Comment doser simultanément par cytométrie en flux six cytokines

Journée thématique de l’Association française de cytométrie
Microbilles et cytométrie : de l’analyse cellulaire à l’analyse moléculaire
Institut Curie, Paris, 17 janvier 2003
Comment doser simultanément par cytométrie
en flux six cytokines sécrétées
dans seulement 25 µL d’échantillon ?
G. Pinna
1
J.-M. Reimund
1,2
C.D. Muller
1
1
Pharmacologie et physico-chimie des
interactions cellulaires et moléculaires
(UMR 7034 du CNRS), Université Louis
Pasteur de Strasbourg.
[email protected]
2
Service d’hépatogastroentérologie
et d’assistance nutritive,
Hôpitaux Universitaires de Strasbourg
Résumé. Des travaux récents réalisés chez l’homme ou dans des modèles
expérimentaux chez l’animal, ont identifié certains médiateurs inflammatoires
et/ou immunitaires clés du développement et/ou de l’entretien de maladies
inflammatoires chroniques (maladie de Crohn, polyarthrite rhumatoïde, sclé-
rose en plaque, maladie d’Alzheimer). Il en est ainsi, par exemple, de cytokines
pro-inflammatoires (TNFa, IL-1b, IL-6), régulatrices (IL-12) ou anti-
inflammatoires (IL-10), ou de certaines chimiokines (IL-8), sécrétées au niveau
des sites inflammatoires. Les systèmes contrôlant la production de ces média-
teurs apparaissent comme autant de cibles thérapeutiques potentielles pour le
traitement de ces affections. Pour tester rapidement le profil anti-inflammatoire
de nouvelles substances obtenues par criblage de chimiothèque (composés de
synthèse ou extraits naturels de plantes), il peut être nécessaire et utile de
pouvoir doser simultanément ces cytokines et ceci dans un volume minimal de
surnageant cellulaire. C’est ainsi qu’ont été mis à disposition récemment des
tests Elisa dont le coating n’est plus fait sur une plaque à 96 puits mais sur des
billes de latex dont l’intensité de fluorescence intrinsèque de chacune corres-
pond à sa cytokine, alors qu’une deuxième fluorescence de couleur différente
va correspondre à la quantité de protéine détectée. Nous avons comparé les
résultats obtenus par l’un de ces tests, le kit CBA (cytometric bead array) à
ceux d’un Elisa sandwich classique. Le coût non négligeable du kit CBA est
amorti par la simultanéité du dosage des six cytokines d’intérêt et le faible
volume de surnageant cellulaire nécessaire au dosage. Les courbes effets doses
et les CI
50
calculées donnent des résultats très équivalents. Si la mise en œuvre
de ces dosages CBA paraît délicate au premier abord, l’expérience montre que
cette technique s’avère être fiable et présente de nombreux avantages dans
l’évaluation du profil d’activités de certains composés.
Mots clés : cytokine, cytométrie en flux, inflammation, immunosuppresseur,
microbille
Summary. Inflammatory and regulatory or anti-inflammatory cytokines
(TNFa, IL-1b, -6, -8, -10 and -12) regulate both the humoral and cellular
immune responses. Cytokines have diverse peripheral and central functions.
They are critical mediators of protective host responses, including defense
against microbial invasion and tumorigenesis. However, the production of spe-
cific proinflammatory cytokines must be tightly regulated and compartmentali-
zed to prevent the overexpression of these molecules that can end in chronic
inflammation and tissue injury. Many diseases like autoimmune disease (rheu-
matoid arthritis, multiple sclerosis, arteriosclerosis, Crohn’s disease), neuro-
dossier abc
Ann Biol Clin 2004, 62 : 59-63
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004 59
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degenerative disease (Alzheimer’s and Parkinson’s disease), tumor invasion
and metastasis correlate with a deregulation in cytokine action. Thus, cytokines
network provides an attractive and intensely competitive area of potential
targets for therapeutic intervention. To monitor such secretion patterns in pre-
sence of putative drugs obtained by high throughput screening (HTS) some
new techniques recently appeared on the market. We here compared results
obtained by CBA (BD™ Cytometric Bead Array) to IC50 values obtained by
classical sandwich Elisa. The complexity and cost of this new method is largely
compensated by simultaneous testing of 6 cytokines in only 25 µL of cell
supernatant.
Key words: cytokine, flow cytometry, inflammation, immunosuppression,
microsphere
Si l’étiologie des maladies inflammatoires chroniques de-
meure le plus souvent inconnue, de nombreux travaux
réalisés au cours des dernières années ont permis d’identi-
fier certaines étapes clés du développement et surtout de
l’entretien de la réponse inflammatoire et immunitaire au
cours de ces affections. Elles se traduisent très schémati-
quement par une activation dérégulée de certaines cellules
résidentes sur les lieux de l’inflammation (cellules mono-
nucléées : lymphocytes et macrophages) sécrétrices de cy-
tokines pro-inflammatoires (principalement, mais non ex-
clusivement, l’IL-1b, l’IL-6, l’IL-8 et le TNFa). Ces
médiateurs de l’inflammation sont alors capables d’in-
duire, outre leur propre production, le recrutement et l’ac-
tivation d’autres cellules immunocompétentes circulantes
(monocytes, lymphocytes, polynucléaires neutrophiles)
accompagnée d’une production de certaines protéases ou
encore d’espèces réactives de l’oxygène. Ces derniers sont
directement responsables de dommages tissulaires d’une
part, et de l’entretien de l’inflammation par des mécanis-
mes de rétroaction positive sur la production des cytoki-
nes, d’autre part (figure 1). Parmi les nombreux média-
teurs mis en cause dans la pathogénie des maladies
inflammatoires chroniques, le facteur nécrosant les tu-
meurs (tumor necrosis factor-alpha ou TNFa) est apparu
comme l’une des cibles privilégiées de leur traitement.
Cette hypothèse, basée initialement sur des observations
in vitro ou ex vivo [1, 2], a été largement confirmée depuis
par les réponses thérapeutiques rapportées avec l’utilisa-
tion des récepteurs solubles pour le TNFa, ou encore celle
des anticorps neutralisants (anticorps anti-TNFa), dans des
affections comme la polyarthrite rhumatoïde, l’arthrite
chronique juvénile ou la MC [3].
Dans le cadre de la recherche de nouvelles molécules
anti-TNFanous avons testé une molécule originale, le
célastrol, dont certains dérivés ont été utilisés occasionnel-
lement comme médicaments anti-inflammatoires en méde-
cine traditionnelle. Le célastrol est extrait d’une plante
chinoise Trypterigium wilfordii Hook F. Ce triterpène
pentacyclique est un immunomodulateur potentiel
puisqu’il possède une activité anti-oxydante, et plus parti-
culièrement anti-peroxydante [4, 5]. Ces propriétés anti-
oxydantes permettent en théorie, en diminuant l’activation
du facteur transcriptionnel NF-jB par les espèces réacti-
ves de l’oxygène, d’inhiber la production des cytokines
dont l’activation dépend en partie du NF-jB.
Parallèlement à ce travail, nous avons réalisé le criblage
d’une chimiothèque à la recherche d’autres molécules ou
familles de molécules modulant la production du TNFaet
de l’IL-1bpar les PBMC (résultats non exposés ici). Ce
criblage a été effectué par des tests Elisa classiques et
quelques composés sélectionnés ont été caractérisés plus
avant pour leur profil anti-inflammatoire (action sur la
sécrétion de cytokines induite par LPS) par le kit CBA.
Tirés à part : C. Muller
Cellules effectrices
(synoviocytes,
fibroblastes...)
Diapédèse
Monocytes
IL-8
TNFα
IL-1β
Métalloprotéases,
NO, espèces
réactives de l'O
2
Dégradations
tissulaires
TNFα
IL-1β
TNFα
IL-1β
TNFα
IL-6
(résistance à l'apoptose)
Macrophage
Lymphocyte
Phénotype TH1
entretien du cycle
Agression PNN
PNN
Figure 1. Représentation schématique de quelques étapes de la
réponse inflammatoire et immunitaire.
dossier
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Dans la figure 2, représentation schématique de l’Elisa
sandwich et des billes CBA (cell bead array), on s’aper-
çoit que le principe de dosage des deux tests est similaire :
le support de la plaque à 96 puits est remplacé tout simple-
ment par le support de la bille de latex. La sensibilité reste
donc entièrement liée à l’affinité des couples d’anticorps
utilisés et dans le cas du kit CBA est augmentée par l’utili-
sation d’un rapporteur fluorescent vert. Les différentes po-
pulations de billes, donc de cytokines, sont différenciées
par le cytomètre à l’aide des différences d’intensité de
fluorescence dans le canal rouge.
Matériels et méthodes
Nature des cellules utilisées
La sécrétion des cytokines a été dosée dans des surna-
geants d’incubation de cellules mononucléées du sang vei-
neux périphérique (PBMC) de donneurs sains humains.
Tous les prélèvements de sang ont été réalisés au service
d’hépato-gastro-entérologie et d’assistance nutritive des
hôpitaux universitaires de Strasbourg (hôpital de Haute-
pierre), après approbation du protocole d’étude concer-
nant les effets du célastrol par le CCPPRB n° 1 d’Alsace.
Isolement et incubation
des cellules mononucléées et du sang total
Chez des volontaires sains, 20 mL de sang veineux péri-
phérique sont prélevés le matin à jeun sur héparine. Le
sang est ensuite dilué au demi dans une solution saline
équilibrée de Hank’s dépourvue en Ca
2+
et en Mg
2+
(HBSS-CMF, Gibco BRL, Cergy, France) additionnée de
pénicilline-streptomycine 100 UI/mL (Biochrom KG, Ber-
lin, Allemagne). Les cellules mononucléées (lymphocytes
et monocytes) sont alors séparées par centrifugation sur
Ficoll-Histopaque de densité 1,076 (Sigma, L’Isle
d’Abeau-Chesnes, France) (30 min à 400 g) selon la tech-
nique de Bøyum [6], puis, après deux lavages successifs,
resuspendues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL)
additionné de 10 % (volume/volume) de sérum de veau
fœtal (SVF) inactivé à la chaleur (56 °C, 30 min, Gibco
BRL), et d’antibiotiques (pénicilline/streptomycine
100 UI/mL). Les cellules sont incubées, à raison de
2×10
5
cellules/puits des plaques de 24 puits (Corning
Inc, New York), à 37 °C dans un incubateur humidifié (air
95%–CO
2
5 %), en présence ou en absence des compo-
sés étudiés dilués dans du DMSO (diméthyl sulfoxyde,
Sigma ; maximum : 1 % (v/v) par puits), avec ou sans
activation par lipopolysaccharide (LPS Salmonella abor-
tus equi, 5 µg/mL) (Sigma). Après 24 heures d’incubation,
les plaques sont centrifugées (15 min à 200 g), et les sur-
nageants prélevés puis congelés à – 80 °C jusqu’au dosage
Elisa. Le célastrol nous a été gracieusement fourni par le
professeur Allison (DAWA Inc, Belmont, CA, États-Unis).
Test de viabilité cellulaire
Les culots cellulaires (PBMC et sang total) contenus dans
les plaques de culture sont resuspendus dans du RPMI
1640 additionné de XTT (1 mg/mL, Sigma), et de phéna-
zine méthosulfate (1,25 mM, Sigma). Les plaques sont
incubées 4 heures, puis lues en absorbance à 450 nm (fil-
tre de référence : 620 nm). La viabilité cellulaire est esti-
mée par rapport aux puits de référence (maximum de via-
bilité) après soustraction de l’absorption propre du milieu
(milieu sans cellules).
Test Elisa
Les concentrations d’IL-8, d’IL-6, d’IL-1bet de TNFa
dans les milieux de culture sont déterminées par des tests
immunoenzymatiques Elisa spécifiques. Brièvement, des
plaques 96 puits (Corning Inc.) sont traitées par 50 mL/
puits d’une solution du premier anticorps monoclonal de
capture (Antibody Solutions, Half Moon Bay, CA, États-
Unis) (5 µg/mL) dilué dans du PBS/thimérosal 0,05 %
(poids/volume) (Sigma).Après une nuit d’incubation, scel-
lées hermétiquement et à 4 °C, les plaques sont lavées
trois fois et les sites de fixation non spécifique saturés par
Elisa sandwich
lavagelavage
E
lavage
100 101 102 103 104100 101 102 103 104
100 101 102 103 104
FL3-height FL2-height
0 10 20 30
Counts
FL3-height
IL-12p70
TNF
IL-10IL-6
IL-1ß
IL-8
Cytometric bead array
1er anticorps + échantillon à doser + 2e anticorps-enzyme
Figure 2. Représentation schématique comparée de l’Elisa sand-
wich et des billes CBA. Si le principe de capture de l’antigène
(c’est-à-dire la cytokine à doser) reste le même dans les deux
tests, les différentes cytokines sont séparées par la fluorescence
(FL3) respective de leur bille comme l’illustre bien l’histogramme
(en bas à gauche). La quantité de cytokine sécrétée est alors
dosée par le taux de fluorescence jaune-orangé (FL2) associé au
deuxième anticorps de révélation comme le montre le cyto-
gramme (en bas à droite).
Dosage des cytokines par cytométrie en flux
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incubation durant 1 heure à température ambiante en pré-
sence de PBS/lait 5 % (poids/volume). Après trois lavages
supplémentaires, 25 µL d’échantillon, ou de cytokines re-
combinantes humaines servant à l’établissement de la
gamme étalon (Pharma Biotechnologies, Hannover, Alle-
magne pour l’h-IL-1b; R&D Systems Europe, Abingdon,
UK pour l’h-IL-6, l’h-IL-8 et l’h-TNFa) additionnés de
25 µL d’une solution d’anticorps biotinylé (Antibody So-
lutions, Half Moon Bay, CA, États-Unis) (2 µg/mL) sont
déposés en double dans chaque puits, et les plaques in-
cubées 2 heures à température ambiante. Après lavages,
50 µL d’une solution de streptavidine-HR-peroxydase (Zy-
med, San Francisco, CA, États-Unis) diluée au 1/3 000
dans du PBS sont déposés dans chaque puits.Après 1 heure
d’incubation à température ambiante, la réaction enzyma-
tique est révélée par du dichlorate d’O-phénylènediamine
(OPD SigmaFast, Sigma) déposé après 4 lavages supplé-
mentaires. La lecture s’effectue par mesure de la densité
optique (DO) à 450 nm au spectrophotomètre d’absorp-
tion (filtre de référence : 620 nm). La concentration en
cytokines est déterminée par interpolation à partir de la
gamme étalon, et les résultats normalisés par rapport au
contrôle.
Test microbilles CBA
Les cytokines sont dosées dans 25 à 50 µL de surnageant
d’incubation cellulaire, suivant le protocole décrit par le
fabriquant du Kit CBA (BD Bioscience, San Diego, États-
Unis).
Statistiques
Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la
valeur de référence (production de la cytokine étudiée en
présence de LPS). Compte tenu du faible nombre d’échan-
tillons, les résultats ont été analysés par des tests non
paramétriques (Kruskal-Wallis). La significativité statisti-
que est définieàp=0,05.
Courbes dose-réponses
Les courbes dose-réponses ont été ajustées à l’aide du
logiciel Prism (GraphPad Software, Inc San Diego, CA,
États-Unis).
Pourcentage de sécrétion maximale
de TNFα induite par LPS
120
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
00,1 1 10 100 1 000
0,01 0,1 1 10 100 1 000
Test
Kit CBA
(n = 1 donneur)
Elisa classique
(n = 9 donneurs)
Valeur Cl50
25 nM
intervalle de confiance (95 %) : 20 à 30 nM
11,4 ± 1,8 nM
TNF α
Célastrol nM Célastrol nM
ab
Figure 3. Valeur des CI
50
obtenues pour les PBMC par Elisa
sandwich (a) et kit CBA (b).
0 %
50 %
100 %
0,01 0,1 1 10 100 1 000
A02
IL-10
IL-12
IL-1β
IL-6
IL-8
TNFα
[Composé AO2] en µM
Composés Cl50 sécrétion TNFαR
AO2
AO3
AO4
AO5
50 ± 60 µM
30 ± 2 µM
25 ± 9 µM
36 ± 16 µM
0,999
0,982
0,980
0,982
Figure 4. Exemple de courbes effets doses obtenues pour le
composé A02 de la chimiothèque par dosage simultané de six
cytokines inflammatoires par les kits CBA. On remarque par
exemple que cette molécule n’a aucune activité inhibitrice ou
activatrice de l’IL-6. Tableau des CI
50
obtenues par kit CBA
permettant de comparer rapidement divers composés.
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Résultats
Elisa versus CBA
Le célastrol a montré dans nos expériences une forte acti-
vité inhibitrice de la sécrétion de TNFa, d’IL-1b, d’IL-6 et
d’IL-8 par des cellules mononucléées de sang veineux
périphérique humain (PBMC) après activation par LPS
(résultats non présentés ici). Cette molécule nous a servi à
comparer les deux techniques dans le cas par exemple du
dosage du TNFa(figure 3). La valeur des CI
50
obtenues
reste très comparable et la méthode CBA est très satisfai-
sante vue la rapidité et le peu de volume du prélèvement
sanguin nécessaire à la préparation et au dosage des six
cytokines en parallèle. Lorsque nous comparons dans la
figure 3 les courbes effets doses obtenues avec les deux
techniques (expérience et donneur de sang différents) on
constate une adéquation satisfaisante des CI
50
obtenues
par les deux techniques.
Caractérisation de composés anti-inflammatoires
obtenus par criblage de chimiothèque
Nous avons réalisé le criblage d’une chimiothèque à la
recherche d’autres molécules modulant la production du
TNFapar les PBMC. Ce criblage a été effectué par test
Elisa classique (résultats non présentés ici) et les compo-
sés sélectionnés ont été caractérisés plus avant pour leur
profil anti-inflammatoire (action sur la sécrétion de cytoki-
nes induite par LPS) grâce au kit CBA (exemple donné en
figure 4). Nous avons ainsi dosé quatre molécules en cour-
bes dose-réponses de manière simultanée sur un unique
donneur (20 mL de sang) ce qui permet de comparer rapi-
dement les quatre composés sans être dépendant des varia-
tions de réponses entre donneurs.
Conclusion
Le coût relativement onéreux du dosage des cytokines par
le kit CBA s’efface rapidement devant la possibilité de
doser simultanément six cytokines d’intérêt. De plus, cette
technique est particulièrement appropriée aux protocoles
expérimentaux ne générant que de faibles volumes de sur-
nageants d’incubations, comme c’est le cas lors d’un cri-
blage sur cultures miniaturisées. Notre travail indique une
très bonne corrélation entre les résultats obtenus en test
Elisa et en CBA. Cette dernière technique, de mise en
œuvre rapide, s’avère donc être particulièrement fiable et
présente de nombreux avantages dans l’évaluation du pro-
fil d’activités de certains composés.
Références
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cytokine production by intestinal biopsies in patients with ulcerative
colitis and Crohn’s disease. J Clin Immunol 1996 ; 16 : 144-50.
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in the treatment of Crohn’s disease. Aliment Pharmacol Ther 2002 ; 16 :
1579-90.
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Crohn’s disease and rheumatoid arthritis. BioDrugs 2002 ; 16 : 111-48.
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inhibitors. Part I : triterpenes. Bioorg Med Chem Lett 1998 ; 8 : 1883-6.
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Part III : truncated analogs of tripterine. Bioorg Med Chem Lett 1998 ;
8 : 3659-64.
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man blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of
granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.
Scand J Clin Lab Invest 1968 ; 97 (Suppl) : 77-89.
Dosage des cytokines par cytométrie en flux
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004 63
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