DIU F13_30-01

DIU
Hémostase Biologique
et Biochimie de l’Hémostase
Les autres déficits rares de la
coagulation
[email protected]
Les déficits
rares des
facteurs de
coagulation
Fréquence
souvent <1/106
Illustration de
l’exploration
du déficit en
FXIII
Plasmin
Fibrinolyse
A2AP, TAFI, PAI2,
etc..
Facteur XIII et coagulation
FXIII : zymogène d’une transglutaminase
Covalences entre γ amide de GLN et ε amine
de LYS de fibrines adjacentes
Ariëns et al Blood 2000; 96:988-95
Stabilisation du caillot
• Autres substrats (A2AP, fibronectine,
collagène…)
Quelques réactions catalysées :
coagulation et au delà
fibrine γ - fibrine γ
fibrine α - fibrine γ
Fibrine - α2 antiplasmine, PAI2 et TAFI
Fibrine - fibronectine
Fibronectine - collagène
αvβ3 - GpIIb/IIIa
Cytosquelette plaquettaire
Angiogenèse
Facteur XIII
Facteur de coagulation (stabilisation par
transglutamination des polymères de
fibrine)
Dans le plasma, FXIII : hétéro-tétramère
A2B2
Dans les cellules (plaquettes, monocytes,
placenta) : homo-dimère A2
Le plan
Contexte clinique
Exploration biologique initiale (et ses pièges)
et spécialisée
Un peu plus sur le FXIII
Contexte clinique
Signe d’appel pas forcément hémorragique :
exemple 27 ans, 7 FCS, diagnostic lors d’une HIC
de sa sœur (Trigui et al. Haemophilia 2007;13:221)
TCA/TCK normal ; TQ/TP (INR) normaux ;
Fibrinogène normal
http://www.f13-database.de
Contexte clinique
Recouvrement des manifestations cliniques avec
l’afibrinogénémie mais :
Hémorragies retardées
Cicatrisation retardée
Pas de thrombose
Déficit sévère en FXIII :
fausses couches précoces
Le traitement maternel
(objectif 5-35%)
préviendrait les
fausses couches
Le statut du fœtus
(homozygote ou non)
n’influe(rait) pas sur
la grossesse
Fibrogammin Behring
10U/kg/mois
Contexte clinique : déficits
acquis
En général déficit modéré
Inhibiteurs rares (parfois en association avec
l’Isoniazide)
maladies chroniques inflammatoires du tube digestif (Crohn,
colite)
- le taux diminue pendant la grossesse
Insuffisance hépatique sévère, hémopathies malignes
- Activation excessive, CIVD
- traitement par le valproate.
Niveau de preuve bas : certains purpura,
pulmonaire, lupus, GVH intestin…
bypass cardio-
Notion classique “15% suffisent” …. mais taux à 30% dans
des syndromes hémorragiques “inexpliqués”,
Le plan
Contexte clinique
Exploration biologique initiale (et ses pièges)
et spécialisée
Un peu plus sur le FXIII
Le bilan initial (et la
suite)
TCA, TQ, fibrinogène normaux
Phases suivantes et prise en charge du syndrome
hémorragique laboratoire-dépendant
Test de solubilité du caillot (Iso 15189…)
Dosage quantitatif du XIII (recommandation ISTH 2013)
+ recherche d’auto AC si déficit acquis
Puis : dosage antigénique du FXIII-A2B2,
Si celui-ci est diminué, dosage antigénique du FXIIIA et du FXIII-B
Biomol pas indispensable (pour certains)
1°) Solubilité du caillot
Facile à mettre en œuvre, le plus souvent
« artisanal », long et bon marché
Pas de méthode standardisée. Difficile à
certifier
Ne détecte que les déficits inférieurs à 10%
voire 1%
Pas quantitatif
N’est plus recommandé dans la démarche
diagnostique
Recommandation UK
2001
Réalisation UK
(147 centres)
Iso 15189
(2016)
I. Jennings, S. Kitchen, T. A. L. Woods, F. E. Preston JTH 2003 (1) 2603
2°) Le test
« quantitatif »
(recommandation ISTH)
Mesure d’activité transglutaminase : libération de
NH4+
D-CO-NH2 + NH4+ -A
(FXIIIa)
->
D-CO-NH2-A + NH4+
NH4+ + NADH +αCG
(GLDH)
->
NAD + Glu + H2O
Mesure de la diminution de DO à 340 nm
D’une trousse à l’autre, variations à la marge
(substrats ; réaction couplée au NADPH)
Exemple du Berichrom FXIII
Utilisable sur tout automate (ouvert) capable de
mesurer une DO à 340nm
Mesure de l’activité enzymatique
ε
NH2
O
N
N
NH2
N
N
N
H
OHHO
NAD+
NADH
O
N
O
CH 2 O P O P O CH 2
O
OO-
O
NADH
OH
OH
260
300
340
380
λ (nm)
Spectre UV des coenzymes nicotiniques
DO = ε.l.[P]
Loi de Beer-Lambert
Cuve
contenant
E et S
Io
I
l
lampe
diaphragme
Cellule Vmètre
DO = fonction de Io et I
La nécessité du blanc
Les raisons : production plasmatique de NH4+,
lE
consommation plasmatique de NADH (activité
LDH)…
Ajzner & Muszbek JTH 2004 (2) 2075
Iodoacétamide
activation : pourquoi,
comment ?
Forme circulante FXIII, forme mesurée FXIIIa
D-CO-NH2 + NH4+ -A
(FXIIIa)
->
D-CO-NH2-A + NH4+
Activation par la thrombine indispensable, ∆DO pas
linéaire initialement
Nécessité d’un dérivé de GPRP pour que la fibrine
ne soit pas utilisée comme substrat
En cas de déficit en fibrinogène, activation
incomplète et sous évaluation du FXIII
Il faut un
rapport
adéquat
FXIII/Fib
Limite
inférieure de
détection
fonction des
appareils
Validité du
test : 5%-170%
Les autres réactifs
Technochrom F13 (Technoclone ; Stago bnl ; …).
Contient l’iodoacétamide
Méthodes « maison » (dansylcadavérine,
incorportatgion de putrescine marquée…)
nécessitent une défibrination préalable
3°) Les dosages
antigéniques
A2B2 (ELISA ou turbidimétrie) exemple Technozym
FXIII:Ag
A2 (ELISA ou turbidimétrie ex: IL FXIII-A Ag)
B2 (ELISA, pas d’AMM pour le diagnostic)
D’une manière générale, les mutations de F13A
s’accompagnent d’une diminution isolée de A2 (B2 pas
modifiée)
Les mutations de F13B induisent une diminution de la
½ vie et donc parallèle de A2 (A2 moins diminuée que
B2)
4°) Biologie moléculaire du
FXIII
Pas indispensable pour certains
Vraisemblablement pas de corrélation
génotype/phénotype (pas de sécrétion des
variants)
Important pour les rares mutations à sécrétion
conservée
Certaines mutations (stop ou frameshift)
permettent de prédire des taux nuls (pas
mesurable par l’activité)
En cas de grossesse, facilite la prise en charge
de l’enfant (ou l’IMG)
Les apports de la génétique
« classique »
Déficit congénital très rare (1 pour 5
millions)
Autosomique récessif
Manifestations sévères dès l’enfance
Traitement par concentré de FXIII : 5 à
35% d’activité plasmatique préviennent
(…) les complications
Les apports de la génétique
moléculaire
Sous unité B : 1q32, 12 exons
Expression hépatocytaire
Sous unité A : 6p24-25, 15 exons, pas de peptide
signal
Promoteur : éléments spécifiques des lignées
myéloïdes
Ichinose Thromb Haemost 2001; 86:57-65
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cg
i
ggcaaaatgtgttgctcaag
Identification des mutations :
PCR puis séquençage
1
2
blc cont
Une douzaine de cas index au labo (12 résolus, 3 publiés),
une petite vingtaine de cas vivants en France selon le réseau « France
Approche « structure-fonction » pas réaliste
RESULTATS
Analyse des sé
séquences
RESULTATS
Alignement des sé
séquences
variant : Mutation ou
polymorphisme ?
Exon 2
DNA: CTG AAG GAC CTT GTA AAG TCA AAA ATG TCA GAA ACT TCC AGG ACC GCC TTT
+1: L
K
D
L
V
K
S
K
M
S
E
T
S
R
T
A
F
DNA: GGA GGC AGA AGA GCA GTT CCA CCC AAT AAC TCT AAT GCA GCG GAA GAT GAC
+1: G
G
R
R
A
V
P
P
N
N
S
N
A
A
E
D
D
DNA: CTG CCC ACA GTG GAG CTT CAG GGC GTG GTG CCC CGG GGC GTC AAC CTG CAA
+1: L
P
T
V
E
L
Q
G
V
V
P
R
G
V
N
L
Q
DNA: G
Les apports de la génétique
Déficit en sous unité B : symptomatologie plus
modérée (moins de FCS) ?
T1/2 de la sous unité A passe de 14 à 3j
Déficit sur la sous unité B : 5 cas décrits
• Déficit en sous unité
A : environ 500 cas
• 67 mutations décrites
épissage
Faux sens
Deletion
Non sens insertion
(stop)
http://www.f13-database.de
Biomol : interprétation
des résultats
Acquis ou constitutionnel ? Pas de mutation
récurrente -> évaluation du caractère pathogène d’un
variant :
Non sens ou décalage du cadre de lecture : facile
Faux sens : logiciels de prédiction; alignements avec
d’autres espèces, modélisation 3D (pas de cristal
pour FXIIIB); construction de vecteur, mutagenèse
dirigée et expression…
Epissage : logiciels de prédiction ; construction de
minigènes
Recherche de larges délétions : MLPA (ou QPCR), CGH
array ; recherche de mutation en zone de régulation ;
recherche de réarrangement génique
En suspens : protéines cargo
Le plan
Contexte clinique
Exploration biologique initiale (et ses pièges)
et spécialisée
Un peu plus sur le FXIII
2. Structure de la protéine :
la sous unité A
• 731 acides aminés (83,2 kDa)
• Sous unité catalytique
• Forme cellulaire : A2 (association
quaternaire)
• 4 domaines
Peptide d’activation
H 2 N-
37
184
628
515
-COOH
731
2. Structure de la protéine :
la sous unité A
Domaine
Sandwich β
H 2 N-
37
184
628
515
-COOH
731
2. Structure de la protéine :
la sous unité A
Domaine
Catalytique
H 2 N-
37
184
628
515
-COOH
731
2. Structure de la protéine :
la sous unité A
Domaine
Tonneau 1
H 2 N-
37
184
628
515
-COOH
731
2. Structure de la protéine :
la sous unité A
Domaine
Tonneau 2
H 2 N-
37
184
628
515
-COOH
731
La soussous-unité
unité A
Composé de 731 acides aminés délimitant 4
domaines:
Dans la partie N-terminale, les résidus 1 à 37
constituent un peptide d’activation limitant
l’accès au site actif.
Le domaine β sandwich : résidus 38 à 184
Le domaine CORE : du 185ème au 515ème résidu.
Comprend le site (codé par l’exon 7) Et le site de
fixation du calcium
Le domaine Barrel 1 : du 516ème au 628ème acide
aminé
Le domaine Barrel 2 : du 629ème au 731ème acide
aminé
Dimère A2 dans les tissus
Tétramère A2B2 dans le plasma
3. Structure de la protéine :
la sous unité B
641 acides aminés (79.7 kDa)
Sous unité de transport et liaison (A2B2)
Dissociation nécessaire à la catalyse par A2
Peptide signal, sécrétion hépatocytaire
10 domaines en Sushi
H2N- 20
Sushi 1 Sushi 2
Sushi 10 641
-COOH
La sous
sous-unité
unité B
Rôle: Régule l’expression, protège (transporte) et
stabilise la sous-unité A (T1/2 passe de 3 à 15j. N’a
aucune activité enzymatique
Présent dans le plasma sous forme lié (A2B2) et libre (B2,
1/3)
Exprimé par les hépatocytes, gène en1 p31-32
Structure: Peptide signal (exon 1)
4 domaines en Sushi
10 domaines Sushi (exons 2-11) ;
Un exon par domaine (60-65 AA)
Domaine C terminal (exon 12)
H2N- 20
Sushi 1 Sushi 2
Sushi 10 641
-COOH
Placenta : quantités considérables de FXIIIA
Déficit congénital en FXIIIA : fausses couches
à répétition
Risque minoré si déficit en FXIIIB (n=5)
Placenta à terme 38 SA (X20) Facteur XIIIa Novus au 1/50è over night à +4°C (CM + MND)
Le FXIII est présent dans les cellules de
Hofbauer
1Espace intervilleux
2 Syncytiotrophoblaste
3 Capillaire
4 Cellule Mésenchymateuse
5 Cytotrophoblaste
6 Cellules de Hofbauer
Asahina et al Placenta 2000;21 : 388-
Déficit maternel en FXIII