Les Milieux de Culture en Bactériologie

BIO303
Rédigé par Chringel
Les Milieux de Culture en
Bactériologie
Les Milieux de Culture
Gélose au Cétrimide - milieu sélectif
Composition
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
Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone
Glucide et dérivés : /
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : cétrimide (antiseptique), acide nalidixique
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minéraux : chlorure de magnésium MgCl 2, sulfate de potassium K2PO4,
hydrogénophosphate de potassium
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques


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

Milieu proche du King A, favorise la production de pyocyanide.
Milieu relativement pauvre.
Acide nalixidique : inhibiteur des Gram –
Cétrimide : inhibiteur des Grams + donc des Gram – par extension.
Ensemencement en cadran.

Recherche des Pseudomonas, notamment Pseudomonas earuginosa.
Usage
Lecture


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
Incubation 24h à 37°C :
Développement Pseudomonas aeruginosa et éventuellement Pseudomonas putida,
Pseudomonas stutzeri et Pseudomonas maltophilia.
Incubation 24h à 42°C :
Développement presque exclusif de Pseudomonas aeruginosa.
Pyocyanine : milieu bleu
Pyoverdine : milieu jaune-vert  indicateur de la présence de Pseudomonas
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Gélose de Chapman – milieu sélectif
Composition
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extrait de viande
Glucides et dérivés : /
Autres molécules carbonées : mannitol
Indicateur S2- : /
Inhibiteurs : NaCl à 75g/L
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phénol
Ions minéraux : NaCl
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques
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

Permet la croissance des bactéries halophiles.
Très forte concentration en NaCl permettant l’inhibition des GramPermet l’étude de l’attaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte jaune)
Ensemencer richement en stries ou cadran.
Incubation : 24-48h


Isolement de Staphylococcus aureus.
Numération des staphylocoques.
Usage
Lecture

Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes avec halo clair. Mannitol +
Les autres colonies sont Mannitol -.
Contamination possible par Enterococcus et certains Bacillus.
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Drigalski – milieu sélectif
Composition
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de viande et levure
Glucide et dérivés : Lactose
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : Cristal violet, Désoxycholate de sodium
Divers : /
Indicateurs de pH : Bleu de Bromothymol
Ions minéraux : Thiosulfate de sodium
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques




Cristal violet : inhibe les bactéries Gram +
Désoxycholate de sodium : inhibe les bactéries Gram +
Sélectionne les bactéries Gram –
Inoculation en cadran.

Isolement des entérobactéries.
Usage
Lecture


Bactéries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)
Bactéries lactose - : colonies bleu-vert
Lexique
Mannitol : utilisé pour étudier sa voie d’attaque par les bactéries (fermentation…).
Bleu de Bromothymol : vert (basique) et jaune (acide)
Entérobactéries : bactéries se trouvant dans les cavités internes des êtres vivants comme
l’appareil digestif.
Rouge de phénol : rouge (basique) à jaune (acide)
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Hektoen – milieu sélectif
Composition
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de levure
Glucide et dérivés : salicine, lactose, saccharose
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : citrate de fer
Inhibiteurs : sels biliaires
Divers : /
Indicateurs de pH : Bleu de bromothymol, fuschine acide
Ions minéraux : Thiosulfate de sodium, NaCl
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques




Sels biliaires : limitent le développement des Gram +
Fuschine : vire au rose s’il y a production d’aldéhyde.
Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.
Mise en évidence de la production d’H2S

Isolement des entérobactéries pathogènes : principalement pour vérifier la présence de
Shigella et Salmonella.
Usage
Lecture

Aspect des colonies :
H2S

Attaque
glucide
+
Production
aldéhyde
+
Saumon
Saumon et
+
+
+
centre noir
Bleu-vert
Bleu-vert
et centre
+
noir
Interprétation :
o Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Yersinia.
o Saumon et centre noir : Proteus vulgaris.
o Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella.
o Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella.
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Hugh et Leifson – milieu différentiel
Composition
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones, extrait de levures
Glucide et dérivés : glucose
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : bleu de bromothymol
Ions minéraux : NaCl, K2HPO4
Agar : oui
Eau : oui

Détermination de la voie d’attaque des Glucides, utilisés comme principale source
d’énergie par les bactéries.
L’utilisation du glucose acidifie le milieu, le BBT va alors virer au jaune.
Usage
Technique
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



Régénérer les 2 tubes : création gradient d’oxygène.
Les ramener à 45°C.
Ajouter aseptiquement quelques gouttes d’une solution de glucose stérile.
Concentration finale dans le tube environ 10g/L.
Agiter le tout pour répartir le glucose dans tout le tube.
Solidifier les deux tubes en les plongeant dans l’eau froide.
Ensemencer chaque tube par piqûre centrale avec la pipette Pasteur.
Recouvrir l’un des deux tubes de paraffine ou vaseline stérile.
Incubation 24h à 37°C.
Tube recouvert = tube fermé
Tube non recouvert = tube ouvert
NE PAS REVISSER A FOND LES BOUCHONS.
Lecture
Il peut y avoir formation de gaz par les bactéries.
Résultats après
cultures 24h à 37°C
Interprétation
Le glucose est
dégradé en
aérobiose et en
anaérobiose :
bactérie
fermentative du
glucose.
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Le glucose est
dégradé en
anaérobiose
uniquement :
bactérie
fermentative du
glucose.
Utilisation du
glucose
uniquement en
aérobiose :
bactérie
oxydative.
La bactérie
n’utilise pas le
glucose : elle est
inerte vis-à-vis du
glucose.
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King A et King B – milieu différentiel
Composition King A
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone
Glucide et dérivés : glycérol
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minéraux : MgCl2 (chlorure de magnésium), K2SO4 (sulfate de potasssium)
Agar : oui
Eau : oui
Composition King B
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Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : polypeptone
Glucide et dérivés : glycérol
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : /
Ions minéraux : MgSO4 (sulfate de magnésium), K2HPO4 (hydrogénophosphate de
potassium)
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques





La gélose est inclinée dans un tube.
Ensemencement en stries.
Le chlorure de magnésium et le sulfate de potassium favorisent la production de
pyocyanine.
Le sulfate de magnésium et le phosphate bipotassique favorisent la production de
pyoverdine.
King A : recherche de production de pyocyanine.
King B : recherche de production de pyoverdine.

Identification des Pseudomonas par la présence de pyocyanine ou de pyoverdine.

Usage
Technique


Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la
surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose.
Replacer la capsule sur chaque tube sans la reviser.
Lecture

Aspect après 24h minimum à 30°C :
o King A : culture colorée en bleu-vert (pyocyanine +) et parfois en brun-rose
(pyoverdine +).
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En cas de doute, prélever l’eau de condensation à la pipette Paster et verser
0,5mL de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 à 10min en position
inclinée. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu.
o King B : culture colorée en vert fluorescent (pyoverdine +).
Interprétation :
o Pyocyanine + : présence de Pseudomonas aeruginosa.
o Pyoverdine + : présence de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens
et Pseudomonas putida.
Gélose de Mac Conkey – milieu sélectif
Composition
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


Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone
Glucide et dérivés : lactose
Autres molécules carbonées : /
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : Cristal violet, sels biliaires
Divers : /
Indicateurs de pH : Rouge neutre
Ions minéraux : NaCl
Agar : oui
Eau : non
Caractéristiques

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

Sels biliaires : inhibiteur des Gram +
Cristal violet : inhibiteur des Gram +
Si la bactérie fermente le lactose, le milieu devient rouge du fait de l’acidification du
milieu.
Ensemencement en cadrans.
Incubation 18 à 24h à 37°C
Usage

Détermine si la bactérie fermente le lactose ou pas.
Utilisé pour Shigella et Salmonella.
Lecture


Lactose + : colonies rouges entourées d’un halo opaque de la même couleur dû à la
précipitation des sels biliaires.
Lactose - : colonies jaunes ou incolores.
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Mannitol - Mobilité - Nitrate – milieu différentiel
Composition


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

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones trypsiques de viande
Glucide et dérivés : /
Autres molécules carbonées : mannitol
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phénol
Ions minéraux : KNO3
Agar : oui
Eau : oui
Caractéristiques



Utilisable uniquement pour les bactéries fermentives.
Ensemencement par piqûre centrale au fil droit par pipette Pasteur.
Ne pas oublier de régénérer le milieu et de le laisser refroidir.



Recherche de la dégradation du mannitol
Recherche de la mobilité de la bactérie.
Recherche de mobilité par présence d’une Nitrate réductase.
Usage
Lecture
Aspect après 24h à
37°C
Interprétation
Mannitol Mobilité -
Mannitol Mobilité +
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Mannitol +
Mobilité -
Mannitol +
Mobilité +
Dégradation des Nitrates :
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Urée Indole – milieu synthétique
Composition
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
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

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : /
Glucide et dérivés :
Autres molécules carbonées : L-triptophane (noyau indole), éthanol
Indicateurs S2- : /
Inhibiteurs : /
Divers : /
Indicateurs de pH : rouge de phénol
Ions minéraux : NaCl, K2HPO4 hydrogénophosphate de potassium, KH2PO4
dihydrogénophosphate de potassium
Agar : /
Eau : eau distillée
Caractéristiques



Il n’y a pas de source de carbone : les bactéries ne se multiplient pas. Il faut donc
l’ensemencer abondamment.
Absence de peptones : alcalinisation du milieu due à l’hydrolyse de l’urée.
Milieu complexe synthétique.
Fournit un ensemble de données permettant l’identification des entérobactéries et
autres bactéries.
Usage

Permet la recherche de 3 activités enzymatiques :
o L’uréase
o La tryptophane désaminase (TDA)
o La production d’indole grâce à une tryptophanase.
Technique
Recherche d’une Uréase


Ensemencement riche à partir de cultures solides.
Aspect après 24h à 37°C :

Interprétation :
Toutes les bactéries hydrolysent l’urée : O=C(NH2)2 + H2O  H2N-COOH + NH3
Seules les bactéries ayant une uréase très active arrivent à : H2N-COOH  CO2 + NH3
Le CO2 et le NH3 se combinent pour former du carbonate d’ammonium : CO2 + NH3 
2NH4+ + CO32-.
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Le carbonate d’ammonium est très alcalin : la recherche de l’uréase constituera à tester
l’alcalinisation du milieu.
o Uréase constitutive : uréase + très rapidement, 10min pour Proteus et Yersinia.
o Uréase induite : uréase + en plusieurs heures, pour Klebsiella.
Recherche d’une Tryptophane Désaminase (TDA)



Ensemencement :
o Classique : ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en
milieu solide et incuber 24h à 37°C.
o Rapide : faire une suspension dense dans 10 gouttes de milieu urée-indole.
Agiter 10min à l’agitateur de Kahn.
Aspect après 24h à 37°C :
Interprétation :
En présence de TDA, le tryptophane donne de l’acide β-indole peruvique. Ce dernier, en
présence de perchlorure de fer donne une coloration brune.
o TDA + : coloration brune. Proteus, Providencia, Morganella…
o TDA - : coloration jaune-orangée.
Recherche de la Production d’Indole



Ensemencement :
Ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en milieu solide et
incuber 24h à 37°C.
Aspect après 24h à 37°C :
Interprétation :
Grâce à une tryptophanase, les bactéries peuvent dégrader le tryptophane en indole,
acide pyruvique et NH3.
o Indole + : anneau rouge
o Indole - : anneau brûnatre.
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