le temps chez des souris cis-NF-κBeGFP
A. Réponse NF-κB dans le temps suite à un traitement MPTP dosé à 8 mg/kg. B. Réponse NF-κB dans le temps suite à un traitement
LPS. C. Infiltration de neutrophiles dans le plexus myentérique chez une souris traitée au MPTP dose 20 mg/kg et sacrifiée à 24h. Les
neutrophiles se déplacent rapidement dans le tissu comme le montre 4 exemples de déplacement. Ces cellules sont reconnaissables
de par la forme de leur noyau polylobé.
28
Ces neutrophiles sont faiblement positifs en GFP. Par ailleurs, avec cette dose de MPTP, les cellules
endothéliales sont activées à un niveau similaire à ce que nous pouvons observer chez les souris
NF-κB traitées avec la LPS et le MPTP faible dose.
Par la suite, nous avons utilisé des souris CX3CR1GFP dans le but d’observer le rôle des
macrophages résidents dans la réponse immunitaire du plexus myentérique. Dans une première
expérience sur une souris traitée au MPTP et sacrifiée 5 jours plus tard (temps 120h), nous avons
constaté que les macrophages résidents ne sont pas mobiles dans le tissu en réponse à la
neurotoxine. Cependant, des noyaux, marqués avec le DRAQ5™, de cellules GFP négatives se
déplaçaient rapidement à travers le tissu (Fig.21F). Un protocole de souris injectées avec de la LPS
ou de la saline a par la suite confirmé la première observation selon laquelle les macrophages
patrouillent activement leur environnement de manière très dynamique, leurs prolongements étant
fortement mobiles, mais ne se déplacent pas dans le tissu (Fig.21ABC). De plus, une étude sur
l’intensité de la GFP des macrophages résidents entre des souris traitées au MPTP ou à la saline et
sacrifiées au temps 120h a été faite (Fig.21D). Nous observons une diminution de cette intensité
chez les macrophages traités avec le MPTP. Finalement, un essai pour mesurer l’activité
phagocytaire des macrophages résidents a été réalisé avec du dextran TexasRed™(Fig.21E). Nous
observons une diminution de cette activité avec un traitement MPTP en comparaison à un traitement
avec de la saline.
29
Figure 21 - Étude du dynamisme cellulaire chez des
souris CX3CR1-GFP
A. Réponse des macrophages CX3CR1GFP positifs dans le
temps suite à un traitement LPS. Échelle : 24μm.
B. Réponse des macrophages CX3CR1GFP positifs dans le
temps suite à un traitement de saline. Échelle : 24μM.
C. Images illustrant un macrophage et son dynamisme
(traitement LPS, sacrifice après 24h) tel que montré en A.
en haut, ou avec une superposition de couleurs
correspondant à des temps différents en bas. Échelle :
GFP
18μm. D. Mesure de l’intensité en GFP de macrophages CX3CR1 en fonction d’un traitement de saline ou MPTP dose 8
mg/kg. Test Mann-Whitney, p<0,0001. E. Mesure de l’intensité en TexasRed™ de macrophages CX3CR1GFP en fonction d’un
traitement de saline ou MPTP dose 8 mg/kg. Test Mann-Whitney, p<0,0001. F. Imagerie en microscopie confocale d’une souris
traitée au MPTP dose 8 mg/kg et sacrifiée au temps 120h montrant, à gauche, la présence de deux cellules CX 3CR1GFP négatives
aux noyaux marqués au DRAQ5™ (pointes blanches) et à droite leur parcours dans le tissu. Échelle : 30μM.
30
Enfin, nous avons utilisé la souris lysMeGFP pour étudier la participation immunitaire des monocytes
circulants pouvant infiltrer le plexus myentérique et, potentiellement, valider si ce type cellulaire
pourrait correspondre aux cellules CX3CR1GFP négatives observées précédemment. Nous observons
alors la présence de cellules lysMeGFP positives dans le tissu dès 6 heures après la première injection
de MPTP (Fig. 22A). De plus, ces cellules sont, pour certaines, sous forme amiboïde et se déplacent
activement dans le tissu (Fig.22C). Ces cellules activées sont aussi présentes aux temps 24h et 48h,
cependant le nombre de cellules se ramifiant, perdant ainsi leur phénotype actif, augmente dans le
temps. Ainsi, à 72h, la majorité des cellules lysMGFP+ sont ramifiées. Chez les souris traitées avec la
saline, nous observions une grande quantité de macrophages ramifiés, mais pas de cellules
amiboïdes. Fig.22B).
31
Figure 22 - Étude du dynamisme cellulaire chez la souris lysMeGFP
A. Réponse des cellules lysMeGFP positives dans le temps suite à un traitement MPTP. Échelle : 24 μm. B. Réponse des cellules
lysMeGFP positives dans le temps suite à un traitement de saline. Échelle : 24 μm C. Imagerie en microscopie confocale d’une souris
traitée au MPTP et sacrifiée au temps 6h telle que montrée en A. montrant, à gauche, la présence de deux cellules lysM eGFP positives
et à droite leur parcours dans le tissu. Échelle : 31μm.
32
II. Étude mécanistique
II.1 Étude in vitro avec le traceur fluorescent APP+
Des résultats obtenus précédemment dans le laboratoire mettent de l’avant l’importance
de la réponse immunitaire dans le plexus myentérique suite à un traitement avec le MPTP 11. De plus,
l’hypothèse d’une activation des cellules de l’immunité innée directement par la neurotoxine est
renforcée par ces derniers.
Pour montrer les interactions possibles entre la neurotoxine et les cellules immunitaires, nous avons
utilisé un analogue du MPP+, le 4-(4-Diméthyle-amino)phényle-1-méthylepyridinium iodide (APP+),
comme traceur fluorescent. L’APP+ possède une structure très semblable à celle du MPP+, si ce
n’est le groupement donneur d’électron ajouté sur sa structure qui lui confère sa fluorescence dans le
bleu cyan. Il s’agit d’un marqueur de neurones catécholaminergiques, avec une affinité pour le
transporteur de la DA (DAT), le transporteur de la 5-HT (SERT) et le transporteur de la noradrénaline
(NET)196.
II.1.1 But
Investiguer les paramètres de transport de l’APP+ par des cellules en culture dont des
cellules immunitaires.
II.1.2 Hypothèses
1. Les cellules immunitaires sont capables de capter l’APP+.
2. L’APP+ n’est pas nocif pour les cellules.
3. L’APP+ emprunte un transport actif pour entrer dans les cellules.
II.1.3 Matériel et méthodes
Traitements expérimentaux
Traceur fluorescent
L’APP+ est un analogue fluorescent du MPP+ nous permettant de visualiser la position de cette
molécule dans les cellules. L’APP+ émet de la fluorescence dans le bleu cyan lorsqu’il est excité196.
Les cellules ont été transférées dans des plaques de 24 puits où elles ont été incubées avec de
l’APP+ 500nM dilué dans du milieu de culture (DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin) durant une
période de temps variables allant de 15 minutes à 2 heures. Deux températures d’incubation ont été
pratiquées : 4°C et 37°C.
Cytométrie de flux
Les cellules ont été analysées avec un système BD FACSCantoll (BD Biosciences, Ca, États-Unis)
et l’acquisition de données a effectué avec le logiciel Diva (version 6.1.2, BD Bioscience). Les
données ont été analysées avec le logiciel Flow Jo (version 7.6.1, Tristar, Or, États-Unis). L’intensité
de l’APP+ a été mesurée en utilisant les longueurs d’onde suivantes : λex : 405 nm et λem : 435 nm.
33
Survie cellulaire
La survie cellulaire a été mesurée avec la trousse Vybrant™ MTT Cell Proliferation Assay Kit (Life
Technologies, États-Unis) tel qu’indiqué par le fabricant.
Lignées cellulaires utilisées
Lignées
cellulaires
Type de
cellule
Hôte
RAW.267
SH-SY5Y
BV-2
THP-1
Macrophage
Neurone
DAergique
Microglie
Monocytes
Souris
Humain
Souris
Humain
Tableau 3 - Lignées cellulaires utilisées dans l’étude in vitro du traceur fluorescent APP+
Analyses statistiques
Les comparaisons statistiques ont été faites en utilisant une analyse de variance two-way (ANOVA),
suivi par un post-test Bonferroni (confidence d’intervalles de 95%) afin de comparer chacun des
groupes contrôles et traités. Les analyses statistiques ainsi que les graphiques représentatifs ont été
fait avec le logiciel GraphPad Prism 5.0d (GraphPad Software Inc., Ca, USA). Les données sont
présentées par moyenne de groupe ± SEM dans chacun des histogrammes. Une valeur de p < 0,05
était requise pour que le résultat soit considéré comme statistiquement significatif.
II.1.4 Résultats expérimentaux
3RSXODWLRQGH7+3
GXFRQWU{OHQpJDWLI
3RSXODWLRQGH5$:
GXFRQWU{OHQpJDWLI
3RSXODWLRQGH%9
GX FRQWU{OH QpJDWLI
3RSXODWLRQGH6+6<<
GXFRQWU{OHQpJDWLI
Premièrement, les expérimentations liées à la toxicité du APP+ montrent qu’il n’y a pas de
mort cellulaire significative chez les lignées cellulaires testées avec le réactif MTT et ce, à aucun des
temps choisis dans l’étude (Fig. 23). De plus, l’APP+ n’induit pas la production de NO chez les
ules immunitaires BV-2, RAW et THP-1 (données non montrées).
cellules
Figure 23 - - Étude par FACS de la toxicité de l'APP+ sur différents types cellulaires dans le temps
A. Étude faite avec des cellules THP-1. B. Étude réalisée avec des cellules RAW.267. C. Étude faite avec des cellules BV-2. D. Étude
réalisée avec des cellules SH-SY5Y. Two-way ANOVA.
34
5$:SRVLWLYHVjOC$33
6+6<<SRVLWLYHVjOC$33
7+3SRVLWLYHVjOC$33
%9SRVLWLYHVjOC$33
Deuxièmement, l’étude de la cinétique de capture de l’APP + par divers types cellulaires permet de
conclure que celle-ci est différente entre ces derniers (Fig. 24). En effet, il semble que les monocytes
humains THP-1 soient les plus rapides à capter l’APP+, avec près de 50% de cellules positives au
marqueur fluorescent après 15 minutes d’incubation avec celui-ci. Viennent ensuite les BV-2 et SHSY5Y qui ont un profil cinétique semblable. Finalement, les RAW.267 sont les plus lents à transporter
le marqueur fluorescent. De plus, cette même étude montre l’inhibition du transport de l’APP+ dans
les THP-1 lorsque ces cellules sont incubées à 4°C plutôt qu’à 37°C (Fig 24A).
Figure 24 - Étude par FACS de la cinétique de capture de l'APP+ par différents types cellulaires
A. Étude faite avec des cellules THP-1. B. Étude réalisée avec des cellules RAW.267. C. Étude avec des cellules BV-2. D. Étude
réalisée avec des cellules SH-SY5Y. Two-way ANOVA ; *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001 (en fonction du contrôle négatif) #p<0.05,
##p<0.01, ###p<0.001 (en fonction du temps précédant).
II.2 Étude in vitro de la distribution intracellulaire de l’APP+
Dans la littérature, le MPP+ est connu pour se localiser au niveau des mitochondries où
l’inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire cellulaire cause un stress oxydatif au sein de la
cellule181,182.
II.2.1 But
Étudier la distribution intracellulaire du traceur fluorescent APP+, analogue du MPP+, dans
différentes lignées cellulaires, grâce à des marqueurs des mitochondries et du stress oxydatif
cellulaire.
II.2.2 Hypothèses
1. L’APP+ colocalise avec les mitochondries, puisque c’est le comportement attendu du MPP+.
2. Le MPP+ induit un stress oxydatif au niveau des mitochondries des cellules, et celui-ci
promeut une réponse immunitaire.
35
II.2.3 Matériel et méthodes
Marqueurs fluorescents
Le Mitotracker™ (Life Technologies, États-Unis) et le CellRox™ (Life Technologies, États-Unis) sont
des marqueurs fluorescents des mitochondries197 et du stress oxydatif cellulaire respectivement198.
Marqueurs
Compagnies
# Catalogue
Concentration utilisée
APP+
Sigma-Aldrich
SML0756
500 nM
Mitotracker™
Life technologies
M22425
100 nM
CellRox™
Life technologies
C10448
5 μM
Tableau 4 - Marqueurs fluorescents
Traitements expérimentaux
10 000 cellules ont été transférées dans des puits d’une Lab-Tek™ chambered coverglass (SigmaAldrich) avec du milieu de culture la veille de l’expérimentation. Le lendemain, elles ont été incubées
avec les différents marqueurs fluorescents durant 30 minutes. Le milieu de culture a ensuite été
changé, et le MPP+ ajouté dans les puits souhaités à une concentration de 50 μM (Sigma-Aldrich
Chemicals), ou encore la LPS à une concentration de 50 ng/mL (Sigma-Aldrich Chemical).
Lignées cellulaires
RAW.267
Type de cellule
Macrophage
Hôte
Souris
SH-SY5Y
Neurone
DAergique
Humain
N2-A
Neuroblastoma
Souris
Tableau 5 - Lignées cellulaires utilisées dans l'étude de la distribution de marqueurs fluorescents
Imagerie
Les cellules ont été imagées dans la chambered coverglass à l’intérieur d’une boîte de
conditionnement avec un circuit d’eau et de CO2, avec un microscope à balayage laser confocal
(Olympus IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises par un balayage
non-séquentiel avec un objectif 60x à immersion en faisant l’alternance entre les 4 puits de la plaque.
II.2.4 Résultats expérimentaux
Chez les deux types cellulaires imagés, des cellules N2A et RAW.267, l’APP+ est capté par
les cellules et se retrouve à l’intérieur de celles-ci (Fig. 25-26). Visuellement, l’APP+ est présent dans
le cytosol, mais il colocalise aussi fortement avec les mitochondries marquées avec le Mitotracker™.
N2-A
36
Figure 25 - Étude mécanistique in vitro sur des cellules N2-A avec des marqueurs fluorescents
1. Contrôle négatif sans traitement ni marqueur. 2. Présence des 3 marqueurs. 3. Absence de APP+, mais présence de MPP+. 4. Tous
les marqueurs en plus du MPP+.
De plus, le stress oxydatif, marqué lui avec le CellRox™, colocalise aussi fortement avec les
mitochondries, même s’il semble se retrouver aussi dans ce qui ressemble à des compartiments
cellulaires de types vésiculaires (Fig. 25-26).
RAW.267
Figure 26 - Étude mécanistique in vitro sur des cellules RAW.267 avec des marqueurs fluorescents
1. Contrôle négatif sans traitement ni marqueur. 2. Présence des 3 marqueurs. 3. Absence de APP+, mais présence de MPP+. 4. Tous
les marqueurs en plus du MPP+.
Cette colocalisation du stress oxydatif et des mitochondries est aussi présente chez les cellules SHSY5Y et RAW.267 traitées avec le contrôle positif de LPS (Fig.27-28).
37
SH-SY5Y
Figure 27 - Comparaison du stress oxydatif suite au traitement à la LPS et au MPP+ chez les cellules SH-SY5Y
1. Contrôle négatif sans traitement ni marqueur. 2. Présence des 2 marqueurs et absence de traitement. 3-4. Présence des 2
marqueurs, avec de la LPS. 4. Présence des 2 marqueurs, avec du MPP+.
RAW.267
Figure 28 - Comparaison du stress oxydatif suite au traitement à la LPS et au MPP+ chez les cellules RAW.267
1. Contrôle négatif sans traitement ni marqueur. 2. Présence des 2 marqueurs et absence de traitement. 3-4. Présence des 2
marqueurs, avec de la LPS. 4. Présence des 2 marqueurs, avec du MPP+.
38
II.3 Étude in vitro de conditionnement de monocytes et neurones DAergiques humains
II.3.1 But
Puisque les monocytes humains sont en mesure de transporter l’APP+, et ainsi d’être
potentiellement modulables par la neurotoxine, nous voulions observer les effets de l’activation de
ces cellules sur les neurones DAergiques humains suite à différents traitements.
II.3.2 Hypothèse
1. L’activation des monocytes par la neurotoxine affecte la viabilité des neurones DAergiques.
II.3.3 Matériel et méthodes
II.3.3.1 Lignées cellulaires utilisées
Nous avons utilisé des monocytes humains THP-1 et des neurones DAergiques humains SH-SY5Y.
II.3.3.2 Traitements des cellules
Nous avons procédé à l’échange du surnageant de cellules en culture, traitées ou non avec de la
LPS, du MPP+ ou du MPTP tel qu’illustré par le schéma ci-dessous pour ensuite mesurer la
concentration de NO et la viabilité des cellules tel que décrit en II.1.3.
Figure 25 - Protocole de conditionnement
Détaille des échanges de surnageant des cellules THP-1 et Sh-SY5Y suivant un traitement ou non de LPS, MPP+
ou MPTP ainsi que des contrôles.
39
Les cellules étaient traitées avec les concentrations suivantes de toxines :
LPS
Compagnie
# catalogue
Concentration utilisée
L2637
50ng/mL
MPP+
Sigma-Aldrich
M7068
5µM
MPTP
M0896
5µM
Tableau 6 - Traitements utilisés pour le protocole de conditionnement
Les cellules ont été incubées dans du milieu de culture (Roswell park memorial institute medium;
RPMI, avec 10% de sérum fœtal bovin) durant 24 h avec ou sans traitement, puis le surnageant et
les cellules ont été récolté pour effectuer les différentes mesures.
II.3.3.3 Mesure de la production de NO
La production de NO a été mesurée par la réaction colorimétrique de Griess (Promega Corporation, WI, USA)
en suivant le protocole donné par la compagnie. L’absorbance a été mesuré à 535 nm avec un spectrophotomètre (Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader, Bioteck, VT, USA).
II.3.3.4 Test de viabilité
La viabilité des cellules en culture a été mesuré avec une trousse MTT (Life Technologies Inc., ON, CA) selon
le protocole de la compagnie Invitrogen. L’absorbance a été lu à 540 nm avec un spectrophotomètre (Synergy
HT Multi-Mode Microplate Reader, Bioteck, VT, USA).
II.3.3.5 Analyses statistiques
Les comparaisons statistiques ont été faites en utilisant une analyse de variance two-way (ANOVA),
suivi par un post-test Bonferroni (confidence d’intervalles de 95%) afin de comparer chacun des
groupes contrôles et traités. Les analyses statistiques ainsi que les graphiques représentatifs ont été
fait avec le logiciel GraphPad Prism 5.0d (GraphPad Software Inc., Ca, USA). Les données sont
présentées par moyenne de groupe ± SEM dans chacun des histogrammes. Une valeur de p < 0,05
était requise pour que le résultat soit considéré comme statistiquement significatif.
II.3.4 Résultats expérimentaux
Avec les traitements avec la LPS, nous observons une augmentation de la prolifération
cellulaire des cellules THP-1 lorsqu’en présence de LPS (Fig.30A). Cependant, aucune variation de
la viabilité des SH-SY5Y n’est observée avec ces traitements, même suite à l’activation des cellules
THP-1 (Fig.30B), observable par l’augmentation de leur production de nitrite (Fig.30C).
40
Figure 26 - Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la
production de nitrite suite à un conditionnement de cellules
THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de LPS.
Légende : La table sous les graphiques illustre les différents
traitements utilisés pour chaque colonne, la première ligne étant
la LPS seule, la deuxième ligne étant le surnageant de l’autre
monoculture seul et la troisième ligne étant pour le surnageant de
cellules traitées avec la LPS; barre d’erreur : SEM; n=3; Two-way
ANOVA; *p < 0,05 et ***p < 0,001 pour le contrôle négatif, ###p <
0,001 pour le traitement à la LPS, ^^^p < 0,001 pour le
surnageant de l’autre monoculture seule, ooop < 0,001 pour le
surnageant de l’autre monoculture avec un traitement à la LPS.
Suite à différents traitements avec le MPTP, aucun changement n’est mesuré par rapport à la
viabilité des deux types cellulaires étudiés (Fig.31AB). Cependant, une augmentation de la
production de nitrite est observable chez les cellules THP-1, où elle est moins forte après l’incubation
avec le MPTP seul qu’avec le surnageant de SH-SY5Y avec ou sans le MPTP (Fig.31C).
Figure 27 - Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la production de nitrite suite à un conditionnement de cellules THP-1 et
SH-SY5Y à différents traitements de MPTP
Légende : La table sous les graphiques illustre les différents traitements utilisés pour chaque colonne, la première ligne étant le MPTP
seul, la deuxième ligne étant le surnageant de l’autre monoculture seul et la troisième ligne étant pour le surnageant de cellules traitées
avec le MPTP; barre d’erreur : SEM; n=3; Two-way ANOVA; **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour le contrôle négatif, ###p < 0,001 pour le
traitement au MPTP seul.
41
Finalement, une activation des cellules THP-1 est présente suite aux différents traitements de MPP+
avec encore une fois une augmentation de la production de nitrite, mais pas de différence dans la
viabilité de ces cellules. (Fig.32AB). La viabilité des cellules SH-SY5Y est significativement diminuée
avec la combinaison du traitement MPP+ et l’exposition des neurones au surnageant des cellules
THP-1 préalablement activées par le MPP+, mais leur viabilité est inchangée avec l’un ou l’autre de
ces traitements utilisés séparément (Fig.32C).
Figure 28 – Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la
production de nitrite suite à un conditionnement de
cellules THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de
MPP+
Légende : La table sous les graphiques illustre les différents
traitements utilisés pour chaque colonne, la première ligne
étant le MPP+ seul, la deuxième ligne étant le surnageant de
l’autre monoculture seul et la troisième ligne étant pour le
surnageant de cellules traitées avec le MPP+; barre d’erreur :
SEM; n=3; Two-way ANOVA; *p < 0,05 et ***p < 0,001 pour le
contrôle négatif, ###p < 0,001 pour le traitement au MPP+ seul.
II.4 Étude ex vivo avec l’APP+
II.4.1 But
Investiguer la capacité des cellules immunitaires à transporter le MPP+ en imageant son
analogue fluorescent l’APP+ sur des tissus vivants d’iléon.
II.4.2 Hypothèses
1. Les cellules immunitaires sont capables de transporter l’APP+ ;
2. L’APP+ peut servir de marqueur de la capacité de transport du MPP+.
42
II.4.3 Matériel et méthodes
Traitements expérimentaux
Une souris CX3CR1GFP a été sacrifiée puis son iléon récolté immédiatement pour être microdisséqué. La couche de microvillosité a été enlevée, et l’échantillon incubé avec 500 nM de APP + et 5
μM de DRAQ5™ dans du milieu de culture.
Imagerie
L’échantillon d’iléon, incubé dans du milieu de culture (DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin), dans
une boîte de Pétri, à l’intérieur d’une boîte de conditionnement avec un circuit d’eau et de CO 2 à
37°C, ont été imagés avec un microscope à balayage laser confocal (Olympus IX81-FV1000 ;
Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises par un balayage laser séquentiel avec un
objectif 40x.
II.4.4 Résultats expérimentaux
Tel qu’attendu, l’APP+ marque ce qui semble être les neurones DAergiques et leurs
prolongements à l’intérieur du plexus myentérique de manière très similaire à ce que nous pouvons
observer en présence d’un marquage TH en immunofluorescence (Fig. 33). Cependant, il n’est pas
possible de conclure quant à la colocalisation de l’APP + et des macrophages CX3CR1GFP positifs
présents dans les différentes images présentées. En effet, l’APP+ émet une fluorescence dans le
bleu-vert trop près de celle de la GFP, il est donc fort difficile de faire la différence entre les deux
signaux. De plus, l’intensité de l’APP+ dans les fibres neuronales était possiblement beaucoup plus
importante que dans les cellules immunitaires d’où un problème à détecter ce signal durant l’imageri
$
%
&
DRAQ5™
Figure 29 - Étude ex vivo de la capacité des neurones et des macrophages résidents à capter l’APP+
A.B.C. Imagerie d’une souris CX3CR1GFP sans traitement faite en microscopie confocale sur tissu ex vivo.
43
Discussion
L’un des objectifs de mon projet de maîtrise était de comprendre le dynamisme de l’inflammation
dans la dégénérescence parkinsonienne dans un contexte où le rôle de la réponse immunitaire est
incompris dans le développement ou la progression de la MP. Mes résultats démontrent que le
système immunitaire inné est activé de manière très précoce dans le plexus myentérique suivant les
injections de MPTP. En effet, la voie NF-ĸB est activée dès 24 heures après la première injection
dans ce tissu. Au même temps, des cellules infiltrantes telles que des monocytes sont présentes
dans le tissu. Elles sont sous forme amiboïde et perdent leur phénotype actif dans le temps en se
ramifiant. Quant aux macrophages résidents, ils patrouillent de manière active leur
microenvironnement sans se déplacer dans le tissu, mais semblent se polariser vers un phénotype
pro-inflammatoire de type M1. Ce dernier résultat a été obtenu avec la comparaison de l’intensité en
GFP des macrophages CX3CR1GFP positifs du plexus myentérique.
Notre étude a permis de caractériser la chronologie des évènements cellulaires se produisant dans le
plexus myentérique suite au traitement avec la neurotoxine. Cette précocité immunitaire est très
intéressante dans le contexte de la maladie de Parkinson puisque, comme plusieurs pathologies où
une inflammation chronique est présente, il est difficile de savoir si celle-ci est une cause ou une
conséquence de la maladie. Ainsi, une activation du système immunitaire pourrait se faire suite à
l’altération des neurones, comme les neurones DAergiques, ou encore cette activation aurait lieu en
premier par un agent chimique ou pathogène puis causerait des dégâts chez les neurones. Aussi,
puisque cette inflammation est chronique, il ne faut pas perdre de vue l’activation en boucle de ce
système : les cellules immunitaires causent des altérations cellulaires de par les différentes
molécules pro-inflammatoire qu’elles produisent, ce qui mène au recrutement d’autres cellules sur le
site de l’inflammation pour nettoyer les débris. Dans notre modèle d’inflammation intestinale induite
par le MPTP, une altération significative des neurones DAergiques marqués par la TH est visible dès
24h après la première injection, c’est-à-dire au même moment que l’activation de la voie NF-ĸB a été
observée. Dans ce contexte, il est ardu de conclure si l’activation du système immunitaire inné a eu
lieu avant l’atteinte des neurones DAergiques ou l’inverse. Cependant, des résultats publiés cette
année par le laboratoire indiquent, qu’au niveau du SNC, une inflammation serait présente avant
l’atteinte significative des neurones positifs pour la TH11. En effet, l’activation de la voie NF-ĸB a été
observée dans le striatum et la SN dès 24h après la première injection de MPTP, alors qu’une
diminution significative en TH n’est présente qu’après une période de 10 jours au niveau du
striatum11.
L’étude de l’immuno-phénotype de cellules immunitaires telles que les monocytes/
macrophages/microglies est très complexe et difficile à interpréter. Alors que des chercheurs de
renoms avaient créé une nomenclature ressemblant à celle des lymphocytes, ceux-ci sont revenus
en arrière récemment en expliquant qu’il s’agissait d’un modèle trop simpliste qui, au final, n’est pas
représentatif de ce qui se passe dans l’organisme127,133. Effectivement, la dichotomie entre les 2
phénotypes extrêmes M1 et M2 peut être vraie in vitro puisque le milieu est contrôlé, mais in vivo il
45
existe une plage de phénotypes variés dont les fonctionnalités peuvent se chevaucher. Cependant,
cette nomenclature est un outil nécessaire afin d’étudier l’activation de ces cellules immunitaires en
réponse à certaines conditions d’expérimentation et doit être utilisée avec précaution133. Dans le
cadre du protocole sur le dynamisme cellulaire, j’ai montré que les macrophages résidents perdaient
l’expression de la GFP avec le traitement MPTP, c’est-à-dire l’expression du récepteur à la
fractalkine dont le gène rapporteur est sous son contrôle. Or, l’expression de ce récepteur serait
nécessaire aux cellules pro-réparatrices de type M2, et indiquerait une polarisation inverse lorsqu’il y
a perte de son expression comme c’est le cas dans mon modèle199. Ce résultat concorde avec celui
obtenu précédemment dans le laboratoire en utilisant un marquage ionized calcium-binding adapter
molecule 1 (IBa1) ainsi qu’en utilisant plusieurs anticorps en cytométrie de flux11. Dans l’optique de
caractériser l’activation des macrophages résidents, une expérience avec du dextran TexasRed™ a
été faite sur des échantillons d’iléon afin de mesurer l’activité phagocytaire de ces cellules. De
manière surprenante, nous avons plutôt observé une diminution de l’intensité en TexasRed™ chez
ces cellules, indiquant une perte de l’activité phagocytaire par ces dernières après un traitement
MPTP. Ce résultat avait déjà été rapporté dans la littérature par une équipe qui a isolé des
monocytes circulants à partir de sang de patients parkinsoniens et effectué une analyse de
phagocytose avec des billes fluorescentes200. Bien que ce résultat soit sans explication pour l’instant,
il est fort intéressant de constater la concordance entre celui-ci dans un modèle MPTP et chez les
patients parkinsoniens de cette étude en question.
Le modèle MPTP est l’un des plus utilisés dans l’étude de la MP. La dose faible de MPTP entraîne
une baisse de 50% de la production de dopamine dans le striatum, mais aucune altération des corps
cellulaires des neurones DAergiques se trouvant dans la SN11. Ainsi, ce modèle mime un stade
précoce de la MP, ce qui permet d’étudier les mécanismes de dommages neuronaux dans le cadre
de cette maladie, mais aussi d’étudier les évènements immunitaires pouvant être liés à la
progression de la pathologie. Cependant, l’une des faiblesses du modèle MPTP/MPP + est le fait que
celui-ci ne soit pas un modèle chronique de la maladie ; l’action de la neurotoxine étant bien plus
rapide que le développement de la MP qui s’étale sur plusieurs années179.
L’intérêt d’étudier la composante immunitaire de la MP est, d’abord, de caractériser sa réponse afin
de comprendre son rôle dans la MP, et ensuite de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
potentielles pour moduler cette réponse indésirable. Plusieurs études portant sur des traitements
anti-inflammatoires ont été faites chez les patients parkinsoniens, mais les résultats sont
mitigés87,201,202. Une des faiblesses de ces traitements est leurs effets systémiques : ils ne sont pas
assez spécifiques dans leur mécanisme de toxicité. Il importe donc de comprendre les mécanismes
précis prenant place dans l’inflammation parkinsonienne afin de trouver des cibles pouvant moduler
celle-ci précisément.
Mes résultats in vitro vont dans le sens de mon hypothèse de départ selon laquelle la neurotoxine
MPTP, et/ou sa forme toxique le MPP+, pourraient activer directement les cellules immunitaires
innées. Effectivement, les trois types cellulaires immunitaires testés, soit des microglies et des
46
macrophages murins ainsi que des monocytes humains, étaient capable de capter le traceur
fluorescent APP+ en plus des neurones DAergiques. Cela indique que ces cellules seraient aussi
capables de transporter le MPP+ et de voir leur activité modulée par ce dernier. Il s’agit d’un résultat
très intéressant en lien avec la thématique du laboratoire dans la compréhension du rôle de
l’inflammation dans la MP. De plus, aucun autre résultat montrant une activation directe de ces
cellules dans le modèle MPTP ne se retrouve dans la littérature. Peu de données sont disponibles
concernant le(s) transporteur(s) cellulaire(s) par le(s)quel(s) seraient transporté le MPP+. Cependant,
le DAT est pointé du doigt puisque la neurotoxine affecte préférentiellement les neurones
DAergiques. Par contre, les cellules immunitaires n’exprimant pas ce transporteur203, il est possible
que la toxine entre dans les cellules via le SERT puisqu’elles expriment ce dernier204. Bien que cette
question reste sans réponse, mes résultats par cytométrie de flux montrent que le transport de l’APP+
est inhibé lorsque les cellules sont incubées à 4°C. Cette température a la particularité d’inhiber le
transport actif cellulaire205. Ainsi, ces résultats indiquent que c’est par un transport actif que l’APP+
entre dans les cellules. Il faudrait bloquer spécifiquement les NET et les SERT afin d’identifier si un
de ces transporteurs est impliqué dans le transport de l’APP +. Ce même protocole a permis de
mesurer la cinétique de transport du traceur fluorescent par ces mêmes cellules. De manière
intéressante, les cellules ayant le plus de facilité à transporter l’APP + sont les monocytes humains,
bien devant les neurones DAergiques humains. C’est ce même type cellulaire dont la déplétion
partielle chez la souris protège les neurones DAergiques du plexus myentérique lors d’un traitement
MPTP. Une étude de la distribution de l’APP+ par microscopie confocale a permis d’observer une
grande colocalisation de ce traceur avec les mitochondries de différents types cellulaires, ainsi
qu’une colocalisation entre les mitochondries et le stress oxydatif. Cela concorde avec ce qui est
connu du mécanisme de toxicité du MPTP, le MPP+ allant effectivement se localiser dans la
membrane mitochondriale où il inhibe le complexe I de la chaîne respiratoire, créant une crise
énergétique au sein de la cellule menant à un stress oxydatif 181,182. Cependant, l’APP+ n’est pas
toxique pour les cellules comme le montre des mesures de la survie cellulaire et autres données du
laboratoire.
L’étude in vitro de conditionnement de monocytes et neurones DAergiques humains a montré un
résultat des plus intéressants : pour qu’il y ait atteinte des neurones DAergiques suite à un traitement
au MPP+, il doit y avoir la présence de deux composantes: 1) les neurones doivent avoir été en
contact avec le MPP+ 2) les neurones doivent avoir été en contact avec le surnageant de cellules
immunitaires activées par le MPP+. Ce phénomène est résumé et illustré par la figure 34 à la page
suivante. Cette atteinte neuronale est spécifique au traitement MPP+, puisque l’activation des cellules
THP-1 suite aux traitements LPS et MPTP ne suffit pas à induire des dommages aux neurones SHSY5Y même lorsque jumelés à l’exposition de surnageant de cellules THP-1 activées.
Ainsi, en conditions pathologiques, les neurones DAergiques pourraient produire des ROS et autres
molécules suite à un stress ou à une toxine. L’activation des monocytes et des macrophages, quant
à elle, serait conséquente à la présence de stress/toxine, mais aussi en réponse aux signaux
47
neuronaux. Ce résultat met de l’avant l’importance de la réponse immunitaire dans l’atteinte des
neurones DAergiques dans un modèle MPTP.
Figure 30 - Schématisation des effets du MPP+ sur les cellules THP-1 et SH-SY5Y
Catherine F. Lavallée et coll. (article en préparation)
a) Le MPP+ induit l’accumulation de ROS à l’intérieur du cytoplasme de neurones SH-SY5Y suite à l’inhibition du complexe I de la chaîne
respiratoire mitochondriale. Il en résultera une production de NO qui sera relâché dans le milieu extracellulaire. b) Le MPP+ induit l’activation des
cellules THP-1, lesquelles produiront et relâcheront du NO. c) Les 2 conditions illustrées en a et b doivent être réunies pour que les neurones SHSY5Y dégénèrent.
Abréviations: ROS; dérivés réactifs de l’oxygène, NO; oxide nitrique.
Évidemment, ces résultats provenant de lignées cellulaires immortalisées, il est important de garder
en tête les limitations d’un tel modèle. En effet, bien que de telles lignées permettent une certaine
uniformité des résultats au sein de la communauté scientifique, celles-ci ne correspondent pas à la
réalité riche et variée des organismes vivants. De plus, le milieu contrôlé dans lequel les
expérimentations ont lieu est fortement simplifié par rapport au milieu in vivo. Gillet et coll. (2013) ont
d’ailleurs écrit une revue de littérature concernant la complexité de l’utilisation de lignées cellulaires
cancéreuses dans les recherches sur le cancer206.
Après avoir montré l’entrée de l’APP+ dans des cellules en culture, nous avons voulu en faire la
démonstration dans des échantillons d’iléon. Cependant, bien qu’un marquage de neurones du
plexus myentérique soit visible, nous n’avons pu obtenir des images montrant la colocalisation du
traceur et des macrophages résidants. Une problématique rencontrée est la difficulté de séparer le
signal provenant de l’APP+ en cyan et de la GFP en vert chez la souris CX3CR1GFP. L’utilisation d’une
souris transgénique avec un gène rapporteur pour certains types de cellules immunitaires est
nécessaire puisque l’APP+ ne peut être fixé dans le but de faire des marquages histologiques. Nous
prévoyons ainsi utiliser des souris transgéniques avec un gène rapporteur autre que la GFP dans un
proche avenir.
Le mécanisme d’activation des cellules immunitaires par la neurotoxine n’est pas encore bien
compris. Cependant, certains indices pointent vers la voie de l’inflammasome par laquelle les cellules
immunitaires vont sécréter l’IL-1β et l’IL-18167. En effet, nous savons déjà que la réponse immunitaire
passe par la voie MyD88/NF-ĸB11,56. Or, cette voie est liée à l’activation de l’inflammasome 170. Un
48
autre lien intéressant entre la maladie de Parkinson, ainsi que le modèle MPTP, et l’inflammasome
est celui entre le stress oxydatif mitochondriale et l’activation de l’inflammasome NRLP3 171,172.
49
Perspective
Les résultats obtenus dans le cadre de mon projet de recherche ont soulevé plusieurs points qui
restent sans réponse. Ainsi, il serait intéressant de poursuivre dans ces voies pour de futures
recherches au sein du laboratoire.
D’abord, mes résultats ont montré que l’analogue du MPP + emprunte le transport actif de différents
types cellulaires, mais peu d’informations existent concernant l’identification de ces transporteurs. En
effet, alors que chez les neurones DAergiques le transporteur de la dopamine (DAT) est pointé du
doigt, nous savons que les cellules immunitaires n’expriment pas celui-ci. Pourrait-il s’agir dans leur
cas de (NET) ou de (SERT) ? Cela ne serait pas étonnant puisque l’APP+ est connu pour être un
analogue des neurones catécholaminergiques. La neurotoxine pourrait aussi emprunter un autre
transporteur non-identifié.
De plus, des zones sombres restent à éclaircir dans la caractérisation des voies d’activations du
système immunitaire inné du modèle MPTP. Les résultats du laboratoire ont précédemment montré
l’activation de la voie MyD88 dépendante et de la voie NF-ĸB, une activation consistante avec
l’augmentation de la concentration en IL-1β, IL-6 et NO dans le surnageant de cellules en culture. J’ai
par la suite montré la chronologie des évènements immunitaires dans le plexus myentérique suite à
un traitement MPTP. Ces évènements concordent avec des résultats antécédents du laboratoire. De
plus, j’ai démontré la capacité de différents types de cellules immunitaires à capter l’APP +, et ainsi le
MPP+ in vitro. Cependant, malgré une hypothèse du rôle de l’inflammasome dans cette activation,
rien n’est connu de ce côté pour le moment. Il s’agit évidemment d’une piste très intéressante afin de
trouver de nouvelles cibles immuno-modulatrices. Aussi, de récentes publications indiquent le lien
étroit entre le dysfonctionnement des mitochondries en conditions pathologiques et l’activation de
l’inflammasome, plus précisément l’inflammasome NLRP3172,207.
Bien que mes résultats portent spécifiquement sur la périphérie, nous savons que la réponse
immunitaire diffère dans le temps entre le SNE et le SNC. De plus, la déplétion des monocytes proinflammatoires n’avaient pas d’effet protecteur dans le SNC alors que c’était le cas dans le SNE,
sous-entendant une différence marquée entre les phénomènes immunitaires prenant place dans ces
deux tissus distincts11. Évidemment, ces divergences mécanistiques sont importantes dans
l’élaboration de molécules immuno-modulatrices en vue de futurs traitements de la MP.
Une autre voie qui intéresse le laboratoire est l’étude des neurones VIP du plexus myentérique et ce,
pour plusieurs raisons. D’abord, Wakabayashi et coll. (1990) ont montré que les corps de Lewy se
retrouvent, entre autres, dans les neurones VIP de tissus prélevés chez des patients parkinsoniens99.
De plus, notre laboratoire a montré le lien fonctionnel étroit entre ce type neuronal et les neurones
DAergiques par une étude de colocalisation dans le plexus myentérique. Ainsi, 32% des neurones
positifs pour la TH exprimaient aussi le VIP alors que 49% des neurones VIP étaient aussi positifs
pour la TH11. Finalement, ce neuropeptide possèderait des effets neuro-modulateurs et neuroprotecteurs208,209. En ajoutant une composante liée à l’α-syn, grâce à un modèle animal impliquant
51
l’expression de cette protéine mutée, nous nous retrouverions avec un modèle complexe qui inclut
différentes composantes de la MP. Il s’agirait donc de l’α-syn, du VIP et des neurones DAergiques du
plexus myentérique. De plus, un modèle utilisant l’α-syn mutée se rapprocherait davantage de la MP
de par son aspect chronique avec une accumulation de la protéine dans diverses cellules en
comparaison avec le modèle MPTP en usage dans le laboratoire. Il serait ainsi possible d’étudier les
caractéristiques et rôles de la réponse immunitaire innée dans le cadre de ce nouveau modèle.
Finalement, l’étude in vitro de conditionnement ouvre la voie à plusieurs expériences
complémentaires qui seraient pertinentes de réaliser. D’abord, il serait intéressant de mesurer
l’expression de la TH dans les cellules SH-SY5Y suite aux différents traitements du protocole. En
effet, est-ce que le traitement MPP+ seul induit une diminution en TH des neurones DAergiques ? Il
faut savoir que nous ignorons si les neurones DAergiques meurent dans notre modèle MPTP, mais
peut-être sont-ils endommagés et non-fonctionnels. Aussi, dans le cadre de l’hypothèse de Braak, il
serait fort pertinent de tester une condition mixte : l’activation des cellules THP-1 par la LPS, et
l’incubation des cellules SH-SY5Y avec le MPP+. De cette manière, nous mimerions une condition où
la présence de bactéries (p. ex. suite à une hyperperméabilité de la barrière épithéliale) serait
simultanée à une atteinte des neurones DAergiques tel que le propose le Dr Braak. En ajout à cela, il
serait fort pertinent de reproduire ces résultats en utilisant des cultures primaires, provenant du
plexus myentérique de souris ou d’humain, afin de parer aux limitations de l’utilisation d’un modèle
de lignées cellulaires immortalisées. Cela serait effectivement une étape supplémentaire vers un
modèle translationnel de la MP.
Plus généralement, mes résultats, ainsi que ceux obtenus précédemment par Mélissa Côté,
suggèrent une avenue intéressante pour une stratégie thérapeutique de la MP basée sur des
molécules anti-inflammatoires. Celles-ci pourraient effectivement se montrer utiles afin de contrer les
symptômes non-moteurs ressentis par les patients parkinsoniens dans les stades précoces de la
maladie. En effet, l’importance du système immunitaire inné a été démontrée dans la progression de
la MP dans notre modèle MPTP chez la souris et sur des cellules immunitaires et neuronales en
culture. Pour conclure, le développement d’un mécanisme médicamenteux efficace et précoce contre
cette maladie doit considérer l’importance de la participation immunitaire de l’organisme à celle-ci. En
précisant le comportement du système immunitaire ainsi que son implication dans le cadre de la MP,
il sera possible de se rapprocher de la compréhension étiologique de la MP… puis de trouver des
cibles thérapeutiques.
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