SYNTHESE ET ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE

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Rev. Microbiol. Ind. San et Environn. Vol 7, N°1, p : 1-29
Chennaoui et al., 2013
SURVIE DES BACTERIES ISSUES DU REJET D’ABATTOIR
DANS LES EAUX DE LA PLAGE D’EL JADIDA (MAROC)
M. CHENNAOUI1*, H. AASSILA2, Y. FARID1, A. EL KOURI1, M.
MOUNTADAR2 et O. ASSOBHEI1
1- Laboratoire de Biotechnologie Marine et de l’Environnement (Biomare).
2- Unité de Chimie Analytique et Génie de l’Environnement.
Faculté des Sciences, Université Chouaib Doukkali, BP : 20, El Jadida 24000 (Maroc).
Pour correspondance : [email protected]
RESUME
La présente étude sur la survie des bactéries issues du rejet d’abattoir dans l’eau
de mer a été réalisée au laboratoire et insitu. Les facteurs abiotiques étudiés au
laboratoire sont le rayonnement solaire, la température et la salinité. Pour évaluer l’effet
des facteurs biotiques et abiotiques sur la survie des bactéries dans les conditions
naturelles, des chambres de diffusion ont été utilisées. Les résultats mettent en relief
l'importance de ces paramètres de stress dans l’inactivation des bactéries. Les
pourcentages de dormance peuvent atteindre 98% à forte salinité. Les résultats obtenus
des essais in situ montrent une réduction des effectifs bactériens plus importante que
lors de l’étude menée au laboratoire. L'étude comparative des techniques de comptage
utilisées montre que les facteurs abiotiques et biotiques ont un effet bactéricide ou
bactériostatique, ce qui entraîne la transformation des bactéries à un état viable non
cultivable leur permettant de conserver leur caractère pathogène.
Mots clés : Abattoir, survie, bactérie.
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Chennaoui et al., 2013
ABSTRACT
The present study on the survival of bacteria from the rejection of an abattoir in
seawater was carried out in the laboratory and in situ. Abiotic factors studied in the
laboratory are solar radiation, temperature and salinity. To evaluate the effect of biotic
and abiotic factors on the survival of bacteria in natural conditions, diffusion chambers
were used. The results highlight the importance of these stress parameters in the
inactivation of bacteria. The percentages of dormancy can reach 98% to high salinity.
The results of in situ tests show a reduction in bacterial numbers greater than during the
study in the laboratory. The comparative study of counting techniques used shows that
the abiotic and biotic factors have a bactericidal or bacteriostatic effect, which causes
the transformation of bacteria viable non-culturable state allowing them to retain their
pathogenicity.
Keywords: Abattoir, survival, bacteria.
INTRODUCTION
La plage de la ville d’El jadida, située sur la côte atlantique marocaine est
caractérisée pour son importante activité touristique estivale et par ses richesses
aquacoles. Cependant, cette plage est soumise à une forte pollution par les eaux usées
parmi lesquelles les rejets d’abattoir. Ces derniers contiennent de nombreux organismes
pathogènes (ex : Salmonelles, virus de l'hépatite A...), représentant une menace pour la
santé humaine et l’écosystème marin (Lamghari et Assobhei 2005, Chennaoui et al.,
2006).
Il est bien connu que lorsque les bactéries issues de ses rejets arrivent dans
l’environnement côtier, leur devenir dépend à la fois de processus hydrodynamiques,
biotiques (liés à l’action des êtres vivants) et physiologiques (action sur les fonctions
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propres de la cellule) (Troussellier et al., 1998).
Jusqu'au milieu des années 70, il semblait bien établi que les bactéries étaient
vouées soit à une disparition plus ou moins rapide , soit à une altération de leur état
physiologique sous l'influence du pouvoir "auto-épurateur" du milieu marin :
température basse, salinité élevée, irradiation solaire intense, carence nutritionnelle,
présence de substances toxiques des eaux usées (détergents, métaux lourds), activité de
nombreux micro-et macro-prédateurs, inhibition ou lyse par des substances
antibiotiques produites par les microorganismes marins (algues, champignons,
bactéries) (Aubert et al., 1981).
Ce concept de "mortalité" bactérienne a rapidement évolué au cours des quinze
dernières années. En effet, la revivification des bactéries telluriques d'origine fécale,
dans certains milieux particulièrement agressifs (eaux chlorées, eaux froides ou
chaudes, eaux salées, etc...), éventuellement réversible par l'utilisation de techniques de
dénombrement dites de "reviviscence" (Garry 2000).
Nous étudierons successivement le comportement des bactéries dans le milieu
marin, en l’exposant, au laboratoire et in situ, aux paramètres biotiques et abiotiques du
milieu qui contrôlent leur survie. Ainsi, nous avons choisi quatre espèces de bactéries
dont les abondances sont élevées (E. coli, C. perfringens, St. aureus et Streptocoques.
fécaux).
MATERIEL ET METHODES
Description du site d’étude
Le système côtier de la ville d’El Jadida constitue l’assise d’une activité
multiforme (pêche, ramassage des algues, exploitation des sables, tourisme
balnéaire…). Malheureusement, tous les rejets de la ville, dont celui de l’abattoir
déversent en mer ce qui constitue une menace sérieuse pour cet environnement marin et
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notamment le littoral d’El Jadida (figure 1).
Figure 1 : Localisation de la ville d’El Jadida et de son abattoir municipal
Préparation des suspensions bactériennes
Souches
Les souches utilisées dans le présent travail sont des collections du laboratoire
de Biotechnologie marine et de l’environnement (Biomare) d’El jadida. Il s’agit de C.
perfringens, E.coli, des streptocoques fécaux et Streptococcus aureus.
Milieux de culture
Les milieux de culture utilisés ainsi que la température d’incubation pour les
différents microorganismes étudiés sont Lactose Sulfite (LS) à 37°C pour C.
perfringens, Lysogeny broth (LB) à 44°C pour E. coli, le milieu Ethyl Violet Azide
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(EVA) à 37°C pour les streptocoques fécaux et le milieu chapman à 37°C pour S.
aureus
Cultures
Les cellules en phase exponentielle de croissance sont récoltées par
centrifugation (3000 g pendant 15 min). Les culots sont lavés deux fois avec une
solution de NaCl à 90/00 et mis en suspension dans la même solution. A partir de ces
suspensions, nous avons ensemencé les milieux de culture à raison de 10% dans des
erlens et les chambres de diffusion contenant une solution d’eau de mer pour étudier
l’effet des facteurs biotiques et l’effet des facteurs abiotiques sur leur survie. Les
évolutions des abondances bactériennes sont suivies toutes les 24 heures pendant 10
jours par dénombrement indirect sur milieux de culture spécifiques et par
dénombrement direct en utilisant la technique d’épifluorescence au DAPI (4’,6diamidino-2-phenylindole, Sigma).
Comptage des bactéries étudiées
1-
Comptage indirect
Les unités forming colony (UFC) des différentes espèces bactériennes ont été réalisées
dans les milieux de culture solide résumés dans le tableau I.
Tableau I : milieux utilisés pour le dénombrement des différentes espèces.
Milieu sélectif
Milieu non sélectif
EMB Biokar
Incubation
44°C/24h
TSA + 6g/l d’E.L
Incubation
37°C/24h
C. perfringens
LS
46°C/8h
TSA + 6g/l d’E.L
37°C/24h
S. aureus
MSA
37°C/24h
TSA + 6g/l d’E.L
37°C/24h
Streptocoques
fécaux
SB
37°C/24h
TSA + 6g/l d’E.L
37°C/24h
Espèce
E.coli
E.L Extrait de levure
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2- Comptage direct
Le nombre total des cellules dans les échantillons est déterminé par numération
au microscope à épifluorescence. Cette méthode nécessite la coloration des cellules par
un composé fluorescent DAPI (4’,6-diamidino-2-phenyl indole, Sigma) et un comptage
au microscope à épifluorescence selon la technique décrite par Bremer et al., 1998.
Ainsi, 5 ml de l’échantillon prélevés par une seringue stérile, sont placés dans un tube à
hémolyse additionné de 0,1 ml de formaldéhyde à 37% est passé au vortex pendant 2
min pour décrocher les bactéries collées en agrégats puis placés dans la glace pendant
10 min. Ensuite, les 5 ml de l’échantillon sont filtrés sur une membrane de 0,22 m
(merck) puis 5 gouttes du DAPI sont ajoutées. La coloration se fait à l’obscurité. Une
fois la filtration terminée, le filtre est mis sur une lame et on ajoute une goutte d’huile à
immersion sur la membrane puis on recouvre d’une lamelle et on passe au microscope à
épifluorescence pour lecture. Le nombre de bactéries par ml est estimé par un comptage
de bactéries dans au moins 20 champs du microscope à l’oculaire 10x10.
3- Utilisation de T90
Le paramètre T90 est employé pour représenter les survivants (temps nécessaire
à la disparition de 90% des effectifs de la population bactérienne initiale). Les
pourcentages de survie et de dormance des cellules bactériennes durant le temps t sont
calculés par l’application des équations (1), (2) et (3).
(1) : pourcentage de cellules cultivables = (comptage sur milieu non sélectif au temps t/
comptage sur milieu non sélectif au temps t0) X 100
(2) : pourcentage cellules altérées = (1- (comptage sur milieu sélectif au temps t /
comptage sur milieu non sélectif au temps t0)) X 100
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(3) : pourcentage de cellules en dormance = (1- comptage sur milieu non sélectif au
temps t/ comptage par DAPI au temps t) X 100
Calcule de T90 : (Ganoulis 1992)
L’inactivation microbienne est évaluée par l’application de la droite de
régression logarithmique C + C0 X 10-t /T90T90 = -t / log (C/C0)
C0 et C sont respectivement les concentrations microbiennes initiale et à l’instant t
mesurées en heure.
1.
Survie des cellules microbiennes
1.1.
Effet des paramètres abiotiques
1- 1.1. Rayonnement solaire
Pour vérifier l’effet du rayonnement solaire sur les souches précitées, 4 séries de 3
erlenmyers en pyrex ont été préparées comme suit (Tableau II) :
Tableau II : Séries préparées pour étudier l’effet du rayonnement solaire sur les
différentes espèces.
Série
1
2
3
Eau de robinet (ml)
200
200
200
Salinité (‰)
9
9
9
Sédiment (g)
0
0
50
pH
8,3
8,3
8,3
Lumière
Température (°C)
Non exposé
20
exposé
20
exposé
20
Toutes les séries ont été stérilisées à l’autoclave à 120°C pendant 20 minutes pour
éliminer l’effet des autres paramètres tels que la compétition bactérienne et la prédation.
Chacune des 4 séries est ensemencée respectivement par une suspension d’E. coli, C.
perfringens, S. fécaux et S. aureus à une concentration finale de 9.107ufc/ml,
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7,3.107ufc/ml, 7,2.107ufc/ml et 7.106ufc/ml.
1.1.2- Effet de la température
4 séries de 2 erlens ont été préparées comme suit (Tableau III):
Tableau III : Séries préparées pour étudier l’effet de la température sur les
différentes espèces.
Série
1
2
Eau de robinet (ml)
200
200
Salinité (‰)
9
9
pH
8,3
8,3
Température (°C)
6
28
Toutes les séries ont été autoclavées puis ensemencées respectivement par une
suspension d’E. coli, C. perfringens, S. fécaux et S. aureus à une concentration finale
9.107ufc/ml, 7,3.107ufc/ml, 7,2.107ufc/ml et 7.106ufc/ml. Toutes les séries sont incubées
à l’obscurité dans des étuves.
1.1.3- Effet de la salinité
4 séries de 3 erlens ont été préparées selon le tableau IV:
Tableau IV : Séries préparées pour étudier l’effet de la salinité sur les différentes
espèces.
Série
1
2
3
Eau de robinet (ml)
200
200
200
Salinité (‰)
9
35
35
Sédiment (g)
0
0
50
pH
8,3
8,3
8,3
Température (°C)
20
20
20
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Chacune des 4 séries est ensemencée respectivement par une suspension d’E.
coli à une concentration finale de 9.107ufc/ml, une suspension de C. perfringens à une
concentration finale de 7,3.107ufc/ml, une suspension de S. fécaux à une concentration
finale de 7,2.107ufc/ml et une suspension de S. aureus à une concentration finale de et
7.106ufc/ml. Tous les erlens ont été protégés des rayonnements solaires par un tissu
épais noir.
1.2.
Effet
des
paramètres
biotiques
et
abiotiques
en
eau
de
mer :
expérimentation in situ
1.2.1- Description de la chambre de diffusion
Les chambres de diffusion employées dans cette étude, sont préparées au
laboratoire selon la technique décrite par Mc Feters et Stuart (1972) ; Filiermans et
Gordon (1977) et Emmerson et al., (1994). Les chambres sont construites en Plexiglas
de 3mm d’épaisseur sous forme d’un cube de 6 cm d’arête ayant été percé au niveau de
deux côtés opposés sur un cercle de diamètre 4 cm. Deux plaques de Plexiglas
permettent de fixer les filtres millépores en polycarbonate stériles de 47 mm de diamètre
et 0,45 m de porosité. Ces derniers sont fixés par deux joints en carton pour assurer
l’étanchéité des chambres de diffusion. Une ouverture fermée par un bouchon de
caoutchouc permettant la prise des échantillons par une seringue stérile. La capacité du
volume finale est de 120 ml. Avant utilisation, les chambres sont stérilisées par UV
(figure 2).
1.2.2- Sites d’emplacement des chambres de diffusion
Les chambres de diffusion remplies avec les suspensions bactériennes sont
placées dans la plage de la ville d’El jadida à 30 m de la côte. Les chambres sont
immergées dans une zone peu agitée protégée contre les vagues. Elles sont suspendues
entre un flotteur et un lest relié par un fil. Le flotteur leurs permettra de rester à la même
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profondeur (20cm).
Figure 2 : Schéma de la chambre de diffusion.
1.2.3- Protocole expérimental
Afin d’étudier l’effet de ces facteurs sur la survie des bactéries étudiées, 4 séries
de 2 chambres de diffusion ont été utilisées. Une série est remplie par l’eau de mer non
stérile qui permettra d’étudier l’effet de la prédation sur ces bactéries, l’autre est remplie
par la même eau de mer stérilisée par autoclave (120°C/20 min) pour annuler l’effet
d’autres micro-organismes (Servais et al., 2009). Cette dernière série permet d’étudier
l’effet des facteurs abiotiques sur la survie de ces espèces. Une chambre de diffusion de
chaque série est ensemencée par une suspension E. coli à une concentration finale de
9.107ufc/ml, une suspension de C. perfringens à une concentration finale de
7,3.107ufc/ml, une suspension de S. fécaux à une concentration finale de 7,2.107ufc/ml
et une suspension de S. aureus à une concentration finale de et 7.106ufc/ml. Les
échantillons sont prélevés périodiquement avec une seringue stérile puis amenés au
laboratoire dans une glacière à 4°C, pour une numération immédiate en utilisant les
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techniques décrites précédemment.
Les évolutions des abondances bactériennes sont suivies après 4, 24, 48 et 72 h
d’immersion dans l’eau de mer. Le dénombrement direct a été effectué en utilisant la
technique au DAPI et le dénombrement indirect est réalisé par le dénombrement sur les
milieux de culture sélectifs et non sélectifs.
RESULTATS
1.
Survie des cellules bactériennes issues de l’abattoir
1.1 .Effet des paramètres abiotiques
1.1. 1- Salinité
Les évolutions temporelles des abondances de E. coli, C. perfringens, S. aureus
et les Streptocoques fécaux dans l’eau de mer ajustée à 90/00 et 35 0/00 (avec et sans
sédiment) sont illustrées dans la figure 4. Dans les conditions du milieu d’incubation
des bactéries (pH 8,3, obscurité et température ambiante), les courbes d’évolution des
bactéries étudiées, par comptage indirect et par épifluorescence au DAPI, présentent des
allures différentes suivant la salinité du milieu et suivant la présence ou l’absence du
sédiment.
A la salinité de 9 0/00, on note une légère décroissance des abondances de C.
perfringens, d’E. coli, de S. aureus et des Streptocoques fécaux dans les erlens. Cette
décroissance peut être expliquée par l’appauvrissement du milieu d’incubation.
A la salinité de 35 0/00 avec et sans sédiment, on note une décroissance à différent
rythme des abondances de E. coli, de C. perfringens, de S. aureus et des Streptocoques
fécaux dans les erlens sans sédiment, alors qu’à la même salinité mais en présence de
sédiment les abondances de ces bactéries diminuent moins rapidement. En effet, les
Streptocoques fécaux ne sont plus cultivables à partir du 7ème jour, alors qu’en
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présence de sédiment elles sont encore cultivables même après le 10ème jour. Les
abondances d’ E. coli, de C. perfringens et de S. aureus respectivement sont de 1,3 103,
3 104 et 7 103ufc/ml en absence de sédiments et de 7 104, 9,4 104 et 3 104ufc/ml en
présence de sédiments.
Figure 4: Effet de la salinité sur la survie des bactéries issues des rejets de
l'abattoir d'El Jadida.
Les T90 à la salinité de 35 0/00 et sans sédiments, sont pour C. perfringens 96 h,
pour S. aureus 60 h, pour E. coli 48 h et pour les Streptocoques fécaux 24 h. On peut
conclure, en maintenant les autres paramètres constants (Température, pH et lumière),
que C. perfringens, S. aureus et E. coli manifestent une halotolérance plus importante
que et les Streptocoques fécaux.
L’évolution des abondances de ces bactéries dénombrées par la méthode au
DAPI montre que le nombre des cellules en dormance après 10 jours d’incubation est
respectivement de 49 %, 34 %, 36 % et 100 % pour E. coli, C. perfringens, S. aureus et
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Streptocoques fécaux.
2- Rayonnement solaire
Les évolutions temporelles des abondances de E. coli, de C. perfringens, de S.
aureus et des Streptocoques fécaux dans l’eau de mer (avec et sans sédiment) exposées
et non à la lumière sont représentées sur la figure 5. L’abondance des bactéries étudiées
diminue plus rapidement en présence de la lumière visible dans l’eau de mer sans
sédiment qu’en obscurité ou en présence de sédiment. La T90 de E. coli exposée avec
ou sans sédiment et non exposée à la lumière est respectivement 36 h, 40 h et 48 h, dans
les mêmes conditions, la T90 de C. perfringens est 48 h, 72 h et 96 h, la T90 de S. aureus
est 18 h, 32 h et 60 h et la T90 de Streptocoques fécaux est 16 h, 30 h et 24 h. On
remarque donc que le rayonnement solaire conditionne la mortalité des bactéries alors
que dans l’essai en présence de sédiment, ces derniers diminuent notablement le pouvoir
de pénétration de la lumière dans l’eau. En effet, S. aureus, les Streptocoques fécaux et
E. coli ne sont plus cultivables respectivement à partir du 5, 6 et 7ème jour. Alors qu’en
présence de sédiment, elles sont encore cultivables même après le 10ème jour. Par
comparaison de T90 de chaque espèce on déduit que l’effet létal de la lumière est plus
marqué pour S. aureus et les Streptocoques fécaux que pour E. coli et C. perfringens.
On note aussi que ces bactéries dénombrées par la méthode au DAPI montrent que le
nombre des cellules en dormance après 10 jours d’incubation est respectivement de 100
%, 65 %, 100% et 100 % pour E. coli, C. perfringens, S. aureus et Streptocoques
fécaux.
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Figure 5: Effet de la lumière sur la survie des bactéries issues des rejets de
l'abattoir d'El Jadida.
3- Température
La figure 6 montre les évolutions temporelles des abondances d’E. coli, de C.
perfringens, de S. aureus et des Streptocoques fécaux dans l’eau de mer incubée à
l’obscurité aux différentes températures 6 et 28°Cau laboratoire. 6 et 28 °C étant
respectivement la température minimale en hiver et la température maximale en été de
l’eau de mer à la plage d’El jadida.
Les résultats des numérations des bactéries à la fin de la durée d’incubation dans
l’eau de mer stérile montrent, respectivement, que les T90 sont de 72 h, 120 h, 72 h, 48
h à la température de 6°C et 48 h, 96 h, 60 h, 24 h à la température de 28 °C. On
remarque, donc, que la température 28 °C a plus d’effet sur les T90 pour les bactéries
étudiées que la température de 6 °C.
Le nombre de cellules en dormance, dénombrées par la méthode au DAPI, après 10
jours d’incubation est respectivement de 49 %, 34 %, 36 % et 100 % pour E. coli, C.
perfringens, S. aureus et Streptocoques fécaux.
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Figure 6 : Effet de la température sur la survie des bactéries issues des rejets de
l'abattoir d'El Jadida.
2. SURVIE DES BACTERIES EN MER DANS LES CHAMBRES DE
DIFFUSION
Dans cette étude, les chambres de diffusion sont immergées dans l’eau de mer à
proximité du port d’El jadida. Les facteurs physico-chimiques du site sont contrôlés. La
température varie entre 20- 21°C, la salinité de 350/00, le pH varie de 8,2 à 8,3,
l’oxygène dissout est de 7,79 mg O2/l et l’intensité lumineuse est supérieure à 2000 lux
à midi. Les cellules bactériennes sont mises dans 2 chambres de diffusions l’une
contenant de l’eau de mer stérile et l’autre contenant l’eau de mer non stérile pour
étudier l’effet de la prédation.
2.1- dans l’eau de mer stérile
L’évolution temporelle des abondances d’E. coli, de C. perfringens, de S. aureus
et des streptocoques fécaux dénombrées par la méthode indirecte (milieux sélectifs et
TSA additionné de 6
0
/00 d’extrait de levure) et par la méthode directe (par
épifluorescence au DAPI) est consignée dans la figure 7.
15
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Après 48 h d’exposition, les bactéries ne se développent plus sur leurs milieux
sélectifs mais peuvent cultiver sur TSA. En effet, le pourcentage des cellules
cultuvables après 48 h d’incubation est respectivement de 48, 73, 29 et 37 pour E. coli,
C. perfringens, S. aureus et pour les streptocoques fécaux alors que le pourcentage des
cellules altérées est respectivement de 39, 15, 31 et 54. Ceci démontre leur altération
après leur séjour en eau de mer. Cependant, le comptage par la méthode au DAPI
montre qu’après 48h, l’effectif des bactéries diminue mais elles restent vivantes.
Ces résultats montrent que la majorité des bactéries, sous l’action des facteurs de stress
dans l’eau de mer, sont viables mais non cultivables sur leurs milieux de culture
classiques, elles entrent donc en état de dormance.
Figure 7 : Evolution des abondances des bactéries en chambre de diffusion en eau
de mer stérile.
2.2- dans l’eau de mer non stérile
L’évolution temporelle des abondances d’E. coli, de C. perfringens, de S. aureus
et des streptocoques fécaux incubées dans l’eau de mer non stérile est consignée dans la
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figure 8. Après 36 h d’exposition, aucune cellule bactérienne n’est détectable sur leurs
milieux sélectifs et non sélectifs. Cependant le comptage direct au microscope à
épifluorescene et après le même temps d’exposition montre que quelques bactéries sont
vivantes. Ceci suggère que l’ensemble des cellules bactériennes qui, en plus de leur état
physiologique altéré, comme décrit précédemment, elles sont affectées par les facteurs
biotiques c’est à dire par la prédation (infestation virale...).
Figure 8 : Evolution des abondances des bactéries en chambre de diffusion en eau
de mer non stérile.
DISCUSSION
Cette étude nous a donné une idée sur la survie de certaines bactéries, issues des
déchets d’abattoir, vis à vis des facteurs de stress du milieu marin récepteur. La salinité
est l’un des principaux facteurs de stress subit par les bactéries d’origine entériques
arrivant en milieu marin (Choon Weng Lee et al., 2011). En effet, dans notre travail
nous avons mis en évidence l’effet néfaste de la salinité sur la survie bactérienne en
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absence de sédiment. Par contre, en présence de sédiments, la survie des
microorganismes est comparable à celle des eaux marines. ce résultats concordent avec
ceux de Wiklund, 1995 et Elmanama et al., 2005. La présence de matière organique
dans l’eau et dans les sédiments joue un rôle protecteur vis à vis des cellules
bactériennes et lui permet d’équilibrer sa pression interne en fonction de la
concentration en sel de l’eau de mer (Chandran et al., 2011). Par ailleurs, McCarthy
(1977),
Michel
et
Dubois-
(1980)
et
Wiklund
(1995)
ont
montré
que
Aeromonassalmonicida peut survivre jusqu’à 291 jours dans une eau de mer stérile
contenant de sédiments. Ainsi la plupart des bactéries adhèrent aux surfaces et peuvent
rester ainsi actives à de très faible niveau de concentration en nutriments (Janasch et
pritchard, 1972; Gerba et al., 1975), alors qu’elles n’auraient pu le faire dans le même
milieu en étant libre (Brown et al, 1977).
Gauthier et al. (1991) ont montré qu’E. coli résiste mal à l’eau de mer, même en
présence de la glycine bétaïne. Dans ces conditions, les cellules n’accumulent que de
très faibles quantités de glycine-bétaïne car l’expression des gènes codant pour le
transport de cette molécule sont réprimées par contre, si les cellules sont en contact avec
des sédiments contenant de fortes proportions de matière organique, les teneurs
intracellulaires en bétaïnes sont beaucoup plus fortes et la survie est plus importante.
Ces résultats suggèrent que les cellules ont besoin de substances nutritives en plus des
osmoprotecteurs pour pouvoir surmonter le choc osmotique Les sédiments contiennent
plus de matière organique que l’eau de mer, ils servent ainsi de source de carbone et
d’azote mais aussi comme source d’osmoprotecteurs. Cette halo-tolérance en présence
du sédiment peut être expliquée par le fait que celui-ci offre aux bactéries les éléments
nécessaires à leur survie : nutriments et composés osmoprotecteurs; par contre dans
l’essai sans sédiments le choc osmotique est plus important ce qui accélère le processus
de mortalité de ces bactéries.
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De récents travaux ont montré que les cellules bactériennes entretiennent une
pression interne élevée, chez E. coli est de 546 atm induisant les protéines Hsps et Csps
(Fumiyoshi et al, 1999), leur contact avec le milieu marin salé (350/00) provoque une
chute de cette pression au-dessous d’un seuil qui n’est plus compatible avec le
métabolisme, donc avec le développement. Le rétablissement de l’équilibre osmotique
entre le milieu extérieur et le cytoplasme bactérien met en jeu, dans certaines
conditions, des mécanismes variés qui évitent la lyse de la cellule. Très
schématiquement, ces mécanismes font appel à une augmentation de la concentration de
certains solutés dans les cellules. Ils ont été décrits, chez E. coli, Shewanella benthica,
Saccharomyces cerevisiae, Salmonella et Klebsiella par (Csonka, 1989; Qureshi et al.,
1998; Fumiyoshi et al., 1999).
L’évolution temporelle d’ E. coli, de C. perfringens, de S. aureus et des
streptocoques fécaux en présence et en absence des rayonnements solaires, révèle que
ces microorganismes sont très sensibles au rayonnement solaire quand ils se
développent dans l’eau de mer. L’effet combiné de la salinité et du rayonnement solaire
est négatif pour les microorganismes étudiés. Ce constat est en concordance avec les
résultats de Gameson et saxon, 1967; Mc Cambridge et Mc Meekin, 1980 ; Kapuscinski
et Mitchell, 1983 ; Barcina et al., 1986; Bonnefont et al., 1990 ; Pommepuy et Guillaud,
1992 ; Solic et Krustulovic, 1992 ; Gourmelon et al., 1994 ; Sinton et al., 1999 ; Rozen
et Belkin 2001 ; Chandran et Hatha, 2005 ; et Walters et al., 2009 Nombreux sont les
travaux qui ont abordés le mode d’action du rayonnement solaire sur les bactéries
(Tuveson et al., 1983 ; Sammartano et Tuveson, 1985 ; Davies-Colley et al., 1994 ;
Sinton et al., 1999 et Rozen et Belkin 2001). Ces auteurs ont montré que la fraction UV
des radiations solaires a un effet bactéricide. Ces radiations agissent sur la cellule en
induisant des dommages soit directement sur l’ADN (Davies-Colley et al., 1994 et
Sinton et al., 1999) soit indirectement par libération des ions peroxydes qui se forment
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après réduction du radical O2- suite à une réduction incomplète de O2 durant la
respiration bactérienne (Goerlich et al., 1989 ; Curtis et al., 1992 ; Sammartano et al.,
1986). Ces peroxydes agissent sur la cellule bactérienne en la rendant perméable aux
sels inorganiques changeant de ce fait sa pression osmotique. L’action bactéricide des
UV, surtout les UV (280-329 nm), sur la survie bactérienne dépend, entre autres, de la
turbidité de l’eau (Qualls et al., 1983 ; Mezrioui, 1987 et Pommepuy et Guillaud,
1992). En effet, la matière organique en surface absorbe la majorité des UV et protège
les cellules bactériennes contre les effets du rayonnement solaire. Chung et Sobsey
(1993) ont montré que les petites particules inférieures à 10 m peuvent protéger la
cellule bactérienne contre les effets des UV.
La température est aussi l’un des paramètres faisant partie des modèles
explicatifs des évolutions des abondances bactériennes dans l’eau de mer (Davey,
1989 ; Chung et Sobsey, 1993 et Wiklund, 1995). Lors de notre étude, les résultats
obtenus montrent que les basses températures (6°C) favorisent la survie des bactéries
étudiées dans l’eau de mer stérile. Ces résultats sont en concordance avec ceux de Hirn
et al., (1980) ; Chung et Sobsey (1993) ; Wiklund (1995) et Chraibi (1996), qui ont
montré que les bactéries indicatrices de la pollution fécale survivent mieux dans l’eau
durant la période d’hiver que la période d’été. Ceci peut être expliqué par le fait que les
basses températures limitent les dépenses énergétiques de la cellule bactérienne par
diminution de son activité métabolique. En effet, dans un milieu aquatique, où les
nutriments existent en concentration élevée, la survie, voir même la croissance
bactérienne peut se produire si les températures sont proches de celles favorisant la
croissance optimale de la bactérie. A l’inverse quand les substances nutritives font
défaut, la survie est alors favorisée par les basses températures qui limitent les dépenses
énergétiques de la cellule bactérienne par une diminution de son activité métabolique.
Alors qu’à ces mêmes températures les produits toxiques en même temps que les fortes
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concentrations de nutriments ne sont que très lentement métabolisées (Lessard et
Sieburth, 1983). La température 25°C augmente la diffusion des produits toxiques
présents dans le milieu d’incubation et par la suite permettrait leur transport à l’intérieur
de la cellule. Bremer et al., (1998) ont montré que Listeria monocytogenes peut survivre
dans l’eau de mer pendant 10 à 30 jours à une température de 28°C alors qu’elle peut
survivre jusqu’à 110 jours à une température de 5°C.
D’autre part, le comptage direct par épifluorescence au DAPI effectué sur les
souches bactériennes testées durant l’expérience de survie au laboratoire a montré que le
nombre de ces bactéries reste relativement constant. Le même résultat a été retrouvé par
Munro et Colwell, (1996), Chraibi (1996) et Bremer et al., (1998) en étudiant le
comptage de V. cholerae, E. coli, C. perfringens et L. monocytogenes par la méthode à
l’Acridine Orange ou au DAPI. Ils ont montré que le comptage par cette méthode donne
un nombre de bactéries plus élevé que celui obtenu par les méthodes classiques de
comptage indirect sur les milieux spécifiques. Ainsi en fonction de l’environnement
bactérien, celles-ci continuent à vivre d’une façon normale pendant un certain temps,
puis modifient leur métabolisme pour surmonter les facteurs de stress. Dans ce dernier
cas, la mise en évidence de ces bactéries par les méthodes d’analyses classiques est
alors très difficile. La bactérie peut persister et passer inaperçue à travers des systèmes
de détection utilisés de routine (Pommepuy et Guillaud, 1992). Ainsi, différentes étapes
ont pu être mises en évidence lors de la survie d’E. coli (Roszack et Colwell, 1987).
Dans les premiers stades, dits «Viables», la bactérie présente un métabolisme qui lui
permet d’être recultivée en utilisant des méthodes dites douces ; à un stade ultérieur les
cellules ne peuvent plus être cultivées mais elles continuent à pouvoir utiliser du
matériel exogène et à avoir un métabolisme actif.
L’effet de la présence ou de l’absence de prédateurs bactériens sur la survie des
bactéries entériques dans différents écosystèmes aquatiques a été étudiée par plusieurs
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auteurs (Enzinger et Cooper, 1976 ; McCambridge et McMeekin, 1980 ; Rhodes et
Kator, 1988 ; Gonzalez et al., 1990 ; Massana et Pedros-Alio, 1994 ; Delille, 1994 ;
Chraibi, 1996 ; Rozen et Belkin 2001 ; Chandran et Hatha, 2005 ). Nos résultats ont
montré qu’en absence de la flore naturelle ou prédatrice, dans les chambres de diffusion,
l’abondance d’E. coli, de C. perfringens, de S. aureus et des Streptocoques fécaux
montre une diminution moins importante qu’en leur présence, suggérant que ces
derniers ont un effet de prédation sur les bactéries. En effet, Barcina et al., 1991 a
montré que les protozoaires sont le principal facteur responsable de l’élimination des
bactéries entériques dans l’écosystème marin et que ces protozoaires appartenaient au
nanoplancton. Les prédateurs microbiens comme Bdellovibrio sp. (Guélin et al., 1967 ;
Mitchelle et Morris, 1969 ; Mc Cambridge et Mc Meekin, 1980 ) et les bactériophages
(Carlucci et Pramer, 1960 ; Flint, 1987 ; Proctor et al., 1988) ont été aussi proposés
comme une cause possible de la mortalité bactérienne dans les eaux naturelles, bien que
leur importance quantitative reste discutable (Pace , 1988 ; Sherr et al., 1989).
Cependant ces prédateurs microbiens paraissent agir seulement sur les bactéries
vivantes (Carlucci et Pramer, 1960 ; Shilo, 1984
Hurst, 1989). L’utilisation des
bactéries marquées par fluorescence montre l’effet possible de ces prédateurs
microbiens sur les bactéries testées (Gonzalez et al., 1990).
L’utilisation des chambres de diffusion nous a permis de démontrer que l’effet
combiné des paramètres physico-chimiques et biologiques est plus marqué sur la survie
des bactéries que si l’un des paramètres agit seul. En conclusion, la survie des bactéries
dans le milieu marin dépend de plusieurs facteurs physico-chimiques et biologiques.
Ces facteurs agissent séparément ou combiné (Solic et Krstulovic, 1992). Ainsi la
prédation par les protozoaires à une grande importance dans l’élimination des bactéries,
d’autre part les facteurs physico-chimiques (salinité, lumière et température) eux ont
une action sur la dormance bactérienne. Cependant, ces bactéries pourraient conserver
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leur éventuelle virulence une fois réinjectés à l’homme. Cet état de dormance n’est donc
bien qu’une étape transitoire de maintien dans l’attente de conditions plus favorables.
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