Détermination CMI

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ÉTUDE DE LA SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES :
DÉTERMINATION DE LA CMI
Un antibiotique est :
• une substance naturelle ou synthétique
• capable d’empêcher la multiplication de certaines bactéries (bactériostatique) ou de les
détruire (bactéricide)
• de mode d’action spécifique
• actif à des concentrations faibles (de l’ordre du !g par mL ou mg/L)
Les antibiotiques utilisés en pathologie humaine sont en général peu toxiques pour les cellules
eucaryotes supérieures.
Certaines antibiotiques antibactériens comme les sulfamides sont aussi actifs contre certains
parasites eucaryotes (toxoplasme, Plasmodium du paludisme,…).
La classification des antibiotiques n’est pas aisée mais est principalement basée sur leur nature
biochimique.
Le mode d’action des antibiotiques fait l’objet d’un chapitre dans le cours de Microbiologie de
Terminale.
Classe d’antibiotiques
Exemples
Aminosides
Streptomycine, kanamycine, gentamicine, Tobramycine, Amikacine
Noyau de type
pénicilline
Pénicilline G, Pénicillines A (ampicilline, amoxicilline,…)
Penicilline M (oxacilline,…)
Mécillinam
Ticarcilline
Pipéracilline …
ß-lactamines
Noyau de type
céphalosporine
Céphalosporines de 1ère génération : céfalotine,…
Céphalosporines de 2ème génération : céfuroxime, céfoxitine,…
Céphalosporines de 3ème génération : céfotaxime,…
…
Fosfomycine
Fosfomycine
Glycopeptides
Vancomycine
Macrolides et apparentés
Macrolides vrais : érythromycine, josamycine,…
Lincosamides : lincomycine,…
Streptogramines : pristinamycine,…
Nitrofuranes
Nitrofurantoïne
Phénicolés
Chloramphénicol
Polypeptides
Bacitracine, colistine, polymyxine
Quinolones
Quinolones de 1ère génération :acide nalidixique,…
Quinolones de 2ème génération ou fluoroquinolones : norfloxacine,…
Sulfamides et sulfones
Sulfaméthoxazole
Triméthoprime,…
Tétracyclines ou cyclines
Tétracycline,…
Figure 1 : principaux antibiotiques et leur classification
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1. Effets des antibiotiques sur la croissance bactérienne
1.1. Courbes expérimentales
Figure 2 : évolution de la croissance bactérienne
en fonction du temps à différentes concentrations d’antibiotique
1.2. Notion de bactériostase et de bactéricidie
1.2.1. Bactériostase
Pour de faibles concentrations en antibiotique, la concentration bactérienne
augmente mais d’autant plus lentement que la concentration en antibiotique
augmente ; la croissance bactérienne est ralentie mais la concentration bactérienne en
période stationnaire est inchangée.
On dit que l’antibiotique a un effet bactériostatique.
La bactériostase correspond à l’arrêt de la multiplication des bactéries.
1.2.2. Bactéricidie
Pour de fortes concentrations en antibiotique, la concentration bactérienne
diminue et ceci d’autant plus vite que la concentration en antibiotique augmente au-
dessus d’une certaine valeur seuil.
On dit que l’antibiotique a un effet bactéricide.
La bactéricidie correspond à la destruction des bactéries.
10
9
10
8
10
7
10
6
10
5
Courbe de croissance
SANS antibiotique
1 !g/mL
2 !g/mL
4 !g/mL
8 !g/mL
16 !g/mL
Logarithme de la concentration bactérienne
exprimée en bactéries viables par mL
Temps en heures
BACTÉRIOSTASE
BACTÉRICIDIE
CMI
Inoculum

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1.3. Notion de CMI
Entre bactériostase et bactéricidie existe une concentration en antibiotique pour
laquelle la concentration bactérienne ne varie sensiblement pas par rapport à celle de
départ. Cette concentration difficile à déterminer par cette méthode correspond à la
concentration minimale inhibitrice ou CMI.
La CMI est la plus petite concentration en antibiotique pour laquelle la croissance
bactérienne n’est plus visible, in vitro (pas de croissance mais 100 % des bactéries
survivantes).
À partir de la courbe de la figure 2, on peut tracer la courbe de la figure 3 en se
plaçant à un temps fixé (pointillé vertical sur la figure 2). Cette courbe décrit alors
l’évolution de la concentration bactérienne en fonction de la concentration en antibiotique.
L’intersection de la courbe avec l’axe des abscisses permet de déterminer avec une relative
précision la CMI.
Figure 3 : évolution de la croissance bactérienne
en fonction de la concentration en antibiotique
Logarithme de la concentration bactérienne
exprimée en bactéries par mL
Concentration en antibiotique (en !g/mL)
1
2
4
8
16
CMI
10
9
10
8
10
7
10
6
10
5
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On peut représenter la CMI de la manière suivante :
1.4. Notion de sensibilité et de résistance
1.4.1. Concentrations critiques inférieure et supérieure
La CMI permet d’apprécier in vitro la sensibilité d’une souche vis-à-vis d’un
antibiotique mais elle ne reflète pas la réalité thérapeutique.
Sur le plan thérapeutique, des études statistiques chez un nombre significatif
d’individus permettent de déterminer deux valeurs caractéristiques des concentrations
plasmatiques obtenues suite à l’administration d’une posologie recommandée
d’antibiotique :
• la concentration critique inférieure (CCinf ou c) représente la
concentration plasmatique moyenne minimale habituellement obtenue
chez un patient suite à l’administration d’une posologie recommandée
d’antibiotique
• la concentration critique supérieure (CCsup ou C) représente la
concentration plasmatique moyenne maximale habituellement obtenue
chez un patient suite à l’administration d’une posologie recommandée
d’antibiotique
1.4.2. Souche sensible
Si CMI " CCinf, la souche est sensible car dans l’organisme, les bactéries sont en contact
avec une concentration en antibiotique supérieure à la CMI où leur croissance est inhibée.
1.4.3. Souche résistante
Si CMI > CCsup, la souche est résistante car dans l’organisme, les bactéries sont en contact
avec une concentration en antibiotique inférieure à la CMI où leur croissance n’est pas inhibée.
CMI
Présence
de culture bactérienne
Absence
de culture bactérienne
CMI
Présence
de culture bactérienne
Absence
de culture bactérienne
CCinf
CCsup
CMI
Présence
de culture bactérienne
Absence
de culture bactérienne
CCinf
CCsup

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1.4.4. Souche intermédiaire
Si CCinf < CMI " CCsup, la souche est intermédiaire car dans l’organisme, les bactéries
sont en contact avec une concentration en antibiotique où il n’est pas possible de dire s’il y aura
croissance ou non.
Certains microbiologistes préfèrent dans ce cas-là rendre la souche résistante.
2. Détermination de la CMI
Déterminer la CMI consiste à déterminer la concentration en antibiotique inhibant la
croissance bactérienne.
2.1. Méthode de dilution en milieu liquide
En milieu liquide, la croissance bactérienne se visualise par un trouble ou un culot
bactérien.
On réalise une gamme d’antibiotique de concentrations décroissantes par dilutions
successives de raison 1/2 à partir d’une solution mère d’antibiotique.
2.1.1. Préparation d’un inoculum à 105 bactéries par mL (absence de trouble)
L’inoculum bactérien est préparé à partir d’une culture de 24 h en milieu
liquide.
Introduire 0,1 mL (3 gouttes de pipette Pasteur) d’une culture de 24 heures de la
souche étudiée dans 25 mL de bouillon Mueller-Hinton.
Au final, cette suspension correspond à une concentration bactérienne de 105 à
106 bactéries par mL et constitue l’inoculum.
2.1.2. En macrométhode
La gamme d’antibiotique est réalisée en tubes à hémolyse.
L’inoculum standard est mis en contact avec des concentrations croissantes en
antibiotique.
Après 24 heures d’incubation à 37 °C, la CMI correspond à la concentration en
antibiotique du premier tube ne présentant ni trouble ni culot bactérien.
Voir protocole du TP 8 : détermination de la CMI en milieu liquide
2.1.3. En microméthode
La gamme d’antibiotique est réalisée en microplaque de 96 puits à fond en U.
L’inoculum standard est mis en contact avec des concentrations croissantes en
antibiotique.
La CMI correspond à la concentration en antibiotique du premier puits ne
présentant ni trouble bactérien ni culot bactérien.
Voir protocole du TP 8 : détermination de la CMI en milieu liquide
CMI
Présence
de culture bactérienne
Absence
de culture bactérienne
CCinf
CCsup
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2.2. Méthode en milieu gélifié
Les dilutions d’antibiotique sont incorporées dans des géloses de Mueller-Hinton
maintenues en surfusion qui sont ensuite coulées en boîte de Pétri. Chaque boîte contient
une concentration d’antibiotique différente. La surface de la gélose est ensemencée par des
stries de suspension à environ 105 bactéries par mL à l’aide d’une anse calibrée de 10 !L.
Une dizaine de souches peuvent être testées sur une boîte.
La CMI correspond à la plus petite concentration en antibiotique qui inhibe la
croissance bactérienne (aucune colonie sur la strie).
2.3. Méthode Etest®
Une bandelette est imprégnée de quantités croissantes d’antibiotique. Elle est placée
sur une gélose pour antibiogramme ensemencée classiquement (voir TP 9 : antibiogramme
standard) ; l’antibiotique diffuse en formant un gradient de concentration : la zone
d’inhibition a la forme d’une ellipse et la lecture est alors directe sur la bandelette là où
celle-ci rencontre la zone d’inhibition.
Figure 4 : schéma de la méthode Etest®
Bibliographie :
• Activités technologiques en Microbiologie Terminale BGB de G. Leyral, C. et J.N. Joffin, E. Verne-Bourdais,
J.P. Larpent (CRDP Aquitaine 1994)
• Microbiologie technique Tome 1 Dictionnaire des techniques de J.N. Joffin et G. Leyral
(CRDP Aquitaine 2006)
• Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie Recommandations 2007
http://www.sfm.asso.fr/nouv/general.php?pa=2
• Image de l’Etest® : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq/figcinq.html