cours de microbiologie generale - Cours en Ligne

1ère année – 2016/2017
AM Davila et C Tinsley
COURS DE MICROBIOLOGIE
GENERALE
1
Cours et TP de microbiologie à l’emploi du
temps
Date
Demie promo A
7 sept
Cours 1 (structures)
7 sept
Cours 2 (génétique)
Demie promo B
8 sept
Cours 1 (structures)
8 sept
Cours 2 (génétique)
9 sept
TP 1
12 sept
TP 2
13 sept
TP 3
14 sept
TP 1
15 sept
TP 2
16 sept
TP 3
3 oct
Cours 3 (métabolisme)
Cours 3 (métabolisme)
2
Salles de
TP
 Le cours est dans le « bloc Sciences de la Vie et du Milieu ».
 Pré requis : bases solides en biologie générale, biochimie,
génétique et biologie moléculaire.
Contenu et objectifs des cours.
 Bases qui seront utilisées (en ce qui concerne la première année)
dans d’autres parties du tronc commun et dans les modules à
choix.
 Spécificités structurales des bactéries, génétique, métabolisme et
physiologie. Eléments importants pour les interactions avec les
autres composants de la biosphère (biotiques et abiotiques) dans
les activités humaines
Contenus et objectifs des TP
 Mettre en pratique les principales méthodes expérimentales
utilisées en microbiologie
 Identification d’une souche bactérienne,
étude de sa
morphologie et de son métabolisme
 Etude d’un transfert génétique entre bactéries (conjugaison)
4
INTRODUCTION
5
Classification des organismes
cellulaires
ANIMAUX
PLANTES
EUCARYOTES
PROTISTES
algues
protozoaires
champignons
Domaine de la
microbiologie
PROCARYOTES
EUBACTERIES
ARCHAE
Virus
Acellulaire
6
Ordres de magnitude
liaison
C-C
diamètre de
distance
nucléosome
inter-bases l'hélix d'ADN
poxvirus
de l'ADN
membrane
porine
cellulaire
RNA pol.
d'E. coli
procaryote
LacI
glucose
λ
ribosome
10-10
10-9
10-8
liaison C-C
distance inter-bases de l'ADN
glucose
pore du porine d'E. coli
diamètre de l'hélix d'ADN
LacI
bactériophage λ
epaisseur de la membrane cellulaire
nucléosome
10-7
1,5
3,4
6
1
2,4
4
6
8
1
x 10-10
x 10-10
x 10-10
x 10-9
x 10-9
x 10-9
x 10-9
x 10-9
x 10-8
Plasmodium
mérozoïte
Paramecium
E. coli
10-6
erythrocyte
S. cerevisiae
10-5
RNA pol. Procaryote
ribosome
poxvirus
bacterium
Plasmodium mérozoïte
erythrocyte
yeast
Paramecium
oocyte humain
10-4 m
1,2
2
2
+/4
7,5
1
1
1
x 10-8
x 10-8
x 10-7
10-6
x 10-6
x 10-6
x 10-5
x 10-4
x 10-4
7
Grandes caractéristiques du monde
microbien
•Petite taille (inférieure à 0,1 mm)
Conséquences sur :
Invisibilité, possibilité de dissémination, capacité à
donner des populations denses, techniques
expérimentales
Rapport surface/volume élevé, capacités d ’échange
élevées
Simplicité des structures cellulaires
•Diversité morphologique
•Diversité taxonomique
•Diversité physiologique et métabolique
8
Méthodes expérimentales
Largement illustrées dans les travaux pratiques
 Etude des individus isolés : difficile
 Observations microscopiques (photonique, électronique)
 Cytométrie en flux
 Etude après propagation : souvent nécessaire
 Techniques d’isolement et de culture
 Etude sans culture préalable
 Techniques de manipulation aseptique
9
Grands types morphologiques
10
11
SPÉCIFICITÉS STRUCTURALES
DES PROCARYOTES
12
Schéma type et simplifié d’une cellule
bactérienne
13
Contenu cytoplasmique
 Nucléoïde
 Plasmide(s)
 Ribosomes et polysomes (grande similarité avec




ceux des eucaryotes)
Matrice cytoplasmique : siège de la plupart des
fonctions métaboliques
Inclusions, granules de réserve
Vésicules (rares)
Cytosquelette
Bacillus subtilis
Microscopie électronique
14
Nucléoïde
 Un chromosome bactérien surenroulé associé
à des protéines qui participent au maintien de
la structure
 ARN et ARN polymérase
Un modèle de la structure générale
du chromosome bactérien. (A) Le
chromosome circulaire d’ E. coli non
replié. (B) L’ ADN replié en
domaines chromosomiques par des
associations protéine-ADN. Les
points noirs représentent des
protéines qui interagissent entre
elles et avec l’ADN. Ce schéma
montre six domaines mais E. coli en
présente environ 50. (C)
Chromosome compacté sous l’effet
du surenroulement et d’interactions
protéines-ADN.
15
Granules de réserve
a
b
Granulations de poly--hydroxybutyrate chez Sphaerotilus natans.
a : microscopie électronique
b : microscopie optique
Globules de soufre chez Thiomargarita namibiensis.
16
Inclusions
Vésicules de gaz (hexagonales) chez la cyanobactérie
Microscystis sp.
Cellule en cours de division.
Observation en microscopie électronique.
Bactéries magnétotactiques de
la mer Méditerranée observées
au microscope électronique.
La flèche indique une chaîne de
magnétosomes. (D’après Pradel)
17
Rôle des pigments
 Les pigments ont la capacité de passer d’un état
énergétique à un autre en changeant de couleur
 Production d’énergie
 Stockage d’énergie (molécule organique – métabolite
secondaire)
 Protection contre les rayonnements
 Evolution secondaire ?





Réponse au stress
Antimicrobien
Toxine
Virulence
Signalisation
18
Cytosquelette bactérien
 Le cytoplasme des bactéries contient des protéines
homologues de l’actine et de la tubuline des eucaryotes.
 Sous forme polymérisée, ces protéines participent au
recrutement d’autres protéines (enzymes).
 Exemples de rôles connus
 Homologue de la tubuline intervient lors de la division : polymérisation
en anneau, au milieu de la cellule, sous la membrane cytoplasmique ,
recrutement des protéines qui assureront la formation du septum
 Homologues de l’actine contrôle la forme de la bactérie : assure le
positionnement d’enzymes et de complexes membranaires
intervenant dans la synthèse ou l’hydrolyse de la paroi.
Visualisation des filaments
hélicoïdaux de l'actine bactérienne
chez Bacillus subtilis (microscopie à
fluorescence)
© R. Carballido-López
19
Schéma type et simplifié d’une cellule
bactérienne
20
Particularités de la membrane
cytoplasmique des procaryotes
Vs eucaryotes
Structurales
 Pas de stérols (sauf chez
les mycoplasmes) mais
parfois des hopanoïdes
 Plus de protéines
Fonctionnelles
 Respiration : déshydrogénases,





coenzymes, ATPase
Photosynthèse : pigments
antennaires et centres
réactionnels
Synthèse d’éléments de la paroi et
des pili
Assemblage et sécrétion de
protéines membranaires et des
exo-protéines
Mobilité : structure basale des
flagelles
Réception de messages chimiques
: chimiotaxie et régulation du
métabolisme
21
Invaginations de la membrane
Augmentation de la surface : activité respiratoire intense,
photosynthèse
Nitrosomonas : observations au microscope électronique
A : cellules intactes ; B : cellules après lavage spécifique
22
Paroi bactérienne
 Enveloppe caractéristique de la cellule
procaryote
 Paroi rigide qui confère à la cellule sa forme ;
parfois qualifiée d’exosquelette
 Fonctions
 Permet de résister à la forte pression osmotique
interne (5 à 20 atm)
 Permet de résister aux agressions extérieures,
chimiques, physiques, biologiques
 Barrière qui autorise les échanges avec
l’extérieur mais elle s’oppose à la pénétration
des plus grosses molécules
23
Paroi bactérienne
 Dans la paroi il existe un élément caractéristique et quasiment
commun à tous les procaryotes : la muréine ou peptidoglycane
Structure chimique de la muréine : motif de base
N-acétylglucosamine
Acide N-acétylmuramique
Tétrapeptide
24
Peptidoglycane
25
Coloration de Gram
Une bactérie à Gram positif
Bacillus cereus
Une bactérie à Gram négatif
Serratia marcescens
26
Paroi type des bactéries à
Gram positif
27
Acides teichoïques
 Peuvent représentés jusqu’à 50%
du poids de la paroi
 Acides teichoïques liés à la
muréine
 Acides lipoteichoïques liés à la
membrane cytoplasmique
 Déterminants antigéniques
28
Paroi type des bactéries à
Gram négatif
29
Lipopolysaccharide LPS
• Lipide A : support de la toxicité de la molécule
• Polysaccharide : responsable de la spécificité antigénique
• Chaîne latérale O : permet le sérotypage (antigène O de paroi)
30
Espace périplasmique
 Significatif chez les bactéries à Gram négatif
 Contient des protéines différentes de celles du cytoplasme
 Ces protéines sont impliquées dans des fonctions aussi variées que
 Le transport de molécules, l’efflux
 La dégradation de molécules
 La mobilité (présence de chimiorécepteurs)
(Tamber et Hancock, 2003)
31
Principe coloration de Gram
(D’après M Naïtali)
32
Schéma type et simplifié d’une cellule
bactérienne
33
Couche S
 Extérieure à la paroi
 Bactéries à Gram + : pas de liaison covalente avec la
muréine
 Bactéries à Gram - : couche S ancrée au LPS
 Formée d’un ou deux types de polypeptides parfois
additionné de glucide, arrangés en réseau d’aspect
cristallin carré, hexagonal ou oblique
 Membrane primitive ?
 Fonctions




Filtre pour les grosses molécules
Fonctions anti-phagocytaires et anti-bactériophage
Protection contre les variations de pH
Adhésion
34
Glycocalix
 Couche généralement constituée de polysaccharides
fibrillaires qui entoure la paroi
 Cohésion à la cellule bactérienne plus ou moins forte
(capsule, slime, EPS)
Capsule
Acinetobacter sp en
microscopie optique
Colonie de Xanthomonas
campestris (Jarober - NC
State University Plant
Pathology )
Cellules bactériennes produisant des
EPS en microscopie électronique
35
Fonction du glycocalix
 Adhésion aux surfaces et formation de
microcolonies
 Protection contre les agressions chimiques et
biologiques comme la phagocytose (facteur de
virulence) et la prédation (protozoaires)
Utilisations possibles du glycocalix
 Spécificité sérologique (antigène K de capsule ou
d’enveloppe) – utilisation diagnostique
 Utilisation des propriétés gélifiantes,
émulsifiantes, lubrifiantes, etc
36
Pili commun
(fimbriae)
Flagelles et pili
Flagelles
http://www.pref.okayama.jp/okayama/fukushi/kensaka/images/o1
57_3.jpg
Bactérie magnétotactique
Dispositions courantes des flagelles
37
Composition chimique des
flagelles et pili
 Flagelles
 Composés principalement d’une protéine, la
flagelline (sous unités répétées disposées en
hélice)
 Pili
 Pili communs (fimbriae) et pili sexuels (transfert
de matériel génétique entre deux bactéries)
 Essentiellement constitués de protéines, pilines et
adhésines dans un arrangement spatial en
cylindre droit
38
Propriétés et fonctions des
flagelles et des pili
 Les flagelles
 Propriétés antigéniques – antigène H flagellaire
(immunité et sérotypage)
 Mobilité
 Les pili communs
 Propriétés antigéniques (immunité)
 Rôle dans l’adhésion aux surfaces inertes ou aux cellules
(formation de biofilm, facteur de virulence)
 Peuvent être les éléments moteurs de la locomotion par
glissade ou par saccade
 Eléments terminaux de systèmes de sécrétion (virulence)
 Peuvent présenter des récepteurs (bactériophages)
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Locomotion chez les bactéries
Possible pour certaines bactéries sous conditions particulières
d’environnement. Les mécanismes moléculaires ne sont pas tous
élucidés surtout en ce qui concerne la mobilité en milieu solide
 Milieu liquide
 Nage par propulsion flagellaire (swimming)
 Hydrostation (par l’intermédiaire de vésicules de gaz)
 Milieu solide
Swarming (essaimage)
• Mvt coordonné
• Différentiation
• Flagelles + surfactant
ou eau
Twitching (saccade)
•Mvt coordonné
• Pili de type IV + eau ou
surfactant
Gliding (glissement)
• Mobilité aventureuse
• Propulsion par
macromolécules et/ou

mvt structures externes
Sliding ( étalement)
• Expansion de la
colonie + réduction
tension de surface
(surfactants, etc)
Harshey, 2003
40
Locomotion par propulsion flagellaire
Attachement du flagelle chez une bactérie
à Gram négatif
Prescot et al. Microbiology
(wikipedia)
•Nécessite un gradient de
protons
•Tactismes : chimiotactisme,
aérotactisme, phototactisme,
magnétotactisme, etc
41
Biofilm
Communautés de microorganismes, possédant une structure tridimensionnelle et englobées d'une matrice extracellulaire (polysaccharide,
ADN, protéines . . . )




constituées d'une ou, plus souvent, de plusieurs espèce(s)
augmentation d’adhésion aux surfaces
augmentation de la résistance aux attaques chimiques ou physiques
Communication et développement coordonné des organismes
constituants
Développement d'un biofilm
JM Ghigo, Institut Pasteur, Paris
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Biofilm et quorum sensing
Communauté multicellulaire complexe
 L’organisation dépend d’un processus de communication inter-cellulaire- Quorum sensing
 Les auto-inducteurs : petites molécules qui à forte concentration sont à l’origine d’une
réponse concertée (coopération) dans la communauté
Faible densité bactérienne
Auto-inducteurs en faible
concentration perdus par diffusion
D’après C Tinsley
Forte densité bactérienne
Auto-inducteur rencontre un récepteur
Signal transmis à la machinerie transcriptionnelle
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Spore bactérienne
Observation au microscope
photonique
Structure de la spore bactérienne
C’est une forme de résistance qui
résiste à
• Température (minimum
• Antibiotiques
• Désinfectants
• Dessication
• Rayonnements (UV, X)
10 min à 80°C)
Endospore de Bacillus
subtilis observée au
microscope électronique
44
Sporulation
JF Perrin 2010
Germination possible si les conditions environnementales le
permettent
45
Structures bactériennes peuvent être
 Obligatoires pour leur survie et leur développement
 Nécessaires pour leur survie ou protection
 Eléments d’interaction avec l’environnement
biotique ou inerte
 Utiles du point de vue taxonomique ou diagnostic
(ex Gram, sérotypage)
 Autres applications dans les activités humaines
Peintures avec des bactéries
Huffington post 8 avril 2016
46
(D’après M Naïtali)
47
Principaux ouvrages utilisés
 Physiologie de la cellule bactérienne : une approche
moléculaire
 FC Neidhardt, JL Ingraham, M Schaechter
 Cours de microbiologie générale
 A Meyer, J Deiana, A Bernard
 Molecular genetics of bacteria
 L Snyder et W Champness
 Microbial ecology
 R Atlas et R Bartha
 Bacterial metabolism
 G Gottschalk
 Microbiology webbed out
 T Paustian et U Wisconsin
 Microbes-edu.org
48