Comment doser simultanément par cytométrie en flux six cytokines

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dossier
Ann Biol Clin 2004, 62 : 59-63
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017.
Journée thématique de l’Association française de cytométrie
Microbilles et cytométrie : de l’analyse cellulaire à l’analyse moléculaire
Institut Curie, Paris, 17 janvier 2003
Comment doser simultanément par cytométrie
en flux six cytokines sécrétées
dans seulement 25 µL d’échantillon ?
G. Pinna1
J.-M. Reimund1,2
C.D. Muller1
1
Pharmacologie et physico-chimie des
interactions cellulaires et moléculaires
(UMR 7034 du CNRS), Université Louis
Pasteur de Strasbourg.
[email protected]
2
Service d’hépatogastroentérologie
et d’assistance nutritive,
Hôpitaux Universitaires de Strasbourg
Résumé. Des travaux récents réalisés chez l’homme ou dans des modèles
expérimentaux chez l’animal, ont identifié certains médiateurs inflammatoires
et/ou immunitaires clés du développement et/ou de l’entretien de maladies
inflammatoires chroniques (maladie de Crohn, polyarthrite rhumatoïde, sclérose en plaque, maladie d’Alzheimer). Il en est ainsi, par exemple, de cytokines
pro-inflammatoires (TNFa, IL-1b, IL-6), régulatrices (IL-12) ou antiinflammatoires (IL-10), ou de certaines chimiokines (IL-8), sécrétées au niveau
des sites inflammatoires. Les systèmes contrôlant la production de ces médiateurs apparaissent comme autant de cibles thérapeutiques potentielles pour le
traitement de ces affections. Pour tester rapidement le profil anti-inflammatoire
de nouvelles substances obtenues par criblage de chimiothèque (composés de
synthèse ou extraits naturels de plantes), il peut être nécessaire et utile de
pouvoir doser simultanément ces cytokines et ceci dans un volume minimal de
surnageant cellulaire. C’est ainsi qu’ont été mis à disposition récemment des
tests Elisa dont le coating n’est plus fait sur une plaque à 96 puits mais sur des
billes de latex dont l’intensité de fluorescence intrinsèque de chacune correspond à sa cytokine, alors qu’une deuxième fluorescence de couleur différente
va correspondre à la quantité de protéine détectée. Nous avons comparé les
résultats obtenus par l’un de ces tests, le kit CBA (cytometric bead array) à
ceux d’un Elisa sandwich classique. Le coût non négligeable du kit CBA est
amorti par la simultanéité du dosage des six cytokines d’intérêt et le faible
volume de surnageant cellulaire nécessaire au dosage. Les courbes effets doses
et les CI50 calculées donnent des résultats très équivalents. Si la mise en œuvre
de ces dosages CBA paraît délicate au premier abord, l’expérience montre que
cette technique s’avère être fiable et présente de nombreux avantages dans
l’évaluation du profil d’activités de certains composés.
Mots clés : cytokine, cytométrie en flux, inflammation, immunosuppresseur,
microbille
Summary. Inflammatory and regulatory or anti-inflammatory cytokines
(TNFa, IL-1b, -6, -8, -10 and -12) regulate both the humoral and cellular
immune responses. Cytokines have diverse peripheral and central functions.
They are critical mediators of protective host responses, including defense
against microbial invasion and tumorigenesis. However, the production of specific proinflammatory cytokines must be tightly regulated and compartmentalized to prevent the overexpression of these molecules that can end in chronic
inflammation and tissue injury. Many diseases like autoimmune disease (rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, arteriosclerosis, Crohn’s disease), neuro-
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004
59
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degenerative disease (Alzheimer’s and Parkinson’s disease), tumor invasion
and metastasis correlate with a deregulation in cytokine action. Thus, cytokines
network provides an attractive and intensely competitive area of potential
targets for therapeutic intervention. To monitor such secretion patterns in presence of putative drugs obtained by high throughput screening (HTS) some
new techniques recently appeared on the market. We here compared results
obtained by CBA (BD™ Cytometric Bead Array) to IC50 values obtained by
classical sandwich Elisa. The complexity and cost of this new method is largely
compensated by simultaneous testing of 6 cytokines in only 25 µL of cell
supernatant.
Key words: cytokine, flow cytometry, inflammation, immunosuppression,
microsphere
Si l’étiologie des maladies inflammatoires chroniques demeure le plus souvent inconnue, de nombreux travaux
réalisés au cours des dernières années ont permis d’identifier certaines étapes clés du développement et surtout de
l’entretien de la réponse inflammatoire et immunitaire au
cours de ces affections. Elles se traduisent très schématiquement par une activation dérégulée de certaines cellules
résidentes sur les lieux de l’inflammation (cellules mononucléées : lymphocytes et macrophages) sécrétrices de cytokines pro-inflammatoires (principalement, mais non exclusivement, l’IL-1b, l’IL-6, l’IL-8 et le TNFa). Ces
médiateurs de l’inflammation sont alors capables d’induire, outre leur propre production, le recrutement et l’activation d’autres cellules immunocompétentes circulantes
(monocytes, lymphocytes, polynucléaires neutrophiles)
accompagnée d’une production de certaines protéases ou
encore d’espèces réactives de l’oxygène. Ces derniers sont
directement responsables de dommages tissulaires d’une
part, et de l’entretien de l’inflammation par des mécanismes de rétroaction positive sur la production des cytokines, d’autre part (figure 1). Parmi les nombreux médiateurs mis en cause dans la pathogénie des maladies
inflammatoires chroniques, le facteur nécrosant les tumeurs (tumor necrosis factor-alpha ou TNFa) est apparu
comme l’une des cibles privilégiées de leur traitement.
Cette hypothèse, basée initialement sur des observations
in vitro ou ex vivo [1, 2], a été largement confirmée depuis
par les réponses thérapeutiques rapportées avec l’utilisation des récepteurs solubles pour le TNFa, ou encore celle
des anticorps neutralisants (anticorps anti-TNFa), dans des
affections comme la polyarthrite rhumatoïde, l’arthrite
chronique juvénile ou la MC [3].
Dans le cadre de la recherche de nouvelles molécules
anti-TNFa nous avons testé une molécule originale, le
célastrol, dont certains dérivés ont été utilisés occasionnelTirés à part : C. Muller
60
lement comme médicaments anti-inflammatoires en médecine traditionnelle. Le célastrol est extrait d’une plante
chinoise Trypterigium wilfordii Hook F. Ce triterpène
pentacyclique est un immunomodulateur potentiel
puisqu’il possède une activité anti-oxydante, et plus particulièrement anti-peroxydante [4, 5]. Ces propriétés antioxydantes permettent en théorie, en diminuant l’activation
du facteur transcriptionnel NF-jB par les espèces réactives de l’oxygène, d’inhiber la production des cytokines
dont l’activation dépend en partie du NF-jB.
Parallèlement à ce travail, nous avons réalisé le criblage
d’une chimiothèque à la recherche d’autres molécules ou
familles de molécules modulant la production du TNFa et
de l’IL-1b par les PBMC (résultats non exposés ici). Ce
criblage a été effectué par des tests Elisa classiques et
quelques composés sélectionnés ont été caractérisés plus
avant pour leur profil anti-inflammatoire (action sur la
sécrétion de cytokines induite par LPS) par le kit CBA.
IL-8
Monocytes
PNN
Agression
Diapédèse
TNFα
Macrophage
TNFα
IL-1β
Lymphocyte
Phénotype TH1
entretien du cycle
TNFα
IL-1β
Cellules effectrices
(synoviocytes,
fibroblastes...)
IL-6
(résistance à l'apoptose)
PNN
TNFα
IL-1β
Métalloprotéases,
NO, espèces
réactives de l'O 2
Dégradations
tissulaires
Figure 1. Représentation schématique de quelques étapes de la
réponse inflammatoire et immunitaire.
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004
Dosage des cytokines par cytométrie en flux
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004
Elisa sandwich
E
lavage
1er anticorps
lavage
+ 2e anticorps-enzyme
+ échantillon à doser
Cytometric bead array
30
104
lavage
IL-12p70
100
101
102
FL3-height
103
104
103
102
101
100
IL-8
FL3-height
IL-1ß
TNF
IL-10
IL-6
20
Isolement et incubation
des cellules mononucléées et du sang total
Chez des volontaires sains, 20 mL de sang veineux périphérique sont prélevés le matin à jeun sur héparine. Le
sang est ensuite dilué au demi dans une solution saline
équilibrée de Hank’s dépourvue en Ca2+ et en Mg2+
(HBSS-CMF, Gibco BRL, Cergy, France) additionnée de
pénicilline-streptomycine 100 UI/mL (Biochrom KG, Berlin, Allemagne). Les cellules mononucléées (lymphocytes
et monocytes) sont alors séparées par centrifugation sur
Ficoll-Histopaque de densité 1,076 (Sigma, L’Isle
d’Abeau-Chesnes, France) (30 min à 400 g) selon la technique de Bøyum [6], puis, après deux lavages successifs,
resuspendues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL)
additionné de 10 % (volume/volume) de sérum de veau
fœtal (SVF) inactivé à la chaleur (56 °C, 30 min, Gibco
BRL), et d’antibiotiques (pénicilline/streptomycine
100 UI/mL). Les cellules sont incubées, à raison de
2 × 105 cellules/puits des plaques de 24 puits (Corning
Inc, New York), à 37 °C dans un incubateur humidifié (air
95 % – CO2 5 %), en présence ou en absence des composés étudiés dilués dans du DMSO (diméthyl sulfoxyde,
Sigma ; maximum : 1 % (v/v) par puits), avec ou sans
activation par lipopolysaccharide (LPS Salmonella abortus equi, 5 µg/mL) (Sigma). Après 24 heures d’incubation,
les plaques sont centrifugées (15 min à 200 g), et les surnageants prélevés puis congelés à – 80 °C jusqu’au dosage
Elisa. Le célastrol nous a été gracieusement fourni par le
professeur Allison (DAWA Inc, Belmont, CA, États-Unis).
Counts
Nature des cellules utilisées
La sécrétion des cytokines a été dosée dans des surnageants d’incubation de cellules mononucléées du sang veineux périphérique (PBMC) de donneurs sains humains.
Tous les prélèvements de sang ont été réalisés au service
d’hépato-gastro-entérologie et d’assistance nutritive des
hôpitaux universitaires de Strasbourg (hôpital de Hautepierre), après approbation du protocole d’étude concernant les effets du célastrol par le CCPPRB n° 1 d’Alsace.
Test Elisa
Les concentrations d’IL-8, d’IL-6, d’IL-1b et de TNFa
dans les milieux de culture sont déterminées par des tests
immunoenzymatiques Elisa spécifiques. Brièvement, des
plaques 96 puits (Corning Inc.) sont traitées par 50 mL/
puits d’une solution du premier anticorps monoclonal de
capture (Antibody Solutions, Half Moon Bay, CA, ÉtatsUnis) (5 µg/mL) dilué dans du PBS/thimérosal 0,05 %
(poids/volume) (Sigma). Après une nuit d’incubation, scellées hermétiquement et à 4 °C, les plaques sont lavées
trois fois et les sites de fixation non spécifique saturés par
10
Matériels et méthodes
Test de viabilité cellulaire
Les culots cellulaires (PBMC et sang total) contenus dans
les plaques de culture sont resuspendus dans du RPMI
1640 additionné de XTT (1 mg/mL, Sigma), et de phénazine méthosulfate (1,25 mM, Sigma). Les plaques sont
incubées 4 heures, puis lues en absorbance à 450 nm (filtre de référence : 620 nm). La viabilité cellulaire est estimée par rapport aux puits de référence (maximum de viabilité) après soustraction de l’absorption propre du milieu
(milieu sans cellules).
0
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Dans la figure 2, représentation schématique de l’Elisa
sandwich et des billes CBA (cell bead array), on s’aperçoit que le principe de dosage des deux tests est similaire :
le support de la plaque à 96 puits est remplacé tout simplement par le support de la bille de latex. La sensibilité reste
donc entièrement liée à l’affinité des couples d’anticorps
utilisés et dans le cas du kit CBA est augmentée par l’utilisation d’un rapporteur fluorescent vert. Les différentes populations de billes, donc de cytokines, sont différenciées
par le cytomètre à l’aide des différences d’intensité de
fluorescence dans le canal rouge.
100
101
102
103
104
FL2-height
Figure 2. Représentation schématique comparée de l’Elisa sandwich et des billes CBA. Si le principe de capture de l’antigène
(c’est-à-dire la cytokine à doser) reste le même dans les deux
tests, les différentes cytokines sont séparées par la fluorescence
(FL3) respective de leur bille comme l’illustre bien l’histogramme
(en bas à gauche). La quantité de cytokine sécrétée est alors
dosée par le taux de fluorescence jaune-orangé (FL2) associé au
deuxième anticorps de révélation comme le montre le cytogramme (en bas à droite).
61
incubation durant 1 heure à température ambiante en présence de PBS/lait 5 % (poids/volume). Après trois lavages
supplémentaires, 25 µL d’échantillon, ou de cytokines recombinantes humaines servant à l’établissement de la
gamme étalon (Pharma Biotechnologies, Hannover, Allemagne pour l’h-IL-1b ; R&D Systems Europe, Abingdon,
UK pour l’h-IL-6, l’h-IL-8 et l’h-TNFa) additionnés de
25 µL d’une solution d’anticorps biotinylé (Antibody Solutions, Half Moon Bay, CA, États-Unis) (2 µg/mL) sont
déposés en double dans chaque puits, et les plaques incubées 2 heures à température ambiante. Après lavages,
50 µL d’une solution de streptavidine-HR-peroxydase (Zymed, San Francisco, CA, États-Unis) diluée au 1/3 000
dans du PBS sont déposés dans chaque puits. Après 1 heure
d’incubation à température ambiante, la réaction enzymatique est révélée par du dichlorate d’O-phénylènediamine
(OPD SigmaFast, Sigma) déposé après 4 lavages supplémentaires. La lecture s’effectue par mesure de la densité
optique (DO) à 450 nm au spectrophotomètre d’absorption (filtre de référence : 620 nm). La concentration en
cytokines est déterminée par interpolation à partir de la
gamme étalon, et les résultats normalisés par rapport au
contrôle.
Test microbilles CBA
Les cytokines sont dosées dans 25 à 50 µL de surnageant
d’incubation cellulaire, suivant le protocole décrit par le
fabriquant du Kit CBA (BD Bioscience, San Diego, ÉtatsUnis).
présence de LPS). Compte tenu du faible nombre d’échantillons, les résultats ont été analysés par des tests non
paramétriques (Kruskal-Wallis). La significativité statistique est définie à p = 0,05.
Courbes dose-réponses
Les courbes dose-réponses ont été ajustées à l’aide du
logiciel Prism (GraphPad Software, Inc San Diego, CA,
États-Unis).
A02
IL-10
IL-1β
IL-8
IL-12
IL-6
TNFα
100 %
50 %
0%
0,01
0,1
1
10
100
[Composé AO2] en µM
1 000
Statistiques
Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à la
valeur de référence (production de la cytokine étudiée en
Pourcentage de sécrétion maximale
de TNFα induite par LPS
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dossier
120
a
100
100
b
80
Cl50 sécrétion TNFα
R
AO2
50 ± 60 µM
0,982
AO3
30 ± 2 µM
0,999
AO4
36 ± 16 µM
0,980
AO5
25 ± 9 µM
0,982
80
60
60
40
40
20
20
0
0,01
0,1
1
10 100
Célastrol nM
Test
1 000
0
TNFα
0,1
1 10 100 1 000
Célastrol nM
Valeur Cl50
Kit CBA
25 nM
(n = 1 donneur)
intervalle de confiance (95 %) : 20 à 30 nM
Elisa classique
(n = 9 donneurs)
11,4 ± 1,8 nM
Figure 3. Valeur des CI50 obtenues pour les PBMC par Elisa
sandwich (a) et kit CBA (b).
62
Composés
Figure 4. Exemple de courbes effets doses obtenues pour le
composé A02 de la chimiothèque par dosage simultané de six
cytokines inflammatoires par les kits CBA. On remarque par
exemple que cette molécule n’a aucune activité inhibitrice ou
activatrice de l’IL-6. Tableau des CI50 obtenues par kit CBA
permettant de comparer rapidement divers composés.
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004
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Dosage des cytokines par cytométrie en flux
Résultats
Conclusion
Elisa versus CBA
Le célastrol a montré dans nos expériences une forte activité inhibitrice de la sécrétion de TNFa, d’IL-1b, d’IL-6 et
d’IL-8 par des cellules mononucléées de sang veineux
périphérique humain (PBMC) après activation par LPS
(résultats non présentés ici). Cette molécule nous a servi à
comparer les deux techniques dans le cas par exemple du
dosage du TNFa (figure 3). La valeur des CI50 obtenues
reste très comparable et la méthode CBA est très satisfaisante vue la rapidité et le peu de volume du prélèvement
sanguin nécessaire à la préparation et au dosage des six
cytokines en parallèle. Lorsque nous comparons dans la
figure 3 les courbes effets doses obtenues avec les deux
techniques (expérience et donneur de sang différents) on
constate une adéquation satisfaisante des CI50 obtenues
par les deux techniques.
Le coût relativement onéreux du dosage des cytokines par
le kit CBA s’efface rapidement devant la possibilité de
doser simultanément six cytokines d’intérêt. De plus, cette
technique est particulièrement appropriée aux protocoles
expérimentaux ne générant que de faibles volumes de surnageants d’incubations, comme c’est le cas lors d’un criblage sur cultures miniaturisées. Notre travail indique une
très bonne corrélation entre les résultats obtenus en test
Elisa et en CBA. Cette dernière technique, de mise en
œuvre rapide, s’avère donc être particulièrement fiable et
présente de nombreux avantages dans l’évaluation du profil d’activités de certains composés.
Caractérisation de composés anti-inflammatoires
obtenus par criblage de chimiothèque
Nous avons réalisé le criblage d’une chimiothèque à la
recherche d’autres molécules modulant la production du
TNFa par les PBMC. Ce criblage a été effectué par test
Elisa classique (résultats non présentés ici) et les composés sélectionnés ont été caractérisés plus avant pour leur
profil anti-inflammatoire (action sur la sécrétion de cytokines induite par LPS) grâce au kit CBA (exemple donné en
figure 4). Nous avons ainsi dosé quatre molécules en courbes dose-réponses de manière simultanée sur un unique
donneur (20 mL de sang) ce qui permet de comparer rapidement les quatre composés sans être dépendant des variations de réponses entre donneurs.
Ann Biol Clin, vol. 62, n° 1, janvier-février 2004
Références
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cytokine production by intestinal biopsies in patients with ulcerative
colitis and Crohn’s disease. J Clin Immunol 1996 ; 16 : 144-50.
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in the treatment of Crohn’s disease. Aliment Pharmacol Ther 2002 ; 16 :
1579-90.
3. Keating GM, Perry CM. Infliximab : an updated review of its use in
Crohn’s disease and rheumatoid arthritis. BioDrugs 2002 ; 16 : 111-48.
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inhibitors. Part I : triterpenes. Bioorg Med Chem Lett 1998 ; 8 : 1883-6.
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Part III : truncated analogs of tripterine. Bioorg Med Chem Lett 1998 ;
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granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.
Scand J Clin Lab Invest 1968 ; 97 (Suppl) : 77-89.
63