la bioluminescence de l`aequorine

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS VI
Spécialité :
NEUROSCIENCES
Présentée par :
Ludovic Tricoire
Pour l’obtention du grade de :
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS VI
LABIOLUMINESCENCE DE L’AEQUORINE EN REPONSE
AU CALCIUM INVITRO ET DANS LE CORTEX CEREBRAL
Thèse dirigée par :
Dr. Bertrand LAMBOLEZ
Soutenue le 6 octobre 2006 devant le jury composé de :
Pr. Régis LAMBERT Président
Dr. Valérie CREPEL Rapporteur
Pr. J. Woodland HASTINGS Rapporteur
Pr. Jean ROSSIER Examinateur
Dr. Bertrand LAMBOLEZ Examinateur

Remerciements
Je tiens à exprimer ici toute ma gratitude à Bertrand Lambolez qui a dirigé mon travail
au cours de ces quatre années de thèse. Je lui suis particulièrement reconnaissant, non
seulement pour son aide, sa disponibilité, et la confiance qu’il m’a accordée depuis mon
arrivée au laboratoire, mais aussi pour avoir su cultiver une atmosphère de travail
particulièrement stimulante et chaleureuse. Je te suis reconnaissant de m'avoir donné les
moyens pour mener à bien mon travail dans les meilleures conditions.
Je remercie vivement les professeurs Jean Rossier et Jean Mariani pour m’avoir
accueilli au sein de leur laboratoire respectif et m’avoir permis de réaliser ce travail dans
d’excellentes conditions. Leurs conseils scientifiques et professionnels avisés, leur
dynamisme et leur bienveillance m’ont été particulièrement précieux au cours de ces
années.
Je remercie respectueusement et chaleureusement le professeur Régis Lambert qui
me fait l’honneur d’être membre du Jury de cette thèse, ainsi que le professeur J. Woodland
Hastings et le Dr Valérie Crépel qui ont accepté d’être les rapporteurs de ma thèse.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à tous les membres du Laboratoire de
Neurobiologie des Processus Adaptatifs pour leurs encouragements et leur soutien. Je
remercie très chaleureusement les personnes de l’équipe Neuromodulateurs et Dynamiques
des Seconds Messagers à savoir, Estelle Drobac, Régine Hepp, Danièle Tritsch, Emilie Hu,
Pierre Vincent et Nicolas Gervasi. Ce fut un réel plaisir de travailler avec vous. Je vous suis
particulièrement reconnaissant pour toute l’aide que vous avez apportée au cours de ces
années. Je tiens également à remercier pour leurs encouragements les membres de l’équipe
Réseaux de Neurones et Rythmes Physiopathologiques à savoir Nathalie Leresche, Fanny
Dreyfus, Régis Lambert et Thomas Bessaih. Un merci spécial pour Rosine Wehrle pour sa
bonne humeur et ses bons conseils.
Je remercie tous les membres du Laboratoire de Neurobiologie à l’ESPCI, avec qui j’ai
travaillé durant la première partie de ma thèse, en particulier Hélène Geoffroy, Jean Rossier,
Bruno Cauli et Thierry Gallopin, pour leur soutien et leurs conseils avisés. Je tiens également
à remercie Isabelle Férézou et Armelle Rancillac. Je remercie tout spécialement Marcel
Léopoldie pour tout l’aide qu’il m’a apportée.
Je remercie également tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin durant ma thèse. Je
remercie tout particulièrement toute ma famille et en particulier, mes parents ainsi que ma
marraine et mon parrain, qui m’ont permis de poursuivre mes études dans les meilleures
conditions et qui m’ont soutenu et encouragé tout au long de ces années.

A Frédo
A Mon Bon Papa et Ma Bonne Maman,
A Mon Papé et ma Mamé,
Je leur dédie ce travail.

RESUME
Mon travail de doctorat a consisté à étudier in vitro la bioluminescence calcium
dépendante de la photoprotéine aequorine puis d’utiliser cette bioluminescence afin de
réaliser l’imagerie des activités du réseau néocortical. En effet, cette protéine peut être
exprimée dans des types cellulaires spécifiques et sa bioluminescence présente un rapport
signal/bruit très élevé et pas de toxicité.
Dans un premier temps, j’ai recherché des mutations modifiant les propriétés de
bioluminescence de l’aequorine par une approche de mutagenèse aléatoire et d’évolution in
vitro. J’ai ainsi obtenu des mutants dont la stabilité, la sensibilité calcique et/ou la cinétique
de bioluminescence étaient modifiées. L’étude de ces mutants a permis de mettre en
évidence les relations étroites entre la cinétique d’émission de la bioluminescence et la
sensibilité calcique de l’aequorine. Ces travaux ont permis de mieux comprendre comment la
liaison du calcium induit l’émission d’un photon par l’aequorine.
Dans un second temps, j’ai développé une approche d’imagerie des activités
d’ensembles neuronaux grâce à une chimère GFP-aequorine exprimée en tranches de
néocortex à l’aide d’un virus Sindbis recombinant. J’ai utilisé cette approche pour étudier la
modulation cholinergique de l’activité corticale évoquée par stimulation électrique. J’ai pu
montrer que les agonistes muscariniques augmentent l’extension spatiale et la durée des
réponses du réseau néocortical aux stimulations électriques.
Mots clés : Aequorine, Calcium, Luminescence, EF-hand, Imagerie, Néocortex,
Acétylcholine
SUMMARY
During my PhD, I investigated in vitro the calcium-dependent bioluminescence of the
photoprotein aequorin and then used its bioluminescence to image neuronal activities in the
neocortical network. This genetically encoded calcium sensor can be expressed in specific
cell types and its bioluminescence is not toxic and exhibit a high signal/noise ratio.
I first search for mutations modifying aequorin bioluminescence, using a random
mutagenesis and in vitro evolution approach. I isolated mutants showing modified stability,
calcium sensitivity and/or luminescence kinetics. The study of these mutants disclosed
relationships between bioluminescence kinetics and calcium sensitivity of aequorin. These
results help to understand how calcium binding leads to photon emission by aequorin.
Next, I used the bioluminescence of a GFP-aequorin chimera expressed in
neocortical slices with the recombinant Sindbis virus to image the activities of neuronal
ensembles. Using this approach, I studied the cholinergic modulation of neocortical
responses to electrical stimulation. I showed that muscarinic agonists increase spatial extent
and the duration of neocortical network responses to electrical stimulations.
Keywords : Aequorin, Calcium, Luminescence, EF-hand, Imaging, Neocortex,
Acetylcholine

1
TABLE DES MATIERES
LA BIOLUMINESCENCE DE L’AEQUORINE ............................................................................2
1I
NTRODUCTION .......................................................................................................................2
1.1 La biologie de la bioluminescence ................................................................................2
1.1.1 Généralités sur la bioluminescence..................................................................................... 2
1.1.2 Diversité des systèmes bioluminescents ............................................................................. 6
1.1.3 Origine de la coelentérazine..............................................................................................13
1.2 La photoprotéine aequorine ........................................................................................ 15
1.2.1 Préparation de l’aequorine................................................................................................. 15
1.2.2 Bioluminescence de l’aequorine indépendante du calcium ............................................... 15
1.2.3 Activité luciférase de l’aequorine ....................................................................................... 16
1.2.4 Structure de l’aequorine..................................................................................................... 18
1.3 Le domaine de liaison du calcium Dans l’aequorine : l’EF-hand ................................23
1.3.1 Structure d’un domaine EF-hand....................................................................................... 23
1.3.2 Affinité pour le calcium....................................................................................................... 26
1.3.3 Bioluminescence de l’aequorine dépendante du calcium .................................................. 26
1.4 Mécanisme de la bioluminescence .............................................................................28
1.4.1 De la liaison du calcium à l’émission de lumière................................................................ 28
1.4.2 La chimie de la bioluminescence. Les espèces émettrices ............................................... 30
1.4.3 L’émission de lumière par le coelentéramide..................................................................... 32
1.4.4 Transfert d’énergie de biolumnescence par resonance (BRET) ........................................ 34
2. RESULTATS : ETUDE DE L’AEQUORINE PAR MUTAGENESE ALEATOIRE ET CRIBLAGE FONCTIONNEL
.........................................................................................................................................................36
2.1 Présentation de l’article 1 : “Thermostable mutants of the photoprotéin aequorin
obtained by in vitro evolution”...................................................................................................... 37
2.1.1 Sélection des mutants Bright et SloDK.............................................................................. 37
2.1.2 Thermostabilité .................................................................................................................. 37
2.1.3 Déclenchement de la bioluminescence par liaison du Ca2+à l’EF3.................................... 38
Article 1 : Thermostable mutants of the photoprotéine aequorin obtained by in vitro evolution .. 39
2.2 Présentation de l’article 2 : “Calcium dépendence of aequorine bioluminescence
dissected by random mutagenesis”.............................................................................................40
2.2.1 Sensibilité calcique ............................................................................................................ 40
2.2.2 Cinétique de la luminescence et quantité totale de photon................................................ 41
2.2.3 Rôle des résidus Gln168 et Leu170 dans la cinétique de bioluminescence ...................... 42
2.2.4 Dépendance au calcium de la bioluminescence de l’aequorine : un modèle..................... 42
Article 2 : « Calcium dépendance of aequorine bioluminescence dissected by random
mutagenesis » et informations supplementaires.................................................................................... 44
2.3 Remarques générales.................................................................................................45
IMAGERIE DES ACTIVITES NEURONALES PAR BIOLUMINESCENCE AEQUORINE ....... 47
1. INTRODUCTION ....................................................................................................................47
1.1 Utilisation de l’aequorine comme senseur calcique....................................................47
1.1.1 Historique .......................................................................................................................... 47
1.1.2 La protéine de fusion GFP-aequorine................................................................................ 50