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DIRECTION ENVIRONNEMENT
DÉTERMINATION DE L’EFFICACITÉ
BACTÉRIOSTATIQUE ET BACTÉRICIDE D’UN
REVÊTEMENT DE SOL
Dossier CRIQ no 640-PE35964
Rapport technique
Madame Louise Larivière
FORBO LINOLEUM INC.
8300, rue Pascal-Gagnon
Saint-Léonard (Québec) H1P 1Y4
GUY GENEST, ING.
CONSEILLER EN DÉVELOPPEMENT TECHNOLOGIQUE
MICHEL COMEAU, TECHNICIEN R-D
RESPONSABLE TECHNIQUE
DIRECTION ENVIRONNEMENT
QUÉBEC, LE 15 MARS 2006
MARIE-JOSÉE HARDY, MICROBIOLOGISTE
DIRECTRICE ADJOINTE
DIRECTION ENVIRONNEMENT
FORBO LINOLEUM INC.
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ii
TABLE DES MATIÈRES
PAGE
1.
INTRODUCTION..................................................................................................... 1
2.
OBJECTIF DU PROJET ......................................................................................... 1
3.
DESCRIPTION DES TRAVAUX ............................................................................. 1
4.
5.
3.1
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS.................................................................... 2
3.2
ÉVALUATION QUALITATIVE DE L’EFFICACITÉ BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE
SELON TNO SEEDLAYER METHOD .................................................................... 2
3.3
ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L’EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON AATCC 100 ... 3
3.4
UNE ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT NÉCESSAIRE DU REVÊTEMENT
MARMOLEUM AVEC LA BACTÉRIE POUR LA DÉTERMINATION DE L’ACTIVITÉ
BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS)................ 4
RÉSULTATS OBTENUS......................................................................................... 4
4.1
RÉSULTAT DE L’ÉVALUATION QUALITATIVE DE L’EFFICACITÉ MESURÉE SELON TNO
SEEDLAYER METHOD ....................................................................................... 4
4.2
RÉSULTAT DE L’ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L’EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON
AATCC 100 .................................................................................................. 5
4.3
RÉSULATS DE L’ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT (MÉTHODE IN VIVO
SIMULATIONS) ................................................................................................. 6
CONCLUSION ........................................................................................................ 7
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LISTE DES TABLEAUX
PAGE
TABLEAU I :
CROISSANCE OBSERVÉE APRÈS 72 HEURES D'INCUBATION
(TNO SEEDLAYED METHOD).......................................................... 5
TABLEAU II :
EFFICACITÉ BACTÉRICIDE............................................................. 6
TABLEAU III :
CROISSANCE OBSERVÉE EN FONCTION DU TEMPS DE
CONTACT ......................................................................................... 7
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1.
1
INTRODUCTION
FORBO LINOLEUM INC. fabrique et distribue un revêtement de sol à base d’huile de
lin commercialisé sous le nom de Marmoleum. Ce revêtement a déjà été testé dans le
passé pour en démontrer l’efficacité bactéricide et bactériostatique sur différents
microorganismes.
2.
OBJECTIF DU PROJET
L’objectif de ce projet consistait à déterminer l’efficacité bactéricide et bactériostatique
du revêtement Marmoleum sur la bactérie Clostridium difficile selon trois méthodes
d’essais différentes auxquelles le revêtement Marmoleum avait déjà été soumis soit :
une évaluation qualitative de l’efficacité bactéricide ou bactériostatique (TNO
seedlayed method);
une évaluation quantitative de l’efficacité bactéricide selon la norme AATCC 100;
une évaluation du temps de contact nécessaire du revêtement Marmoleum avec la
bactérie pour la détermination de l’activité bactéricide ou bactériostatique
(méthode in vivo simulations).
3.
DESCRIPTION DES TRAVAUX
Un échantillon de revêtement Marmoleum a été livré au CRIQ le 2 février 2006. Les
essais se sont déroulés entre le 20 février et le 10 mars 2006. Chacun des essais a
été réalisé sur un échantillon de revêtement tel qu’il a été reçu ainsi que sur un
échantillon ayant été soumis à une lixiviation d’une heure dans de l’eau du robinet et
séché ensuite à l’air ambiant.
Dans tous les cas, les essais ont été réalisés dans du bouillon ou sur une gélose
contenant le milieu de culture Reinforced Clostridium Medium et la souche utilisée fut
Clostridium difficile ATCC 9689.
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3.1
2
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Avant de procéder à chacun des essais, les échantillons ont d’abord été découpés
selon la forme et la dimension requises. Ils ont ensuite été désinfectés avec une
solution d’alcool éthylique à 70 %.
La moitié des échantillons ont, par la suite, été soumis à une lixiviation d’une heure
dans de l’eau du robinet. Pour ce faire, ils ont été placés dans un contenant peu
profond et une quantité d’eau suffisante pour les recouvrir y a été ajoutée. Les
contenants ont été placés sur une plaque agitante ajustée à une vitesse suffisamment
élevée pour permettre un faible déplacement de l’eau à la surface des pièces de
revêtement. Après une heure, ils ont été retirés de la solution, égouttés et mis à
sécher sur une grille en acier inoxydable pendant une heure à la température de la
pièce.
3.2
ÉVALUATION QUALITATIVE DE L’EFFICACITÉ BACTÉRICIDE OU
BACTÉRIOSTATIQUE SELON TNO SEEDLAYER METHOD
Le principe de cette évaluation consiste à mettre en contact une suspension de
bactéries en concentration connue dans une gélose liquéfiée et de transférer une
petite quantité de cette suspension à la surface du revêtement. Pendant la période
d’incubation, les échantillons sont inspectés périodiquement pour déterminer s’il y a
eu développement ou non de la bactérie.
Une culture de Clostridium difficile a été réalisée en inoculant 10 ml de bouillon
Reinforced Clostridium Medium et en l’incubant en condition anaérobie à 35 °C
pendant 48 heures. Cette culture a ensuite été diluée dans une gélose liquéfiée
contenant le même milieu de culture pour obtenir une concentration finale d’environ
105 UFC (unités formatrices de colonies) par millilitre.
Deux rondelles de téflon d’un diamètre de 1 cm et d’une épaisseur de 0,5 cm ont
ensuite été placées sur un échantillon de revêtement de 5 cm sur 5 cm et chacune a
été remplie avec 0,5 ml de gélose inoculée. Après solidification de la gélose, les
échantillons ont été déposés dans des plats de pétri de 100 x 15 mm et incubés
pendant 4 jours à 35 °C en condition anaérobie. Un échantillon témoin a également
été préparé en transférant la même quantité de gélose inoculée dans une rondelle
placée au fond d’un plat de pétri stérile et incubé dans les mêmes conditions, de
même qu’un contrôle de stérilité de la gélose avant son inoculation.
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3
Un dénombrement a, de plus, été réalisé sur la gélose fraîchement inoculée en
effectuant des dilutions successives de celle-ci et en filtrant un volume connu de la
dilution sur une membrane filtrante quadrillée hydrophobe. La membrane a ensuite
été déposée à la surface d’une gélose Reinforced Clostridium Medium et incubée
pendant 72 heures à 35 °C en condition anaérobie. À la fin de la période d’incubation,
le dénombrement a été effectué.
L’activité bactériostatique a été évaluée quotidiennement en examinant la présence
ou l’absence de croissance sur les échantillons. L’absence de croissance confirme
l’activité bactériostatique ou bactéricide et à l’inverse, la croissance démontre que
cette activité n’est pas enregistrée.
3.3
ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L’EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON
AATCC 100
L’American Association of Textile Chemist and Colorists offre une méthode
d’évaluation quantitative de l’activité bactéricide d’une surface sur laquelle une
quantité connue de bactéries est présente. Cette technique a été développée pour
tester des tissus mais est totalement applicable à un revêtement de sol.
Une suspension de Clostridium difficile à une concentration d’environ 105 UFC par
0,1 ml a été préparée dans du bouillon Reinforced Clostridium Medium. Des
échantillons de revêtement d’un diamètre de 48 mm ont été découpés et placés
individuellement au fond de bouteilles en plastique de 500 ml stériles. Les échantillons
ont été inoculés avec 0,1 ml de la suspension et un dénombrement a été réalisé sur la
moitié d’entre eux en ajoutant 100 ml d’une solution neutralisante contenant 0,1 % de
peptone et 0,1 % de polysorbate 80 et en filtrant 1 ml de cette solution sur une
membrane filtrante tel que décrit dans l’essai précédent. Des échantillons témoins
ayant été mouillés avec 0,1 ml d’eau stérile ont également été préparés.
L’autre moitié des échantillons a été placée à l’incubateur à 35 °C, après avoir fermé
hermétiquement les contenants, pendant 24 heures. Une bouteille ne contenant que
0,1 ml d’inoculum sans échantillon a également été insérée pour valider la viabilité de
l’inoculum. Après à la période d’incubation, un nouveau dénombrement a été effectué
en ajoutant 100 ml solution neutralisante dans chacun des contenants et en filtrant
1 ml de la solution résultante.
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3.4
4
UNE ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT NÉCESSAIRE DU
REVÊTEMENT MARMOLEUM AVEC LA BACTÉRIE POUR LA
DÉTERMINATION
DE
L’ACTIVITÉ
BACTÉRICIDE
OU
BACTÉRIOSTATIQUE (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS)
Cette évaluation consiste à déterminer le temps de contact requis entre une pièce de
Marmoleum et la bactérie soit pour en empêcher la croissance et la multiplication, soit
pour l’éliminer.
Une suspension de Clostridium difficile à une concentration d’environ 105 UFC par
0,1 ml a été préparée dans du bouillon Reinforced Clostridium Medium. Un volume de
0,1 ml de cette suspension a été étalée à l’aide d’une tige de verre recourbée sur la
surface de chaque gélose contenue dans un plat de pétri de 100 x 15 mm et mis à
sécher 15 minutes sous une hotte à flux laminaire.
Les échantillons de revêtement de 1 cm sur 1 cm ont été déposés sur une gélose face
aux bactéries et mis à incuber à 35 °C en condition anaérobie. Des pièces
d’échantillons ont été retirées après 1, 2, 4, 6 et 24 heures. Après chaque retrait, les
géloses maintenant dépourvues de l’échantillon de revêtement ont été replacées dans
l’incubateur dans les mêmes conditions et examinées à toutes les 24 heures jusqu’à
concurrence de 72 heures. La croissance inhibée totalement à la fin des 72 heures
indique un effet bactéricide ou bactériostatique alors qu’une inhibition partielle de la
croissance au cours des 48 premières heures suivie d’une croissance après
72 heures démontre plutôt une activité bactériostatique. La méthode est validée par la
croissance des bactéries à la surface d’une gélose inoculée qui n’a pas été mise en
contact avec les échantillons de même que par l’insertion d’une gélose non inoculée
sur laquelle aucune croissance ne doit être observée.
4.
RÉSULTATS OBTENUS
4.1
RÉSULTAT DE L’ÉVALUATION QUALITATIVE
MESURÉE SELON TNO SEEDLAYER METHOD
DE
L’EFFICACITÉ
Le dénombrement réalisé sur l’inoculum utilisé pour la réalisation de cet essai a été
de 1,2 x 105 UFC/ml. Le tableau I présente les résultats obtenus après 72 heures
d’incubation. Le symbole + indique qu’il y a eu croissance tandis que le symbole –
représente l’absence de croissance de la bactérie Clostridium difficile.
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TABLEAU I :
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CROISSANCE OBSERVÉE APRÈS 72 HEURES D'INCUBATION
(TNO SEEDLAYED METHOD)
ÉCHANTILLON
CROISSANCE OBSERVÉE
Marmoleum tel quel
-
Marmoleum trempé une heure
-
Témoin positif (gélose inoculée)
+
Contrôle de stérilité
-
Le résultat obtenu démontre que le revêtement Marmoleum possède une activité
bactériostatique certaine et potentiellement bactéricide envers Clostridium difficile.
4.2
RÉSULTAT DE L’ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L’EFFICACITÉ
BACTÉRICIDE SELON AATCC 100
L’inoculum utilisé lors de cette évaluation contenait 1,3 x 105 UFC/0,1 ml. Le tableau II
présente les résultats obtenus lors des dénombrements réalisés tout de suite après
l’inoculation ainsi qu’après 24 heures de contact entre la bactérie et le revêtement à
35 °C.
L’efficacité est calculée de la façon suivante :
R = 100 (B - A)/B
où
R = % de réduction après 24 heures de contact
A = dénombrement de l’échantillon inoculé après 24 heures de contact
B = dénombrement de l’échantillon inoculé après inoculation
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TABLEAU II :
6
EFFICACITÉ BACTÉRICIDE
DÉNOMBREMENT (UFC/SURFACE)
ÉCHANTILLON
Marmoleum tel quel
(inoculé)
Marmoleum tel quel
(non inoculé)
Marmoleum trempé
une heure (inoculé)
Marmoleum trempé
une heure(non
inoculé)
Inoculum
% EFFICACITÉ
LORS DE
L’INOCULATION
APRÈS 24 HEURES
DE CONTACT
1,2 x 105
< 100
> 99,9
< 100
< 100
---
1,2 x 105
< 100
> 99,9
< 100
< 100
---
1,3 x 105
> 108
---
L’augmentation du nombre de bactéries dans l’inoculum après 24 heures d’incubation
démontre sa viabilité dans le temps. De plus, le fait que le dénombrement des
échantillons non inoculés soit inférieur à 100 démontre qu’ils n’ont pas été contaminés
lors des manipulations.
4.3
RÉSULATS DE L’ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT (MÉTHODE IN
VIVO SIMULATIONS)
Le tableau qui suit présente les résultats obtenus après 72 heures d’incubation à la
suite des différents temps de contact entre l’échantillon et l’inoculum. Le symbole +
indique qu’il y a eu croissance tandis que le symbole – représente l’absence de
croissance de la bactérie Clostridium difficile. L’inoculum utilisé pour cet essai
contenait 5 x 105 cellules vivantes de Clostridium difficile au début de l’essai.
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TABLEAU III :
7
CROISSANCE OBSERVÉE EN FONCTION DU TEMPS DE
CONTACT
CROISSANCE OBSERVÉE
ÉCHANTILLON
T = 1 HEURE T = 2 HEURES T = 4 HEURES
Marmoleum tel
quel
Marmoleum
trempé une
heure
Témoin positif
(gélose
inoculée)
Contrôle de
stérilité
T = 6 HEURES T = 24 HEURES
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
Puisque aucune croissance n’a été enregistrée après réincubation des échantillons
une fois le revêtement enlevé, le Marmoleum semble ainsi être bactéricide envers
Clostridium difficile.
5.
CONCLUSION
Le revêtement de sol Marmoleum possède des propriétés bactériostatique et
bactéricide envers la souche de Clostridium difficile ATCC 9689. De plus, le fait de
faire tremper l’échantillon dans de l’eau pendant une heure ne semble pas modifier
ses propriétés antibactériennes. On peut ainsi conclure que :
Le Marmoleum démontre son efficacité bactériostatique envers Clostridium difficile
lorsque testé selon le TNO Seedlayer Method;
Le Marmoleum possède une activité bactéricide supérieure à 99,9 % sur
Clostridium difficile lorsque testé selon la méthode AATCC 100;
Après une heure de contact avec la bactérie Clostridium difficile, le Marmoleum
démontre son efficacité bactéricide lorsque testé selon la méthode in vivo
simulations.